CN102313814A

CN102313814A - 一种基于纳米金增强的多种肺癌标志物的高灵敏检测方法

Info

Publication number: CN102313814A
Application number: CN201110211260A
Authority: CN
Inventors: 贾春平; 景奉香; 赵辉; 金庆辉; 赵建龙
Original assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2031-07-22
Also published as: CN102313814B

Abstract

本发明是一种基于纳米金增强的多种肺癌标志物。高灵敏度检测方法，检测步骤为：1)先将各待测蛋白质的捕捉抗体点样到醛基修饰的基片上；2)然后在纳米金上标记上待测蛋白的多克隆或单克隆检测抗体；3)将标记好待测蛋白质捕捉抗体的蛋白芯片及纳米金生物复合探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，洗去没有反应的纳米金探针；4)加入金增强反应液，肉眼或显微镜下观察、或用CCD扫描拍照，根据灰度值测定相应的蛋白浓度。本发明提供的方法可广泛应用于临床诊断、肿瘤转移监测、抗原、抗体、核酸的检测、卫生检疫、环境检测等领域，检测蛋白质的灵敏度达pg/ml级。

Description

一种基于纳米金增强的多种肺癌标志物的高灵敏检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于纳米金增强的多种肺癌标志物的高灵敏检测方法，特别是一种基于微阵列、纳米生物复合探针及纳米金增强的高灵敏检测方法，该方法能同时检测多种肺癌相关标志物，可用于肺癌的早期检测、复发及转移监测。属于纳米生物检测技术领域。

背景技术

能够对生物分子简便、快捷、高灵敏度地检测，始终是人们努力的方向，在疾病的早期诊断、快速诊断、卫生检测、环境监测等领域都具有重要意义。肺癌是全球发病率最高、死亡总人数最多的恶性肿瘤，肺癌也是预后最差、容易转移的恶性肿瘤之一，肺癌起病隐匿，早期无临床症状。现有影像学检测和痰细胞学检查等检测手段，即使最先进的检测技术如多层螺旋CT和正电子发射体层摄影等可以发现直径约2-6mm的肿瘤，但检查过程复杂，花费很高，且此时肿瘤已经进入血管生成期，因此，现有的检测技术显然仍无法用于肺癌早期及转移检测。随着分子生物学和医学研究的深入，出现了许多肺癌标志物，主要有癌胚抗原、细胞角蛋白、p53蛋白、黏蛋白等。总体来说，肺癌标志物含量低，单一标志物很难同时满足敏感性和特异性的要求。随着纳米技术的飞速发展，已可以同时实现多种肺癌标志物的高灵敏检测，这导致早期肺癌及转移肺癌的敏感和特异检测成为可能。

微阵列是利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的生物样品有序地固化在硅衬底或玻璃上，利用微阵列可以快速地获取或处理大量的生命信息。微阵列的信号标记通常采用荧光标记检测法，而荧光试剂价格昂贵、以及生物分子自身荧光干扰、荧光衰减以及读取所用仪器价格昂贵等缺点，也大大限制了其在医学临床诊断方面的应用。随着纳米科学技术的不断发展，纳米材料和纳米结构取得了引人瞩目的成就。纳米材料具有传统材料所不具备的特有的三大效应：表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。作为标记材料纳米材料和纳米结构已广泛应用于免疫检测中。如纳米金颗粒对生物分子有很强的吸附功能，可以与蛋白质、核酸等非共价结合，因而在生物医学基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。纳米金颗粒具有高电子密度的特性，在纳米金颗粒结合处，在显微镜下可见褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而广泛应用于定性或半定量的快速检测方法中，但是这类检测技术的最大缺点是灵敏度低，检测蛋白的灵敏度仅为ng/ml，对微量生物分子检测无能为力(免疫标记技术的进展及纳米技术在其中的应用，贾春平等，生命科学，第20卷，第5期，第749-753页)。此外，这类检测方法大部分适用于试纸条或膜为固相载体的检测体系中，对于以玻璃等为固相载体的微阵列上的微米甚至纳米级的检测点来说，不经过进一步的信号放大，一般显微镜尤其肉眼根本是检测不到的，需要进一步进行纳米金信号的放大。本发明就是在基于以上的需求提出的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纳米金生物复合探针、微阵列及纳米金增强的高灵敏检测方法，该方法能同时高灵敏检测多种肺癌标志物。

本发明主要内容包括：首先将待测蛋白的捕捉抗体点样到微阵列上，然后在纳米金上标记待测蛋白的多克隆或单克隆检测抗体，然后将标记好待测蛋白质单克隆或多克隆捕捉抗体的蛋白微阵列及纳米金生物复合探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，洗去没有反应的纳米金探针，加入金增强反应液，肉眼或显微镜下观察、或用CCD扫描拍照，根据灰度值测定相应的蛋白浓度。

本发明的方法步骤：

(1)蛋白抗体微阵列制作

用芯片点样仪将各待检测蛋白质的抗体及质控点(二抗)点在醛基修饰的玻璃基片上，具体点样方法参见专利(200710170613.X)，室温放置16小时以上，置4℃保存。

(2)构建纳米金生物复合探针

在pH6～9情况下，纳米金颗粒水溶液与待测蛋白质相对应的抗体结合，根据胶体金凝集实验确定各抗体的用量，将各抗体与纳米金溶液室温条件下混匀一段时间，再加入一定浓度(0.1％-20％)(质量/百分数，下同)的聚乙二醇，4℃过夜，离心，洗去未标记上的抗体，用纳米金重悬液(牛血清白蛋白BSA 0.25-10％、聚乙烯吡咯酮PVP 0.1-1％、蔗糖1.5-10％、聚乙二醇PEG0.01-1％、吐温Tween20 0.2-1％)重悬标记好的纳米金生物复合探针，置4℃保存备用。

(3)免疫反应

将标记好各待测蛋白抗体的芯片及纳米金生物复合探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，然后再洗去没有反应的纳米金探针。

(4)显色

加入金增强反应液(次氯金酸HAuCl·3H₂O 0.1-100mM、盐酸羟胺NH₂OH·HCl 0.1-100mM、明胶Gelatin1-10％)后，室温轻摇3-5min，肉眼观测或用CCD拍照。

本发明提供的检测方法的优点及特点：

本发明提供的测试方法最大的特点及优点是灵敏度高，检测方便，耗时短，且能同时检测多种肺癌标志物。

(1)背景信号低，检测灵敏度高

本发明提供的测试方法主要是基于纳米金生物复合探针及纳米金增强技术的蛋白质检测技术，只有当待测蛋白存在时，纳米金探针才会结合在蛋白芯片上，也只在有纳米金的地方，才会发生进一步的纳米金信号增强，由于纳米金增强液的作用，使检测信号得到级联放大；没有纳米金的地方则不会有信号，背景信号很低，提高了信噪比，达到对微量蛋白质的检测，检测蛋白质的灵敏度达到pg/mL级。

(2)同时可以检测多种蛋白质

本发明利用蛋白芯片可在一次检测反应提供多种信息的优点，实现同时检测多种蛋白标记物。

(3)操作方便，耗时短

本发明提供的测定方法从检测标本开始，只需要1-1.5h的时间，就可以得到检测结果；另外，本技术操作步骤少，操作方便、简单，适于临床大批量标本的快速检测。

附图说明

图1基于纳米金增强反应的蛋白质测定流程示意图

其中A为纳米金生物复合探针构建示意图，B为蛋白微阵列制作流程示意图，C为免疫反应及显色示意图。

图2基于纳米金增强的CEA(上排)、P53(下排)的检测结果，检测CEA、p53蛋白的灵敏度为180pg/mL。

图3基于银染的CEA(上排)、P53(下排)的检测结果，检测CEA、p53蛋白的灵敏度为1.5ng/mL。

图4肺癌病人正常人血清检测结果

(a)肺癌标志物标准品CEA、NSE、CK-19及P53蛋白、(b)肺癌病人、(c)正常人血清中检测结果。

在该肺癌病人血清中，CEA、CK-19、P53均为强阳性，而正常人血清中为阴性。

图5(a)正常人及肺癌转移病人血清检测结果肺癌标志物标准品CEA、CK-19及MUC1蛋白、(b)肺癌转移病人、(c)正常人血清中检测结果。

在肺癌转移病人血清中，CEA、MUC1均为强阳性，而正常人为阴性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：可用于标准品CEA、P53蛋白的高灵敏检测方法

1蛋白芯片的制作：

将癌胚抗原(CEA)、P53蛋白的单克隆抗体点样到醛基修饰的玻璃基片上。室温过夜，置4℃保存备用。

2纳米金生物复合探针的制备

在pH6～9情况下，根据胶体金凝集实验确定CEA、P53蛋白的检测抗体的用量，并将各浓度的抗体与纳米金溶液室温条件下混匀1-5小时，再加入0.1-20％(质量)的聚乙二醇，4℃过夜，离心，洗去未标记上的抗体，用纳米金重悬液(牛血清白蛋白BSA 0.25-10％、聚乙烯吡咯酮PVP 0.1-1％、蔗糖1.5-10％、聚乙二醇PEG 0.01-1％、吐温Tween20 0.2-1％)重悬标记好的纳米金生物复合探针，置4℃保存备用。

3免疫反应

将标记好CEA、P53抗体的蛋白芯片及纳米金生物复合探针与CEA、P53蛋白样品(样品浓度均为100、50、25、12.5、6.25、3.1、1.5、0.75、0.37、0.18、0.09、0ng/mL)混合，37℃孵育30-60分钟，然后再洗去没有反应的纳米金探针。

4显色反应

加入金增强反应液(次氯金酸HAuCl·3H₂O 0.1-100mM、盐酸羟胺NH₂OH·HCl 0.1-100mM、明胶Gelatin1-10％)后，室温轻摇3-10min，肉眼观测或用CCD拍照，有褐色点出现的为阳性结果。

另外作为对比实验的显色方法为柠檬酸盐缓冲液作用下的银染显色方法，具体显色过程参见专利(200710170613.X)。

5结果分析

常规的银染方法，检测CEA、p53蛋白的灵敏度为1.5ng/mL(图3)，而采用本发明中的金增强液显色方法，检测CEA、P53蛋白的灵敏度为180pg/mL(图2)，所以灵敏度得到提高。

实施例2：可用于肺癌早期检测的测定方法

癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen CEA)是一种酸性糖蛋白，血清CEA水平的动态变化不仅可用于恶性肿瘤的早期诊断，还能反映患者对治疗的反应和预后，其测量值进行性升高者多预后不良。细胞角蛋白(Cytokeratin)19在肺癌诊断中有很大价值，是非小细胞肺癌的重要标志物。血清CK19的水平随肿瘤分期的增加逐渐升高，其还能预示肺癌预后，并有助于判定手术疗效。细胞角蛋白19与CEA联合应用，诊断非小细胞肺癌符合率已可达到78％。神经元特异性烯醇酶(Neuron-Specific Enolase NSE)是一种哺乳动物组织中普遍存在的糖酵解酶，是小细胞肺癌(SCLC)的重要标志物，有助于SCLC的诊断及其与非小细胞肺癌的鉴别诊断。NSE还是肺癌化疗效果观察和随访的有效指标，对化疗产生反应后此酶水平会下降，病情完全缓解后其可达正常水平。因为p53基因是与人类肿瘤发生密切相关的最重要的抑癌基因，约有50％的肿瘤的发生与其有关，尤其是对肺癌来说，有高达70％的肺癌患者有p53基因突变的发生。P53基因突变往往导致异常p53蛋白的积累，因此p53蛋白检测可以预测p53基因的状态及肿瘤发生及进展，是个很好的预测因子。对以上肿瘤标志物的联合检测可以用于肺癌的早期检测及诊断。

1蛋白芯片的制作

将癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白(CK-19)、神经烯醇化酶(NSE)、P53蛋白的单克隆抗体、质控点(抗鼠IgG)点样到醛基修饰的玻璃基片上。室温过夜，置4℃保存备用。

2纳米金生物复合探针的制备

在pH6～9情况下，根据胶体金凝集实验确定CEA、CK-19、NSE、P53各蛋白的检测抗体的用量，并将各浓度的抗体与纳米金溶液室温条件下混匀1-5小时，再加入0.1-10％(质量)的聚乙二醇，4℃过夜，离心，洗去未标记上的抗体，用纳米金重悬液(牛血清白蛋白BSA 0.25-10％、聚乙烯吡咯酮PVP0.1-1％、蔗糖1.5-10％、聚乙二醇PEG 0.01-1％、吐温Tween200.2-1％)重悬标记好的纳米金生物复合探针，置4℃保存备用。

3免疫反应

将标记好CEA、CK-19、NSE、P53抗体的蛋白芯片及纳米金生物复合探针与CEA、CK-19、NSE、P53蛋白样品或病人血样混合，37℃孵育一段时间，然后再洗去没有反应的纳米金探针。

4显色

加入金增强(次氯金酸HAuCl·3H₂O 0.5-100mM、盐酸羟胺NH₂OH·HCl1-100mM、明胶Gelatin1-10％)反应液后，室温轻摇3-10min，肉眼观测或用CCD拍照，有褐色点出现的为阳性结果。

5结果分析在该肺癌病人血清中，CEA、CK-19、P53均为强阳性，而正常人血清中为阴性，表明这个检测方法可用于肺癌的检测(图4)。

实施例3：可用于肺癌微转移检测的测定方法

黏蛋白1(Mucins MUC1)是一种大分子量的糖蛋白，在肿瘤组织中黏蛋白1多出现异常表达，并与肿瘤的浸润、转移及预后相关。MUC1与CEA、CK19联合检测可以用来预测肺癌的转移及预后情况。

1蛋白芯片的制作

将癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白(CK-19)、黏蛋白(MUC1)、质控点(抗鼠IgG)点样到醛基修饰的玻璃基片上。室温过夜，置4℃保存备用。

2纳米金生物复合探针的制备

在pH6～9情况下，根据胶体金凝集实验确定CEA、CK-19、MUC1各蛋白的检测抗体的用量，并将各浓度的抗体与纳米金溶液室温条件下混匀1-5小时，再加入0.1-10％(质量)的聚乙二醇，4℃过夜，离心，洗去未标记上的抗体，用纳米金重悬液(牛血清白蛋白BSA 0.25-10％、聚乙烯吡咯酮PVP0.1-1％、蔗糖1.5-10％、聚乙二醇PEG 0.01-1％、吐温Tween20 0.2-1％)重悬标记好的纳米金生物复合探针，置4℃保存备用。

3免疫反应

将标记好CEA、CK-19、MUC1抗体的蛋白芯片及纳米金生物复合探针与CEA、CK-19、MUC1蛋白样品或病人血样混合，37℃孵育一段时间，然后再洗去没有反应的纳米金探针。

4显色

加入金增强反应液(次氯金酸HAuCl·3H₂O 0.5-100mM、盐酸羟胺NH₂OH·HCl 1-100mM、明胶Gelatin1-10％)后，室温轻摇3-10min，肉眼观测或用CCD拍照，有褐色点出现的为阳性结果。

5结果分析

在肺癌转移病人血清中，CEA、MUC1均为强阳性，而正常人为阴性，表明这个检测方法可用于肺癌的转移检测(图5)。

Claims

1.一种多种肺癌标志物的高灵敏度检测方法，其特征在于基于纳米金生物复合探针微阵列和纳米金增强，进行检测的步骤是：首先将待测蛋白的捕捉抗体点样到微阵列上，然后在纳米金上标记上待测蛋白的多克隆或单克隆检测抗体，然后将标记好待测蛋白质单克隆或多克隆捕捉抗体的蛋白微阵列及纳米金生物复合探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，洗去没有反应的纳米金探针，加入金增强反应液，肉眼或显微镜下观察、或用CCD扫描拍照，根据灰度值测定相应的蛋白浓度。

2.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于具体步骤为：

(a)蛋白抗体微阵列制作

用芯片点样仪将各检测蛋白的抗体及质控点点在醛基修饰的玻璃基片上，室温放置16小时以上，置4℃保存；

(b)构建纳米金生物复合探针

在pH 6～9情况下，纳米金颗粒水溶液可与待测蛋白质相对应的抗体结合，根据胶体金凝集实验确定各抗体的用量，将各抗体与纳米金溶液室温条件下混匀一段时间，再加入质量百分浓度为0.1％-20％的聚乙二醇，4℃过夜，离心，洗去未标记上的抗体，用纳米金重悬液重悬标记好的纳米金生物复合探针，置4℃保存备用；

(c)免疫反应

将标记好各待测蛋白抗体的芯片及纳米金生物复合探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，然后再洗去没有反应的纳米金探针；显色

(d)加入金增强反应液后，室温轻摇3-5min，肉眼观测或用CCD拍照。

3.按权利要求2所述的检测方法，其特征在于步骤(c)中所述重悬液组成为牛血清白蛋白BSA 0.25-10％、聚乙烯吡咯酮PVP 0.1-1％、蔗糖1.5-10％、聚乙二醇PEG 0.01-1％、吐温Tween20 0.2-1％。

4.按权利要求2所述的检测方法，其特征在于步骤(d)中金增强反应液组成为次氯金酸HAuCl·3H₂O 0.1-100mM、盐酸羟胺NH₂OH·HCl0.1-100mM、明胶Gelatin1-10％，以上均为质量百分浓度。

5.按权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于所述的方法适用于肺癌早期检测和肺癌微转移检测。

6.按权利要求5所述的检测方法，其特征在于检测蛋白质的灵敏度达pg/ml级。