CN111999364A - 一种用于沙门氏菌检测的dna电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器及其制备方法，利用聚吡咯还原氧化石墨烯复合物(PPy‑rGO)纳米复合材料及亲和素‑辣根过氧化物酶(SA‑HRP)修饰的金纳米粒子(AuNPs)成功制备了一种基于双重信号放大超灵敏检测食品中沙门氏菌的DNA电化学传感器。该DNA电化学传感器具有快速、灵敏、低耗低成本特点，可用于食品中的沙门氏菌检测。因此，该生物传感器可通过invA基因对食品中沙门氏菌进行检测，应用前景广泛，是制造电化学DNA生物传感器的理想模式。

Description

一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及到微生物检测领域，具体说是一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器及其制备方法。
【背景技术】
DNA生物传感器以核酸作为分子识别元件，将目标物的存在转换为可检测的电、光、声等信号，其包含两部分即分子识别元件和换能器。分子识别元件用来感知待测样品中是否存在目标物质及含量，DNA生物传感器分子识别元件通常是一段被固定在修饰电极上的单链DNA杂交形成双链DNA，或识别小分子物质形成特异结构。换能器将探针与目标物杂交前后所产生的变化转换为可被分析测量的信号(电流、频率变化、荧光和光吸收的强度等)，根据信号的变化量，定性定量检测DNA或小分子物质。DNA生物传感器中用于生物识别的DNA分子易于合成、稳定性高、可再生、有易于功能化修饰与标记等优点。DNA生物传感器按换能器不同分为光学DNA传感器、压电DNA传感器、电化学DNA传感器等。
目前检测食品中沙门氏菌的的生物传感器有荧光传感器、磁电传感器、电容免疫传感器、压电免疫传感器、电化学免疫传感器等。这些生物传感器在沙门氏菌检测中存在选择性差、检测周期长、检测灵敏度低及检测成本高等问题。因此研究开发快速、灵敏、低耗低成本、易于操作和便携等优点的新型食品中沙门氏菌DNA生物传感器很有必要。
【发明内容】
本发明利用聚吡咯还原氧化石墨烯复合物(PPy-rGO)纳米复合材料及亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)修饰的金纳米粒子(AuNPs)成功制备了一种基于双重信号放大超灵敏检测食品中沙门氏菌的DNA电化学传感器。该DNA电化学传感器具有快速、灵敏、低耗低成本特点，可用于食品中的沙门氏菌检测。
一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：
其制备方法包括以下步骤：
(1)电极预处理；
(2)电极组装；
首先，滴加5-6μL浓度为1.0mg/mL-1的聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液到预处理后的电极表面，将电极置于干燥器中，静置1.8-2.2h，获得聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE；
将聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE置于浓度为3-4mM的HAuCl4与浓度为0.1M KNO3的混合溶液中，在恒定电位-0.2V下电沉积50-55s，用超纯水洗涤电极，用N2吹干，得到金纳米粒子修饰后电极depAuNP/PPy-rGO/GCE；用移液器取5-6μL 的10μM cDNA滴加到所得电极表面，放置11-12小时，之后电极依次用浓度0.1％的SDS 溶液和pH 7.4的10mM的Tris-HCl缓冲液洗去未结合在电极表面的探针，待电极表面干燥后滴加浓度2％的BSA溶液100-110μL，放置58-62min以消除非特异性吸附，得到的 DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极；
将100-110μL浓度为100pM的tDNA与10-11μL的浓度为10μM的bio-DNA溶液混合均匀，将上述DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极浸泡在此溶液中，36-38℃下温育1-1.1h，得到bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO /GCE电极；
之后再在所得电极上滴加亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物5-6μL，室温下放置30-32min，Tris-HCl缓冲液清洗并用N2吹干得到AuNPs-HRP-SA/bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE，即得。
所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述的电极预处理方法为：首先将直径为3mm的玻碳电极先用1200目SiC砂纸打磨1-2min，再依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光至镜面；再依次用1:1的硝酸水溶液、1:1的乙醇和超纯水超声清洗3-4min；以5mM Fe(CN)6 3-/4-溶液为底液，将电极在-0.2～0.6V 范围内循环伏安获得一对可逆氧化还原峰，当峰差小于80mV时，说明电极表面清洁可用，否则重新处理电极，直到电极符合要求，最后用二次蒸馏水清洗再用氮气吹干。
所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：浓度为1.0mg mL-1聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液制备方法包括以下步骤：
(1)准确称取0.100g的氧化石墨烯溶解于100mL超纯水中，配置浓度为1.0mg/mL-1的氧化石墨烯悬浊液，超声23-24h，悬浊液变为较均匀溶液，转速3000-3100rpm离心 10-12min，取上清液，得到均一稳定的溶液，再用超纯水透析1周，去除其它小分子，最终得到1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液；
(2)取10-12mL 1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液于锥形瓶中，匀速搅拌下加入150μLPy:GO质量比为15:1的吡咯，超声25-30min，将浓度为1mol L-1FeCl3溶液一滴一滴加入到溶液中，使得n Fe3+:n Py＝1:1，室温下搅拌23-24h，原位聚合得到PPy-GO复合物，用乙醇和超纯水离心洗涤三次，真空干燥得到固体粉末；
(3)利用所得固体粉末配置10mL 1.0mg/mL-1PPy-GO溶液，随后缓慢加入100μL 浓度为28％的氨水，最后加入40μL浓度为25％的水合肼，将混合物剧烈搅拌25-30min，然后在55-60℃下中速搅拌反应15-16h，得到的黑色溶液，10000-11000rpm下离心25-30 min，弃去上清液，并将沉淀离心水洗3-4次，之后将得到的PPy-rGO真空干燥，制备浓度为1.0mg mL- 1PPy-rGO溶液，3-4℃下储存备用，即得。
所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：
亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物的制备方法为：
(1)用锥形瓶取100mL浓度为0.01％的氯金酸溶液置于石棉网加热至沸腾，加入3.5mL 浓度1％柠檬酸钠，迅速搅拌，继续加热直至溶液颜色由浅黄色变为紫色，最后变为酒红色，停止加热，待溶液冷却，将制备好的金纳米粒子AuNPs溶液置于3-5℃冰箱备用；
(2)取1mL制备好的AuNPs溶液于1.5mL离心管中，10000-11000rpm下离心10-12min，弃去上清液，用pH 7.4的PBS缓冲液重新定容至300μL，完成AuNPs溶液的浓缩，加入20μL浓度0.1mg/mL-1SA-HRP溶液，震荡均匀，3-5℃放置23-25h，之后转速7500-8000rpm 条件下离心15-20min，离心水洗三次后用缓冲液定容，3-4℃条件下储存备用，得到亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物。
所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：Tris-HCl 缓冲液溶液的制备方法为:准确称取0.484g的Tris固体，溶于超纯水中，并用100mL 容量瓶定容，得到0.02M Tris溶液，取50mL Tris溶液加入约42mL的0.02M HCl溶液，加超纯水至100mL，用pH计对溶液pH校正，得到pH 7.4的浓度为10mM的Tris-HCl 缓冲溶液。
所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：1molL-1FeCl3溶液制备方法为：称取2.703g FeCl3·6H2O颗粒溶解于10mL超纯水中。
本发明方法制得的用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器。所得的用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器在电化学检测后，符合要求即可投入使用。
本发明利用聚吡咯还原氧化石墨烯复合物(PPy-rGO)纳米复合材料及亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)修饰的金纳米粒子(AuNPs)成功制备了一种基于双重信号放大超灵敏检测食品中沙门氏菌的DNA电化学传感器。该DNA电化学传感器具有快速、灵敏、低耗低成本特点，可用于食品中的沙门氏菌检测。
通过FeCl3作用，使吡咯单体在氧化石墨表面原位聚合得到PPy-GO复合物，之后通过水合肼还原，经过离心水洗干燥得到PPy-rGO复合物，通过紫外，XPS，扫描电镜对复合物进行组成以及形态分析。同时通过HRP-SA与AuNPs的吸附作用制备AuNPs-HRP-SA复合材料。实验通过循环伏安法表征组装过程，表明组装方法可行，同时证明PPy-rGO纳米材料具有良好的导电性，与裸电极相比，可以极大提高电子传输速率。通过在含H2O2和HQ 的PBS溶液中，使用差分脉冲伏安法对放大方式进行可行性分析，证明双重放大可行有效，并探究出实验的最优反应条件，在最优条件对沙门氏菌invA基因片段进行检测分析，分现峰电流与tDNA在tDNA浓度为0.1fM到0.1nM范围之间存在着线性关系，线性回归方程为I(μA)＝3.8147logC(M)+78.2781(R＝0.990)检出限低至15.8aM，同时该传感方法具有良好的选择性，稳定性和重现性，并展现良好的再生性，再生三次电化学信号仍能保持91.58％，该传感平台可用于实际样品的检测，并且有良好的效果。因此，该生物传感器可通过invA基因对食品中沙门氏菌进行检测，应用前景广泛，是制造电化学DNA 生物传感器的理想模式。
附图说明
图1为采用差分脉冲伏安法对不同浓度的tDNA进行检测分析，得到的不同浓度tDNA的浓度横轴对应DNA传感器的差分脉冲伏安响应电流纵轴的曲线图；
图2为采用差分脉冲伏安法对不同浓度的tDNA进行检测分析，所得cDNA浓度横轴对数与 DPV峰电流纵轴之间的示意图；
图3中图(A)为DNA生物传感器分别对单碱基错配序列，三碱基错配序列，完全不互补序列，目标DNA序列的差分脉冲伏安响应曲线图，其中，DNA浓度为横轴，目标DNA序列的差分脉冲伏安响应值为纵轴，单碱基错配DNA(Mis-1)为曲线d，三碱基错配DNA(Mis-3) 为曲线c，完全不匹配DNA(N-DNA)为曲线b、tDNA为曲线e，N-DNA为曲线b的峰电流与blank(曲线a)接近，图(B)为三次重复检测得到的各DNA的峰平均电流值柱状图；图4中为DNA生物传感器进行连续三次再生重复实验检测得到平均峰电流值折线图。
具体实施方式
1.溶液及其配置
Tris-HCl缓冲液溶液:准确称取0.484g的Tris固体，溶于超纯水中，并用100mL 容量瓶定容，得到0.02M Tris溶液，取50mL Tris溶液加入约42mL的HCl(0.02M) 溶液，加超纯水至100mL，用pH计对溶液pH校正，得到pH 7.4的10mM Tris-HCl缓冲溶液。
DNA储存缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1.0mM EDTA，pH 7.4)来储存全部寡核苷酸。
DNA固定缓冲液(10mM Tris-HCl，1.0mM EDTA，1.0mM TCEP，100mM NaCl，1.0mMMgCl2，pH 7.4)。
DNA杂交缓冲液(10mM Tris-HCl，1.0mM EDTA，100mM NaCl，1.0mM MgCl2，pH7.4)。FeCl3溶液(1mol L-1)：称取2.703g FeCl3·6H2O颗粒溶解于10mL超纯水中 0.1M PBS溶液：称取15.6g磷酸二氢钠，用二蒸水定容至1000mL，得到0.1M磷酸二氢钠溶液；称取35.81g磷酸氢二钠，用二蒸水定容至1000mL，得到0.1M磷酸氢二钠溶液，将两种溶液按一定比例混合，得到不同pH的PBS缓冲液。
2.聚吡咯-还原氧化石墨烯(PPy-rGO)制备
(2.1)氧化石墨烯(graphene oxide，GO)的制备
准确称取0.100g的氧化石墨溶解于100mL超纯水中，配置浓度为1.0mg/mL-1的氧化石墨悬浊液，超声24h，悬浊液变为较均匀溶液，转速3000rpm离心10min，取上清液，得到均一稳定的溶液，再用超纯水透析1周，去除其它小分子，最终得到1.0mg/mL-1 氧化石墨烯溶液。
(2.2)聚吡咯-还原氧化石墨烯(PPy-rGO)及还原氧化石墨烯(reduced grapheneoxide，rGO)的制备
PPy-rGO具体制备步骤如下：取10mL 1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液于锥形瓶中，匀速搅拌下加入150μL吡咯(Py:GO＝15:1)，超声30min，将FeCl3溶液一滴一滴加入到溶液中(n Fe3+:n py＝1:1)，室温下搅拌24h，原位聚合得到PPy-GO复合物，用乙醇和超纯水离心洗涤三次，真空干燥得到固体粉末。配置10mL 1.0mg/mL-1PPy-GO溶液，随后缓慢加入100μL氨水(28％)，最后加入40μL水合肼(25％)，将混合物剧烈搅拌 30min，然后在60℃下中速搅拌反应16h，得到的黑色溶液，10000rpm下离心30min，弃去上清液，并将沉淀离心水洗3次，之后将得到的PPy-rGO真空干燥，制备1.0mg mL-1 PPy-rGO溶液，4℃下储存备用。按照相似的方法，制备rGO。
3.亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子(AuNPs-HRP-SA)制备方法
金纳米粒子(AuNPs)的制备：用锥形瓶取100mL氯金酸溶液(0.01％)置于石棉网加热至沸腾，加入3.5mL柠檬酸钠(1％)，迅速搅拌，继续加热直至溶液颜色由浅黄色变为紫色，最后变为酒红色，停止加热，待溶液冷却，将制备好的AuNPs溶液置于4℃冰箱备用。
亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子(AuNPs-HRP-SA)制备：取1mL制备好的AuNPs溶液于1.5mL离心管中，10000rpm下离心10min，弃去上清液，用PBS(pH 7.4) 缓冲液重新定容至300μL，完成AuNPs溶液的浓缩，加入20μL SA-HRP(0.1mg/mL-1) 溶液，震荡均匀，4℃放置24h，之后转速8000rpm条件下离心15min，离心水洗三次后用缓冲液定容，4℃条件下储存备用。
4.DNA传感器制备
(4.1)电极预处理
首先将直径为3mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光至镜面。再分别用1:1的硝酸水溶液、乙醇和超纯水超声清洗3min。以5mM Fe(CN)63-/4-溶液为底液，在-0.2～0.6V范围内循环伏安获得一对可逆氧化还原峰，当峰差小于80mV时，说明电极表面清洁可用，否则重新处理电极，直到电极符合要求。最后用二蒸水清洗再用氮气吹干。
(4.2)电极组装
首先，滴加5μL 1.0mg/mL-1PPy-rGO溶液到预处理后的电极表面，将电极置于干燥器中，静置2h，获得聚吡咯还原氧化石墨烯修饰电极(PPy-rGO/GCE)；将电极置于3 mMHAuCl4溶液(0.1M KNO3)，在恒定电位-0.2V下电沉积50s，用超纯水洗涤电极，用N2吹干，得到金纳米粒子修饰后电极(depAuNP/PPy-rGO/GCE)；用移液器取5μL 的10μM cDNA滴加到电极表面，在湿润环境下放置12小时，之后电极分别用0.1％SDS 溶液和Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 7.4)洗去未结合在电极表面的探针；待电极表面干燥后滴加BSA(2％)溶液，湿润环境下放置60min以消除非特异性吸附，得到的DNA传感界面(BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE)；将100μL一定浓度的tDNA与10μL bio-DNA (10μM)溶液混合均匀，将上述电极浸泡在此溶液中，37℃下温育一定时间，得到bio-DNA /tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE；之后滴加AuNPs-HRP-SA复合物，室温下放置30min，缓冲液清洗并用N2吹干得到AuNPs-HRP-SA/bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA /depAuNP/PPy-rGO/GCE，然后进行电化学检测。
5.实验测试方法
X射线光电子能谱(XPS)，主要用于表征材料表面元素的构成。x射线光电子能谱(XPS) 使用Al Kα(1486.6eV)为射线源，辐射功率225W，入射角为90°。制样：干燥得到粉末样品进行检测。
场发射扫描电子显微镜(FESEM),二次电子探测器，电子加速电压：1kV。制样：将硅片用乙醇和超纯水清洗，将适量待测样水溶液滴加在硅片，干燥后将带有样品的硅片，用导电胶粘到样品台上，对试样进行25min喷金处理。将喷金后的样品放到仪器中进行测试，观察试样表面形貌。
紫外-可见光谱(UV-Vis)测试范围250nm-900nm，样品池为1cm容量为500μL的狭缝石英比色皿。制样：样品水溶液进行检测。
电化学检测：GCE作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝电极作为对电极的三电极系统。(1)采用循环伏安法(CV)、含0.1M kCl的5.0mM(Fe(CN)6)3/4-溶液中对电极组装过程进行表征，CV扫描范围为-0.3V到0.5V，扫描速率为50mV s-1。(2)采用循环伏安法(CV)，底液为pH 7.4磷酸缓冲溶液(含2mM HQ，3mM H2O2)，CV扫描范围为-0.6V 到0.6V，扫描速率为50mV s-1。(3)采用微分脉冲伏安法(DPV)检测，底液为pH 7.4磷酸缓冲溶液(含2mM HQ，3mMH2O2)，初始电位：0.5V，终止电位：-0.4V，电位增量4mV s-1,脉冲幅度50mV，脉冲宽度为0.05s。
6.线性关系
在优化后的最佳反应时间的条件下，采用差分脉冲伏安法对不同浓度的tDNA进行检测分析，如图1、图2所示。峰电流随着分析物tDNA浓度的增加而增强，表明随着tDNA的增加，更多的HRP被固定在电极表面，电极峰电流与tDNA的浓度呈现正相关，校准曲线显示了峰电流和分析物浓度的对数之间有着良好线性关系，电化学信号在tDNA浓度0.1fM 至0.1nM范围内获得，线性回归方程为I(μA)＝3.8147logC(M)+78.2781(R＝0.990)。在信噪比为3的情况下，检测限为15.8aM。这些结果表明在一定范围该DNA生物传感器可用于目标DNA的定量检测。
7、传感器的选择性，稳定性，重复性，再生性
该DNA生物传感器对tDNA识别性能，将100 pM的tDNA，单碱基错配DNA（Mis-1），三碱基错配DNA（Mis-3），完全不匹配DNA（N-DNA）4种DNA序列分别作为检测序列，研究该DNA生物传感器的选择性。如图1A所示，Mis-1（曲线d），Mis-3（曲线c）的峰电流值明显低于tDNA（曲线e），N-DNA（曲线b）的峰电流与blank（曲线a）接近，由图2B得到，Mis-1和Mis-3的相对峰值电流值（扣除空白值）为tDNA的53.4％和14.5％，N-DNA的电流值与空白相近，因此看出该传感器有良好的选择性。如图3所示。
实验对DNA传感器的重复性和稳定性进行了研究，使用三根不同的电极，在tDNA为1 pM的条件下。组装电极得到AuNPs-HRP-SA/bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/PPy-rGO/ GCE传感器进行测试，三根电极的信号相对标准偏差(RSD)为7.98％；电极在4℃条件下放置7天后，响应信号保持了原信号的84.6％，因此该电极有良好重复性和稳定性。
电极表面的再生是通过物理温度变化方法，来解开DNA杂交重新得到BSA/cDNA/PPy-rGO/GCE传感器界面，实验具体方法：先将电极放置90℃的PBS缓冲液中5min，之后迅速对电极进行盐冰水浴，电极用PBS缓冲液和超纯水清洗后，进行电化学测试，之后重新对电极进行后续步骤的组装，得到AuNPs-HRP-SA/bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/ PPy-rGO/GCE进行测试，结果显示，解开DNA间互补配对后，电流降低并与空白相近，重新组装后电流增加，该生物传感器3次循环后电流是其原始响应电流的91.58％，因此该电极具有良好的再生性，结果如图4所示。

Claims (7)

1.一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：
其制备方法包括以下步骤：
(1)电极预处理；
(2)电极组装；
首先，滴加5-6μL浓度为1.0mg/mL-1的聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液到预处理后的电极表面，将电极置于干燥器中，静置1.8-2.2h，获得聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE；
将聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE置于浓度为3-4mM的HAuCl4与浓度为0.1M KNO3的混合溶液中，在恒定电位-0.2V下电沉积50-55s，用超纯水洗涤电极，用N2吹干，得到金纳米粒子修饰后电极depAuNP/PPy-rGO/GCE；用移液器取5-6μL的10μM cDNA滴加到所得电极表面，放置11-12小时，之后电极依次用浓度0.1％的SDS溶液和pH 7.4的10mM的Tris-HCl缓冲液洗去未结合在电极表面的探针，待电极表面干燥后滴加浓度2％的BSA溶液100-110μL，放置58-62min以消除非特异性吸附，得到的DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极；
将100-110μL浓度为100pM的tDNA与10-11μL的浓度为10μM的bio-DNA溶液混合均匀，将上述DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极浸泡在此溶液中，36-38℃下温育1-1.1h，得到bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极；
之后再在所得电极上滴加亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物5-6μL，室温下放置30-32min，Tris-HCl缓冲液清洗并用N2吹干得到AuNPs-HRP-SA/bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE，即得。
2.根据权利要求1所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述的电极预处理方法为：首先将直径为3mm的玻碳电极先用1200目SiC砂纸打磨1-2min，再依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光至镜面；再依次用1:1的硝酸水溶液、1:1的乙醇和超纯水超声清洗3-4min；以5mM Fe(CN)6 3-/4-溶液为底液，将电极在-0.2～0.6V范围内循环伏安获得一对可逆氧化还原峰，当峰差小于80mV时，说明电极表面清洁可用，否则重新处理电极，直到电极符合要求，最后用二次蒸馏水清洗再用氮气吹干。
3.根据权利要求1所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：
浓度为1.0mg mL-1聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液制备方法包括以下步骤：
(1)准确称取0.100g的氧化石墨烯溶解于100mL超纯水中，配置浓度为1.0mg/mL-1的氧化石墨烯悬浊液，超声23-24h，悬浊液变为较均匀溶液，转速3000-3100rpm离心10-12min，取上清液，得到均一稳定的溶液，再用超纯水透析1周，去除其它小分子，最终得到1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液；
(2)取10-12mL 1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液于锥形瓶中，匀速搅拌下加入150μL Py:GO质量比为15:1的吡咯，超声25-30min，将浓度为1mol L-1FeCl3溶液一滴一滴加入到溶液中，使得n Fe3+:n Py＝1:1，室温下搅拌23-24h，原位聚合得到PPy-GO复合物，用乙醇和超纯水离心洗涤三次，真空干燥得到固体粉末；
(3)利用所得固体粉末配置10mL 1.0mg/mL-1PPy-GO溶液，随后缓慢加入100μL浓度为28％的氨水，最后加入40μL浓度为25％的水合肼，将混合物剧烈搅拌25-30min，然后在55-60℃下中速搅拌反应15-16h，得到的黑色溶液，10000-11000rpm下离心25-30min，弃去上清液，并将沉淀离心水洗3-4次，之后将得到的PPy-rGO真空干燥，制备浓度为1.0mg mL-1PPy-rGO溶液，3-4℃下储存备用，即得。
4.根据权利要求1所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：
亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物的制备方法为：
(1)用锥形瓶取100mL浓度为0.01％的氯金酸溶液置于石棉网加热至沸腾，加入3.5mL浓度1％柠檬酸钠，迅速搅拌，继续加热直至溶液颜色由浅黄色变为紫色，最后变为酒红色，停止加热，待溶液冷却，将制备好的金纳米粒子AuNPs溶液置于3-5℃冰箱备用；
(2)取1mL制备好的AuNPs溶液于1.5mL离心管中，10000-11000rpm下离心10-12min，弃去上清液，用pH 7.4的PBS缓冲液重新定容至300μL，完成AuNPs溶液的浓缩，加入20μL浓度0.1mg/mL-1SA-HRP溶液，震荡均匀，3-5℃放置23-25h，之后转速7500-8000rpm条件下离心15-20min，离心水洗三次后用缓冲液定容，3-4℃条件下储存备用，得到亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物。
5.根据权利要求1所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：Tris-HCl缓冲液溶液的制备方法为:准确称取0.484g的Tris固体，溶于超纯水中，并用100mL容量瓶定容，得到0.02M Tris溶液，取50mL Tris溶液加入约42mL的0.02M HCl溶液，加超纯水至100mL，用pH计对溶液pH校正，得到pH 7.4的浓度为10mM的Tris-HCl缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：1mol L-1FeCl3溶液制备方法为：称取2.703g FeCl3·6H2O颗粒溶解于10mL超纯水中。
7.采用权利要求1-6任一项所述的用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法制得的DNA电化学传感器。
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