CN105886611A - 磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用 - Google Patents

磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105886611A
CN105886611A CN201610209399.3A CN201610209399A CN105886611A CN 105886611 A CN105886611 A CN 105886611A CN 201610209399 A CN201610209399 A CN 201610209399A CN 105886611 A CN105886611 A CN 105886611A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tiny rna
graphene
label
magnetic
nanometer gold
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610209399.3A
Other languages
English (en)
Inventor
毕赛
岳淑珍
王宗花
张立学
龚世达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao University
Original Assignee
Qingdao University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao University filed Critical Qingdao University
Priority to CN201610209399.3A priority Critical patent/CN105886611A/zh
Publication of CN105886611A publication Critical patent/CN105886611A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种磁性氧化石墨烯‑纳米金免标记复合物的制备方法及应用，基于磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA不同的吸附作用，加入目标小RNA后，DNA1的识别段与目标小RNA特异性结合，形成DNA/RNA双链结构，从而将吸附在磁性氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中。通过磁性分离，利用纳米金在可见光区的显色效应，观察上清液中纳米金溶液随小RNA浓度不同所产生的颜色变化，并采用紫外‑可见分光光度计进行定量分析，从而实现对小RNA的高灵敏度、高特异性的快速比色法检测。

Description

磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种小RNA的检测方法，具体涉及一种磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用。
背景技术
比色法是一种利用有色物质溶液颜色的深浅，对待测物质含量进行测定的分析方法，具有操作简便、灵敏度高、准确度高等优点，已广泛应用于生化分析领域。其中，纳米金由于其独特的光学性质、良好的生物相容性和化学活性，在生物检测领域表现出潜在的应用价值。目前采用纳米金比色法检测核酸分子的工作，大多是通过Au-S共价键将巯基修饰的DNA自组装到纳米金表面。这些方法需要对DNA分子进行化学修饰，成本较高，且操作复杂。此外，利用此方法组装得到的金纳米探针不易精确控制纳米金表面DNA的密度、构象以及空间取向等。现已发现含有多个连续腺嘌呤的polyA序列对纳米金具有非常强的亲和力，能够有效的吸附在纳米金表面。此外，采用polyA作为纳米金和DNA之间的连接体可以较好地控制纳米金表面所连接DNA的空间取向，并且可以通过改变polyA的长度调控金纳米粒子表面以polyA为介导的DNA的密度分布，同时控制并提高DNA的杂交能力。
石墨烯(graphene)是由一层密集碳原子紧密排列而成的二维蜂窝状晶体点阵结构。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的一种衍生物，其表面含有大量羟基和含氧基团，同时在其边缘含有大量的羧基和羰基，这些基团使GO具有良好的亲水性，并为GO的功能化提供了充足的活性位点；同时GO具有较高的比表面积，可以通过非共价作用力，如π-π堆叠、氢键以及范德华作用力等进行功能化修饰，为其在生化分析领域的应用提供了优势。
目前并没有磁性氧化石墨烯与非巯基核酸相结合制备成为磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物在检测小RNA的相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术，提供了一种磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小RNA的比色法。
本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种检测小RNA的中间体，该中间体为免标记生物条形码金纳米探针，其特点是：在纳米金上吸附DNA1和DNA2，所述DNA1为二嵌段DNA，一段为5～10个腺嘌呤碱基，用于将DNA1固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识别段；DNA2为5～10个腺嘌呤碱基，用于封闭位点。
所述检测小RNA的中间体是通过以下方法制备得到的：向纳米金溶液中加入DNA1和DNA2，并加入柠檬酸盐-盐酸缓冲液混合反应2～5min(优选3min)，然后调节反应体系的pH至中性，在20～30℃继续反应5～10min，再将反应后的混合液离心，洗涤去除未组装的DNA1和DNA2，得到免标记生物条形码金纳米探针。
具体的制备方法如下：
(1)向纳米金溶液中加入DNA1和DNA2，所述DNA1为二嵌段DNA，一段为5～10个腺嘌呤碱基，用于将DNA1固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识别段；DNA2为5～10个腺嘌呤碱基，用于封闭位点；
(2)向上述混合液中加入柠檬酸盐-盐酸缓冲液进行反应；
(3)向步骤(2)中的反应体系中加入PB缓冲液调节体系的pH至中性，继续反应5～10min；
(4)将反应后的混合液离心，用PB缓冲液洗涤以除去未组装成功的DNA1和DNA2。
(5)将洗涤后的生物条形码金纳米探针分散于PBS缓冲液，制备得到免标记生物条形码金纳米探针。
步骤(1)中，所述纳米金的制备为现有技术中的公知常识。根据本发明的实际情况和研究效果，优先选用以下技术方案，纳米金的制备方法如下：加热四氯金酸溶液至沸腾，在持续搅拌的条件下，加入柠檬酸三钠，继续煮沸10～20min，反应之后冷却，将溶液过滤，得到纳米金溶液。
优选的，所述DNA1为二嵌段DNA，一段为5个腺嘌呤碱基，用于将DNA1固定于纳米金表面；DNA2为5个腺嘌呤碱基，用于封闭位点。
本发明可以通过控制腺嘌呤个数调节金纳米粒子表面以polyA为介导的二嵌段DNA的密度分布。实验表明，随腺嘌呤个数增多，纳米金表面所连接的二嵌段DNA密度减小。为构建免标记生物条形码纳米探针，即保证粒径为13nm的纳米金上DNA1(即识别探针)与DNA2(即生物条形码)的比例为1:100，通过优化条件，确定范围为5～10个腺嘌呤，从而达到封闭位点，减少交叉反应、提高检测灵敏度的目的。
优选的，纳米金、DNA1和DNA2混合溶液中，所述纳米金、DNA1和DNA2的浓度比例为1:1:100。
所述生物条形码指的是纳米粒子上结合的大量序列相同、且不与目标物结合的DNA片段，可以是单链DNA，也可以是双链DNA。本发明中DNA2作为生物条形码为5～10个腺嘌呤(优选为5个)，平铺式吸附在金纳米粒子表面，其作用主要体现在以下两个方面：1)用于封闭金纳米粒子表面的位点，避免金纳米粒子表面结合多个二嵌段DNA(即DNA1)，有效减少交叉反应，提高检测灵敏度；2)使吸附在金纳米粒子表面的DNA分子探针的构象更为伸展，有利于靶分子与二嵌段DNA进行杂交反应。
本发明的第二个方面，提供了一种检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物，该复合物通过所述中间体中的DNA1识别段与磁性氧化石墨烯间的π-π堆叠作用，将所述中间体吸附到磁性氧化石墨烯，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。
所述检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合材料的制备方法如下：将所述中间体和磁性氧化石墨烯混合反应，反应之后将反应体系磁性分离，除去未结合的中间体，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。
其具体制备方法如下：
(1)向制备好的免标记生物条形码金纳米探针溶液中加入磁性氧化石墨烯，20～30℃反应5～15min；
(2)将反应体系磁性分离，除去未结合的金纳米探针，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。
将磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物分散于PBS缓冲液中，即得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液。
优选的，所述中间体与磁性氧化石墨烯的体积比例为90～110:1(优选为100:1)。
其中，所述磁性氧化石墨烯的制备为现有技术中的公知常识。根据本发明的实际情况和研究效果，优先选用以下技术方案，所述磁性氧化石墨烯的制备方法如下：首先采用EDC活化氧化石墨烯的羧基，然后将活化后的氧化石墨烯与氨基包被磁性微球(粒径3～4μm)反应，再进行磁性分离、清洗，得到磁性氧化石墨烯。
所述氨基包被磁性微球为现有技术中的公知常识，比如：氨基化的核壳式聚苯乙烯磁性微球，本领域的技术人员可以常规得到，也可购买于天津贝思乐色谱技术开发中心。
本发明的第三个方面，提供了一种磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小RNA的比色法，基于所述的磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA吸附能力的差别，加入待测目标小RNA后，DNA1的识别段与待测目标小RNA特异性结合，形成DNA/RNA双链结构，从而将吸附在磁性氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中，磁性分离后，通过直接观察上清液颜色的变化并运用紫外-可见分光光度计进行定量分析，实现对小RNA的比色法检测。
本发明所述的小RNA包括微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和与piwi相互作用的RNA(piRNA)。
具体步骤如下：
(1)将磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物制备成为磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液；
(2)制作标准曲线：将不同浓度的目标小RNA加入到步骤(1)中的溶液中，进行反应，反应后将反应液磁性分离，测定不同浓度下的紫外-可见吸收光谱，制作标准曲线；
(3)测定待测目标小RNA：将待测目标小RNA加入到步骤(1)中的溶液，进行反应，反应后将反应液磁性分离，测定紫外-可见吸收光谱，根据标准曲线计算得到待测目标小RNA的浓度。
优选的，步骤(2)和步骤(3)中，反应温度为30～40℃，反应时间为0.5～1.5h。进一步优选的，反应温度为37℃，反应时间为1h。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的检测小RNA的中间体具有以下优点：该中间体为免标记生物条形码金纳米探针，特点是在纳米金上吸附DNA1和DNA2，所述DNA1为二嵌段DNA，一段为5～10个腺嘌呤碱基，用于将DNA1固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识别段；DNA2为5～10个腺嘌呤碱基，作为生物条形码序列，用于封闭位点，有效减少交叉反应。采用多个腺嘌呤碱基作为封闭试剂，使得上述免标记生物条形码金纳米探针作为检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的中间体，为准确、高效检测小RNA提供了良好基础。
该中间体利用连续的腺嘌呤碱基与纳米金之间极强的吸附力，制备免标记生物条形码金纳米探针。克服了传统方法中基于Au-S共价键相互作用，将巯基化的DNA固定于纳米金表面所引起的不易精确控制纳米金表面所修饰的寡核苷酸的构象和空间取向、与靶DNA杂交能力较弱等缺点。
经过大量实验验证与分析，本发明检测小RNA中间体的制备方法，使得到的核酸与纳米金偶联后的中间体产物性质更加优异。
(2)本发明提供的检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物具有以下优点：通过DNA1识别段与氧化石墨烯间的π-π堆叠作用，将所构建的生物条形码金纳米探针吸附到磁性氧化石墨烯表面，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。基于磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA吸附能力的差别，利用比色法实现高效、准确、特异检测目标小RNA。现有技术中存在氧化石墨烯和纳米金的复合物，比如中国专利201510271333.2，但是两者检测对象和检测的机理完全不同。
经过大量实验验证与分析，本发明的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法操作简单，实用，使得到的磁性复合物的性质更加优异，稳定性好，可以实现高效、准确、高特异性、高灵敏性检测目标小RNA。
(3)本发明研究采用磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小RNA的比色法，该方法利用连续的腺嘌呤碱基与纳米金之间极强的吸附力，制备免标记生物条形码金纳米探针。同时，利用氧化石墨烯表面的羧基与包被于磁性微球表面的氨基发生酰胺反应，制备得到磁性氧化石墨烯。通过生物条形码金纳米探针识别段DNA与氧化石墨烯间的π-π堆叠作用，构建磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。基于磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA吸附能力的差别，加入目标小RNA后，DNA1的识别段与目标小RNA特异性结合，形成DNA/RNA双链结构，从而将吸附在磁性氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中。磁性分离后，通过直接观察上清液颜色的变化并运用紫外-可见分光光度计进行定量分析，实现对小RNA的高灵敏度、高特异性的快速比色法检测。该方法操作简便，成本低廉，检测结果直观，无需复杂仪器设备，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：基于磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物比色法检测小RNA示意图。
图2：加入不同浓度目标小RNA(miRNA-210)，磁性分离后，上清液颜色变化的照片。miRNA-210的浓度(自左到右)：0，1nM，2nM，4nM，6nM，8nM，10nM。
图3：加入不同浓度目标小RNA(miRNA-210)，磁性分离后，上清液的紫外-可见光谱图。miRNA-210的浓度(自下到上)：0，1nM，2nM，4nM，6nM，8nM，10nM。
图4：加入不同miRNA，磁性分离后，上清液在520nm处的紫外-可见吸光度的比较。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一、实验原理：
基于磁性氧化石墨可以快速磁分离及其对单、双链DNA吸附作用不同的特点，结合连续腺嘌呤碱基(polyA)免标记修饰金纳米粒子技术以及纳米金在可见光区的显色效应，建立了一种基于磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小RNA的比色法。实验原理如图1所示，首先利用polyA与纳米金之间极强的吸附力，制备免标记生物条形码金纳米探针，即在纳米金上吸附两种DNA(DNA1和DNA2，二者比例为1:100)，其中DNA1为二嵌段DNA，一段为5个腺嘌呤碱基(A5)，用于将DNA1固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识别段；DNA2为5个腺嘌呤碱基(A5)，作为生物条形码序列，用于封闭位点，有效减少交叉反应。同时，利用氧化石墨烯表面的羧基与包被于磁性微球表面的氨基发生酰胺反应，制备得到磁性氧化石墨烯。将制备好的生物条形码金纳米探针与磁性氧化石墨烯混合，通过DNA1识别段与氧化石墨烯间的π-π堆叠作用，将生物条形码金纳米探针吸附于磁性氧化石墨烯表面，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。基于磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA吸附能力的差别，加入目标小RNA后，DNA1的识别段与目标小RNA特异性结合，形成DNA/RNA双链结构，从而将吸附在磁性氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中。通过磁性分离，利用纳米金在可见光区的显色效应，观察上清液中纳米金溶液随小RNA浓度不同所产生的颜色变化，实现对小RNA的高灵敏度、高特异性的快速比色法检测。
二、实验步骤：
表1所用寡核苷酸序列
(一)磁性氧化石墨烯的制备
1、将一定量的氧化石墨烯片置于烧杯中，加入二次水溶解，超声分散得到棕色溶液，6000rpm离心10min制得终浓度为1mg/mL的氧化石墨烯悬浮液；
2、取600μL上述制备的氧化石墨烯悬浮液，向其中加入600μL EDC，37℃条件下振荡活化1h；
3、取300μL氨基包被磁性微球(粒径约为3～4μm)，用咪唑-HCl缓冲液(1M，pH＝6.8，现配现用)清洗三次，备用。
4、向上述活化好的氧化石墨烯溶液中加入清洗完全的氨基包被磁性微球，37℃振荡反应12h。
5、将制备好的磁性氧化石墨烯进行磁性分离，用二次去离子水清洗三次，将清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4℃保存备用。
(二)纳米金的制备
1、将100mL 0.01％的四氯金酸溶液(取1mL 1％的四氯金酸溶液于100mL容量瓶中，定容)加入三口烧瓶中，快速搅拌下加热至沸腾。
2、在持续搅拌的条件下，迅速加入2.5mL柠檬酸三钠(1％)，将此溶液继续煮沸15min，移去热源，继续搅拌至整个反应系统自然冷却至室温。
3、将冷却至室温的纳米金溶液通过微孔滤膜(0.22μm)过滤，最终得到粒径约为13nm的纳米金溶液，4℃保存备用。
(三)免标记生物条形码金纳米探针的制备
1、向纳米金溶液(10nM)中加入DNA1和DNA2，浓度分别为10nM和1μM；
2、向上述混合液中加入柠檬酸盐-盐酸缓冲液(500mM，pH＝2)，室温下反应3min。
3、向反应体系中加入PB缓冲液(200mM，pH＝7.6)调节体系的pH至中性(每50μL纳米金溶液加入3μL PB缓冲液)，室温下继续反应5～10min；
4、将反应后的混合液离心(转速为12000rpm)，用PB缓冲液(100mM，pH＝7.6)洗涤三次以除去未组装成功的DNA1和DNA2。
5、将洗涤后的生物条形码金纳米探针分散于PBS缓冲液(100mM，pH＝7.6)，4℃保存备用。
(四)磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备
1、向5mL制备好的免标记生物条形码金纳米探针溶液中加入50μL磁性氧化石墨烯，室温反应10min；
2、将反应体系磁性分离，除去未结合的金纳米探针。将磁性复合物分散于200μL PBS缓冲液中，即得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液。
(五)目标小RNA的检测
1、选择miRNA-210作为目标小RNA。将100μL不同浓度的miRNA-210(浓度依次为：0，1nM，2nM，4nM，6nM，8nM，10nM)分别加入到300μL上述制备的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液中，37℃反应1h；
2、将反应液磁性分离，观察上清液颜色变化，并测定其紫外-可见吸收光谱。
(六)特异性检测
1、取五份300μL磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液，分别加入100μL PBS缓冲液(空白样品)、错配小RNA(miRNA-155、miRNA-196a、miRNA-21)、目标小RNA(miRNA-210)，37℃反应1h(所加入的小RNA浓度均为4nM)；
2、将反应液磁性分离，观察上清液颜色变化，并测定其紫外-可见吸光度。
三、实验结果与讨论
将100μL不同浓度的目标小RNA(miRNA-210)(浓度依次为：0，1nM，2nM，4nM，6nM，8nM，10nM)加入到300μL磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液中，37℃反应1h后，将反应液磁性分离，磁性氧化石墨烯上清液颜色变化如图2所示，上清液呈现出纳米金溶液的红色，且红色随着加入目标小RNA浓度的增大逐渐加深。说明加入目标小RNA后，吸附在磁性氧化石墨烯表面的生物条形码金纳米探针被成功解离下来，所解离下来的金纳米粒子的浓度与加入的目标小RNA的浓度呈正相关。进一步，测定其上清液的紫外-可见吸光度。粒径约为13nm的金纳米粒子在520nm处出现最大紫外-可见吸收。如图3所示，随加入的目标小RNA浓度的增大，其对应的上清液在520nm处的紫外-可见吸光度升高，进一步说明解离下来的金纳米探针的浓度与加入的目标小RNA的浓度呈正相关，从而实现对小RNA的定量检测。
为了评价该方法对目标小RNA检测的特异性，向所制备的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液中分别加入PBS缓冲液(空白样品)、错配小RNA(miRNA-155、miRNA-196a、miRNA-21)、目标小RNA(miRNA-210)，37℃反应1h后，将反应液磁性分离，取上清液，测定其紫外-可见吸光度。结果如图4所示，体系中加入错配小RNA(miRNA-155、miRNA-196a、miRNA-21)后，其上清液在520nm处的紫外-可见吸光度与空白样品相比，没有明显变化；当加入目标小RNA(miRNA-210)后，其上清液在520nm处的紫外-可见吸光度明显增大，表明该方法可以高特异性的检测目标小RNA。

Claims (10)

1.一种检测小RNA的中间体，所述中间体为免标记生物条形码金纳米探针，其特征是：在纳米金上吸附DNA1和DNA2，所述DNA1为二嵌段DNA，一段为5～10个腺嘌呤碱基，用于将DNA1固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识别段；DNA2为5～10个腺嘌呤碱基，用于封闭位点。
2.权利要求1所述的检测小RNA的中间体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：向纳米金中加入DNA1和DNA2，并加入柠檬酸盐-盐酸缓冲液混合反应2～5min，然后调节反应体系的pH至中性，在20～30℃继续反应5～10min，再将反应后的混合液离心，洗涤去除未组装的DNA1和DNA2，得到免标记生物条形码金纳米探针。
3.如权利要求2所述的检测小RNA的中间体的制备方法，其特征是：所述纳米金、DNA1和DNA2混合溶液中，所述纳米金、DNA1和DNA2的浓度比例为1:1:100。
4.一种检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物，其特征是：该复合物通过权利要求1所述中间体中的DNA1识别段与磁性氧化石墨烯间的π-π堆叠作用，将所述中间体吸附到磁性氧化石墨烯，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。
5.权利要求4所述的检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法，其特征是，包括以下步骤：将所述中间体和磁性氧化石墨烯混合反应后，将反应体系磁性分离，除去未结合的中间体，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。
6.如权利要求5所述的检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法，其特征是：所述中间体与磁性氧化石墨烯的体积比例为(90～110):1。
7.一种磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小RNA的比色法，其特征是：基于权利要求4所述的磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA吸附能力的差别，加入待测目标小RNA后，DNA1的识别段与待测目标小RNA特异性结合，形成DNA/RNA双链结构，从而将吸附在磁性氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中，磁性分离后，通过直接观察上清液颜色的变化并运用紫外-可见分光光度计进行定量分析，实现对小RNA的比色法检测。
8.如权利要求7所述的比色法，其特征是，包括以下步骤：
(1)将磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物制备成为磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液；
(2)制作标准曲线：将不同浓度的目标小RNA加入到步骤(1)中的溶液中，进行反应，反应后将反应液磁性分离，测定不同浓度下的紫外-可见吸收光谱，制作标准曲线；
(3)测定待测目标小RNA：将待测目标小RNA加入到步骤(1)中的溶液，进行反应，反应后将反应液磁性分离，测定紫外-可见吸收光谱，根据标准曲线计算得到待测目标小RNA的浓度。
9.如权利要求8所述的比色法，其特征是步骤(2)和步骤(3)中，反应温度为30～40℃，反应时间为0.5～1.5h。
10.下述任一应用：
权利要求1所述的中间体在检测小RNA的应用；
权利要求4所述的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物在检测小RNA的应用；
权利要求7～9中任一项所述的比色法在检测小RNA的应用。
CN201610209399.3A 2016-04-06 2016-04-06 磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用 Pending CN105886611A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610209399.3A CN105886611A (zh) 2016-04-06 2016-04-06 磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610209399.3A CN105886611A (zh) 2016-04-06 2016-04-06 磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105886611A true CN105886611A (zh) 2016-08-24

Family

ID=57013349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610209399.3A Pending CN105886611A (zh) 2016-04-06 2016-04-06 磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105886611A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636405A (zh) * 2016-12-26 2017-05-10 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种核酸检测的复合物及其制备方法与核酸检测的方法
CN107121464A (zh) * 2017-05-03 2017-09-01 湖北大学 一种磁性双功能纳米探针及其制备方法和应用
CN108359715A (zh) * 2018-02-06 2018-08-03 中国科学院上海高等研究院 Poly A介导的可调控纳米金探针及其制备与应用
CN112326763A (zh) * 2020-09-24 2021-02-05 福建医科大学附属第一医院 一种可用于临床样品等位基因分型的dna纳米筛可再生电化学传感器
CN114470204A (zh) * 2022-02-10 2022-05-13 西安交通大学 一种实现多模态治疗的智能金纳米粒子的制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031375A (zh) * 2012-12-10 2013-04-10 江苏大学 一种dna甲基化检测试剂盒及其检测方法
CN103882132A (zh) * 2014-03-27 2014-06-25 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 痕量rna实时动态检测方法
CN104726605A (zh) * 2015-04-08 2015-06-24 中国科学院上海高等研究院 一种基于纳米金的分子信标及其制备与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031375A (zh) * 2012-12-10 2013-04-10 江苏大学 一种dna甲基化检测试剂盒及其检测方法
CN103882132A (zh) * 2014-03-27 2014-06-25 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 痕量rna实时动态检测方法
CN104726605A (zh) * 2015-04-08 2015-06-24 中国科学院上海高等研究院 一种基于纳米金的分子信标及其制备与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZONGHUA WANG等: "Lable-free quadruple signal amplification strategy for sensitive electrochemical p53 gene biosensing", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
叶宗煌: "基于石墨烯构建新型生物传感器的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 信息科技辑》 *
陈敏: "氧化石墨烯和DNA纳米结构用于核酸检测的研究", 《万方 中国学位论文全文数据库》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636405A (zh) * 2016-12-26 2017-05-10 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种核酸检测的复合物及其制备方法与核酸检测的方法
CN106636405B (zh) * 2016-12-26 2021-01-05 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种核酸检测的复合物及其制备方法与核酸检测的方法
CN107121464A (zh) * 2017-05-03 2017-09-01 湖北大学 一种磁性双功能纳米探针及其制备方法和应用
CN107121464B (zh) * 2017-05-03 2019-04-30 湖北大学 一种磁性双功能纳米探针及其制备方法和应用
CN108359715A (zh) * 2018-02-06 2018-08-03 中国科学院上海高等研究院 Poly A介导的可调控纳米金探针及其制备与应用
CN112326763A (zh) * 2020-09-24 2021-02-05 福建医科大学附属第一医院 一种可用于临床样品等位基因分型的dna纳米筛可再生电化学传感器
CN112326763B (zh) * 2020-09-24 2022-10-21 福建医科大学附属第一医院 一种可用于临床样品等位基因分型的dna纳米筛可再生电化学传感器
CN114470204A (zh) * 2022-02-10 2022-05-13 西安交通大学 一种实现多模态治疗的智能金纳米粒子的制备方法与应用
CN114470204B (zh) * 2022-02-10 2022-11-04 西安交通大学 一种实现多模态治疗的智能金纳米粒子的制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105886611A (zh) 磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用
Liu et al. Point-of-care assay of alkaline phosphatase enzymatic activity using a thermometer or temperature discoloration sticker as readout
Luo et al. Fluorescent aptasensor for antibiotic detection using magnetic bead composites coated with gold nanoparticles and a nicking enzyme
Krysztafkiewicz et al. Adsorption of dyes on a silica surface
Liu et al. Facile molecular imprinting on magnetic nanozyme surface for highly selective colorimetric detection of tetracycline
Ning et al. Luminescent MOF nanosheets for enzyme assisted detection of H2O2 and glucose and activity assay of glucose oxidase
He et al. One-step label-free optical genosensing system for sequence-specific DNA related to the human immunodeficiency virus based on the measurements of light scattering signals of gold nanorods
CN102507921B (zh) 一种检测微囊藻毒素的方法
Chen et al. DNA-mediated inhibition of peroxidase-like activities on platinum nanoparticles for simple and rapid colorimetric detection of nucleic acids
Liang et al. Fluorescence “turn-on” determination of H2O2 using multilayer porous SiO2/NGQDs and PdAu mimetics enzymatic/oxidative cleavage of single-stranded DNA
Chen et al. A label-free colorimetric platform for DNA via target-catalyzed hairpin assembly and the peroxidase-like catalytic of graphene/Au-NPs hybrids
Yang et al. Diazo-reaction-based SERS substrates for detection of nitrite in saliva
Xu et al. Tetrahedral DNA framework based CRISPR electrochemical biosensor for amplification-free miRNA detection
Zhao et al. A novel sensing platform using aptamer and RNA polymerase-based amplification for detection of cancer cells
CN105044273B (zh) 一种基于纳米粒子标记氧化还原循环检测多巴胺的方法
Zhu et al. Highly selective imaging of lysosomal azoreductase under hypoxia using pH-regulated and target-activated fluorescent nanoprobes
Tian et al. TiO2 nanoparticle-enhanced linker recombinant strand displacement amplification (LRSDA) for universal label-free visual bioassays
Li et al. Quantum dot based molecularly imprinted polymer test strips for fluorescence detection of ferritin
Gao et al. An aptamer-based colorimetric assay for chloramphenicol using a polymeric HRP-antibody conjugate for signal amplification
Xu et al. A one step method for isolation of genomic DNA using multi-amino modified magnetic nanoparticles
CN105400781B (zh) 一种双嵌段分子探针及其快速检测核酸方法
ChingáCheung et al. A highly versatile platform based on geometrically well-defined 3D DNA nanostructures for selective recognition and positioning of multiplex targets
Cheng et al. Highly sensitive plasmonic biosensor for hepatitis B virus DNA based on the surface etching of the active helical gold nanorods
Zou et al. A reusable electrochemiluminescence biosensor controlled by a nanochannel gating system for T-2 toxin detection
Nag et al. In-situ synthesis of plasmonic core MIPs on U bend optical fibers for LSPR sensing of small molecule contaminants in food and environment: An illustration with Bisphenol A

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination