CN103290132B - 一种用于检测汞离子的核酸纳米金生物传感器及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测汞离子的核酸纳米金生物传感器以及相应的试剂盒。本发明所述的核酸纳米金生物传感器，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线；所述金标垫上喷有胶体金；所述检测线是用链霉亲和素和标记有生物素的SEQ ID NO:3序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成的；所述质控线是链霉亲和素和标记有生物素的SEQ ID NO:4序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成的；所述胶体金结合有SEQ ID NO:2的序列，该序列的5’端用巯基修饰。本发明所述的核酸纳米金生物传感器以及相应的试剂盒实现了对汞离子的快速、简便、直接的检测，既解决了以往检测方法中需要大型仪器的缺陷，又能保证检测灵敏度。

Description

一种用于检测汞离子的核酸纳米金生物传感器及试剂盒

技术领域

本发明涉及金属离子检测领域，具体涉及一种用于检测汞离子的核酸纳米金生物传感器以及相应的试剂盒。

背景技术

目前国内外检测汞离子的传统方法主要有光谱分析法、质谱法和色谱法。光谱分析法指利用光谱学的原理和实验方法以确定物质的结构和化学成分的分析方法，包括可见分光光度法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、原子发射光谱法等。可见分光光度法分析汞离子的灵敏度低、选择性不高，并且需要使用剧毒物质和具有挥发性的有机溶剂，对实验人员有潜在的伤害。火焰原子吸收光谱中和石墨炉原子吸收光谱的实验条件相对复杂，需要用到大型的仪器，前者的检测灵敏度相对较低，后者虽然具有较高的灵敏度，但容易受到其他共存杂质的干扰，影响测定的准确性。原子荧光光谱法利用汞离子与还原剂反应时，可形成气态氢化物，原子化后可进行荧光测定的原理进行检测。此方法虽然在灵敏度和抗干扰程度方面都优于石墨炉原子吸收光谱法，但操作难度高，检测程序很繁琐。质谱法是用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出了离子的准确质量，就可以确定离子的化合物组成。色谱法是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以固定相对流动相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。这两种方法具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，可以实现多组分分析的特点，但仪器比较昂贵，操作复杂，很难在一些缺乏设备资源的地方得到应用。

近年来，纳米材料的发展为解决这一问题提供了新的思路。纳米技术和生物技术，特别是二者的交叉领域，是当代科技的热点领域。金属纳米颗粒和核酸酶在检测分析领域的应用得到了广泛的关注和持续不断研究。胶体金颗粒是一种常用的纳米示踪物，在各种分析检测技术尤其是在电镜、免疫和生化检测中有着广泛的应用。胶体金颗粒直径通常在5-100nm之间，用全波段的光谱进行扫描的时候，不同粒径的胶体金溶液在不同的波长段有相应的吸收峰。一般来说，2-5nm粒径的的胶体金的溶液呈橘黄色；5-20nm的呈酒红色；20-40nm的是深红色；60nm以上粒径的胶体金的溶液的颜色是蓝紫色。胶体金表面的负电荷使其很容易与自然界中的带有正电荷的物质结合，如多肽和蛋白。由于胶体金具有独特的光学、电子学特性与良好的生物相容性，所以被广泛地应用于分析检测技术的各个领域。核酸酶是生命基础研究的重要内容，同时也是检测分析领域的重要工具。目前，利用核酸酶开发各种信号扩增技术用于细胞、蛋白、核酸、小分子甚至离子的检测吸引了越来越多的研究兴趣。在这类技术方案中，分析物首先由某种工程化的DNA探针识别，接着，核酸酶信号扩增系统将分析物的量化信息转变并放大为某种DNA的量化信息；最后通过分析DNA的量来达到分析某种物质的目的。这种基于核酸酶的信号扩增检测技术灵敏度高，可分析的物质多且成本低，十分适合快速检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的汞离子检测技术中存在的不足，提供一种检测汞离子的核酸纳米金生物传感器，可以更简单更快速地对样品中的汞离子进行检测。

本发明所述的一种用于检测汞离子的核酸纳米金生物传感器，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线；所述金标垫上喷有胶体金；所述检测线是用链霉亲和素和标记有生物素的SEQ ID NO:3序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成的；所述质控线是链霉亲和素和标记有生物素的SEQ ID NO:4序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成的；所述胶体金结合有SEQ ID NO:2的序列，该序列的5’端用巯基修饰。

本发明还提供了一种用于检测汞离子的试剂盒。

本发明所述的用于检测汞离子的试剂盒，包括：本发明所述核酸纳米金生物传感器；以及汞离子的检测体系，包括：聚合酶、切刻酶、酶缓冲液、Mg²⁺、序列为SEQ ID NO:1的DNA探针、dNTPs；其中，所述的DNA探针是与汞离子特异性结合的寡聚核苷酸序列，包括一段切刻酶识别序列，该识别序列的上游为一段随机序列，该识别序列的下游为一段在汞离子存在时会折叠形成发夹构象的序列。

本发明利用汞离子存在时，核酸中的胸腺嘧啶碱基(T)能特异性的与汞离子形成T-Hg²⁺-T配合物这一原理，并利用免疫胶体金作为放大显色系统，设计出了一种高灵敏度、低费用、不需要使用任何仪器的胶体金试纸条生物传感器。应用此生物传感器，可以快速的检测汞离子，当Hg²⁺浓度高于5nM，检测线均显出肉眼可见的红色，并且随着Hg²⁺浓度的增加，检测线的颜色也逐渐加深。因此，不仅在灵敏度和特异性上能达到要求，且快速、简便、直接，对汞离子的检测有重要意义。本发明既解决了以往检测方法中需要大型仪器的缺陷，又能保证检测灵敏度，而且制备简便、检测迅速，不需要专业的技术人员。

本发明所提供的的DNA探针，在Hg²⁺存在时，它折叠成发夹型构象，这一构象在切刻酶(例如Nt.BbvCⅠ)的帮助下触发聚合酶(例如Klenow)的信号扩增反应；这一信号扩增反应将汞离子的浓度信息转化并放大为一种单链DNA的浓度信息，通过胶体金试纸条检测该DNA从而得到汞离子的浓度信息。

附图说明

图1为本发明所述核酸纳米金生物传感器原理示意图。

图2为本发明所述核酸纳米金生物传感器检测后的结果示意图。

图3为本发明所述核酸纳米金生物传感器检测汞离子的灵敏度结果图。

图4为本发明所述核酸纳米金生物传感器检测汞离子的特异性结果图。

具体实施方式

实施例1 本发明所述核酸纳米金生物传感器与试剂盒的制备

1、四种核酸序列的设计

上世纪90年代，Thomas Carell发现核酸中的胸腺嘧啶碱基(T)能特异性地与汞离子形成T-Hg²⁺-T配合物，该配合物的热稳定性高于A-T碱基对。二者形成的双链的解链温度差值最大可达到7℃。

本发明根据此原理，经实验筛选，合成了以下四段核苷酸序列：

第一段为汞离子特异性结合的寡聚核苷酸序列，含有64个碱基，如SEQ ID NO:1所示。它包括一段在Hg²⁺存在时会折叠形成发夹构象的序列，一段切刻酶(例如Nt.BbvCⅠ)识别序列和一段随机序列。

SEQ ID NO:1

5’-TGTACATACGATGATCGCTG-GCTGAGG-CCCCAGATTCTTTCTTCCCTTGTTTGTTTCTGGGG

其中下划线标出的部分为切刻酶识别位点，其上游部分为随机序列，其下游部分为环状结构形成区域。

第二段序列用于胶体金标记，序列为5’-SH-SEQ ID NO:2，它的5’端用巯基修饰，标记在胶体金颗粒上，其序列与第一段序列随机部分的部分序列相同，可与第一段序列的互补产物结合。

SEQ ID NO:2   5’-SH-TTTTTTTTTT-ATGATCGCTG

第三段序列划在检测线上，序列为5’-SEQ ID NO:3-biotin-3’，这段序列与第一段序列随机部分的另一部分序列相同，通过其与第一段序列的互补产物结合以聚集胶体金颗粒。

SEQ ID NO:3   5’-TGTACATACG-TTTTTTTTTT-生物素-3’

第四段为质控序列，划在质控线上，序列为5’-biotin-SEQ ID NO:4，它与胶体金颗粒上标记的第二段序列互补，用于检测生物传感器的稳定性。

SEQ ID NO:4   5’-生物素-TTTTTTTTTT-CAGCGATCAT

2.纳米金(胶体金)的制备：

向500ml的锥形瓶中称取100g超纯水，加入1ml1％的HAuCL₄溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中迅速加入4ml1％的柠檬酸三钠，溶液变为紫红色后，继续煮沸10分钟，停止加热继续搅拌直至冷却；胶体金溶液4℃避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度值鉴定。

3.金标核酸的制备：

用100μl去离子水溶解1OD核酸序列2(第二段核酸序列，即SEQ ID NO:2)，加入到1ml4倍体积浓缩的胶体金溶液中，4℃24小时；加入NaCl和1％的SDS，分别至终浓度为0.15M和0.01％，4℃过夜，11500转/分钟离心20分钟，弃上清，沉底用1ml重悬液(20mM Na₃PO₄,5％BSA,0.25％Tween和10％蔗糖)重悬，重复洗三遍后用1ml的重悬液重新悬浮，制成悬浮液。

4.样品垫的处理

玻璃纤维浸泡在杂交液(2％TritonX-100、20mM Tris-Hcl、1％BSA，pH8.0)中5分钟后，37℃烘干备用。

5.金标垫的制备

将本发明制备的金标核酸序列涂于玻璃纤维上，37℃干燥2个小时，制成金标垫，备用。

6.硝酸纤维素膜上检测线和质控线的处理

用去离子水溶解1OD的核酸序列3(第三段核酸序列，即SEQ ID NO:3)，使其浓度为100μM，取15μl100μM的核酸序列3，加入15μl(1mg/ml)链和亲霉素，室温下反应2小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜检测线上，37℃干燥两个小时。

用去离子水溶解1OD的核酸序列4(第四段核酸序列，即SEQ ID NO:4)，使其浓度为100μM，取15μl100μM的核酸序列4，加入15μl(1mg/ml)链和亲霉素，室温下反应2小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜质控线上，37℃干燥两个小时。

7.胶体金试纸条的组装

将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。

如图1所示，汞离子检测传感器包括四个部分：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜上有两条线，分别为检测线和质控线。结合有第二段序列的胶体金喷在金标垫上，用链霉亲和素与标记有生物素的第三段序列应后，划在硝酸纤维素膜上形成检测线；用链霉亲和素与标记有生物素的第四段序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成质控线。

8.Hg²⁺的检测体系的确定

Hg²⁺的检测体系，包括：反应缓冲液、DNA探针(第四段核酸序列，即SEQ ID NO:1)、dNTPs、聚合酶(Klenow large fragment polymerase exo^-)、切刻酶(Nt.BbvCⅠ)。

9.检测方法

在检测体系中加入样本，置于PCR仪中37度温育1小时，最后采用核酸纳米金生物传感器对反应产物进行检测及结果分析。如果待测样品中含有汞离子，则第一段序列的发夹结构会形成并触发聚合酶合成随机序列的互补序列。随后，切刻酶会识别第一段序列中的切刻酶识别位点并切刻形成一个缺口，聚合酶在此缺口处再次进行聚合反应，结果形成了一条新链并置换了原来的互补DNA链。这样大量互补序列被合成，其可与胶体金上标记的核酸序列以及检测线上的核酸序列结合，导致胶体金颗粒停留在检测线上，从而使得检测线显红色；胶体金颗粒继续往前经过质控线，胶体金上标记的核酸序列可与质控线上的核酸序列发生互补配对反应，使得质控线显红色，为阳性结果。如果待测样品中没有汞离子，则检测线不显色，但胶体金颗粒上标记的序列仍然能与质控线上的序列发生反应，质控线显红色，为阴性结果。如果质控线不显色，不管检测线显色与否，都说明生物传感器本身出现了问题，结果不可信，无效结果。

质量控制标准(图2)：

(1)C线(质控线)出现红色的线证明纳米金生物传感器有效。

(2)T线(检测线)出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。

结果判定标准(图2)：

(1)C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品中Hg²⁺含量超标；

(2)C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品中Hg²⁺含量没有超标；

(3)C线没有出现红色的线，说明纳米金生物传感器失效。

实施例2：核酸纳米金生物传感器的检测实验

采用实施例1所制成的核酸纳米金生物传感器，进行以下实验，验证其检测效果。

1.配制汞离子标准溶液梯度，浓度分别为2μM、1μM、0.5μM、0.1μM、50nM、10nM、5nM，室温保存。

2.配制2μM的Mn²⁺、Cd²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺溶液。

3.使用200μL的PCR管配置终体积为50μL检测反应体系。反应缓冲液终浓度为1×，(即，NaAc(50mM),Mg(Ac)₂(10mM),Tris-acetate(20mM),pH7.9)，DNA探针(ssProbe)终浓度为0.1μM，dNTPs终浓度为0.4mM，聚合酶(Klenow large fragment polymerase exo^-)用量为8U，切刻酶(Nt.BbvCⅠ)用量为10U；加入样本。具体请见下表：

将上述PCR管置于PCR热循环仪器中，设置程序，37℃温育1小时，4℃低温保存；

4.将所得检测反应溶液滴加至生物传感器样品垫上，并在检测反应溶液后部进一步滴加约60μL的4×SSC溶液，使检测反应溶液进入层析膜；10分钟后观察质控线和检测线的颜色变化。

结果显示：在Hg²⁺浓度为5nM以上的条件下，检测线均显出肉眼可见的红色，并且，随着Hg²⁺浓度的增加，检测线的颜色也逐渐加深。同时，质控线也呈现均一的红色，说明生物传感器的体系正常，结果可信。在2.0μM的条件下，只有Hg²⁺的检测线显出肉眼可见的红色，其它Mn²⁺、Cd²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺均不显色。该结果显示出了此生物传感器有着良好的特异性。同时，质控线也呈现均一的红色，说明生物传感器的体系正常，结果可信(参见图3和图4)。

                         序列表（SEQUENCE LISTING）

 

<110>  中国科学院广州生物医药与健康研究院

 

<120>  一种用于检测汞离子的核酸纳米金生物传感器及其制备方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  62

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

tgtacatacg atgatcgctg gctgaggccc cagattcttt cttcccttgt ttgtttctgg     60

 

gg                                                                    62

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

tttttttttt atgatcgctg                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

tgtacatacg tttttttttt                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

tttttttttt cagcgatcat                                                 20

 

 

 

Claims (3)

1.一种用于检测汞离子的核酸纳米金生物传感器，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线；所述金标垫上喷有胶体金；其特征在于：

所述检测线是用链霉亲和素和标记有生物素的SEQ ID NO:3序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成的；

所述质控线是链霉亲和素和标记有生物素的SEQ ID NO:4序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成的；

所述胶体金结合有SEQ ID NO:2的序列，该序列的5’端用巯基修饰。

2.一种用于检测汞离子的试剂盒，其特征在于，包括：

如权利要求1所述核酸纳米金生物传感器；以及

汞离子的检测体系，包括：聚合酶、切刻酶、酶缓冲液、Mg²⁺、序列为SEQ ID NO:1的DNA探针、dNTPs；

其中，所述的DNA探针是与汞离子特异性结合的寡聚核苷酸序列，包括一段切刻酶识别序列，该识别序列的上游为一段随机序列，该识别序列的下游为一段在汞离子存在时会折叠形成发夹构象的序列。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述汞离子的检测体系中，当总体积为50μl时，1×缓冲液5μl，终浓度为0.1mM的dNTPs0.5μl，终浓度为0.05μM的DNA探针2.5μl，切刻酶10U，聚合酶1U，样本5μl，其余为去离子水。