CN101408496B - 利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法，具体为：采用现有技术的方法制备用于标记的硬质颗粒材料；将样品载体玻片经过洗涤液超声洗涤后，再经过多聚赖氨酸处理；制备用硬质颗粒材料标记的生物样品片；将样品片固定到样品贴片上；利用AFM的探针的轻敲模式对样品进行扫描；在室温、大气下以轻敲模式同时采集硬质标记材料的高度、振幅和相位的数据；以有差异的相位图颜色变化为主要判读依据，以高度图和振幅图作为辅助判定依据，结合生物对象形态确定硬质标记材料颗粒；通过确定硬质标记材料颗粒后确定被标记物存在。本发明扩展了原子力显微镜的生物学应用范围，可推广至核酸标记等领域，具有巨大的科学应用价值和市场应用价值。

Description

利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法

技术领域

本发明涉及扫描探针显微镜及相关扫描探针模式传感器生物学应用的标记检测领域，尤其是利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法。

背景技术

生物标记技术是目前广泛应用于生物领域的一门技术，其基本原理是利用标记物的信号结合生物材料特异结合的属性，进而通过对信号的阅读间接反映生物结合作用的存在。由于通常的抗原抗体结合反应，在反应量不足或抗原为半抗原、抗体为单价抗体时，肉眼不易察出。而有一些物质即使在含量极微时仍能用某种特殊的理化测试仪器将其检测出来，典型的如酶标记的免疫检测技术(EIA)，免疫荧光标记技术(IFA)、反射免疫标记技术(RIA)等，利用抗原抗体的结合具有高度特异性，通过洗涤、免疫层析等步骤实现游离标记物与结合标记物的分离，再通过酶促反应实现底物显色或通过观察荧光信号等反映出抗原抗体结合反应的存在或结合位置。标记物质可以结合在抗体或抗原分子上，它就能追踪抗原或抗体并与之结合，通过化学或物理的手段使肉眼不可见的反应放大、转化为可见的、可测知的、可描记的光、色、电、脉冲等信号。根据这种类似抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的试验技术，称为生物标记技术。这些技术可用于检测抗原或抗体，其特异性和敏感性远远高于常规的血清学技术。生物领域内已普遍应用的还可以是核酸、受体、配体等生物物质的标记示踪技术。

生物标记技术同样可以结合微观成像技术实现纳米级微观图像与标记物的定位分析，免疫电镜技术就是利用纳米金颗粒的电子致密性特点实现了与背景生物材料的区分，在透射电子显微镜上实现了纳米级病毒颗粒等生物物质的免疫分析。但是，免疫电镜技术仍然是目前仅有的将病原高分辨率微观形态学与免疫识别技术同时结合在一起的病原检测方法。尽管这是一种需要染色和固定的形态学破坏性检测技术，且并不适合于多元化和自动化检测，但对于不可培养的病毒检测而言，它仍然保持着基准的检测方法地位，核心原因便在于将免疫学的特异性精确到对单个微生物病原的定位与结合。

由于微观高分辨率形态学检测技术的发展必须依赖于新型高分辨率仪器的出现，新的替代技术发展受到一定限制。随着新型高分辨率观测工具——原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)的出现，由于它具备接近生理条件(液相)观察样品的优势，使之成为生物样品观察的理想工具，其制样的简便性以及高分辨率三维成像模式，使之不需要固定、染色或其它合成制样模式便可直接以粒径、粗糙度等量化指标描述纳米级的病毒颗粒，成为表面微观研究的重要工具。作为以探针扫描采集信号的一种成像方式，AFM是近十几年来表面成像技术中最重要的进展之一。AFM可以在自然状态下检测样品，因而使样品更接近生理状态，既可以观察生物样品局部微区形貌，还可以检测生物分子间相互作用力。对其结构和功能关系的研究，在微生物领域中的研究都具有重要的意义。

基于AFM高分辨率成像能力及其生物学应用优势，如果结合生物标记等示踪检测技术，将成为类似于免疫电镜检测的另一新型替代技术，实现微观成像与特异性定位分析的结合，并充分发挥AFM生物学应用领域的优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法，本方法在生物学领域实现了原子力显微镜的微观高分辨率成像性能与特异性检测性能的有效结合，可直接用于微生物等生物材料的标记免疫诊断和定位分析。

本发明利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法，具体为：

1)采用现有技术的方法制备用于标记的硬质颗粒材料；

2)将样品载体玻片经过洗涤液超声洗涤后，再经过多聚赖氨酸处理；

3)制备用硬质颗粒材料标记的微生物样品片；

4)将样品片固定到样品贴片上；

5)利用AFM的探针的轻敲模式对样品进行扫描；

6)在室温、大气条件下以轻敲(Tapping)模式采集硬质标记材料的高度、振幅和相位的数据；

7)以有差异的相位图颜色变化为主要判读依据，以高度图和振幅图作为辅助判定依据，结合生物检测对象的形态确定硬质标记材料颗粒的存在；

8)通过确定硬质标记材料颗粒后进一步确定被标记物存在。

进一步，所述硬质颗粒材料为具有硬质属性的纳米金颗粒材料。

进一步，所述扫描时同时采集高度、振幅和相位AFM信号数据，并利用相位图亮度形貌数据特征结合高度、振幅形貌数据进行组合判定。

进一步，所述步骤5)中探针为由硅制成的RTESP探针，其悬臂的长度为115-135μm，弹性常数k为20-80N/m，共振频率为200-400kHz，针尖曲率半径为5-10nm，扫描速度为1Hz和2.8Hz。

进一步，所述扫描像素256×256pixel和512×512pixel。

进一步，所述样品载体玻片为15mm。

本发明中对于生物样品载体应用洗涤液洗涤和多聚赖氨酸处理，所得载体吸附性好，表面平整，适用于大多数AFM生物样品样片的制备。且使用的试剂常见、价格便宜，处理简单，不需用浓硫酸、强碱等有强腐蚀性的试剂分段定时处理，使整体时间大大缩短。本发明使用AFM轻敲模式扫描软硬度不同的生物材料和硬质标记物，通过三种信号同时采集的分析方式，主要以相位图反映标记颗粒与生物材料软硬度的不同，并结合高度图和振幅图形貌特征来反映生物抗原抗体等生物结合作用存在，进而进行定位检测分析。

附图说明

图1A为本发明实施例1多聚赖氨酸处理样品玻片AFM扫描结果；

图1B为多聚赖氨酸处理的玻片制备纳米金样片的扫描结果；

图1C为多聚赖氨酸处理的玻片制备的抗体包被纳米金样片扫描结果；

图2A为本发明实施例2中制备的重组表达麻疹病毒核蛋白的大肠杆菌空白对照片AFM扫描结果；

图2B为实施例2中抗体标记纳米金结合重组表达麻疹病毒核蛋白大肠杆菌样片AFM扫描结果；

图3A为本发明实施例3中制备的流感病毒空白对照片AFM扫描结果；

图3B为实施例3中抗体标记纳米金结合流感病毒样片AFM扫描结果。

具体实施方式

本说明应用原子力显微镜扫描，以纳米金作为硬质颗粒材料标记物，进行特异抗体包被标记，并对微生物表面特异抗原抗体结合的形貌扫描识别过程为例，目的在于创建一种新型的利用原子力显微镜实现对硬质标记材料信号和生物背景材料信号特异区分的解读方法，但并不限于纳米金颗粒材料作为硬质标记物。进而可以利用纳米金属、纳米合成物等硬质标记材料进行特异性抗原、抗体、核酸等生物学标记，再利用原子力显微镜进行直接观察检测，从而实现原子力显微镜的微观高分辨率成像性能与特异性检测性能在生物学领域的有效结合，扩展原子力显微镜的生物学应用范围，直接用于微生物等生物材料的标记免疫诊断或定位分析，以及其它领域内相关的杂交技术标记等生物检测领域。

本发明的方法步骤如下：

一、纳米金的制备

1.煮金

三角烧用前用硫酸泡24h，取出水洗10遍，蒸馏水洗8遍，然后双蒸水洗6遍，煮金用的三角烧及转子为纳米金专用。洗好的三角烧取100ml双蒸水，先用微波炉煮沸，然后放在加热磁力搅拌机上，调整转子，不要有液体溅出，旋转平稳，加1ml氯金酸，1.5ml柠檬酸二钠，其中先加氯金酸，然后加柠檬酸二钠，1.5ml要一起加入。观察颜色变化，无色—黑—酒红，到颜色稳定为酒红色，冷却，装在棕色瓶子里4℃保存。2.调节PH值

用小三角烧瓶(纳米金专用)取15ml煮好的金子，用1M K2C03调节PH值，加70μl K2CO3PH值8.5～9.0之间。

3.最适蛋白量的测定

将纳米金调至所需的PH值。将抗体用2mmol/L的硼酸盐缓冲液(PH9.0)稀释值0.2mg/ml。稀释后的抗体与其他有关试剂按下表逐项操作。

表一  分光光度计测定纳米金最小蛋白量计量

以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标做一曲线，取曲线与横轴接近点的蛋白用量即为最小蛋白质稳定量。在此基础上再加20％即为稳定纳米金蛋白质实际用量。

4.标金

1ml纳米金加测得的最适蛋白量，混合，静止5min。

5.洗金

加10％BSA混合摇匀，放置10min，在4℃下以12000r/min离心30min；弃上清，加重悬液1ml，把沉淀的纳米金弹开使混匀，再在4℃下以12000rpm/min离心30min；弃上清，加重悬液500μl，把沉淀的纳米金弹开使混匀，在4℃下以1000r/min离心10min。用0.2μm滤器过滤除去聚集物。即可得到标记好的纳米金。

二、样品载体制备

将15mm圆形样品载体玻片放入自制的洗涤液中超声洗涤30min，该洗涤液包括硫酸3％、AES3％、氢氧化钠0.4％、氯化钠1.2-1.5％，再用去离子水流水冲洗2min，50ml去离子水超声洗涤15min，取出氮气吹干，再用多聚赖氨酸处理5min，氮气吹干。在取出干燥时时保证玻片无粘贴现象；多聚赖氨酸处理玻片时使玻片与溶液完全接触，以保证玻片表面处理均匀。

三、样片制备

纳米金、蛋白包被标记的纳米金或微生物样品，用1×PBS稀释，取50μl样品液均匀涂于经多聚赖氨酸处理的玻片上，37℃恒温孵育30min，用滤纸吸走玻片表面的样品液，加50μl制备的标记好相应抗体的纳米金颗粒，37℃恒温孵育30min，1×PBS洗5次，1min/次，去离子水洗3次，3min/次，氮气吹干。加纳米金时动作轻柔，液体尽量完全覆盖微生物样品表面，但加液的枪头不能碰到微生物样品；微生物样片制备和原子力显微镜扫描过程中，严格保证环境无尘，移动样片时镊子不能接触有样品的玻片表面，样片扫面完装入培养皿，封口膜封好，4℃保存。

四、原子力显微镜扫描

将制好的金标微生物样片用双面胶粘贴到特制的15mm圆形贴片上，用AFM的轻敲模式对样品进行扫描。AFM图像通过VECCO Multimode和NanoScopeIIIa控制器，在室温、大气条件下以Tapping模式采集。选用E型扫描器。所用探针为由硅制成的RTESP探针，悬臂的长度为115-135μm，弹性常数k为20-80N/m，共振频率为200-400kHz，针尖曲率半径为5-10nm，扫描速度为1Hz和2.8Hz，相应每条扫描线的像素分别为256×256pixel和512×512pixel。测量模式为恒力模式。图像输出信号为高度(Height)与振幅(Amplitude)、相位(Phase)数据。结果分析采用三图对照，以有差异的相位图颜色变化为主要判读依据，以高度图和振幅图作为辅助判定依据，结合病原形态确定硬质纳米金颗粒的存在。

实施例1

将15mm圆形样品载体玻片放入自制的洗涤液(包括硫酸3％、AES3％、氢氧化钠0.4％、氯化钠1.2-1.5％)，超声洗涤10min，取出氮气吹干，多聚赖氨酸处理5min，自然干燥。将玻片贴于AFM专用的直径15mm的圆形贴片上，用AFM的轻敲模式对样品进行扫描。所得图像见图1A：样片背景均匀，起伏于1nm小，表面有孔状结构，易于样品以物理吸附的方式固定，各区软硬度适中。

取煮好的纳米金溶液50μl，均匀涂于多聚赖氨酸处理的玻片表面，37℃恒温孵育30min，1×PBS洗5次，1min/次，去离子水洗3次，3min/次，氮气吹干。将玻片贴于AFM专用的直径15mm的圆形贴片上，用AFM的轻敲模式对样品进行扫描，获得扫描图见图1B。未标记金颗粒形状较规则，多圆形，直径25nm左右，高度图、振幅图、相位图综合观察，可见三种信号采集图金颗粒形貌轮廓及大小表现出高度一致，相位图金颗粒与背景亮暗对比明显。相位图亮暗对比反应样品表面的软硬度、粘滞度等特性，对于金颗粒来说其硬度为其主要特性，因此相位图中亮代表硬，暗代表软，亮暗对比明显表示金颗粒的硬度与周围背景有较大差别。

抗体包被的纳米金颗粒图见图1C，与图1A和图1B明显不同的是，图1C相位图下观察到的颗粒形貌轮廓与高度图、振幅图下观察到金颗粒形状出现明显不一致，纳米颗粒出现消失或缺损的情况比较多见，对比图1A和图1B，可以发现，图1C相位图缺损的金颗粒形状以高亮度形式出现，而其它位置混同于生物背景物中。因此缺损的高亮度区域显示出纳米金颗粒的存在，并通过缺损位置间接指示出蛋白的覆盖区域，也即是包被蛋白的主要位置，辅助振幅图，可以进一步明确抗体包被金颗粒表面所形成的部分凹陷的纳米金形貌学特征。因此，利用缺损的相位图亮区可以明确指示硬质纳米金颗粒与背景或包被物等生物物质的区分特征，进而明确了该标记颗粒可以作为生物标记物用于免疫AFM检测使用的信号采集及判读特点。

实施例2

克隆并可诱导表达有麻疹病毒核蛋白的工程菌种BL-21(BL-21-30a-MVn菌株，来自中国检验检疫科学研究院外来病传染室)，用枪头挑取LB固体培养基上的单个菌落，移入LB液体培养基中，在恒温摇床中(37℃ 265rad/min)振荡过夜；取1ml菌液至1.5ml EP管中，3000rpm离心10min，弃上清，再用1ml 1×PBS悬起菌沉淀后，离心，3000rpm，10min，按以上步骤洗三次，最后将洗涤的菌体细胞悬浮于500μl1×PBS中。各取50μl菌液均匀涂于两张经多聚赖氨酸处理的15mm圆形玻片上，37℃恒温孵育30min，用滤纸吸走玻片表面的菌液，其中一张样片1×PBS洗5次，1min/次，去离子水洗3次，3min/次，氮气吹干，作为对照。另一样片加50μl制备的标记好麻疹病毒核蛋白抗体的纳米金颗粒，37℃恒温孵育30min，1×PBS洗5次，1min/次，去离子水洗3次，3min/次，氮气吹干。将玻片贴于AFM专用的直径15mm的圆形铁片上，用AFM的轻敲模式对样品进行扫描。

以高度、振幅和相位三种模式采集信号，所得图像见图2A为正常表达麻疹核蛋白的重组大肠杆菌BL-21表面微区图片，形态规则，菌体部分凹陷，表面平滑，无囊状突起，表面可见规则颗粒，相位图上无明显的亮暗对比，普遍表现为较暗的软材质图像，并与高度图和振幅图表现出形貌轮廓高度一致，扫描范围：300nm×300nm；图2B为麻疹病毒核蛋白抗体标金结合的的重组工程菌的图片，表面较正常菌体表面轻微变形，有不规则起伏，可见分层或凹陷，相位图上可观察到形状不规则，大小不一的亮点，且亮点有明显的聚集区，结合振幅图和高度图，则显示明显异物颗粒沉积的形貌特征，从而可以判定标记物颗粒的存在。

实施例3

流感病毒A1株为鸡胚培养物经超滤浓缩后经蔗糖密度梯度离心纯化制备。取50μl病毒液均匀涂于经多聚赖氨酸处理的15mm圆形玻片上，37℃恒温孵育30min，用滤纸吸走玻片表面的病毒液，其中一张样片1×PBS洗5次，1min/次，去离子水洗3次，3min/次，氮气吹干，作为对照。另一样片加50μl制备的标记好相应抗体的纳米金，37℃恒温孵育30min，1×PBS洗5次，1min/次，去离子水洗3次，3min/次，氮气吹干。将玻片贴于AFM专用的直径15mm的圆形铁片上，用AFM的轻敲模式对样品进行扫描。所得图像见图3A为流感病毒图片，分布均匀，呈球状，形状规则，直径约80～120nm，相位图上无明显的亮暗对比，并与高度图和振幅图表现出形貌轮廓高度一致，扫描范围：600nm×600nm；图3B为标金抗体结合的流感病毒扫描图片，与未结合标金抗体的对照图3A相比较，病毒颗粒形态同样清晰可见；结合高度图和振幅图，部分病毒表面发生了局部内陷，在相位图上可见该内陷部位出现明显的亮度反差，显示为标记的纳米金颗粒结合位置，扫描范围：600nm×600nm，从而反映出抗体包被纳米金颗粒在病毒表面的结合位置。

本发明通过提供原子力显微镜对生物材料、纳米金颗粒材料以及二者结合物、混合物等系列研究方法及结果，阐明了利用材料的软硬度差异属性，可以通过原子力显微镜高度、振幅以及相位采集信号的集合判定方法，得以区分硬质材料与生物材料背景，尤其是包被有生物物质的硬质颗粒对于背景生物物质的图像区分及方法，进而使该类硬质颗粒物质可以作为生物标记物，并应用于包括原子力显微镜在内的以扫描探针为信号采集方式的分析工具的生物标记物检测，极大的扩展了该类仪器的生物学应用范围，使得免疫原子力显微镜技术进入应用阶段，所用硬质标记物并不需要局限于纳米金，还可推广至塑料球、玻璃球、其他纳米金属颗粒或合成物等具有硬质属性的颗粒材料，并可推广至核酸标记等应用领域，因而具有巨大的科学应用价值和市场应用价值。

本发明的信号采集模式则是利用了标记材料的硬质性与生物材料的软质性的差异，通过原子力显微镜进行高度、振幅和相位等信号组合采集并成像观测，进行区分。区别于传统的生物标记信号采集模式，本发明在于有效利用了原子力显微镜探针的特殊信号读取方式，系列研究了硬质颗粒标记物与生物背景材料的图像区分；基于应用扫描探针对于材料本身软硬度性质的不同及原子力显微镜扫描结果的信号展示不同，进而对硬质标记材料和生物背景材料进行特异区分的方法，实际工作中可用于硬质标记材料进行特异性抗原、抗体、核酸等生物学标记，再利用原子力显微镜进行直接观察检测，从而在生物学领域实现了原子力显微镜的微观高分辨率成像性能与特异性检测性能的有效结合，可直接用于微生物等生物材料的标记免疫诊断和定位分析，以及其它领域内相关的杂交技术标记等生物检测领域。

Claims (6)

1.利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法，具体为：

1)采用现有技术的方法制备用于标记的硬质颗粒材料；

2)将样品载体玻片经过洗涤液超声洗涤后，再经过多聚赖氨酸处理；

3)制备用硬质颗粒材料标记的微生物样品片；

4)将样品片固定到样品贴片上；

5)利用AFM的探针的轻敲模式对样品进行扫描；

6)在室温、大气条件下以轻敲模式采集硬质颗粒材料的高度、振幅和相位的数据；

7)以有差异的相位图颜色变化为主要判读依据，以高度图和振幅图作为辅助判定依据，利用缺损的相位图亮区指示硬质颗粒材料与生物物质的区分特征，结合生物检测对象的形态确定硬质颗粒材料颗粒的存在；

8)通过确定硬质颗粒材料颗粒后进一步确定被标记物存在。

2.如权利要求1所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法，其特征在于，所述硬质颗粒材料为具有硬质属性的纳米金颗粒材料。

3.如权利要求1所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法，其特征在于，所述扫描时同时采集高度、振幅和相位AFM信号数据，并利用相位图亮度形貌数据特征结合高度、振幅形貌数据进行组合判定。

4.如权利要求1所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法，其特征在于，所述步骤5)中探针为由硅制成的RTESP探针，其悬臂的长度为115-135μm，弹性常数k为20-80N/m，共振频率为200-400kHz，针尖曲率半径为5-10nm，扫描速度为1Hz和2.8Hz。

5.如权利要求1所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法，其特征在于，所述扫描像素256×256pixel和512×512pixel。

6.如权利要求1所述的利用原子力显微镜进行生物标记检测的方法，其特征在于，所述样品载体玻片的直径为15mm。 

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