CN114350751B - 一种基于交联网络结构的cha-phcr检测系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于交联网络结构的CHA‑PHCR检测系统及其应用。所述检测系统包括发卡探针H1、发卡探针H2、回文发卡探针f‑PH1和回文发卡探针f‑PH2。所述检测系统具有以下特点：可定量检测目标miRNA且检测限低至10 pM；特异性高，共存的非目标miRNA和其他生物大分子不干扰信号转导；适用于通过荧光成像筛选活细胞中不同表达水平的miRNA‑21；基于回文的交联组装可以将组装的纳米结构在细胞内稳定性提高至少5倍；对其他miRNA检测的通用性好；可准确区分癌细胞和健康细胞。由于DNA的可编程性，该检测系统可仅通过改变目标识别区域来对其他miRNA进行成像，应用前景好。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统及其应用。
背景技术
MicroRNA (miRNA) 是小的非编码内源性RNA分子，通过调节基因表达，如细胞增殖、分化、凋亡和死亡，在调节许多生物过程中发挥着至关重要的作用。各种人类疾病，包括癌症、神经系统疾病通常与miRNA表达紊乱有关。据报道miRNA-21在许多癌症中具有异常表达谱，如肺癌、乳腺癌、胰腺癌、慢性淋巴细胞白血病、肝癌、宫颈癌、乳腺癌和前列腺癌。近年来，miRNA 已成为各种癌症早期诊断的新型生物标志物。然而，由于小尺寸、低含量以及和家族成员之间的高序列同源性，在正常溶液中，特别是在活细胞中高度特异性和灵敏地检测miRNA仍然是一个巨大的挑战。因此，迫切需要开发一种用于miRNA定量检测的准确、可靠和抗降解的探针。
迄今为止，已经报道了许多成熟的方法来检测miRNA。Northern印迹杂交是一种常用的miRNA检测技术，具有更高的灵敏度。然而，这种方法消耗大量样品和时间、灵敏度一般、重现性低，限制了其广泛的应用。基于微阵列的检测方法可以实现miRNA的高通量测量，但只能实现半定量分析，且检测成本相对较高。实时定量PCR (RT-PCR) 被称为miRNA检测的金标准，具有非常高的检测灵敏度。然而，由于miRNA的长度较短，很难设计PCR扩增引物。此外，这些检测系统不适合miRNA的细胞内成像。固有的缺点直接限制了它们在医学和生物领域的广泛应用。
近年来，一些基于核酸介导等温信号放大技术的检测系统越来越受到研究人员的关注，如环介导等温扩增技术（LAMP）、EXO III辅助靶循环扩增技术、指数扩增技术(EXPAR)、链置换扩增技术（SDA）和滚环扩增技术（RCA）。然而，酶辅助信号扩增过程中涉及的外源酶增加了检测成本并需要特异性反应条件，这极大地限制了它们在某些情况下的进一步应用。作为酶促扩增的潜在替代方案，基于非酶促核酸的信号扩增技术为复杂环境中miRNA的灵敏检测提供了新线索。例如，基于分子信标的自组装的催化发夹组装（CHA）和杂交链反应（HCR），通常用于检测各种生物活性分子。此外，回文介导的交联最近应用于生物传感和生物成像。
结合CHA和HCR技术，本发明展示了一种用于miRNA-21扩增检测的回文介导的交联纳米结构的非酶促自组装的CHA-PHCR检测系统。该检测系统由一对无标记发夹探针（H1和H2）和一对分别用Cy3和Cy5基团修饰的回文发夹探针（f-PH1和f-PH2）组成。H1和H2在miRNA-21的刺激下触发CHA反应，而f-PH1和f-PH2被设计参与后续的杂交链反应，进而实现FRET信号输出。少量miRNA-21可以通过激活CHA过程释放出许多H2的粘性末端，每个末端都特异性地启动回文介导的杂交链反应（PHCR）反应，从而实现miRNA-21的高灵敏检测。CHA-PHCR检测系统适用于细胞内miRNA的成像，因此可用于区分癌细胞和健康细胞，在生物分析和疾病诊断中具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先提供了一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统，所述检测系统仅包括4条发卡探针（发卡探针H1、发卡探针H2、回文发卡探针f-PH1和回文发卡探针f-PH2）；
其中，所述发卡探针H1为：5’-ATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’；
所述发卡探针H2为：5’-CTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGAT-3’；
所述回文发卡探针f-PH1为：5’-GGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATG/Cy3/GTAGGATCAGACTGATGTTGATACCTGCTTTTgatcgatc-3’；
所述回文发卡探针f-PH2：5’- ccgtacggTTTATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATCCTACC/Cy5/-3’。
本发明还提供了上述一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统的构建方法，包括以下步骤：
（1）将四种发夹探针（H1、H2、f-PH1和f-PH2）在5.2 μL的 1×TAE/Mg2+ 缓冲液中混合，得到探针混合液；
（2）向步骤1）所得探针混合液中加入靶标miRNA，在37℃下孵育3 h，触发催化发夹组装反应和基于回文的杂交链反应。
进一步的，上述探针混合液中四条发卡探针(H1:H2:f-PH1:f-PH2)的摩尔比为1:1:10:40。
本发明还提供了上述一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统在检测活细胞内miRNA-21中的应用。
本发明还提供了一种由上述基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统改造而来的通用型CHA-PHCR检测系统，所述通用型CHA-PHCR检测系统为针对检测目标改变目标结合的发卡探针的序列所得。
进一步的，上述一种通用型CHA-PHCR检测系统为针对miRNA-31目标改变发卡探针的目标结合域序列所得；改变后的发卡探针的序列为：
H1-31：5’-GATGCTGGCATAGCTTACCTGCTCCATCCAGCTATGCCAGCATCTTGCCT-3’；
H2-31：5’-TGGCATAGCTTACCTGCTCCATCCAGGCAAGATGCTGGCATAGCTGGATGGAGCAGGTAAGCTATGCCAGCATCT-3’；
f-PH1-31：5’-GGATGGAGCAGGTAAGCTATGCCAGCATCTG/Cy3/GTAGGAGATGCTGGCATAGCTTACCTGCTTTTgatcgatc-3’；
f-PH2-31：5’-ccgtacggTTTAGATGCTGGCATAGCTTACCTGCTCCATCCAGCAGGTAAGCTATGCCAGCATCTCCTACC/Cy5/-3’。
本发明还提供了上述一种通用型CHA-PHCR检测系统在检测活细胞内miRNA-31中的应用。
本发明还提供了一种由上述基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统改造而来的单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统，所述单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统的信号输出仅通过一条回文发卡链的荧光释放。
进一步的，上述一种单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统为针对miRNA-21检测目标改变信号输出方式的序列所得；改变后的发卡探针的序列为：
PH1：5’-GGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATGGTAGGATCAGACTGATGTTGATACCTGCTTTTgatcgatc-3’；
FB-PH2：5’-ccgtacggTTTATCAGACTGATGT/BHQ1/TGATACCTGCTCCATCCAGCAGGTATCAA/FAM/CATCAGTCTGATCCTACC-3’。
本发明还提供了上述一种单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统在检测miRNA-21中的应用。
本发明的发明原理如下：
基于CHA-PHCR的非酶促自组装检测系统的工作原理如图1A所示。 H1被设计成具有发夹结构并识别miRNA-21或miRNA-21的DNA类似物(靶标-21)，形成靶标-21/H1双链体。H2 可以通过立足点介导的链置换反应从靶标-21/H1 双链体中置换杂交的靶标-21。在靶标-21刺激下，H1和H2可以触发CHA过程。另外两个发夹探针，f-PH1和f-PH2，分别用Cy3和Cy5荧光团修饰。f-PH1 的3'端和f-PH2的5'端分别包含8个碱基的回文结构域。f-PH1和f-PH2探针能够在触发分子的存在下执行 PHCR 反应。此外，位于H1和H2 探针5' 端的DNA片段与 f-PH1 部分互补，从而实现 CHA 和 PHCR 组装过程的结合。具体来说，在靶标-21存在的情况下，H1首先被打开，形成DNA双链体（靶标-21/H1）并释放出一个长粘性末端。随后，由于H2与H1杂交，靶标-21 被H2取代并启动下一个杂交/链置换循环，形成具有部分不同粘性末端的H1/H2双链体并有助于CHA扩增。接下来，H1/H2双链体的重新释放的粘性末端杂交并打开f-PH1。然后，f-PH1释放的3'末端通过立足点介导的链置换打开 f-PH2，并重新释放f-PH2 的粘性末端。基于类似的分子机制，打开的f-PH2依次与另一个f-PH1杂交。f-PH1和f-PH2之间的杂交/发夹打开反应在循环过程中重复进行，产生具有切口的DNA纳米线，它们在纵向上交替平行排列。回文末端可以相互作用，实现相邻DNA纳米线之间的横向交联组装，最终形成交联网状纳米结构。基于回文片段之间的相互作用，该过程称为PHCR反应，全过程被命名为CHA-PHCR。交联网状结构产物组装后，分别标记在f-PH1和f-PH2探针上的Cy3和Cy5荧光团之间的空间距离大大缩短，从而发生从Cy3供体到Cy5受体的荧光共振能量转移（FRET），产生 FRET信号。由于CHA与PHCR的结合，靶标-21诱导的FRET信号被有效放大，大大提高了检测灵敏度。由于包括 CHA 和 PHCR 在内的整个 FRET 信号转导过程是自主的、等温的和非酶促的，并且交联网状结构产物对核酸酶降解具有增强的抵抗能力，因此所提出的检测系统适用于细胞内miRNA的成像检测。如图1B所示，一旦发夹探针被转染到靶细胞中，CHA-PHCR反应就会被miRNA-21激活，从而无需其他辅助探针即可在活细胞内组装交联网状结构产物。结果，f-PH1和f-PH2的荧光基团相互靠近，产生FRET信号。FRET信号可以通过激光共聚焦显微镜检测，实现目标miRNA的成像检测。
本发明的优点在于：
本发明所提供的一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统具有以下几个优点：（1）本发明中的非酶促自组装过程简单，而且使用样品较少，最终产物的基本构建块仅涉及两条主要DNA探针。（2）本发明基于CHA-PHCR的信号放大方案，其中回文介导的交联网络状纳米结构的非酶促自组装表现出显着增强的核酸酶抗性。（3）CHA过程可以有效地放大目标信号，回文介导的非酶促自组装显着提高了检测灵敏度和线性响应范围，检测限低至10pM。由于组装产物的长期稳定性，回文介导的非酶促自组装有利于 FRET 信号的有效积累。（4） CHA-PHCR检测系统可用于特异性检测目标miRNA，不受非目标miRNA和样品中共存的其他生物分子的干扰。（5）本发明能够将癌细胞与健康细胞区分开来，并且可以依据目标miRNA的不同表达水平筛选出不同类型细胞及癌细胞发展的不同时期。（6）CHA-PHCR 检测系统表现出令人满意的通用性，并且可以通过改变探针的碱基序列来检测其他 miRNA。这些优势使得 CHA-PHCR检测系统成为一种很有前途的用于生物分析和疾病诊断的工具。
附图说明
图1：CHA-PHCR检测系统的工作原理示意图。(A)目标miRNA在体外试管成像检测示意图。(B)目标miRNA在活细胞内成像检测示意图。
图2：基于双扩增循环过程产生的回文介导的交联网络结构的表征及CHA-PHCR 系统用于 miRNA-21扩增检测的可行性分析。 (A) 在靶标-21存在下对CHA-PHCR系统进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。泳道1：H1探针；泳道2：H2探针；泳道3：H1探针和 H2探针的混合物；泳道4：H1探针，H2探针和靶标-21的混合物；泳道5：无荧光f-PH1探针；泳道6：无荧光f-PH2探针；泳道7：无荧光f-PH1探针和无荧光f-PH2探针的混合物；泳道8：H1 探针，H2探针，无荧光f-PH1探针和无荧光f-PH2探针的混合物；泳道9：H1探针，H2探针，无荧光f-PH1探针，无荧光f-PH2探针和靶标-21的混合物。(B)在存在靶标-21的情况下，在CHA-PHCR系统中形成的交联网络状纳米结构的原子力显微镜表征，下方为原子力图中直线的横截面分析图。(C)在有无靶标-21存在的情况下CHA-PHCR系统的荧光光谱。(D) 对应于图C中描述的样品的归一化荧光光谱，相对荧光强度通过将给定波长的发射荧光强度除以568 nm处的荧光强度获得。在 670 nm处发现最高荧光比被定义为FRET信号。
图3：CHA-PHCR系统的检测性能及检测特异性。(A) 在不同浓度的靶标存在下，CHA-PHCR检测系统的归一化荧光光谱。 (B) FRET信号与靶标浓度之间的动态响应关系，靶标浓度范围从0到10 nM，并附有线性回归方程。(C) 在存在靶标或非靶标序列的情况下，CHA-PHCR检测系统的归一化荧光光谱。(D) 由图C记录的670 nm处的FRET信号强度。空白组没有任何分析物。CHA-PHCR检测系统由H1 (10 nM)、H2 (10 nM)、f-PH1 (100 nM)和f-PH2(400 nM) 组成。
图4：回文交联的网状纳米结构抵抗胎牛血清(FBS)降解的能力。(A)在10% FBS溶液中孵育不同时间后，在靶标-21刺激下形成的交联网状结构产物的凝胶电泳分析。a：CHA-PHCR 检测系统（40 nM靶标-21、100 nM H1、100 nM H2、1 μM无荧光f-PH1和4 μM无荧光f-PH2）；b：无回文介导的交联反应对应的CHA-HCR检测系统（40 nM靶标-21、100 nM H1、100nM H2、1 μM NPH1和4 μM NPH2）；c：与样品a相同，但不含靶标-21；d：5.2 μM H1；e：5.2 μMH2；f：5.2 μM无荧光f-PH1；g：5.2 μM无荧光f-PH2。(B) 图A中凝胶条带中残留 DNA的定量分析。
图5：具有不同 miRNA-21 表达水平的不同细胞系的共聚焦成像。CHA-PHCR检测系统由H1 (10 nM)、H2 (10 nM)、f-PH1 (100 nM) 和 f-PH2 (400 nM)组成。CHA-PHCR检测系统分别和MCF-7（人乳腺癌细胞）、HeLa（人宫颈癌细胞）和L02细胞（人正常肝细胞）孵育4小时后进行共聚焦成像。
图6：CHA-PHCR检测系统的通用性分析。(A) 在有无靶标-31存在的情况下，通用型CHA-PHCR检测系统的归一化荧光光谱。(B)用新构建的CHA-PHCR检测系统处理的 miRNA-31高表达的HeLa 细胞和 miRNA-31低表达的L02 细胞的共聚焦显微镜成像。
图7：单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统的可行性分析。(A)在目标miRNA刺激下，通过双扩增循环过程进行回文介导的交联网络状结构非酶促自组装，从而将单荧光信号释放的示意图。(B)基于交联网络结构的单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统的可行性分析，在有无靶标-21存在的情况下，荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统的荧光光谱。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统的构建方法，包括以下步骤：
四种发夹探针（2 μL 1 μM的H1、2 μL 1 μM的H2、2 μL 10 μM的f-PH1和8 μL 10 μM的f-PH2）在5.2 μL的1×TAE/Mg2+缓冲液中混合，得到探针混合液，该体系中四条发卡探针(H1:H2:f-PH1:f-PH2)的摩尔比为1:1:10:40。
其中，所述检测系统的发卡探针如下：
催化发夹组装 (CHA)技术中所用探针：
H1：5’-ATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’；
H2：5’-CTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGAT-3’；
回文介导的杂交链反应 (PHCR)所用探针：
f-PH1：5’-GGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATG/Cy3/GTAGGATCAGACTGATGTTGATACCTGCTTTTgatcgatc-3’；
f-PH2：5’-ccgtacggTTTATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATCCTACC/Cy5/-3’。
实施例2一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统用于体外miRNA检测的可行性分析
使用实施例1的方法构建的CHA-PHCR检测系统，以miRNA-21对应的DNA目标探针进行可行性分析。
所使用的miRNA-21目标探针序列为靶标-21：5’-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’。
可行性分析具体步骤如下：
首先对非酶促自组装产物进行表征：四种发夹探针（2 μL 1 μM的H1、2 μL 1 μM的H2、2 μL 10 μM的无荧光的f-PH1和 8 μL 10 μM的无荧光的f-PH2）在5.2 μL的1×TAE/Mg2+缓冲液中混合，得到探针混合液。然后向探针混合液中加入0.8 μL 1 μM的靶标-21探针，在37℃下孵育3 h，触发CHA-PHCR反应。目标探针触发的自组装产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和原子力显微镜进行表征。其次验证CHA-PHCR检测系统的检测可行性，在探针混合液中加入靶标-21（0.8 μL，1 μM）或相同体积的1×TAE/Mg2+缓冲液，在37℃下孵育3小时。对照组为H1 (2 μL,1 μM)+H2 (2 μL,1 μM) +f-PH1 (2 μL,10 μM) 或H1 (2 μL,1 μM)+H2 (2 μL,1μM) +f-PH2 (8 μL,10 μM)。 在荧光测量前，用 1×TAE/Mg2+缓冲液将反应体系总体积调节至200 μL。激发波长设置为525 nm，并记录540～750 nm的荧光发射光谱。
图2A为在靶标-21存在的情况下，CHA-PHCR检测系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。泳道 1：H1探针；泳道 2：H2探针；泳道 3：H1探针和 H2探针的混合物；泳道 4：H1探针，H2探针和靶标-21的混合物；泳道 5：无荧光f-PH1探针；泳道 6：无荧光f-PH2探针；泳道 7：无荧光f-PH1探针和 无荧光f-PH2探针的混合物；泳道 8：H1 探针，H2探针，无荧光f-PH1探针和无荧光f-PH2探针的混合物；泳道 9：H1 探针，H2探针，无荧光f-PH1探针，无荧光f-PH2探针和靶标-21的混合物。从图中可看出，泳道4中H1和 H2条带的消失和新的低迁移率条带的出现表明靶标触发了CHA 反应，形成了DNA双链体 (H1/H2)；与第5、6、7泳道相比，第8泳道的条带迁移率没有变化，表明CHA-PHCR系统中PH1和PH2的结构没有被破坏；在泳道9中，单条探针的条带消失，出现了一条凝胶迁移率极低的主条带，表明靶标触发了CHA-PHCR反应，最终形成交联网络结构。
图2B为在靶标-21存在的情况下，在CHA-PHCR系统中形成的交联网络状结构的原子力显微镜表征，图2B中下方的为原子力图中直线的横截面分析图。原子力图分析显示最终组装产物由许多纳米线组成，平均宽度为 19.25 nm，平均高度为 2.04 nm；不同纳米线之间存在回文介导的交联作用，形成网络状结构。
图2C为在有无靶标-21存在下，CHA-PHCR检测系统的荧光光谱分析。图2D为对应于图C 中所描述样品的归一化荧光光谱。实验结果表明，在没有靶标的情况下不会产生FRET信号，当CHA-PHCR检测系统中存在靶标时，供体基团Cy3的荧光峰显着降低，受体基团Cy5的荧光峰显着增强，实现了理想的FRET信号输出，表明本发明的miRNA检测可行性。
实施例3 基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统对目标DNA探针检测能力分析
使用实施例1的方法构建基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统，通过加入不同浓度的miRNA-21目标探针，然后使用荧光光谱仪对其动力学进行测试。具体步骤如下：
四种发夹探针（2 μL 1 μM的H1、2 μL 1 μM的H2、2 μL 10 μM的f-PH1和8 μL 10 μM的f-PH2）在5.2 μL的1×TAE/Mg2+缓冲液中混合，得到探针混合液。然后向探针混合液中加入不同浓度的靶标-21探针（0~10 nM），在37℃下孵育3 h，触发CHA-PHCR反应。在荧光测量前，用1×TAE/Mg2+缓冲液将反应体系总体积调节至200 μL。激发波长设置为525 nm，并记录540～750 nm的荧光发射光谱。
图3A为CHA-PHCR检测系统对目标DNA探针检测能力分析实验。图3A展示了在不同浓度的miRNA-21目标探针下，CHA-PHCR检测系统中FRET信号随着孵育时间的增加而增加，高浓度靶标诱导的信号严重重叠，表明CHA-PHCR反应达到平衡。结果表明，该检测系统的检测限为10 pM。
实施例4 CHA-PHCR检测系统对目标DNA探针特异性能力分析
使用实施例1的方法构建基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统，通过加入不同的目标探针，然后使用荧光光谱仪对其荧光强度进行测量。所使用的探针如下：
错配目标1：5’-TAGCTTATgAGACTGATGTTGA-3’；
错配目标2：5’-TAGCTTATCAcACTcATGTTGA-3’；
错配目标3：5’-TAGCgTATaAGACTgATGTTGA-3’；
miR-125b目标：5’-TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA-3’；
Let-7a目标：5’-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3’；
miR-200c目标：5’-TAATACTGCCGGGTAATGATGGA-3’；
Let-7c目标：5’-TGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3’；
具体步骤如下：对于特异性测试，将相同浓度的miRNA-21目标探针、错配目标1、错配目标2、错配目标3、miR-125b目标、Let-7a目标、miR-200c目标、Let-7c目标（每种探针终浓度均为4 nM）分别加入到探针混合液中。然后在37℃下孵育3 小时，随后用1×TAE/Mg2+缓冲液将反应体系总体积调节至200 μL。激发波长设置为525 nm，并记录540～750 nm的荧光发射光谱。
图3B为CHA-PHCR检测系统对目标DNA探针特异性能力分析结果。使用错配目标1、错配目标2、错配目标3、miR-125b目标、Let-7a目标、miR-200c目标、Let-7c目标作为对照，探索CHA-PHCR检测系统对miRNA-21目标探针的检测特异性。如图3B所示，在相同浓度下，靶标-21诱导的荧光信号远高于非目标miRNA。另外还检测了几种包含1、2 或3个错配碱基的突变DNA分析物，除错配目标1外，其他分析物均未观察到明显的FRET信号。结果发现，与靶标-21相比，错配一个碱基诱导的信号仅为31%。表明该检测系统对靶标-21具有高检测特异性。
实施例5 CHA-PHCR检测系统的稳定性分析
使用实施例1的方法构建CHA-PHCR检测系统，通过将CHA-PHCR检测系统与体积分数10% FBS共同孵育不同时间点，然后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳对其稳定性进行评估。
具体步骤如下：
稳定性评估：为了探索该检测体系在胎牛血清中的稳定性，将该检测体系的混合溶液 (18 μL) 与2 μL体积分数10% 的FBS混合并孵育不同的时间段（0 小时、2 小时、4 小时、8 小时、12 小时和 24 小时）。 之后，取8 μL反应样品与2 μL 6 ×上样缓冲液和2 μL10 × SYBR Green I混合进行凝胶电泳分析。对照样品也使用相同的实验步骤，其中对照样品中使用的探针序列如下：
H1：5’-ATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’；
H2：5’-CTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGAT-3’；
无回文发卡探针 1 (NPH1)：5’-GGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATGGTAGGATCAGACTGATGTTGATACCTGCT-3’；
无回文发卡探针2（NPH2）：5’-ATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATCCTACC-3’。
如图4所示，孵育24小时后，在存在靶标-21的情况下，CHA-PHCR系统的残留探针超过 90%（a 组）。如果去除末端回文（对应于CHA-HCR检测系统），探针的残留量减少到约30%（b 组），表明基于回文介导的交联组装产物对抵抗酶促降解的贡献。如果没有回文交联的网状纳米结构产物的组装（c组中没有靶标），孵育12小时后几乎没有观察到DNA条带，这意味着DNA成分已完全降解。同样，其他组中的DNA成分也很容易降解（见d ~ g组）。这些结果表明，回文交联的网状纳米结构可以保持其结构完整性，适用于细胞内生物分子的长时间检测。
实施例7 CHA-PHCR检测系统用于检测不同细胞系之间 miRNA表达水平的差异
使用实施例1的方法构建了CHA-PHCR检测系统，通过将CHA-PHCR检测系统与不同miRNA表达水平的细胞进行孵育，最后使用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像，利用细胞内的FRET信号的荧光强度对细胞内miRNA水平进行分析。具体步骤如下：
为了研究miRNA-21在不同细胞中的表达水平，将L02细胞、HeLa细胞和MCF-7细胞置于37℃、包含5%CO2及95%相对湿度的二氧化碳细胞培养箱内培养。
根据说明书，将 CHA-PHCR 检测系统（10 nM H1、10 nM H2、100 nM f-PH1和400nM f-PH2）与 Lipofectamine 3000混合并孵育10分钟，形成 Lip-CHA-PHCR复合物。随后预先准备好的MCF-7细胞、HeLa细胞和L02细胞分别与Lip-CHA-PHCR复合物在细胞培养箱中孵育4小时。然后，将细胞用 PBS缓冲液(2.67 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 137.93 mM NaCl,8.06 mM Na2HPO4, pH=7.4)洗涤3次，并与染核试剂Hoechst 33342 (12.5 μg/mL) 孵育10分钟，随后再次用PBS缓冲液(2.67 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 137.93 mM NaCl, 8.06 mMNa2HPO4, pH=7.4)洗涤3次。最后，将所得细胞在Leica SP8共聚焦激光扫描显微镜（Leica，德国）上进行荧光成像。 Hoechst 33342 荧光的激发光在405 nm，发射波长范围在410-470nm。Cy3荧光的激发光在552 nm，发射波长范围在559-606 nm。Cy5荧光的激发光在638 nm，发射波长范围在647-720 nm。FRET荧光的激发光在552 nm，发射波长范围在647-720 nm。
图5为CHA-PHCR检测系统用于检测不同细胞系之间 miRNA 表达水平的差异验证。为了测试这一点，根据之前的研究（Analyst 2016, 141, 2861-2864.），L02、HeLa和MCF-7细胞分别具有低、中和高表达水平的 miRNA-21。如图5所示，MCF-7细胞图中的FRET荧光信号高于HeLa细胞，而L02细胞图中未观察到明显的FRET荧光信号，荧光信号的趋势为MCF-7> HeLa > L02。实验结果表明，CHA-PHCR检测系统可以准确感知目标miRNA的不同表达水平，从而能够从健康细胞中分化出病变细胞，例如肿瘤细胞。
实施例8 通用型CHA-PHCR检测系统的构建
通过改变发卡探针中的目标结合序列，参照实施例1的方法构建了可检测miRNA-31的CHA-PHCR检测系统，使用激光共聚焦显微镜对新构建的检测系统的性能进行检测，检测了活细胞（HeLa细胞）内miRNA-31的表达情况。所使用的DNA探针如下：
H1-31：5’- GATGCTGGCATAGCTTACCTGCTCCATCCAGCTATGCCAGCATCTTGCCT-3’；
H2-31：5’-TGGCATAGCTTACCTGCTCCATCCAGGCAAGATGCTGGCATAGCTGGATGGAGCAGGTAAGCTATGCCAGCATCT-3’；
f-PH1-31：
5’-GGATGGAGCAGGTAAGCTATGCCAGCATCTG/Cy3/GTAGGAGATGCTGGCATAGCTTACCTGCTTTTgatcgatc-3’；
f-PH2-31：
5’-ccgtacggTTTAGATGCTGGCATAGCTTACCTGCTCCATCCAGCAGGTAAGCTATGCCAGCATCTCCTACC/Cy5/-3’；
靶标-31（miRNA-31对应的DNA序列）：5’-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT-3’。
为针对检测miRNA-31这一目标设计的CHA-PHCR检测系统序列，改变了miRNA识别区域。图6A为新构建的CHA-PHCR检测系统对于miRNA-31对应的DNA序列的检测。可以看出在靶标-31存在的情况下，可检测到明显的FRET信号。图6B为使用新构建的CHA-PHCR检测系统对细胞内miRNA-31进行检测的激光共聚焦成像，可以看出新构建的CHA-PHCR检测系统可以有效的对细胞内的miRNA-31进行检测，证明本发明提供的CHA-PHCR检测系统具有较好的通用性和应用潜力。
实施例9 基于交联网络结构的单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统的构建
根据实施例1的方法构建了基于交联网络结构的单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统，通过加入目标探针，然后使用荧光光谱仪对其可行性进行测试。具体步骤如下：
四种发夹探针（2 μL 1 μM的H1、2 μL 1 μM的H2、2 μL 10 μM的PH1和8 μL 10 μM的FB-PH2）在5.2 μL的 1×TAE/Mg2+缓冲液中混合，得到探针混合液。然后向探针混合液总加入靶标-21探针（0.8 μL，1 μM），在37℃下孵育3 h，触发CHA-PHCR反应。在荧光测量前，用1×TAE/Mg2+缓冲液将反应体系总体积调节至200 μL。激发波长设置为525 nm，并记录540～750 nm的荧光发射光谱。其中，H1、H2、PH1和FB-PH2的序列为：
H1：5’-ATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’；
H2：5’-CTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGAT-3’；
PH1：5’-GGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATGGTAGGATCAGACTGATGTTGATACCTGCTTTTgatcgatc-3’；
FB-PH2：5’-ccgtacggTTTATCAGACTGATGT/BHQ1/TGATACCTGCTCCATCCAGCAGGTATCAA/FAM/CATCAGTCTGATCCTACC-3’。
图7 A为在目标miRNA 刺激下，通过双扩增循环过程进行回文介导的交联网络状结构非酶促自组装，从而将单荧光信号释放的示意图。图7B为在有无靶标-21存在下，单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统的荧光光谱分析。实验结果表明，在没有靶标的情况下荧光信号保持被淬灭的初始状态，当CHA-PHCR 检测系统中存在靶标时，荧光信号恢复，表明该发明使用荧光恢复型信号输出机制对miRNA检测可行性。
以上所述仅为本发明的较佳实施范例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统及其应用
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<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> NPH1
<400> 13
ggatggagca ggtatcaaca tcagtctgat ggtaggatca gactgatgtt gatacctgct 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> NPH2
<400> 14
atcagactga tgttgatacc tgctccatcc agcaggtatc aacatcagtc tgatcctacc 60
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> H1-31
<400> 15
gatgctggca tagcttacct gctccatcca gctatgccag catcttgcct 50
<210> 16
<211> 75
<212> DNA
<213> H2-31
<400> 16
tggcatagct tacctgctcc atccaggcaa gatgctggca tagctggatg gagcaggtaa 60
gctatgccag catct 75
<210> 17
<211> 71
<212> DNA
<213> f-PH1-31
<400> 17
ggatggagca ggtaagctat gccagcatct ggtaggagat gctggcatag cttacctgct 60
tttgatcgat c 71
<210> 18
<211> 71
<212> DNA
<213> f-PH2-31
<400> 18
ccgtacggtt tagatgctgg catagcttac ctgctccatc cagcaggtaa gctatgccag 60
catctcctac c 71
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 靶标-31
<400> 19
aggcaagatg ctggcatagc t 21
<210> 20
<211> 71
<212> DNA
<213> PH1
<400> 20
ggatggagca ggtatcaaca tcagtctgat ggtaggatca gactgatgtt gatacctgct 60
tttgatcgat c 71
<210> 21
<211> 71
<212> DNA
<213> FB-PH2
<400> 21
ccgtacggtt tatcagactg atgttgatac ctgctccatc cagcaggtat caacatcagt 60
ctgatcctac c 71
Claims (4)
1.一种基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统，其特征在于：所述检测系统由4种发卡探针构成，包括发卡探针H1、发卡探针H2、回文发卡探针f-PH1和回文发卡探针f-PH2；
其中，所述发卡探针H1为：
5’-ATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’；
所述发卡探针H2为：
5’-CTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGAT-3’；
所述回文发卡探针f-PH1为：
5’-GGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATG/Cy3/GTAGGATCAGACTGATGTTGATACCTGCTTTTgatcgatc-3’；
所述回文发卡探针f-PH2为：
5’-ccgtacggTTTATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATCCTACC/Cy5/-3’；
所述检测系统的构建方法包括以下步骤：
1）将发卡探针H1、发卡探针H2、回文发卡探针f-PH1和回文发卡探针f-PH2在5.2μL的1×TAE/Mg2+缓冲液中混合，得到探针混合液；
2）向步骤1）所得探针混合液中加入miRNA-21靶标，在37℃下孵育3h，触发催化发夹组装反应和基于回文的杂交链反应。
2.根据权利要求1所述的CHA-PHCR检测系统，其特征在于：所述探针混合液中，四条发卡探针H1：H2：f-PH1：f-PH2的摩尔比为1：1：10：40。
3.一种由权利要求1所述的基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统改造而来的通用型CHA-PHCR检测系统，其特征在于：所述通用型CHA-PHCR检测系统为针对检测目标改变目标结合的发卡探针的序列所得；
所述通用型CHA-PHCR检测系统为针对miRNA-31检测目标改变发卡探针的目标结合域序列所得；改变后的发卡探针的序列为：
H1-31：
5’-GATGCTGGCATAGCTTACCTGCTCCATCCAGCTATGCCAGCATCTTGCCT-3’；
H2-31：
5’-TGGCATAGCTTACCTGCTCCATCCAGGCAAGATGCTGGCATAGCTGGATGGAGCAGGTAAGCTATGCCAGCATCT-3’；
F-PH1-31：
5’-GGATGGAGCAGGTAAGCTATGCCAGCATCTG/Cy3/GTAGGAGATGCTGGCATAGCTTACCTGCTTTTgatcgatc-3’；
F-PH2-31：
5’-ccgtacggTTTAGATGCTGGCATAGCTTACCTGCTCCATCCAGCAGGTAAGCTATGCCAGCATCTCCTACC/Cy5/-3’。
4.一种由权利要求1所述的基于交联网络结构的CHA-PHCR检测系统改造而来的单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统，其特征在于：所述单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统的信号输出仅通过一条回文发卡链的单荧光释放；
所述单荧光信号恢复型CHA-PHCR检测系统为针对检测miRNA-21目标改变信号输出方式的序列所得；
改变后的发卡探针的序列为：
H1：
5’-ATCAGACTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’；
H2：
5’-CTGATGTTGATACCTGCTCCATCCTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGAT-3’；
PH1：
5’-GGATGGAGCAGGTATCAACATCAGTCTGATGGTAGGATCAGACTGATGTTGATACCTGCTTTTgatcgatc-3’；
FB-PH2：
5’-ccgtacggTTTATCAGACTGATGT/BHQ1/TGATACCTGCTCCATCCAGCAGGTATCAA/FAM/CATCAGTCTGATCCTACC-3’。
Priority Applications (1)
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