CN105911048B - 碳纳米管标记的试纸、其制备方法及快速检测Hg2+的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碳纳米管标记的试纸、其制备方法及快速检测Hg²⁺的方法。所述试纸包括依次粘贴的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫等，所述硝酸纤维素膜上分布有检测线和质控线，其中，所述金标垫上分布有碳纳米管与检测探针的偶联物，所述检测线和质控线上分别分布有T线探针和C线探针，所述检测探针、T线探针和C线探针分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的核酸序列。藉由本发明提供的所述试纸，利用Hg²⁺存在时T‑Hg²⁺‑T碱基能够互补配对的原理，配合碳纳米管标记显色，可以实现对Hg²⁺的精确、灵敏、快速的现场检测。

Description

碳纳米管标记的试纸、其制备方法及快速检测Hg2+的方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种碳纳米管标记的试纸、其制备方法及其应用，例如在快速检测Hg²⁺中的用途。

背景技术

随着我国经济的发展，各种工厂越来越多，污水排放，废气排放等做法对环境的污染越来越严重，而人的生活离不开环境，重金属污染对人类的健康造成了极大的威胁，汞污染是重金属污染中的一种。

Hg²⁺对人体存在严重危害，若存在于天然水体中，则会对大范围的人群造成威胁。它能够在生物体内积累，通过食物链转入到人体内，对人和生物体造成危害。有研究表明汞离子进入人体内，能破坏DNA，抑制配体与受体的相互作用，影响肝脏和肾脏的正常功能，破坏免疫系统的动态平衡，甚至导致死亡。在某些情况下，汞离子在微生物的作用下，转化为甲基汞，甲基汞可通过食物链进入人体，当有大量的甲基汞进入人体时，可出现急性脑损伤，导致意识障碍、痉挛、麻痹，严重可导致死亡。如日本的水俣事件，使人们充分认识到汞离子尤其是甲基汞对人和动物的毒害。为此，世界卫生组织规定，饮用水中汞离子不得高于1ppb。

目前，常用的汞离子检测方法主要有分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法等，但其所用的仪器均为大型的实验仪器，不能实现现场快速检测，且检测周期长，价格昂贵。不能满足对Hg²⁺检测简单，快捷，高灵敏度的要求。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种碳纳米管标记的试纸、其制备方法及快速检测Hg²⁺的方法，以克服现有技术中的不足。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种碳纳米管标记的试纸的制备方法，其包括：

1)将玻璃纤维素膜切成条状，之后用样品垫处理液浸泡、取出，并烘干后备用，形成样品垫，其中，所述样品垫处理液为含有0.25-0.75wt％曲拉通x-100、0.15-0.3mM NaCl及 0.05M Tris-HCl的缓冲体系，pH值为8.0；

2)将玻璃纤维素膜切成条状，之后用金标垫处理液浸泡、取出、烘干，再滴加碳纳米管与检测探针的偶联物，之后烘干，形成金标垫，其中，所述金标垫处理液为包含5-10wt％蔗糖、1-3wt％海藻糖、0.5-2wt％聚乙二醇及0.3-1wt％吐温20且浓度为0.01M PBS的缓冲体系，pH值为7.4；

3)将吸水纸切成条状，形成吸水垫；

4)将T线探针与链酶亲和素的偶联物、C线探针与链酶亲和素的偶联物分别喷涂在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上，而后干燥，完成对硝酸纤维素膜的处理；

5)在底板上沿横向依次粘贴所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，并使相邻粘贴物之间部分重叠，以此形成碳纳米管标记的试纸。

进一步的，所述碳纳米管与检测探针的偶联物的制备方法包括：取体积比为5：3：2的浓度为5-10mg/mL的碳纳米管溶液、浓度为40mM的EDC溶液和浓度为40mM的NHS溶液混合，避光混匀，之后加入浓度为2-5μM的检测探针溶液，并使检测探针溶液与碳纳米管溶液的体积比为20：7，避光混匀，而后离心处理,弃上清，加重悬液重悬，待用，所述重悬液为包含5-10wt％BSA、0.25-0.75wt％Tween 20和10-20wt％Sucrose的，且浓度为1-5mM 的Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0。

进一步的，所述的制备方法包括：

1)取体积比为20：7的浓度为100-200μM的T线探针溶液或C线探针溶液与浓度为83.3-100μM的链酶亲和素溶液混匀后，在室温下振摇孵育，再加PBS缓冲液，混匀后，即制得T线探针与链酶亲和素的偶联物的母液或者C线探针与链酶亲和素的偶联物的母液；

2)将T线探针和链酶亲和素的偶联物的母液、C线探针和链酶亲和素的偶联物的母液分别喷涂在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上，而后干燥，完成对硝酸纤维素膜的处理。

进一步的，所述检测探针具有SEQ ID No.1所示的核酸序列，所述T线探针具有SEQID No.1所示的核酸序列，所述C线探针具有SEQ ID No.3所示的核酸序列。

进一步的，相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2-4mm。

由前述任一种方法制备的碳纳米管标记的试纸。

一种碳纳米管标记的试纸，包括在底板上沿横向依次粘贴的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，且相邻粘贴物之间部分重叠，所述硝酸纤维素膜上分布有检测线和质控线，所述金标垫上分布有碳纳米管与检测探针的偶联物，所述检测线和质控线上分别分布有T线探针和C线探针，所述检测探针、T线探针和C线探针分别具有SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、 SEQ ID No.3所示的核酸序列。

进一步的，相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2-4mm。

一种快速检测Hg²⁺的方法，其包括：

提供所述的碳纳米管标记的试纸，

将可能含有Hg²⁺的待测样品溶液滴加在样品垫上，通过观测检测线上的显色情况，实现对待测样品中Hg²⁺的检测。

在本发明的一些实施例中，藉由所述碳纳米管标记的试纸快速检测Hg²⁺的方法包括以下步骤：

1)将羧基化的碳纳米管与5’端氨基修饰的富T探针一(检测探针)进行偶联而使碳纳米管核酸功能化；

2)将核酸功能化的碳纳米管标记于试纸上，同时在所述试纸上的检测线位置固定富T探针二(T线探针)；

3)在Hg²⁺存在下，根据T-Hg²⁺-T原理，使两条富T探针杂交，将碳纳米管捕获在检测线 (含C线探针)上，从而使检测线显色用以检测Hg²⁺的存在。

与现有技术相比，本发明的优点至少在于：

1)本发明提供的碳纳米管标记的试纸快速检测Hg²⁺的方法，利用Hg²⁺存在时T-Hg^{2 +}-T碱基能够互补配对的原理，配合碳纳米管标记显色，用来检测Hg²⁺，可以实现对目标检测物Hg²⁺更加精确、灵敏、快速的检测。

2)本发明解决了以往用大型仪器检测Hg²⁺的缺陷，适合于现场快速检测以及对大量样品的分析筛查，因此对保障食品安全卫生具有重要意义。

3)本发明提供的碳纳米管标记的试纸结构简单，制备方便，成本低廉。

附图说明

为了更清楚地说明本发明结构特征和技术要点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

图1为本发明实施例所公开的碳纳米管标记的试纸的结构示意图；

图2为本发明实施例所公开的利用碳纳米管标记的试纸检测不同浓度的Hg²⁺标准液的检测结果示意图；

图3为本发明实施例所公开的利用碳纳米管标记的试纸检测不同种类离子的检测结果示意图；

图4为本发明实施例所公开的利用碳纳米管标记的试纸检测自来水中Hg²⁺的检测结果示意图。

附图标记说明：1-底板，2-样品垫，3-金标垫，4-硝酸纤维素膜，5-吸水垫，T-检测线， C-质控线。

具体实施方式

下面将结合本实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行具体、清楚、完整地描述。

参见图1所示，本实施例公开了一种碳纳米管标记的试纸，其包括底板1以及沿底板1 的横向依次粘贴于底板1上的样品垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜(NC膜)4以及吸水垫5，相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2mm，样品垫2和金标垫3的材质均为玻璃纤维素膜，NC膜4上依次喷有检测线T(T线)和质控线C(C线)，其中，且金标垫上滴设有碳纳米管与检测探针(富T探针一)的偶联物，检测线上固定有T线探针(富T探针二)，质控线上固定有C线探针。

具体的，检测探针的序列如SEQ ID No.1所示，即为：5’-NH2-ACAAT CGCGT CATTCAAA GCTG TTAC ACTT CAT AGT GGCG GTG TCG CG-3，其5’端氨基修饰，可与碳纳米管表面的羧基，在碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)的存在下发生脱水缩合反应形成酰胺键偶联，将检测探针固定在碳纳米管表面。

T线探针的序列如SEQ ID No.2所示，即为：5’-Biotin-TTCG GCT CTCG TTT GTGTTT TTTG CATT GT-3’，其5’端由生物素修饰，可与链酶亲和素发生特异性结合。

C线探针的序列如SEQ ID No.3所示，即为：5’-Biotin-ACG CGA CAC GCC ACT ATGAG-3’，其能够与碳纳米管表面固定的检测探针杂交而使碳纳米管固定在质控线上。

需要进一步说明的是，硝酸纤维素膜上的质控线，作为检测是否有效的指示线，其上固定的核酸探针，为一段能与检测探针互补的DNA序列，称为C线探针。无论Hg²⁺存在与否，C 线探针总能与碳纳米管表面固定的检测探针杂交，使碳纳米管固定在质控线上，显色，从而作为质量监控。

藉由本实施例的碳纳米管标记的试纸快速检测Hg²⁺的方法包括以下步骤：

1)将羧基化的碳纳米管与5’端氨基修饰的检测探针(富T探针一)进行偶联而使碳纳米管核酸功能化，将检测探针固定在碳纳米管表面；

2)将核酸功能化的碳纳米管标记于试纸上，同时在试纸上的检测线位置固定T线探针(富 T探针二)；

3)在Hg²⁺存在下，根据T-Hg²⁺-T碱基能够互补配对的原理，使两条富T探针杂交，将碳纳米管捕获在检测线上，从而使检测线显色用以检测Hg²⁺的存在。

本实施例的碳纳米管标记的试纸的制备方法包括以下步骤：

1)样品垫的制备：将玻璃纤维素膜切成29mm×300mm规格的条状，之后用样品垫处理液 (0.05M Tris-HCl pH 8.0的缓冲体系中0.25wt％曲拉通x-100,0.15mM NaCl)浸泡4个小时，取出，放在37℃烘箱中烘干、备用。

2)金标垫的制备：将玻璃纤维素膜切成4mm×300mm规格的条状，之后用金标垫处理液(0.01M PBS pH 7.4的缓冲体系中5wt％蔗糖，1wt％海藻糖，0.5wt％聚乙二醇，0.3wt％吐温20)浸泡4个小时，取出，放在37℃烘箱中，烘干后切成4mm×4mm大小的片状。将重悬后的碳纳米管与检测探针的偶联物用移液枪滴在4mm×4mm的片状金标垫上，每片滴7μL，之后，将金标垫放入37℃烘箱烘干、待用。

3)吸水垫的制备：将吸水纸切成28mm×300mm规格的条状，无需处理，即可使用。吸水垫采用高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率和厚度的吸水纸。

4)NC膜的制备：本实施例中购买的NC膜规格为25mm×300mm，不用处理，即可使用。将T线探针与链酶亲和素的偶联物的母液、C线探针与链酶亲和素的偶联物的的母液分别用喷膜仪以0.6μL/cm的速度平行喷涂在检测线和质控线上，检测线和质控线之间的距离为3mm，然后将NC膜至于37℃下干燥10小时。

5)试纸条的组装：取底板，底板采用不干胶塑衬底，主要起支撑作用。在所述底板上沿其横向依次粘贴所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2mm。

具体的，本实施例选用碳纳米管作为显色标记物，碳纳米管与检测探针的偶联的方法如下：

1)碳纳米管表面羧基的活化：取200μL 5mg/mL CNT、120μL 40mM EDC和80μL 40mMNHS于玻璃小瓶中，避光振摇3小时。

2)碳纳米管与检测探针偶联：在碳纳米管表面羧基的活化后，向玻璃小瓶中加入70μL 2μM的检测探针，继续避光振摇12小时。

3)重悬：将碳纳米管与检测探针的偶联物离心(950rpm,6min),弃上清，加200μL重悬液(1mM Tris-HCl pH 8.0，5wt％BSA,0.25wt％Tween 20,10wt％Sucrose)重悬，放4℃冰箱、待用。

T线探针和C线探针固定在硝酸纤维素膜上的方法，包括以下步骤：

1)取20μL 100μM T线探针或C线探针于玻璃小瓶中，向其中加入7μL 83.3μM 链酶亲和素混匀后，在室温下振摇孵育3小时之后，向其中加入83μL 1mM PBS(PH 7.4)，混匀后，即制备完成T线探针或C线探针与链酶亲和素偶联复合物的母液。

2)将T线探针和链酶亲和素的偶联物的母液、C线探针和链酶亲和素的偶联物的母液用喷膜仪以0.6μL/cm的速度平行喷涂在检测线和质控线上，检测线和质控线之间的距离为3 mm，然后将NC膜至于37℃下干燥10小时。

由于T线探针和C线探针的5’端由生物素修饰，生物素可与链酶亲和素特异性结合，而链酶亲和素为生物大分子蛋白质，能够吸附在硝酸纤维素膜上，以此实现了T线探针和C 线探针分别固定在检测线和质控线上。

以下结合附图和文字说明本发明提供的碳纳米管标记的试纸检测Hg²⁺的常规试验手段，从而更加明确该纳米管标记的试纸的检测Hg²⁺的性能。

1)Hg²⁺标准样品的检测

利用本实施例的碳纳米管标记的试纸检测Hg²⁺样品的标准溶液((0、0.01、0.05、0.1、 0.5、1、5ppb)，上样缓冲液为(10mM Tris-HCl,5mM MgCl₂,5mM KCl,1wt％BSA,4 ×SSC,1wt％Tween-20,1mM CTAB,2wt％PEG)。如图2所示，检测结果清晰地表明：观测的检测限为0.05ppb。

2)特异性实验

利用本实施例的碳纳米管标记的试纸，分别检测溶液中含有100ppb的(Mg2+、Ni2+、 Ag+、Ca2+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、Al3+、Pb2+)、1ppb Hg²⁺的样品溶液。结果如图3所示，只有检测Hg²⁺样品溶液时，检测线显色，检测其他金属离子的试纸条的检测线不显色，或显色极弱。由此可见，本实施例的碳纳米管标记的试纸条法快速检测Hg²⁺的方法具有高灵敏度和高选择性。

3)实际样品自来水中Hg²⁺的检测

利用本实施例的碳纳米管标记的试纸对实际样品自来水中的Hg²⁺进行检测：取实验室自来水，向其中标准添加Hg²⁺标准样溶液(浓度为0、0.1、0.5、1、5ppb)。如图4的检测结果可以看出，利用本实施例的碳纳米管标记的试纸可用于检测实际样品中的Hg²⁺。

综上所述，藉由本发明提供的碳纳米管标记的试纸，利用Hg²⁺存在时T-Hg²⁺-T碱基能够互补配对的原理，配合碳纳米管标记显色，可以实现对目标检测物Hg²⁺更加精确、灵敏、快速的现场检测。

上述具体实施方式，仅为说明本发明的技术构思和结构特征，目的在于让熟悉此项技术的相关人士能够据以实施，但以上所述内容并不限制本发明的保护范围，凡是依据本发明的精神实质所作的任何等效变化或修饰，均应落入本发明的保护范围之内。

<110> 合肥工业大学

<120> 碳纳米管标记的试纸、其制备方法及快速检测Hg²⁺的方法

<160> 3

<210> 1

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

5’-NH₂-ACAATCGCGTCATTCAAAGCTGTTACACTTCATAGTGGCGGTGTCGCG-3’

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

5’-Biotin-TTCGGCTCTCGTTTGTGTTTTTTGCATTGT-3’

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

5’-Biotin-ACGCGACACGCCACTATGAG-3’

Claims (5)

1.一种快速检测Hg²⁺的方法，其特征在于包括：

提供碳纳米管标记的试纸，所述试纸包括在底板上沿横向依次粘贴的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，且相邻粘贴物之间部分重叠，所述硝酸纤维素膜上分布有检测线和质控线，其特征在于：所述金标垫上分布有碳纳米管与检测探针的偶联物，所述检测线、质控线上分别分布有T线探针、C线探针，所述检测探针、T线探针、C线探针的核酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；

将含有Hg²⁺的待测样品溶液滴加在样品垫上，通过观测检测线上的显色情况，实现对待测样品中Hg²⁺的检测。

2.根据权利要求1所述的快速检测Hg²⁺的方法，其特征在于：相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2-4mm。

3.根据权利要求1所述的快速检测Hg²⁺的方法，其特征在于，所述碳纳米管标记的试纸的制备方法包括：

1)将玻璃纤维素膜切成条状，之后用样品垫处理液浸泡、取出，并烘干后备用，形成样品垫，其中，所述样品垫处理液为含有0.25-0.75wt％曲拉通x-100、0.15-0.3mM NaCl及0.05MTris-HCl的缓冲体系，pH值为8.0；

2)将玻璃纤维素膜切成条状，之后用金标垫处理液浸泡、取出、烘干，再滴加碳纳米管与检测探针的偶联物，之后烘干，形成金标垫，其中，所述金标垫处理液为包含5-10wt％蔗糖、1-3wt％海藻糖、0.5-2wt％聚乙二醇及0.3-1wt％吐温20且浓度为0.01M PBS的缓冲体系，pH值为7.4；

3)将吸水纸切成条状，形成吸水垫；

4)将T线探针与链酶亲和素的偶联物、C线探针与链酶亲和素的偶联物分别喷涂在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上，而后干燥，完成对硝酸纤维素膜的处理；

5)在底板上沿横向依次粘贴所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，并使相邻粘贴物之间部分重叠，以此形成碳纳米管标记的试纸。

4.根据权利要求3所述的快速检测Hg²⁺的方法，其特征在于，所述碳纳米管与检测探针的偶联物的制备方法包括：取体积比为5：3：2的浓度为5-10mg/mL的碳纳米管溶液、浓度为40mM的EDC溶液和浓度为40mM的NHS溶液混合，避光混匀，之后加入浓度为2-5μM的检测探针溶液，并使检测探针溶液与碳纳米管溶液的体积比为20：7，避光混匀，而后离心处理,弃上清，加重悬液重悬，待用，所述重悬液为包含5-10wt％BSA、0.25-0.75wt％Tween20和10-20wt％Sucrose的，且浓度为1-5mM的Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0。

5.根据权利要求3所述的快速检测Hg²⁺的方法，其特征在于，所述碳纳米管标记的试纸的制备方法包括：

取体积比为20：7的浓度为100-200μM的T线探针溶液或C线探针溶液与浓度为83.3-100μM的链酶亲和素溶液混匀后，在室温下振摇孵育，再加PBS缓冲液，混匀后，即制得T线探针与链酶亲和素的偶联物的母液或者C线探针与链酶亲和素的偶联物的母液；

将T线探针和链酶亲和素的偶联物的母液、C线探针和链酶亲和素的偶联物的母液分别喷涂在硝酸纤维素膜上的检测线、质控线上，而后干燥，完成对硝酸纤维素膜的处理。