CN110106232A - 基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法。杂交链式反应（HCR）是检测低浓度miRNA的有效方法，然而当前的HCR仍然受到诸多问题影响，如有限的扩增效率，复杂的设计等问题。我们提供了一种靶标催化的无酶和无标记双尾杂交链反应(DtHCR)，用于生物样品中miRNA‑21的超灵敏检测。该方法包含两个部分：靶目标催化发卡组装，形成双尾杂交的主干部分，然后辅助探针杂交形成支链部分。该方法包含两步信号放大过程，能够由单个靶标引发组装大量双尾杂交链，从而提供定位活细胞中单个靶分子的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感技术领域，特别涉及基于催化发卡组装和杂交链式反应放大的电化学生物传感器。
背景技术
MicroRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA。miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。例如，miRNA 在癌症的发生和发展过程中过表达，并且对治疗具有抗性。因此，miRNA可以作为预防，治疗，诊断癌症的潜在生物标志物和药物靶标。在活细胞中检测miRNA的数量对于了解miRNA的生物功能，识别癌细胞和评价药物效果有重要意义。然而，由于细胞中miRNA的数量极少和极其复杂的细胞环境，定性定量的检测miRNA仍然存在不少挑战。
到目前为止，科学家们提出了各种各样的分析方法来定性定量的检测miRNA，例如miRNA成像、聚合酶链式反应、滚环扩增、分子机器等等。这些方法或者通过扩增目标物，或者通过放大信号，均可对特定序列的目标miRNA进行超灵敏的检测。然而，miRNA在细胞中含量少，自身的碱基数量少，大量的同族RNA且易降解。因此，在使用上述方法时有一些无法克服的缺陷，例如灵敏度低、特异性低、需要复杂的精密仪器等。
其他的一些方法，比如等温扩增，可以有效的解决这些问题。根据信号扩增的机制，等温扩增可以主要分为两大类：核酸酶辅助反应和无酶反应。通常，核酸酶辅助的方法是通过不同的核酸酶引发，使目标循环回收，例如：核酸外切酶、核酸内切酶、聚合酶等等。由于酶对pH、温度等因素要求十分苛刻，故而无酶反应用于miRNA的扩增吸引了越来越多科学家的目光。对于无酶反应而言，具有代表性的为杂交链式反应(HCR)，催化发卡组装(CHA)和熵驱动催（使得动力学控制的DNA模块组装的编程成为可能）。这种等温无酶放大的明显优点是操作简单，检测迅速，高灵敏度，高特异性，低成本。因此，该方法十分适合高灵敏度的电化学传感器。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法和应用。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器制备方法，包含以下步骤：
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为2mm的金电极至镜面，超纯水冲洗干净；
（2）取8μL、1μM的H2固定液滴加到电极表面，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（3）取8μL、2mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，盖上电极帽，室温孵育1.5h，封闭电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（4）取10μL含有目标miRNA和1μΜ H1的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得的电极上，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干。
（5）取10μL含有四种辅助探针各1μΜ的杂交缓冲液滴加在步骤（4）所得的电极上，盖上电极帽，室温孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（6）将含有50μΜ六氨合钌的电化学检测液通氮气，20min；
（7）步骤（5）所得的电极置于步骤（6）所得的电化学检测液中，浸泡1h，使六氨合钌吸附在DNA双链上。
（8）步骤（7）所得的电极置于电化学检测液中，电化学工作站在-0.6~0.1电势范围内用差分脉冲伏安法扫描。
步骤（1）的具体方法为；
将金电极置于新鲜配制的Piranha溶液（浓硫酸与30%双氧水按体积比3:1混合制得）浸泡30 min，随后用超纯水将金电极表面清洗干净。先后用0.3μm 和0.05 μm的氧化铝粉末将金电极表面抛光至镜面。将抛光后的金电极先后置于乙醇和超纯水中，分别超声清洗2min，以彻底清除电极表面可能附着的氧化铝粉末。将金电极置于新鲜配制的0.5 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，扫描电位范围-0.6~0.1 V，扫速0.1 V/s。持续扫描，直至获得稳定的循环伏安曲线。用大量超纯水再次冲洗已完成预处理的金电极，用氮气吹干电极。
H2固定液的制备：包含10 mM Tris-HCl 缓冲液， 1 mM EDTA，500 mM NaCl，10 mMTCEP，超纯水，调节pH= 7.4，1μM H2。在金属浴中加热至95℃，保持5min，避光缓慢降至室温，使H2形成发卡结构；
杂交缓冲液的制备：包含10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA ，500 mM NaCl， 1 mM MgCl2,超纯水，调节pH =7.4，加入1μM H1、目标miRNA；
巯基己醇溶液的制备：取巯基己醇加至超纯水中，制成2mM的巯基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用；
六氨合钌的电化学检测液为：50mM 六氨合钌，10mM Tris-HCl，pH 7 .4。
电化学工作站为CHI 660C，采用三电极系统，工作电极是金电极，对电极是铂丝电极，参比电极是银/氯化银电极；
冲洗电极所用缓冲液为pH 7.4 10mM的Tris-HCl缓冲液。
该传感器由以下碱基序列自组装形成。
步骤（4）所述H1序列为GGCGGCTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTCCATGTGTAGATAGCTTATCA GACT；
步骤（2）H2序列为HS-(CH2)6-TCAGTGATAAGCTATCTACACATGGACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGT CCATGTGTAGA；
步骤（5）所述的四种辅助探针：
辅助探针1序列为ACTAAAAGGGTCTGAGGG TCTACACATGG ACATGG；
辅助探针1*序列为CCCTCAGACCCTTTTAGTCCATGT CCATGTGTAGA；
辅助探针2序列为GATGTTGAGCCGCCTACACCCCCACCTGC；
辅助探针2*序列为GGCGGCTCAACATCGCAGGTGGGGGTGTA；
目标miRNA序列为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
所述的制备方法制备的电化学生物传感器用于miRNA-21的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，所准备电极为工作电极，铂电极为对电
极，银/氯化银为参比电极；
（2）用差分脉冲伏安法对miRNA-21进行检测，电压范围-0.6-0.1V，扫速0.1 V/s ；
本发明所用试剂均市售可得；
本发明适用于所有肿瘤细胞中miRNA-21表达上调的检测。
本发明的有益效果：
（1）构建了基于双尾杂交信号放大型超灵敏检测方法，产生强电化学信号，构建过程简单快速，无需标记且不需要任何酶参与。
（2）该生物传感器体现出优异的灵敏度，选择性，能够检测出低至1am的目标物浓度。
（3）该生物传感器能够由单个靶标引发组装大量双尾杂交链，从而提供定位活细胞中单个靶分子的潜力。
附图说明
图1为本发明的构建流程示意图。
图2为实施例1中不同浓度目标物的电流响应。
图3为卵巢癌患者与健康志愿者实际血清样品中的miRNA-21含量检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1，一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器用于测定溶液中不同浓度的目标物miRNA-21，得到传感器的电流响应标准工作曲线。
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为2mm的金电极至镜面，超纯水冲洗干净；
（2）取8μL、1μM的H2固定液滴加到电极表面，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（3）取8μL、2mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，盖上电极帽，室温孵育1.5h，封闭电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（4）取10μL含有1aM-10fM miRNA-21和1μΜ H1的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得的电极上，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干。
（5）取10μL含有四种辅助探针各1μΜ的杂交缓冲液滴加在步骤（4）所得的电极上，盖上电极帽，室温孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（6）将含有50μΜ六氨合钌的电化学检测液通氮气，20min；
（7）步骤（5）所得的电极置于步骤（6）所得的电化学检测液中，浸泡1h，使六氨合钌吸附在DNA双链上。
（8）步骤（7）所得的电极置于电化学检测液中，电化学工作站在-0.6~0.1电势范围内用差分脉冲伏安法扫描。
步骤（1）的具体方法为；
将金电极置于新鲜配制的Piranha溶液浸泡30 min，Piranha溶液由浓硫酸与30wt.%双氧水按体积比3:1混合制得，随后用超纯水将金电极表面清洗干净。先后用0.3μm 和0.05 μm的氧化铝粉末将金电极表面抛光至镜面。将抛光后的金电极先后置于乙醇和超纯水中，分别超声清洗2 min，以彻底清除电极表面可能附着的氧化铝粉末。将金电极置于新鲜配制的0.5 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，扫描电位范围-0.6~0.1 V，扫速0.1 V/s。持续扫描，直至获得稳定的循环伏安曲线。用大量超纯水再次冲洗已完成预处理的金电极，用氮气吹干电极。
H2固定液的制备：包含10 mM Tris-HCl 缓冲液， 1 mM EDTA，500 mM NaCl，10 mMTCEP, 超纯水，调节pH= 7.4，1μM H2。在金属浴中加热至95℃，保持5min，避光缓慢降至室温，使H2形成发卡结构；
杂交缓冲液的制备：包含10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA ，500 mM NaCl， 1 mM MgCl2,超纯水，调节pH =7.4。加入1μM的H1、目标序列miRNA-21；
巯基己醇溶液的制备：取巯基己醇加至超纯水中，制成2mM的巯基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用；
六氨合钌的电化学检测液为：50mM 六氨合钌，10mM Tris-HCl，pH 7 .4。
电化学工作站为CHI 660C，采用三电极系统，工作电极是金电极，对电极是铂丝电极，参比电极是银/氯化银电极；
冲洗电极所用缓冲液为pH 7 .4 10mM的Tris-HCl缓冲液。
该传感器由以下碱基序列自组装形成。
步骤（4）所述H1序列为GGCGGCTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTCCATGTGTAGATAGCTTATCA GACT；
步骤（2）H2序列为HS-(CH2)6-TCAGTGATAAGCTATCTACACATGGACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGT CCATGTGTAGA；
步骤（5）所述的四种辅助探针：
辅助探针1序列为ACTAAAAGGGTCTGAGGG TCTACACATGG ACATGG；
辅助探针1*序列为CCCTCAGACCCTTTTAGTCCATGT CCATGTGTAGA；
辅助探针2序列为GATGTTGAGCCGCCTACACCCCCACCTGC；
辅助探针2*序列为GGCGGCTCAACATCGCAGGTGGGGGTGTA；
miRNA-21序列为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
测定结果如图2所示，在1aM-10fM范围内，随着目标物浓度的增大，电化学信号增强，电流响应值增大。
实施例2，一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器应用于实际血清样品中的miRNA-21含量检测
（1）按本发明所述制备方法构建电化学生物传感器，使用电化学工作站三电极体系进行测试，银/氯化银为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的传感器为工作电极，在血清样品中进行检测。
（2）用差分脉冲伏安法对上述血清样品进行检测，电势范围-0 .6~0 .2。
（3）测定结果如图3所示，患病者血清中miRNA-21的表达明显高于正常人。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法
<130> 7
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcggctcaa catcagtctg ataagctacc atgtccatgt gtagatagct tatcagact 59
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcagtgataa gctatctaca catggacatg gtagcttatc agactccatg tccatgtgta 60
ga 62
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actaaaaggg tctgagggtc tacacatgga catgg 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccctcagacc cttttagtcc atgtccatgt gtaga 35
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatgttgagc cgcctacacc cccacctgc 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcggctcaa catcgcaggt gggggtgta 29
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
uagcuuauca gacugauguu ga 22
Claims (6)
1.一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器的制备方法，其特征在于；包含以下步骤：
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为2mm的金电极至镜面，超纯水冲洗干净；
（2）取8μL、1μM的H2固定液滴加到电极表面，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（3）取8μL、2mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，盖上电极帽，室温孵育1.5h，封闭电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（4）取10μL含有目标miRNA和1μΜ H1的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得的电极上，盖上电极帽，室温下孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（5）取10μL含有四种辅助探针各1μΜ的杂交缓冲液滴加在步骤（4）所得的电极上，盖上电极帽，室温孵育2h，超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；
（6）将含有50μΜ六氨合钌的电化学检测液通氮气，20min；
（7）步骤（5）所得的电极置于步骤（6）所得的电化学检测液中，浸泡1h，使六氨合钌吸附在DNA双链上；
（8）步骤（7）所得的电极置于电化学检测液中，电化学工作站在-0.6~0.1电势范围内用差分脉冲伏安法扫描。
2.根据权利要求1所述的一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤（1）的具体方法为；
将金电极置于新鲜配制的Piranha溶液浸泡30 min，Piranha溶液由浓硫酸与30wt.%双氧水按体积比3:1混合制得，随后用超纯水将金电极表面清洗干净；先后用0.3μm 和0.05 μm的氧化铝粉末将金电极表面抛光至镜面；将抛光后的金电极先后置于乙醇和超纯水中，分别超声清洗2 min，以彻底清除电极表面可能附着的氧化铝粉末；将金电极置于新鲜配制的0.5 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，扫描电位范围-0.6~0.1 V，扫速0.1 V/s，持续扫描，直至获得稳定的循环伏安曲线，用超纯水再次冲洗已完成预处理的金电极，用氮气吹干电极。
3.根据权利要求1所述的一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器的制备方法，其特征在于：
步骤（4）所述H1序列为GGCGGCTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTCCATGTGTAGATAGCTTATCA GACT；
步骤（2）H2序列为HS-(CH2)6-TCAGTGATAAGCTATCTACACATGGACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGT CCATGTGTAGA；
步骤（5）所述的四种辅助探针：
辅助探针1序列为ACTAAAAGGGTCTGAGGG TCTACACATGG ACATGG；
辅助探针1*序列为CCCTCAGACCCTTTTAGTCCATGT CCATGTGTAGA；
辅助探针2序列为GATGTTGAGCCGCCTACACCCCCACCTGC；
辅助探针2*序列为GGCGGCTCAACATCGCAGGTGGGGGTGTA；
目标miRNA序列为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
4.根据权利要求1所述的一种基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器的制备方法，其特征在于：
（1）H2固定液的制备：包含10 mM Tris-HCl 缓冲液， 1 mM EDTA，500 mM NaCl，10 mMTCEP，超纯水，调节pH= 7.4，1μM H2，在金属浴中加热至95℃，保持5min，避光缓慢降至室温，使H2形成发卡结构；
（2）H1的杂交缓冲液的制备：包含10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA ，500 mM NaCl， 1 mMMgCl2，超纯水，调节pH =7.4，加入1μΜ H1、目标miRNA；
（3）巯基己醇溶液的制备：取巯基己醇加至超纯水中，制成2mM的巯基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用；
（4）六氨合钌的电化学检测液为：50mM 六氨合钌，10mM Tris-HCl，pH 7 .4。
5.如权利要求1所述方法制备获得的电化学生物传感器。
6.如权利要求5所述电化学生物传感器用于miRNA-21的检测。
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