CN111579610A - 两步法制备纳米多孔金及用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种两步法制备纳米多孔金及用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let‑7a)检测。其特征是采用由低频至高频的方波伏安法刻蚀金电极表面以制备纳米多孔金（NPG）膜修饰金电极，以硫堇(Th)为电化学杂交指示剂，根据电信号差异判断待测液中是否含有let‑7a并实现其定量分析。本方法采用的两步方波伏安法具有制备过程简单、快速、绿色等优点，制备的纳米多孔金界面具有良好的导电性、电催化能力及生物相容性，且大的表面积可以增加捕获探针的固定量，基于此电极所构建的电化学生物传感器具有选择性好和灵敏度高的特点，与传统方法比较，更为快捷、简便、经济、且电极耗损小。

Description

两步法制备纳米多孔金及用于非小细胞肺癌耐药相关微小 RNA(let-7a)检测
技术领域
本发明涉及一种基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法。
背景技术
在临床基因诊断及监测方面，电化学DNA生物传感器均具有操作简单、检测速度快、灵敏度高、特异性好、有望进行高通量生物分析等优点，广泛用于特定DNA序列或与疾病有关的突变基因的检测。与传统生物传感标记技术相比，免标记法检测无需对待测样本（如DNA或蛋白分子）进行化学修饰或者标记物插入等可能影响样品环境的前期处理，可弥补其标记困难、操作繁琐和价格昂贵等不足。将免标记技术与电化学生物传感技术相结合，并将具有优异性能纳米材料引入到生物传感器中，可进一步提高传感器的检测灵敏度与选择性。
纳米多孔金（NPG）是近年来出现的一种纳米多孔材料，多孔化赋予了原来材料崭新的性能，空隙结构使材料具有很多优异的物理化学性能，如较高的比强度、较低的热导率、较大的比表面积及较高的吸附性能等特点，这些性能方面的延伸，使多孔材料弥补了致密材料在应用上的局限，受到人们的广泛关注；同时，纳米金材料具有许多传统材料无法比拟的功能和特性。结合多孔结构的特点和纳米金性能上的优势，纳米多孔金不仅保留了利于分子在结构内部传输的连续多孔网状结构，而且具备了金属金本身良好导电性及优越的催化性能，因此，与单纯的多孔材料或纳米金颗粒相比，纳米多孔金在生物化学，大分子催化，分子识别，纳米材料组装，DNA电化学传感及色谱载体等领域有着更广泛的应用。
现有的纳米多孔金制备方法主要有化学腐蚀合金法，电化学腐蚀法，电化学合金/腐蚀法，电化学沉积法，电化学氧化/化学还原法、模板合成法和方波伏安法（SWORC）等。在这些方法中，方波伏安法由于其简单，省时和可控的纳米多孔金制备而非常有吸引力。
方波伏安法在制备纳米多孔金材料方面具有比较突出的优点，如简便、快速、反应条件温和可控、产物纯度高(无其他试剂引入)、适用范围广、对环境不造成污染、且通过参数的调整能够更好地控制纳米粒子的尺寸和形貌等，源于这些优点，方波伏安法成为一种重要的电极表面处理方法，在制备纳米多孔金电极上具有巨大的应用潜力。现有的文献报道方波伏安法制备纳米多孔金电极时设置的参数中频率通常选择2000 Hz甚至更高，在电位范围及电位间隔参数不变的前提下，反应频率越高其处理时间越短，通常在不到1秒完成反应，参照文献报道维持高频刻蚀5分钟的要求，实验中需对电极进行反复多次的刻蚀，多次刻蚀可使电极表面划痕增多，导致后续反应中多孔金形成的无序性概率增加，界面形貌随机性直接影响到后期测定结果的重现性。因此，对于有一定程度损耗的电极，如何提高其使用性能方便于再次使用制备出均匀且规则纳米多孔金，尽可能减少多次重复刻蚀对金电极的损耗，保证实验结果较高的重现性，是目前该方法制备纳米多孔金需要解决的一个关键性问题。
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌有两个主要病理组：15％的小细胞肺癌（SCLC）和85％的非小细胞肺癌（NSCLC）。尽管在早期诊断和新的治疗策略方面有所改善，但非小细胞肺癌（NSCLC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因，诊断后5年内存活的患者不到15％。NSCLC患者的耐药性已成为肺癌治疗失败、病情进展的主因。研究表明，微小RNA（microRNAs）的表达与NSCLC患者的耐药、预后紧密相关，特别是let-7a存在水平降低与患者存活时间的缩短直接相关，因此，let-7a的表达水平可以作为预测个体患者耐药信息的参考指标，通过在治疗过程中通过对let-7a表达水平的监测，可以对治疗方案进行指导，以提高NSCLC治愈率。
目前，临床上基因检测的方法主要包括流式细胞仪、染色体分析、FISH、RT-PCR等，但这些方法存在费时、准确性不高、价格昂贵等局限性。因此，研制一种高度敏感性及选择性的生物传感器具有广阔的运用前景。
利用纳米多孔金膜为金电极的修饰材料，巯基修饰的特异性基因序列为分子捕获探针，以硫堇作为电化学杂交指示剂，构建的一种新型纳米电化学生物传感器，并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA（let-7a）的检测。在2 Hz的低频下对电极进行刻蚀，初步形成相对均匀且有序的纳米多孔金结构，在此基础上，对电极进行仅一次的高频（2000Hz）刻蚀，构建三维纳米多孔金薄膜；利用自组装膜法将巯基修饰的捕获探针固定在纳米多孔金修饰电极表面，对电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭，目标微小RNA（let-7a）序列与捕获探针通过碱基互补配对实现杂交，通过杂交前后杂交指示剂（硫堇）电流强度大小的变化，进行目标微小RNA的检测。由于以具有大的比表面积、强的导电性和生物相容性、良好的电催化性能的纳米多孔金作为基底电极，很好地增强了检测的灵敏度与特异性，从而建立了灵敏度高、特异性好的非小细胞肺癌耐药相关微小RNA（let-7a）检测方法，为非小细胞肺癌患者的预后提供分子诊断基础，预警治疗过程中耐药与不良预后风险，为临床医生及时调整化疗方案，指导个体化治疗以及提高疗效并延长患者的生命具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提出了一种简单、快速、绿色的两步方波伏安法制备三维纳米多孔金膜修饰金电极方法，基于此修饰电极提出了一种操作过程简单、检测成本低廉且具有高灵敏度及选择性的检测目标微小RNA的电化学生物传感器。
为了实现上述目的，一种基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于通过两步方波伏安法制备三维纳米多孔金（NPG）薄膜，构建电化学生物传感器，利用杂交前后硫堇分子电流强度的变化实现对目标基因序列microRNA的检测。
所述的基于纳米多孔金膜修饰金电极的电化学生物传感器检测非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)的方法，其特征在于三维纳米多孔金的制备采用两步方波伏安法，且所述的目标基因序列为let-7a的完整序列，具有高度的时序性、保守性和特异性。
所述的两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，依序包括如下步骤：（1）金电极预处理；（2）纳米多孔金膜修饰金电极的制备；（3）捕获探针(5'-SH -TTT TTA ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA -3')的自组装及与目标微小RNA杂交；（4）在电化学DNA杂交指示剂硫堇溶液中富集；（5）带有探针的纳米多孔金膜修饰金电极在PBS缓冲液中，通过杂交前后硫堇电流强度的变化可检测目标微小RNA。
所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于制备的纳米多孔金膜修饰金电极，具有大的比表面积、良好的DNA负载能力、高导电及电催化能力，增强了该传感器的灵敏度。
所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，单链DNA及DNA/RNA杂合体与硫堇分子结合的数量不同，根据杂交前后电流强度的差异检测目标微小RNA。
所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于金电极依次在1.0 μm、0.3 μm 和0.05μm Al2O3粉末和水的混悬液打磨抛光至镜面，再先后用丙酮、无水乙醇、超纯水超声清洗；将超声好的金电极置于0.5 mol/L H2SO4 溶液中进行电化学处理循环扫描至稳定，以除去表面上的可能的杂质，随后用超纯水超声清洗，氮气吹干备用；采用方波伏安法，设置方波伏安法的参数，初始电位为-0.8 V，终止电位为 2.5 V，电位增量为0.004V，振幅为0.025 V，频率为2 Hz，将洁净的金电极置于0.5 M H2SO4中反应；随后，其他参数不变，仅将方波伏安法的频率改为2000 Hz，将上述金电极置于0.5 M H2SO4中反应一次，即制得纳米多孔金膜修饰金电极。
所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于取3 μL浓度为1μM巯基修饰的捕获探针滴加到已处理好的纳米多孔金膜修饰金电极表面，在室温下反应后，用Tris-HCL缓冲液清洗后用氮气吹干，接着在1.0 mM 6-巯基-1-己醇水溶液中封闭，即得到修饰有捕获探针和巯基己醇的ssDNA/MCH/NPG修饰电极，然后用Tris-HCL缓冲液清洗，氮气吹干；在ssDNA/MCH/NPG修饰电极表面滴5 μl含有不同浓度目标微小RNA的SSC缓冲溶液中，37 ℃下反应，用0.1×SSC缓冲溶液冲洗电极，氮气吹干，得到RNA-DNA/MCH/NPG修饰电极；将上述得到的RNA-DNA/MCH/NPG修饰电极浸入到新制的浓度为0.5 mM的含有硫堇的pH 7.4，含0.1 MNaCl的 PBS溶液中，富集30min，用PBS缓冲液冲洗干净，氮气吹干，在PBS缓冲溶液中扫描后记录DPV曲线；DPV扫描电位-0.6 V~-0.2 V，振幅0.05 V，脉冲宽度0.05 s，采样宽度0.0167s，脉冲周期0.2 s，静置时间2 s，扫速100 mV/s。
所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于利用差示伏安曲线方法对非小细胞肺癌耐药相关微小RNA中的let-7a进行定量检测，观察电流强度变化，进一步评估基于RNA-DNA/MCH/NPG修饰电极的检测性能，随着互补链浓度的增加，其电流信号逐渐增大，在浓度范围5.0×10 -15 ~5.0×10 –13 mol/L之间，电流信号与let-7a的浓度成呈良好的线性关系，检测限为1.67×10 -15 mol/L。
具体地说，本发明提供了一种检测非小细胞肺癌耐药相关微小RNA（let-7a）的纳米电化学生物传感器，待测微小RNA为let-7a，包括如下步骤：
（1）从miRBase数据库中查找let-7a基因序列，选择其互补序列作为人工合成的探针使用，探针长度为27个碱基，捕获探针(5'-SH -TTT TTA ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA -3'）,目标微小RNA序列(5'- UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U -3')。
（2）金电极依次在1.0μm、0.3μm 和0.05 μm Al2O3粉末和水的混悬液打磨抛光至镜面，再先后用丙酮、无水乙醇、超纯水超声清洗。将超声好的电极置于0.5 mol/L H2SO4 溶液中进行电化学处理循环扫描至稳定，以除去表面上的可能的杂质，随后用超纯水超声清洗，氮气吹干备用。采用方波伏安法，设置方波伏安法的参数，初始电位为-0.8 V，终止电位为2.5 V，电位增量为0.004V，振幅为0.025 V，频率为2 Hz，将洁净的金电极置于0.5 M H2SO4中反应；随后，其他参数不变，仅将方波伏安法的频率改为2000 Hz，将上述金电极置于0.5M H2SO4中反应一次，即制得纳米多孔金膜修饰金电极。将修饰电极用超纯水冲洗后，置于0.5 M H2SO4中循环伏安扫描，去除表面残留杂质及计算制备前后金电极的真实面积。
（3）捕获探针通过金-硫键自组装纳米多孔金膜修饰金电极(NPG/AuE)表面，在目标微小RNA存在的情况下，捕获探针通过碱基互补配对与目标微小RNA结合。
（4）将杂交前后的修饰电极置于含有硫堇（Th）溶液中富集一定时间，Th在电极表面发生氧化还原反应，从而产生电化学信号。电化学检测过程中，电化学三电极体系：金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl（饱和KCl）为参比电极，所用的电化学检测技术为差示脉冲伏安法。
与现有技术相比，上述技术方案的特点：利用简单、快速、绿色的“两步方波伏安法”制备了三维纳米多孔金膜修饰金电极，利用纳米多孔金材料具有的大的比表面积可提高捕获探针的负载量以及纳米金良好的导电性增强电子的转移能力，极大地提高了检测灵敏度。本发明的方法有望应用于临床上各种基因的诊断检测，为临床上快速诊断提供可能。且该技术的所需检测操作过程简单、检测成本低廉且检测结果灵敏准确，有利于推广使用。
附图说明
图1为本发明的基于纳米多孔金膜修饰金电极构建的电化学生物传感器检测非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)方法的测试流程图。
图2为本发明的纳米多孔金膜修饰金电极制备过程的电极界面图、扫描电镜图、原子力显微镜图及能谱图；图中：(A) 裸玻碳的电极界面图，(B)一步方波伏安法制得修饰电极的界面图，(C) 两步方波伏安法制得修饰电极的界面图，(D) 裸玻碳电极的扫描电镜图，(E)一步方波伏安法制得修饰电极的扫描电镜图，(F)两步方波伏安法制得修饰电极的扫描电镜图，(G) 裸玻碳电极的原子力显微镜图，(H)一步方波伏安法制得修饰电极的原子力显微镜图，(I)两步方波伏安法制得修饰电极的原子力显微镜图，(J)一步方波伏安法制得修饰电极的能谱图，(K)两步方波伏安法制得修饰电极的能谱图。
图3为本发明的不同修饰电极的循环伏安图；图中：(a) 裸金电极，(b)一步方波伏安法制备的金电极及(c)两步方波伏安法制备的金电极在0.5 M H2SO4中的循环伏安图；插图为裸金电极(a)的放大图。
图4为本发明的传感器组装过程的交流阻抗表征对照图；图中：A：裸AuE(a)，裸ssDNA/AuE(b), DNA-RNA/AuE(c)的交流阻抗图(插图为曲线a的放大图)；图中：B：一步法制得的AuE(a)，两步法制得的NPG/AuE(b), ssDNA/NPG/AuE (c)和MCH/ssDNA/NPG/AuE(d)的交流阻抗图。
图5为本发明的捕获探针DNA与完全互补序列及其他非小细胞肺癌耐药相关微小RNA杂交后的差示脉冲伏安图；图中：(A) 背景电流(a)、miRNA-21(b)、LRP(c)、miRNA-210(d)、miRNA-155(e) 以及let-7a(f)；插图为相对应的直方图。
图6为本发明的杂交温度优化的循环伏安图；插图为杂交温度对还原峰电流差值响应的折线图。
图7为本发明的传感器与不同浓度let-7a杂交后的差示脉冲伏安图；图中：（A）不同浓度的杂交链电化学信号比较图；目标let-7a量从(a)到(h)分别为 0, 5 fM, 10 fM,50 fM, 100 fM, 200 fM, 300 fM, 500 fM；插图为电流强度差值与目标let-7a浓度的线性关系图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例是这样实现的（见图1），具体实施如下步骤：
（1）金电极依次在1.0 μm、0.3 μm 和0.05 μm Al2O3粉末和水的混悬液打磨抛光至镜面，再先后用丙酮、无水乙醇、超纯水超声清洗。将超声好的电极置于0.5 mol/L H2SO4 溶液中进行电化学处理循环扫描至稳定，以除去表面上的可能的杂质，随后用超纯水超声清洗，氮气吹干备用。采用方波伏安法，设置方波伏安法的参数，初始电位为-0.8 V，终止电位为2.5 V，电位增量为0.004V，振幅为0.025 V，频率为2 Hz，将洁净的金电极置于0.5 M H2SO4中反应；随后，其他参数不变，仅将方波伏安法的频率改为2000 Hz，将上述金电极置于0.5M H2SO4中反应一次，即制得纳米多孔金膜修饰金电极。具体步骤如下：
金电极（AuE）依次在1.0μm、0.3μm 和0.05 μm Al2O3粉末和水的混悬液打磨抛光至镜面，再先后用丙酮、无水乙醇、超纯水超声清洗。将超声好的金电极置于0.5 mol/L H2SO4 溶液中进行电化学处理循环扫描至稳定，以除去表面上的可能的杂质，随后用超纯水超声清洗，氮气吹干，得到预处理的AuE，电极表面呈现金黄色（图2中的A），扫描电镜图（图2中的D）与原子力显微镜图（图2中的G）可见电极界面存在划痕；当金电极在低频条件下（2Hz）经方波伏安法反应一次后，金电极表面颜色相比于裸金电极明显加深，呈现橙黄色（图2中的B）；扫描电镜下观察金电极表面出现了裂痕，且在裂痕下清晰可见规则的多孔结构（图2中的E），原子力显微镜图亦观察到电极界面出现相对均匀且规则的细小裂痕（图2中的H），与扫描电镜下观察的结果一致；在此基础上继续对电极进行高频（2000Hz）方波氧化还原一次，可见金电极表面的颜色由之前的橙黄色变为深棕色（图2中的C），且界面颜色均匀分布，扫描电镜下观察到电极表面确实形成均匀且规则的纳米多孔金结构（图2中的F），原子力显微镜图（图2中的I）亦与电镜结果图一致。通过对一步方波伏安处理及两步方波刻蚀后修饰金电极表面的X射线能谱图分析，可知一步法电极表面是以纳米金为主要成分（100.0%），且纳米金是单质Au(0)（图2中的J）；两步法刻蚀后，金电极表面的纳米金成分与低频处理方法所得的结果一致(金元素占100.0%)（图2中的K），这种现象主要源于制备过程中无外源性试剂导入电极界面，但在强度上与低频刻蚀相比，高频方波伏安处理后其能谱强度明显增加，即在电极界面上确实产生了更多的纳米量级的产物金，综合扫描电镜、原子力显微镜观察到的电极表面形貌上可视的多孔隙结构，表明经两步方波氧化还原法（即频率参数通过低频结合高频各一次的切换设置），金电极表面上成功形成均匀分布的纳米多孔金结构——纳米多孔金膜修饰金电极，该法简便、快速，尽可能减少电极的频繁刻蚀的损耗，可明显延长金电极的使用寿命，更好地遵循方波伏安法制备纳米多孔金绿色环保的宗旨。
（2）纳米多孔金膜修饰金电极在0.5 mol/L H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，为了便于比较，将裸金电极在相同条件下进行循环伏安法扫描。图3表明一步法（图3中的b）和两步法（图3中的c）的CV图均在1.10V附近出现金的氧化，在1.10V-1.50V正电位范围内有三个较裸金电极（图3中的a）强度更大且峰形更尖锐的氧化峰，且在0.9V电位附近出现的还原峰电流较裸金电极显著增大。仅经低频刻蚀的金电极还原峰电流值达182.6μA，为裸金电极（42.6μA）的4.3倍；而在低频基础上进一步进行高频处理的金电极还原峰电流达333.2μA，为裸金电极响应值的7.8倍。表明采用方波伏安法制备的纳米多孔金膜修饰金电极明显增大了电极表面积，可使界面组装上更多的捕获探针。
（3）取3 μL浓度为1μM巯基修饰的捕获探针(5'-SH -TTT TTA ACT ATA CAA CCTACT ACC TCA -3'，宝生生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）购得)，滴加到步骤（1）处理好的纳米多孔金膜修饰金电极表面，在室温下反应后，用Tris-HCL缓冲液清洗后用氮气吹干，接着在1.0 mM 6-巯基-1-己醇（MCH）水溶液中封闭，即可得到修饰有捕获探针和巯基己醇的ssDNA/MCH/NPG修饰电极，然后用Tris-HCL缓冲液清洗，氮气吹干；在ssDNA/MCH/NPG修饰电极表面滴5 μl含有不同浓度目标miRNA的柠檬酸钠缓冲溶液（20×SSC）中，37 ℃下反应，用0.1×SSC缓冲溶液冲洗电极，氮气吹干，得到RNA-DNA/MCH/NPG修饰电极；将上述得到的RNA-DNA/MCH/NPG修饰电极浸入新制的0.5 mM的硫堇的PBS溶液(pH 7.4，含0.1 M NaCl)中，富集30min，用PBS缓冲液冲洗干净，氮气吹干，在PBS缓冲溶液中扫描后记录DPV曲线。DPV扫描电位-0.6 V~-0.2 V，振幅0.05 V，脉冲宽度0.05 s，采样宽度0.0167 s，脉冲周期0.2 s，静置时间2 s，扫速100 mV/s；交流阻抗法（EIS）：频率范围为0.05 Hz-100 kHz ，每个操作步骤后界面在铁氰电对溶液（10 mM K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] (1:1)，含0.1 MKCl）中记录溶液中电阻(Ret)的变化，监测操作前后的电子传递阻抗行为的差异。具体步骤如下：
通过交流阻抗法监测裸电极与纳米多孔金膜修饰金电极构建的电化学生物传感器在每一步组装过程中传递电阻(Ret)的变化（见图4）。在组装过程中，[Fe(CN) 6]3-/4- 在裸电极和纳米多孔金膜修饰金电极表面的阻抗具有相近的趋势。裸金电极的Ret约为124Ω（图4中的A 曲线a）；当探针自组装到裸金电极电极表面时，由于带负电荷的巯基探针与带负电荷的铁氰电对溶液中的[Fe(CN) 6]3-/4-产生静电排斥，Ret从124Ω增加至5400Ω（图4中的 A曲线b）；当ssDNA探针与let-7a（从miRBase数据库中查找let-7a基因序列，选择其互补序列作为人工合成的探针使用，探针长度为27个碱基，捕获探针(5'-SH -TTT TTA ACT ATA CAACCT ACT ACC TCA -3'),目标microRNA序列(5'- UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U -3')杂交后，形成杂交双链，由于磷酸骨架带有负电荷，杂交后的负电荷量明显增加，进一步阻碍了电极表面电子的传递，从而使电阻明显增大，Ret增加至8427Ω（图4中的A 曲线c）。纳米多孔金膜修饰后的电极，与裸电极相比，低频（2Hz）处理后的金电极未见明显的半圆，几乎为一条直线（图4中的B 曲线a）；进一步进行2000 Hz刻蚀后，交流阻抗图依然近似为一条直线（图4中的B 曲线b），说明纳米多孔金膜修饰金电极的传质阻抗小，导电性能良好；当电极表面固定上ssDNA时，阻抗图中仍未出现半圆，这与裸金电极的阻抗响应具有显著的不同，这可能是纳米多孔金界面良好的导电性能与带负电荷的磷酸骨架对铁氰电对电子交换的斥力相比，前者占据优势，故高频区未见明显半圆，该现象亦证明所制备的纳米多孔金具有良好的促进电子转移的能力，即与裸金电极相比其导电性能明显提升；同法与互补序列杂交后Ret则明显增加，上升至662Ω（图4中的B 曲线d），符合杂交前后交流阻抗的变化规律。方波伏安法处理后的金电极表面积明显增加使在电极表面固定的核酸量增加，与此同时，多孔界面良好的导电性使得电子在界面上易于传质，对比图4中的A与图4中的B可看出，纳米多孔金膜修饰金电极上的Ret在每个步骤操作后均显著小于裸金电极，这表明该电化学传感器检测微小RNA的成功构建。
（4）通过差示脉冲伏安法（DPV）扫描，考察纳米多孔金膜修饰金电极构建生物传感器的选择性（见图5）。ssDNA探针分别与miRNA-21(曲线b)、LRP(曲线c)、miRNA-210(曲线d)、miRNA-155(曲线e)基因序列及目标miRNA let-7a(曲线f)序列杂交，与背景信号(曲线a)相比，非目标基因的∆I值均明显小于目标miRNA let-7a基因序列的∆I值（4.096 μA），结合插图中的柱状图响应差值对比，表明基于NPG电极构建的电化学生物传感器具有较好的选择性，对于不同的RNA序列具有良好的识别能力。
（5）通过循环伏安法（CV）扫描，考察温度对杂交效率的影响（见图6）。采用30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃和45 ℃作为杂交温度，对杂交信号的进行比较。由图6可得在37℃下杂交响应信号最大，且37 ℃为人体正常生理活动的最适温度，综合考虑，选取37 ℃作为let-7a检测的最优反应温度。
（6）利用差示伏安曲线方法对非小细胞肺癌耐药相关microRNAs中的let-7a进行定量检测，观察电流强度变化，进一步评估基于RNA-DNA/MCH/NPG修饰电极的检测性能（见图7）。随着互补链浓度的增加，其电流信号逐渐增大，在浓度范围5.0×10 -15~ 5.0×10 –13mol/L之间，电流信号与let-7a的浓度成呈良好的线性关系，相关的回归方程为ΔI p =0.02656C+1.083，r=0.9966，检测限为1.67×10 -15mol/L。表明基于NPG电极构建的电化学生物传感器能显著提高ssDNA探针在电极上的固定量，且纳米多孔金呈现良好的电催化效果，从而提高对互补microRNA序列识别的灵敏度。
本发明方法可推广应用于临床上各种基因诊断检测，为临床上快速诊断提供可能。且该技术具有所需检测操作过程简单、检测成本低廉、检测结果具有高度灵敏性及选择性等优点，有利于推广使用。

Claims (8)

1.一种基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于通过两步方波伏安法制备三维纳米多孔金（NPG）薄膜，构建电化学生物传感器，利用杂交前后硫堇分子电流强度的变化实现对目标基因序列microRNA的检测。
2.根据权利要求1所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于三维纳米多孔金的制备采用两步方波伏安法，且所述的目标基因序列为let-7a的完整序列，具有高度的时序性、保守性和特异性。
3.根据权利要求1或2所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，依序包括如下步骤：（1）金电极预处理；（2）纳米多孔金膜修饰金电极的制备；（3）捕获探针(5'-SH -TTT TTA ACT ATA CAACCT ACT ACC TCA -3')的自组装及与目标微小RNA杂交；（4）在电化学DNA杂交指示剂硫堇溶液中富集；（5）带有探针的纳米多孔金膜修饰金电极在PBS缓冲液中，通过杂交前后硫堇电流强度的变化可检测目标微小RNA。
4.根据权利要求3 所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于制备的纳米多孔金膜修饰金电极，具有大的比表面积、良好的DNA负载能力、高导电及电催化能力，增强了该传感器的灵敏度。
5.根据权利要求3 所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，单链DNA及DNA/RNA杂合体与硫堇分子结合的数量不同，根据杂交前后电流强度的差异检测目标微小RNA。
6.根据权利要求3 所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于金电极依次在1.0 μm、0.3 μm 和0.05 μm Al2O3粉末和水的混悬液打磨抛光至镜面，再先后用丙酮、无水乙醇、超纯水超声清洗；将超声好的金电极置于0.5 mol/L H2SO4 溶液中进行电化学处理循环扫描至稳定，以除去表面上的可能的杂质，随后用超纯水超声清洗，氮气吹干备用；采用方波伏安法，设置方波伏安法的参数，初始电位为-0.8 V，终止电位为 2.5 V，电位增量为0.004V，振幅为0.025 V，频率为2 Hz，将洁净的金电极置于0.5 M H2SO4中反应；随后，其他参数不变，仅将方波伏安法的频率改为2000 Hz，将上述金电极置于0.5 M H2SO4中反应一次，即制得纳米多孔金膜修饰金电极。
7.根据权利要求3 所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于取3 μL浓度为1μM巯基修饰的捕获探针滴加到已处理好的纳米多孔金膜修饰金电极表面，在室温下反应后，用Tris-HCL缓冲液清洗后用氮气吹干，接着在1.0 mM 6-巯基-1-己醇水溶液中封闭，即得到修饰有捕获探针和巯基己醇的ssDNA/MCH/NPG修饰电极，然后用Tris-HCL缓冲液清洗，氮气吹干；在ssDNA/MCH/NPG修饰电极表面滴5 μl含有不同浓度目标微小RNA的SSC缓冲溶液中，37 ℃下反应，用0.1×SSC缓冲溶液冲洗电极，氮气吹干，得到RNA-DNA/MCH/NPG修饰电极；将上述得到的RNA-DNA/MCH/NPG修饰电极浸入到新制的浓度为0.5 mM的含有硫堇的pH 7.4，含0.1M NaCl的 PBS溶液中，富集30min，用PBS缓冲液冲洗干净，氮气吹干，在PBS缓冲溶液中扫描后记录DPV曲线；DPV扫描电位-0.6 V~-0.2 V，振幅0.05 V，脉冲宽度0.05 s，采样宽度0.0167 s，脉冲周期0.2 s，静置时间2 s，扫速100 mV/s。
8.根据权利要求3 所述的基于两步方波伏安法制备纳米多孔金膜修饰金电极并用于非小细胞肺癌耐药相关微小RNA(let-7a)检测的方法，其特征在于利用差示伏安曲线方法对非小细胞肺癌耐药相关微小RNA中的let-7a进行定量检测，观察电流强度变化，进一步评估基于RNA-DNA/MCH/NPG修饰电极的检测性能，随着互补链浓度的增加，其电流信号逐渐增大，在浓度范围5.0×10 -15 ~5.0×10 –13 mol/L之间，电流信号与let-7a的浓度成呈良好的线性关系，检测限为1.67×10 -15 mol/L。
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KR20220123788A (ko) * 2021-03-02 2022-09-13 충북대학교 산학협력단 미세 전극 표면에 나노다공성 금 형성방법

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