CN108359715B - Poly A介导的可调控纳米金探针及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种纳米金探针，包括纳米金颗粒以及连接在所述纳米金颗粒上的双链探针、所述双链探针包括第一条链和第二条链，所述第一条链包括5’‑3’依次排列的第一区段和第二区段；所述第一区段和所述第二条链互补；所述第二区段作为粘性末端，用于识别靶序列；所述第二条链由荧光基团修饰。本发明提供的纳米金探针通过调整第二区段的核苷酸数目，实现了调控识别序列和靶序列的杂交效率，进而调控纳米金探针对靶序列的识别能力。

Description

Poly A介导的可调控纳米金探针及其制备与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Poly A介导的可调控纳米金探针及其制备与应用。
背景技术
DNA/RNA的检测在生物医学研究和临床诊断有广阔应用空间。DNA检测在疾病的分子诊断、基因治疗、生物医学研究、生物战剂快速检测和法医学应用等方面都具有极其重要的意义。RNA在生物过程中扮演重要角色，影响细胞，组织和个体的发育，疾病过程导致特异性RNA在体液中升高。例如肿瘤特异性的mRNA/miRNA可用于癌症的诊断和分型而受到广泛关注。
传统的核苷酸检测方法分为两类，一类是基于探针杂交技术的检测方法，包括Northernblotting、微阵列芯片和微球技术、原位杂交技术等；另一类是基于扩增反应的检测方法，包括滚环扩增法、定量PCR等。这些传统方法往往存在着灵敏度低，特异性低或者对样品、实验仪器要求高等缺点。
相比传统方法，生物传感器拥有高效、快速、灵敏等特性。纳米金(AuNPs)由于其优良的生物相容性纳和独特的光学性质在生物传感器中得以广泛应用。纳米金能使几乎所有荧光淬灭在它表面。纳米金有很高的比表面积，可以组装大量生物分子，如DNA，蛋白质和抗体并应用于药物传递、生物检测和生物医学研究领域。随着DNA化学合成技术的发展，DNA成为一种简单易得的生物材料。单链DNA可以用作互补序列的探针、金属离子、小分子和蛋白质适配体。
DNA组装在纳米金表面的传统方法通常是用-SH修饰的DNA与纳米金表面利用Au-S键吸附。然而，该方法存在弊端：-SH修饰的DNA成本高，单链DNA在纳米金表面容易发生非特异性吸附，巯基吸附在纳米金表面使得探针空间位阻大。这些原因都导致杂交效率低，从而使分子识别能力降低。
大多数DNA/RNA生物传感器都是基于互补碱基序列的碱基配对。常见的有三种检测策略：第一种策略使用反义寡核苷酸修饰AuNPs检测目标序列。目标序列与反义寡核苷酸互补，杂交引起纳米金聚集。第二种策略利用单链核苷酸对金纳米金表面有很强的亲和力，而双链核苷酸不具有吸附作用。通过添加目标序列和与反义寡核苷酸杂交，DNA对纳米金吸附能力降低引起和金纳米粒子稳定性降低。第三种策略用两端带有荧光分子和淬灭剂的发夹结构，加入目标序列打开靶序列，荧光强度增加。然而，尽管它们各自具有效率、灵敏度和便利性，但没有一种方法具有可调控的灵敏度和信号。提高探针的动力学和热力学性能对提高识别能力具有重要意义。目前，大多数可用的方法是基于经验参数优化。因此，很有必要开发一种用于DNA/RNA检测的可调控的纳米金探针技术。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种Poly A介导的可调控纳米金探针及其制备与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一方面提供了一种纳米金探针，包括纳米金颗粒以及连接在所述纳米金颗粒上的双链探针、所述双链探针包括第一条链和第二条链，所述第一条链包括5’-3’依次排列的第一区段和第二区段；所述第一区段和所述第二条链互补；所述第二区段作为粘性末端，用于识别靶序列；所述第二条链由荧光基团修饰。
本发明提供的纳米金探针的中的第一条链也称为识别序列，识别序列的长度减去第一区段的长度为第二区段的长度，第一区段的长度等于第二条链的长度，因此，可以通过调整第二条链的长度来调整第二区段的长度，从而可以调控识别序列和靶序列的杂交效率，进而调控纳米金探针对靶序列的识别能力。
在一种可能的实现方式中，所述第二区段的长度为1-11nt。优选采用1nt，或3nt，或5nt，或7nt，或9nt，或11nt。
在一种可能的实现方式中，所述双链探针通过Poly A连接在所述纳米金颗粒上。
在一种可能的实现方式中，所述双链探针的第一条链包括5'-3'依次排列的PolyA、第一区段和第二区段，所述Poly A结合在所述纳米金颗粒表面。
PolyA，亦即，多聚腺苷酸，为多个连续的腺苷酸A组成的核苷酸片段。
在本发明提供的纳米金探针中，Poly A的长度影响链取代反应的空间位阻，从而调节链取代反应热力学性质，因此，可以通过调节Poly A的长度调控靶序列与识别序列杂交效率，从而调控纳米金探针对靶序列的识别能力。
在一种可能的实现方式中，所述Poly A的长度为30-50nt。优选采用PolyA30或PolyA40或PolyA50。
在一种可能的实现方式中，所述荧光基团修饰于所述第二条链的3’端。
在一种可能的实现方式中，所述荧光基团的激发波长与所述纳米金颗粒的发射波长有部分重叠或全部重叠。优选地，所述荧光基团选自异硫氰酸荧光素、FAM、ROX、Cy3或Cy5。
优选地，所述纳米金的粒径为25～35nm。所述纳米金为现有技术，既可以参考现有的文献制备，也可以通过商业途径购买。
本发明的第二方面还提供了一种第一方面所述的纳米金探针的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将所述第一条链和所述第二条链杂交，得到双链探针；
(2)将步骤(1)得到的双链探针和纳米金颗粒混合，得到混合液；
(3)将步骤(2)得到的混合液的pH调至酸性，静置第一预设时间后，再调至中性，静置第二预设时间后，离心，去掉上清，获得所述纳米金探针。
在一种可能的实现方式中，所述双链探针连接Poly A。优选地，所述第一区段的5’端连接所述Poly A。
在一种可能的实现方式中，所述步骤(3)中，所述将步骤(2)得到的混合液的pH调至酸性，静置第一预设时间具体为，每100ul混合溶液加入2ul pH＝3 500mM的柠檬酸三钠将pH调至酸性，混匀后静置5-10分钟。优选的，混匀后静置5分钟或6分钟或7分钟或8分钟或9分钟或10分钟。
在一种可能的实现方式种，所述步骤(3)中，所述调至中性，静置第二预设时间具体为，每100ul混合溶液加入18ul PH＝7.2 200mM的磷酸缓冲液(终浓度30mM)将pH调至中性，混匀后静置3-10分钟。优选的，混匀后静置3分钟或4分钟或5分钟或6分钟或7分钟或8分钟或9分钟或10分钟。
在一种可能的实现方式中，所述离心具体为7500g-8500g 10min。优选的，离心速度或7500g或7600g或7700g或7800g或7900g或8000g。
在一种可能的实现方式中，在所述步骤(2)中，所述将步骤(1)得到的双链探针和纳米金颗粒混合为，将每500-2000摩尔的双链探针和1摩尔的纳米金颗粒混合。优选的每500摩尔或每800摩尔或每1000摩尔或每1500摩尔或每2000摩尔的双链探针和1摩尔的纳米金颗粒混合。
本发明的第三方面公开了一种非疾病诊断目的的检测目标分子的方法，包括如下步骤：将目标分子和第一方面所述的纳米金探针混合，再进行荧光值检测。
优选地，所述目标分子包括DNA、miRNA、mRNA。
本发明第四方面还提供了第一方面所述的纳米金探针在制备DNA、miRNA或mRNA检测试剂中的应用。
本发明第五方面，提供了一种核酸检测试剂盒，包括第一方面所述的纳米金探针。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)通过调整粘性末端，即第二区段的核苷酸数目，实现了调控识别序列和靶序列的杂交效率，进而调控纳米金探针对靶序列的识别能力。进一步地，通过调整粘性末端和PolyA的核苷酸数目，实现了调控识别序列和靶序列的杂交效率，进而调控纳米金探针对靶序列的识别能力；从而解决了现有技术中存在的识别序列非特异性吸附、识别序列与目标序列杂交空间位阻大等问题，大大提高了光化学检测小分子核酸(DNA、miRNA或mRNA)的准确度和灵敏度，具有方便、廉价等优势。
(2)本发明提供的纳米金能够用于模拟血清样本检测，具有生物样本检测潜能。
(3)本发明以纳米金作为荧光淬灭基团，报告序列可连接不同荧光基团，用于同时检测多种目标分子。操作简单、快速，成本低。
附图说明
图1：本发明实施例提供的纳米金探针结构示意图。
图2：本发明实施例提供的纳米金探针检测原理示意图。
图3A：本发明实施例1组装的纳米金探针的表征图，表明透射电子显微镜(AFM)下所示纳米金颗粒大小均一切呈单分散。
图3B：本发明实施例1组装的纳米金探针的表征图，示出了纳米金颗粒和二嵌段DNA组装后的纳米金探针紫外吸收光谱。
图3C：本发明实施例1组装的纳米金探针的表征图，示出了纳米金颗粒和二嵌段DNA组装后的纳米金探针水合半径。
图4：本发明实施例2中poly A长度对纳米金表明探针数目的调控作用的结果展示图。在图4中，(A)示出了调节Poly A核苷酸数目，纳米金表面二嵌段DNA组装数目的变化；(B)示出了不同浓度荧光分子对应的荧光强度标准曲线。
图5：本发明实施例3中poly A长度对目标分子识别能力的调控的结果展示图。在图5中，(A)示出了AuNPs-PolyA30探针对目标分子的识别能力，检测限为100pM；(B)示出了AuNPs-PolyA40探针对目标分子的识别能力，检测限为50pM；(C)示出了AuNPs-PolyA50探针对目标分子的识别能力，检测限为10pM。可知，随着PolyA数目逐渐增加，纳米金表面分子识别能力逐渐增强。
图6：本发明实施例4中不同poly A长度下粘性末端核苷酸数目对纳米接探针的调控作用的结果展示图；其中，调控作用的结果表现为相同浓度下探针信噪比(SNR)。在图6中，(A)示出了Poly A30二嵌段纳米金探针的信噪比；(B)示出了Poly A40二嵌段纳米金探针的信噪比；(C)示出了Poly A50二嵌段纳米金探针的信噪比。
图7：本发明实施例5中纳米金探针的特异性展示图。图7中(A)示出了(A)AuNPs-PolyA30对终浓度5nM目标化合物，终浓度50nM非互补序列1(seq1)和终浓度50nM非互补序列2(seq2)的荧光响应结果；(B)示出了AuNPs-PolyA40对终浓度5nM目标化合物，终浓度50nM非互补序列1(seq1)和终浓度50nM非互补序列2(seq2)的荧光响应结果；(C)示出了AuNPs-PolyA40对终浓度5nM目标化合物，终浓度50nM非互补序列1(seq1)和终浓度50nM非互补序列2(seq2)的荧光响应结果。
图8：本发明实施例6组装的携带有不同识别序列的纳米金探针的检测结果展示图。不同识别序列分别与不同荧光基团修饰的报告分子杂交。
图9：本发明实施例7中，纳米金探针检测模拟血清样本中DNA的结果展示图。在图9中，(A)示出了Poly A30二嵌段纳米金探针检测模拟血清样本中DNA的结果；(B)示出了PolyA40二嵌段纳米金探针检测模拟血清样本中DNA的结果；(C)示出了Poly A50二嵌段纳米金探针检测模拟血清样本中DNA的结果。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本发明实施例提供了一种纳米金(AuNPs)探针，其结构如图1所示。具体地，本发明实施例提供的纳米金探针包括包括纳米金颗粒以及连接在所述纳米金颗粒上的双链探针、所述双链探针包括第一条链和第二条链，所述第一条链包括5’-3’依次排列的第一区段和第二区段；所述第一区段和所述第二条链互补；所述第二区段作为粘性末端，用于识别靶序列；所述第二条链由荧光基团修饰。
在一个示例中，所述双链探针通过Poly A连接在所述纳米金颗粒上。
在一个示例中，所述双链探针通过所述PolyA连接在所述纳米金颗粒上包括：所述第一区段的5’端连接所述Poly A，所述Poly A结合在所述纳米金颗粒表面。
在一个示例中，所述Poly A的长度为30-50nt。
在一个示例中，所述第二区段的长度为1-11nt。
在一个示例中，所述第二条链由荧光基团修饰包括：所述第二条链的3’端由荧光基团修饰。
需要说明的是，在本发明实施例中，第一条链也称为识别序列；连接有Poly A的识别序列称为二嵌段DNA，即识别序列和Poly A连接后的核酸分子称为二嵌段DNA。可以将识别序列中用于识别靶序列的第二区段称为粘性末端。第二条链也称为报告序列，也可以称为报告分子。靶序列也可以称为目标分子。纳米金颗粒可以用Au来表示，也可以用AuNPs来表示；纳米金探针可以用Au-PolyAN(N表示Poly A的腺苷酸数目)表示，也可以用AuNPs-PolyAN(N表示Poly A的腺苷酸数目)表示。
本发明实施例提供的纳米金探针检测原理如图2所示，利用金纳米颗粒本身优异的光学性质，以二嵌段DNA与荧光基团修饰的报告分子杂交序列作为探针，通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)现象对于距离的敏感性来检测DNA、mRNA或miRNA，并且可以设计标记不同荧光分子的可调控纳米金探针，实现多种目标分子的同时检测。具体来说，二嵌段DNA的识别序列与荧光基团修饰的报告分子部分互补，留下用于目标分子识别的粘性末端。通过二嵌段DNA的Poly A序列组装在纳米金表面，修饰报告分子的荧光基团淬灭在纳米金表面，溶液检测极低荧光信号。而当加入目标分子DNA、mRNA或miRNA后，目标分子与二嵌段DNA的识别序列的粘性末端杂交延伸，可以将报告分子从识别序列上取代下来，导致荧光基团和纳米金颗粒表面的距离变远，FRET现象减弱甚至消失，荧光恢复。根据FRET效率引发的荧光强度的变化，可以方便快捷的检测目标分子，并且通过选择不同发射波长的荧光染料，以及其对二嵌段DNA设计不同的识别序列，实现多种目标分子(DNA，mRNA或miRNA)的同时检测。为了实现可调控技术，可以分别采用调节粘性末端核苷酸数目和调节Poly A数目实现。粘性末端核苷酸数目越多，目标分子与粘性末端杂交形成的核苷酸序列越稳定，一定范围内，增加粘性末端核苷酸数能够促进链取代反应的发生。调节Poly A的数目可以起到调节链取代反应的空间位阻，从而调节链取代反应热力学性质。
在一个示例中，所述Poly A的长度为30-50nt。
在一个示例中，所述第二区段的长度为1-11nt。
在一个示例中，所述报告序列的3’端由所述荧光基团修饰。在纳米金探针中，所述报告序列的3’端更靠近纳米金颗粒，荧光基团修养报告序列的3’端，可以起到更好的淬灭效果。
在一个示例中，所述荧光基团的激发波长与所述纳米金颗粒的发射波长有部分重叠或全部重叠。
在一个示例中，所述荧光基团为异硫氰酸荧光素。
接下来，在具体实施例中对本发明实施例提供的纳米金探针及其制备方法和应用进行举例说明。
实施例1
(1)材料及设备
本实施例采用的试剂：柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)，磷酸盐，NaCl，MgCl2和KCl等试剂从中国国药集团公司购买。
上述试剂均为分析纯，且没有进一步纯化。
本实施例采用的水为MilliQ水；MilliQ水：18.2MΩ.cm(Millipore)。
本实施例采用的设备包括透射电子显微镜(TEM)，紫外分光光度计(Hitachi U-3010)，荧光分光光度计(F-900,Edinburg)，PH计，冷冻高速离心机(Hitachi)。
本发明实施例采用的二嵌段DNA，报告分子以及靶标分子购于生工生物工程(上海)股份有限公司并使用高效液相色谱纯化。
本发明实施例采用了3个二嵌段DNA，分别为2blockPolyA30(SEQ ID NO.1)、2blockPolyA40(SEQ ID NO.2)、2blockPolyA50(SEQ ID NO.3)；其序列如表1所示。
本发明实施例采用的报告分子为reporter7(SEQ ID NO.4)其序列如表1所示，其3’端由异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)修饰。
表1
Figure BDA0001571129670000091
(2)纳米金探针的制备及表征
可通过商业途径购买纳米金，也可以通过现有技术记载的方法制备纳米金。
将二嵌段DNA和报告分子杂交，得到二嵌段探针。
纳米金探针的制备：主要分为以下四步：第一，将二嵌段探针加入到浓度为0.5nM的纳米金溶液中，使二者的终浓度比为1000:1，孵育10分钟；第二，将柠檬酸三钠(pH＝3，500mM)加入至上述溶液中，使其终浓度为10mM，快速涡旋，静置3-5分钟；第三，将上述溶液pH调至中性，用200mM PB溶液(PH＝7.6)，使其终浓度为30mM，快速涡旋，静置10-15分钟；最后，将上述纳米金溶液8000rpm离心洗涤三次，洗涤溶液为10mM PB(pH＝7.6)。将上述制备好的溶液溶于1xPBS杂交液中，以备后续使用。(紫外分光光度计测发射峰在530nm,ε＝3.585*109L mol-1cm-1)。
将纳米金溶液和组装后的纳米金探针溶液滴于铜网，自然风干，制备TEM样品。使用TEM观察组装前后纳米金和纳米金探针。
将纳米金溶液和组装后的纳米金探针溶液加入到比色皿中，使用紫外分光光度计扫描发射峰位置。
将纳米金溶液和组装后的纳米金探针溶液加入到比色皿中，用DelsaTM纳米亚微米粒度仪测量。在DLS(动态光散射)的理论下，用仪器自带的软件统计并拟合出各组纳米金探针的水合直径
图3A、图3B、图3C为实施例1合成的纳米金探针的表征图，其中，Au表示纳米金颗粒，Au-PolyA30、Au-PolyA40、Au-PolyA50分别表示由2blockPolyA30、2blockPolyA40、2blockPolyA50制备的纳米金探针。
由图3A可知，投射电子显微镜下所示纳米金颗粒大小均一，呈单分散。
由图3B可知，组装前后纳米金紫外吸收光谱(左)，组装后纳米金紫外吸收峰右移5nm至530nm。
由图3C可知，组装前后纳米金粒子的水合半径。组装不同Poly A长度的二嵌段DNA，纳米金水合半径增加不同数值。
实施例2
在本实施例中，对不同Poly A长度的二嵌段DNA对纳米金表面组装数目的调控进行探讨。
将实施例1制备的具有不同长度Poly A的二嵌段DNA纳米金探针溶液溶液，先用紫外分光光度计定量浓度。计算公式为CAuNPs-PolyA＝A520nm*2.79*10-10M。将二嵌段纳米金探针(终浓度为0.15nM)探针加入巯基乙醇(终浓度为20mM)，室温下摇动过夜。接着离心法收集上清荧光标记的DNA(荧光基团FAM，激发波长494nm，发射波长520nm)，检测荧光强度。最后将荧光值代入之前的标准曲线，计算荧光标记DNA浓度。如图4所示，(A)随着PolyA长度的增加，纳米金表面组装的二嵌段DNA数目逐渐减少。与理论组装量相符(随着PolyA长度的增加，理论组装量逐渐降低)；(B)不同荧光分子浓度和相应荧光强度标准曲线。注：标准曲线是在同样的离子强度、pH、浓度缓冲溶液下绘制的。
实施例3
在本实施例中，对不同Poly A核苷酸数目的二嵌段DNA对目标序列识别能力的调控进行探讨。
采用实施例1提供的具有不同长度Poly A的纳米金探针。在不同组纳米金探针中加入不同浓度目标分子，分别为：0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、10、50、100、150、200nM，孵育后检测各组荧光强度。每组实验均重复三次。本实施例中，目标分子的序列如SEQ IDNO.10所示，具体为5’AGCCC CTGCC CACCG CACAC TG3’。
结果如图5所示，荧光信号的强度随着目标分子的加入而增强，最后到达平台期。不同Poly A数目对探针的最低检测限具有调控作用。随着Poly A中腺苷酸数目增加，探针的检测限分别为100pM，50pM，10pM。同时，随着Poly A数目的增加，纳米金表面组装量降低，因此探针检测的线性范围随之降低。
实施例4
在本实施例中对粘性末端核苷酸数目对识别序列识别能力的调控进行探讨。
针对同一目标分子，设计不同长度的报告分子与识别序列杂交，调控粘性末端核苷酸数目。本实施例中的目标分子采用实施例3中SEQ ID NO.10所示的目标分子；二嵌段DNA为实施例1中的2blockPolyA30(SEQ ID NO.1)、2blockPolyA40(SEQ ID NO.2)、2blockPolyA50(SEQ ID NO.3)。设计的报告序列分子为Reporter-1(SEQ ID NO.5)、Reporter-3(SEQ ID NO.6)、Reporter-5(SEQ ID NO.7)、Reporter-7(SEQ ID NO.4)、Reporter-9(SEQ ID NO.8)、Reporter-11(SEQ ID NO.9)，它们的序列如表2所示。
表2
Figure BDA0001571129670000111
Reporter-1、Reporter-3、Reporter-5、Reporter-7、Reporter-9、Reporter-11对应的识别序列粘性末端核苷酸数目分别为1，3，5，7，9，11，分别记为T-1,T-3，T-5，T-7,T-9，T-11。加入5nM上述目标分子，室温孵育；将探针溶液离心取上清，用F-900荧光检测仪检测各组本底荧光强度和信号荧光强度(荧光基团FAM，激发波长494nm，发射波长520nm)，计算信噪比。每组实验重复三次。结果如图6所示。由图6可知，随着粘性末端核苷酸数目的增加，探针的信噪比呈现出现上升趋势。当粘性末端核苷酸数目增加至7时，探针拥有最佳信噪比。
实施例5
在本实施例中，对发明提供的纳米金探针的特异性进行探讨。
将互补的DNA靶标以及其他非互补靶标(non-target DNA)分别与实施例1组装好的二嵌段纳米金探针(0.15nM)混合，孵育。离心取上清测荧光强度(本实施例中，采用荧光基团FAM，其激发波长494nm，发射波长520nm)。杂交体系均为200ul，目标分子target杂交浓度5nM，非互补靶标分子seq-1杂交浓度50nM，非互补靶标分子seq-2杂交浓度50nM。每组实验均重复三次。
如图7所示，非互补靶标加入50nM，目标分子加入5nM。加入目标分子使得荧光信号强烈，加入非互补靶标荧光信号强度与对照组无明显差异。
实施例6
在本实施例中，对发明提供的纳米金探针的miRNA多色检测进行探讨。
设计二嵌段DNA，用于miRNA210(SEQ ID NO.11)，miRNA155(SEQ ID NO.12)，miRNA196a(SEQ ID NO.13)检测。相应的二嵌段DNA分别为2blockA50(for miRNA210)(SEQID NO.14)、2blockA50(for miRNA155)(SEQ ID NO.15)、2blockA50(for miRNA196a)(SEQID NO.16)。相应的序列如表3。二嵌段DNA与不同荧光基团(分别为FAM、ROX、Cy5)修饰的三种报告分子预先杂交，按照1：1：1混合。将混合好的DNA序列按照1000：1的比例加入纳米金溶液孵育10分钟。随后，按照实施例1所述的方法继续组装纳米金探针。
在所得的探针中同时加入浓度为10nM的miRNA210，miRNA155，miRNA196a，孵育。离心取上清测荧光强度(荧光基团FAM，激发波长494nm，发射波长520nm；荧光基团ROX，激发波长588nm，发射波长608nm；荧光基团Cy5，激发波长647nm，发射波长670nm)。
如图8所示，共组装探针在加入三种miRNA的情况下荧光信号与control显著区别，共组装探针具有同时检测能力。
表3
Figure BDA0001571129670000121
Figure BDA0001571129670000131
实施例7
在本实施例中，对发明提供的纳米金探针用于模拟生物样本检测进行探讨。
为了在稀释的胎牛血清中检测miRNA，1xPBS(pH＝7.6,100mM)稀释胎牛血清至10％。用10％FBS稀释目标分子，即模拟血清样本；目标分子采用SEQ ID NO.10所示的目标分子。纳米金探针采用实施例1制备的二嵌段DNA为2blockPolyA50的纳米金探针。所用纳米金探针的浓度为0.15nM。在所得探针中加入模拟血清样本至目标分子终浓度为5nM，孵育。离心取上清，测荧光强度(荧光基团FAM，激发波长494nm，发射波长520nm；)。每组实验均重复三次。
从图9中可以看出，在模拟的血清环境中进行DNA检测，灵敏性和特异性均非常高，AuNPs-PolyA30探针加入target，荧光信号升高10倍；AuNPs-PolyA40探针加入target荧光信号升高8倍；AuNPs-PolyA50纳米金探针加入target，荧光信号升高10倍。
自此，可以证明本发明实施例提供的纳米金探针可应用于模拟血清中，为后续研究实际样本奠定了基础。
由此可见，本发明实施例提供的纳米金探针克服了现有技术中的种种缺陷，具有很好的应用前景。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 中国科学院上海高等研究院
中国科学院上海应用物理研究所
<120> Poly A介导的可调控纳米金探针及其制备与应用
<130> 181271
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cagtgtgcgg tgggcagggg ct 52
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cagtgtgcgg tgggcagggg 60
ct 62
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cagtgtgcgg 60
tgggcagggg ct 72
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcccaccgca cactg 15
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcccctgccc accgcacact g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccctgcccac cgcacactg 19
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgcccaccg cacactg 17
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccaccgcaca ctg 13
<210> 9
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accgcacact g 11
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcccctgcc caccgcacac tg 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agccccugcc caccgcacac ug 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
uagguaguuu cauguuguug gg 22
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cagtgtgcgg 60
tgggcagggg ct 72
<210> 15
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaacccctat 60
cacgattagc att 73
<210> 16
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cccaacaaca 60
tgaaactacc t 71
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcgtgatagg ggttt 15
<210> 18
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcatgttgt tggg 14
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcccaccgca cactg 15

Claims (7)

1.一种纳米金探针，其特征在于，包括纳米金颗粒以及连接在所述纳米金颗粒上的双链探针、所述双链探针包括第一条链和第二条链，所述双链探针的第一条链包括5'-3'依次排列的Poly A、第一区段和第二区段，所述Poly A结合在所述纳米金颗粒表面；所述第一区段和所述第二条链互补；所述第二区段作为粘性末端，用于识别靶序列；
所述第二条链由荧光基团修饰，所述荧光基团修饰于所述第二条链的3'端；所述双链探针通过Poly A连接在所述纳米金颗粒上，所述Poly A结合在所述纳米金颗粒表面，所述第一区段的5'端连接所述Poly A，所述Poly A的长度为30-50nt。
2.根据权利要求1所述的纳米金探针，其特征在于，所述第二区段的长度为1-11nt。
3.一种权利要求1-2任一项所述的纳米金探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将所述第一条链和所述第二条链杂交，得到双链探针；
(2)将步骤(1)得到的所述双链探针和纳米金颗粒混合，得到混合液；
(3)将步骤(2)得到的混合液的pH调至酸性，静置第一预设时间后，再调至中性，静置第二预设时间后，离心，去掉上清，获得所述纳米金探针。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述将步骤(1)得到的双链探针和纳米金颗粒混合为，将每500-2000摩尔的双链探针和1摩尔的纳米金颗粒混合。
5.一种非疾病诊断目的的检测目标分子的方法，包括如下步骤：将目标分子和如权利要求1-2任一项所述的纳米金探针混合，再进行荧光值检测。
6.如权利要求1-2任一项所述的纳米金探针在制备DNA、miRNA或mRNA检测试剂中的应用。
7.一种核酸检测试剂盒，包括如权利要求1-2任一项所述的纳米金探针。
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