CN111141901A

CN111141901A - 一种免疫胶体金均相混合标记法

Info

Publication number: CN111141901A
Application number: CN202010091699.2A
Authority: CN
Inventors: 杨春江; 袁志波; 马孝斌
Original assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: CN111141901B

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种免疫胶体金均相混合标记法，具体包括如下步骤：步骤一、添加裸金并调整pH值；步骤二、添加混合液，其中包含预定量的分散剂和C线抗体；步骤三、封闭。本发明的免疫胶体金均相混合标记法，在生产实践中，免疫胶体金均相混合标记法能够同时实现稳定标记和提高灵敏度的效果。在生产实践中，标记物的投料量平均降低80%，灵敏度提高30～100%。

Description

一种免疫胶体金均相混合标记法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种免疫胶体金均相混合标记法。

背景技术

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的免疫标记技术，英文缩写为：GICT。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如抗坏血酸、枸橼酸钠等作用下，还原聚合成为特定大小的纳米金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金颗粒带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

侧向层析技术是20世纪90年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，具有快速、简便、单人份检测、经济的优点,现已广泛应用于医学检测、食品质量监测、环境监测、农业和畜牧业、出入境检验检疫、法医定案等领域。

如图1所示，侧向层析技术以硝酸纤维素膜(NC膜)为载体，将特异性的抗原或抗体固定在NC膜上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用侧向移动，与结合垫上的胶体金或微球标记的试剂发生特异的免疫反应，再移动到NC膜上，被固定在NC膜表面的抗原或抗体检测线(T线)捕获，聚集在检测带上，通过目测硝酸纤维素表面标记物(胶体金或乳胶颗粒)的光反射信号得到直观的显色结果。其它未结合的标记物则越过检测带，被质控线C线的抗体(通常是羊抗鼠)捕获。通过T线和C线的有无和颜色深浅实现待测物的定性或半定量检测。

抗体是免疫胶体金标记的主要标记物，如图2所示，抗体的空间结构呈Y字型，由两条轻链和两条重链组成。重链的氨基端与轻链组成与抗原结合的Fab段，两条重链的羧基端由二硫键连接组成保守的Fc段。

在免疫胶体金标记过程，抗体与胶体金颗粒的结合构型，在空间上具有方向性。为了描述这种空间结合构型的方向性，笔者将抗体的Fab段定义为头部(Head)，Fc段定义为脚部(Foot)。这样抗体分子与胶体金颗粒的空间结合构型有三种状态，分别如图3的A、B、C所示：1，Fab段与胶体金颗粒结合态，头朝下结合态，Head-on；2，Fc段与胶体金颗粒结合态，脚朝下结合态，Foot-on；3，侧卧态，Side-on。在生产标记中发现，有一些抗体标记后，仅存在Foot-on结合态，或者Foot-on与Side-on结合混合态，而无Head-on结合态。在侧向层析试纸条的测试结果判读直观表现就是，T线显色强度良好，抑制率良好，但抗体C线显色非常弱，或不显色。

很多抗生素、农药、毒品的单克隆抗体很难筛选，使用受体蛋白检测，受体蛋白没有Fc段，不能够与抗体结合。

目前针对没有C线显色的解决方法是应用BSA封闭胶体金颗粒混合化学染料在NC膜上划假C线。假C线的显色强度是恒定的，无T线与C线强弱的消长变换，这就丧失了一部分的灵敏度。另外假C线与胶体金标记物的活性无关，与免疫金的活性状态不同步，不能指示免疫金的活性状态，在质量控制上容易造成假阳性。

常规的免疫胶体金标记步骤是：1，调整pH值；2，添加结合物；3，封闭；4，添加稳定剂。因是直接添加结合物，故本司命名为直接标记法。在生产实践中，直接标记法的标记效果一致性较差，20%，结合物投料量大，通常5ug/ml，造成生产效率低下，生产成本高的缺陷。

现有技术存在的缺陷是：

1.标记效果一致性差；

2.结合物投料量大；

3.假C线无T线与C线强弱的消长变换，灵敏度差；

4.假C线与胶体金标记物的活性无关，与免疫金的活性状态不同步，不能指示免疫金的活性状态，在质量控制上容易造成假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫胶体金均相混合标记法，以解决上述问题。

本发明采用了如下技术方案：

一种免疫胶体金均相混合标记法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、添加裸金并调整pH值；

步骤二、添加混合抗体，其中包含预定量的C线抗体和分散剂；

步骤三、封闭。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤一中添加K₂CO₃调整pH值。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤二中C线抗体的浓度是0.5～4.0ug/ml。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤三中，添加BSA进行封闭。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤四中，分散剂包含0～30wt%的PEG。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：其中，所述分散剂为抗体分散剂AD或受体分散剂RD。

所述抗体分散剂AD的配方为：

牛血清白蛋白BSA：0～30.0wt%，

聚乙烯吡咯烷酮PVP：0～30.0wt%，

聚乙二醇PEG：0～30.0wt%，

余量为纯化水，

其中BSA、PVP、PET的含量不同时为0wt%。

抗体分散剂AD在不同的实施方式中，可采用但不限于下述所列之不同的配比：

(1)30重量份的牛血清白蛋白BSA、30重量份的聚乙二醇PEG以及40重量份的纯化水；或

(2)30重量份的牛血清白蛋白BSA、30重量份的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及40重量份的纯化水；或

(3)30重量份的聚乙烯吡咯烷酮PVP、30重量份的聚乙二醇PEG以及40重量份的纯化水；或

(4)10重量份的牛血清白蛋白BSA、20重量份的聚乙烯吡咯烷酮PVP、20重量份的聚乙二醇PEG以及50重量份的纯化水；或

(5)20重量份的牛血清白蛋白BSA、10重量份的聚乙烯吡咯烷酮PVP、10重量份的聚乙二醇PEG以及60重量份的纯化水；或

(6)15重量份的牛血清白蛋白BSA、15重量份的聚乙烯吡咯烷酮PVP、15重量份的聚乙二醇PEG以及55重量份的纯化水。

在其它的实施方式中，根据检测的需求，当胶体金与受体结合时，则相应的采用受体分散剂RD。

所述受体分散剂RD配方为：

鸡卵白蛋白OVA：0～30.0wt%，

聚乙烯吡咯烷酮PVP：0～30.0wt%，

聚乙二醇PEG：0～30.0wt%，

余量为纯化水，

其中，OVA、PVP、PEG的含量不同时为0wt%。

受体分散剂RD在不同的实施方式中，可采用但不限于下述所列之不同的配比：

(1)30重量份的鸡卵白蛋白OVA、30重量份的聚乙二醇PEG以及40重量份的纯化水；或

(2)30重量份的鸡卵白蛋白OVA、30重量份的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及40重量份的纯化水；或

(4)10重量份的鸡卵白蛋白OVA、20重量份的聚乙烯吡咯烷酮PVP、20重量份的聚乙二醇PEG以及50重量份的纯化水；或

(5)20重量份的鸡卵白蛋白OVA、10重量份的聚乙烯吡咯烷酮PVP、10重量份的聚乙二醇PEG以及60重量份的纯化水；或

(6)15重量份的鸡卵白蛋白OVA、15重量份的聚乙烯吡咯烷酮PVP、15重量份的聚乙二醇PEG以及55重量份的纯化水。

本发明的有益效果为：本发明的免疫胶体金均相混合标记法，在生产实践中，免疫胶体金均相混合标记法能够同时实现稳定标记和提高灵敏度的效果。在生产实践中，标记物的投料量平均降低80%，灵敏度提高30～100%。

附图说明

图1是背景技术中免疫胶体金试纸条的结构原理图；

图2是背景技术中抗体的空间结构示意图；

图3是抗体分子与胶体金颗粒的空间结合构型的三种状态示意图(分别对应A、B、C)；

图4是显色强度与反应时间关系曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施方式来进一步阐述本发明的技术方案。

<实施例一>

对免疫胶体金直接标记法的标记效果一致性差的研究。

本发明以标记显色强度为纵坐标，标记抗体与胶体金颗粒反应时间为横坐标探索反应时间与显色强度的关系。如图4所示，在实验能够操控的15s至120min的范围内，15s即达到显色强度的峰值，这说明抗体与胶体金颗粒的反应速度非常快，也佐证了抗体与胶体金颗粒结合的电吸附理论。

另外，在生产实践中我们观察到，即使是同一试管同一批次标记获得的免疫金颗粒与试纸条T线的结合能力也不相同，这说明不同的的免疫金颗粒结合的抗体分子的数量不同。遂即对胶体金颗粒的蛋白结合能力进行了探索，结果1ml 40nm的胶体金溶液可以吸附10mg的抗体分子。这说明在抗体投料后先接触抗体分子的胶体金颗粒优先结合抗体分子，结合的抗体分子的数量也要显著大于后接触抗体分子的胶体金颗粒结合抗体分子的数量。

通过以上实验，本发明确定了影响免疫胶体金标记效果的关键影响因素主要有两个，一是静电吸附反应速度非常快，几乎是瞬时完成；二是胶体金颗粒对蛋白的吸附容量大。这两个因素综合作用造成抗体投料后瞬时被先接触抗体分子的胶体金颗粒所优先吸附，这也就决定了免疫胶体金标记效果的一致性差的缺陷。

使用本发明的免疫胶体金标记用抗体分散剂AD与抗体溶液混合，使得抗体分子能够均匀的分布在胶体金溶液体系中每一个胶体金颗粒的周围，形成免疫金颗粒均相。

免疫胶体金标记在添加结合物步骤混合添加C线抗体，可以实现与真C线抗体的结合，增加T线与C线强弱的消长变换，提高灵敏度。在生产实践中，对于受体和标记后无真C线结合的单克隆抗体作为结合物的胶体金标记，可以提高灵敏度30～100%。

本发明在免疫胶体金均相标记法和免疫胶体金混合标记法的基础上，在标记物投料步骤，标记物、分散剂与C线抗体同时混合标记，故命名免疫胶体金均相混合标记法。

在生产实践中，免疫胶体金均相混合标记法能够同时实现稳定标记和提高灵敏度的效果。在生产实践中，标记物的投料量平均降低80%，灵敏度提高30～100%。

<实施例二>

C线抗体的筛选方法

一、免疫封闭蛋白

本发明选择常用的封闭蛋白BSA、OVA、酪蛋白作为免疫原。封闭蛋白在自然样本中的含量丰度大，具有容易获得、特异性好、与其他检测物基本无交叉反应、成本低廉的优点，故本发明采用常用的封闭蛋白作为免疫原。

免疫程序共四次免疫：一免、二免、三免、加强免。具体免疫程序如下：

一免：D0天，弗氏完全佐剂，腹腔，50mg。

二免：D21天，弗氏不完全佐剂，皮下，30mg。

三免：D35天，弗氏完全佐剂，皮下，30mg。

加强免：D42天，弗氏不完全佐剂，腹腔，50mg。

二、筛选C线抗体

初次免疫后D45天，间接ELISA检测血清效价大于10万。无菌取免疫小鼠脾脏，SP20融合。

C线抗体筛选方案：

1，调节封闭蛋白浓度为5ug/ml，以100ul/well的量包被酶标板。

2，制备封闭蛋白单克隆抗体，培养上清经1000倍稀释后，OD_450nm值大于2.0，每种封闭蛋白30株。

3，纯化封闭蛋白单克隆抗体，调节浓度为5ug/ml，免疫胶体金直接标记，pH7.8-9.0(0.2M K₂CO₃添加量0.25～10ul)。

4，制备NC膜，T线为0.5mg/ml封闭蛋白，C线为0.5mg/ml羊抗鼠抗体，划膜液为0.05M PBS，40℃条件下干燥24h。

5，筛选条件：ELISA与封闭蛋白亲和力强，血清效价10万以上；与其他封闭蛋白无交叉反应；5ug/ml直接标记，10ul湿金，免疫胶体金T线不显色，C线显色强度大于1200。得到C线抗体。

<实施例三>

Beta内酰胺受体均相混合标记实例：

Beta内酰胺受体的直接标记浓度5ug/ml，pH值8.2，用0.2M K₂CO₃调pH值，2ul/ml Au。Beta内酰胺受体的均相混合标记浓度1ug/ml，pH8.2。

抗体混合液的配制：

Beta内酰胺受体，浓度5mg/ml，C线抗体浓度1mg/ml，受体分散剂RD，受体分散剂RD中含有以重量份计：15份的鸡卵白蛋白、15份的聚乙烯吡咯烷酮和15份的聚乙二醇和55份的纯水，配制100ul抗体混合液如表1所示。

表1：抗体混合液各组分

标记步骤：

1)标记离心管：Mark笔标记5支5ml离心管，在管盖上分别标记0，0.2，0.4，0.6，0.8；

2)添加裸金：混匀胶体金裸金，每管加入3ml胶体金溶液；

3)添加K₂CO₃：在离心管管盖上添加6.0ul 0.2M K₂CO₃，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮；

4)添加抗体：在离心管管盖上添加30ul的混合抗体，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置10min；

5)添加BSA：在离心管管盖上添加30ul 10%BSA，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置5min；

6)添加PEG：在离心管管盖上添加30ul 10%PEG，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮；

7)离心：使用台式高速离心机，将离心管两两置于转子的对角处，12000rpm，离心4min；

8)弃上清：先用1ml移液器弃掉绝大部分上清，再用200ul弃掉沉淀表面残液(剩余约50ul，以不吸起金沉淀为准)；

9)重悬复溶：每管加入300ul复溶液，摇晃重悬，试管底部沉淀金全部悬起，涡旋混匀2轮，备用。

采用上述方法得到的胶体金制备免疫胶体金试纸条,制备免疫胶体金试纸条的过程为：在背衬上依次设置样品垫、胶体金垫、检测线、质控线和吸收垫。制备胶体金试纸条的过程为本领域技术人员所知晓，其结构和检测原理在背景技术中已有描述，此处不做赘述。

本发明Beta内酰胺类侧向层析试纸条的质控标准为：阴性T值1300～1500，C值大于200，T/C值大于3.0；阳性青霉素G1ppb，T/C值0.7～0.9。

直接标记与均相混合标记的结果如表2(每个条件平行测试3条取平均值)所示：

表2：均相混合标记结果

Beta内酰胺受体标记，均相混合标记法与直接标记法相比，显色强度相同的情况下，受体投料量由5ug/ml降至1ug/ml，投料降低80%；灵敏度直接标记法是1ppb，均相混合标记法是0.75ppb，提高50%。

Claims

1.一种免疫胶体金均相混合标记法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、添加裸金并调整pH值；

步骤三、封闭。

2.根据权利要求1所述的免疫胶体金混合标记法，其特征在于：

步骤一中添加K₂CO₃调整pH值。

3.根据权利要求1所述的免疫胶体金混合标记法，其特征在于：

步骤二中C线抗体的浓度是0.5～4.0ug/ml。

4.根据权利要求1所述的免疫胶体金混合标记法，其特征在于：

步骤三中，添加BSA进行封闭。

5.根据权利要求1～4任一项所述的免疫胶体金混合标记法，其特征在于：

所述分散剂为抗体分散剂或受体分散剂；

所述抗体分散剂AD的配方为：

牛血清白蛋白BSA：0～30.0wt%，

聚乙烯吡咯烷酮PVP：0～30.0wt%，

聚乙二醇PEG：0～30.0wt%，

余量为纯化水，

而且BSA、PVP、PET的含量不同时为0wt%；

所述受体分散剂RD配方为：

鸡卵白蛋白OVA：0～30.0wt%，

聚乙烯吡咯烷酮PVP：0～30.0wt%，

聚乙二醇PEG：0～30.0wt%，

余量为纯化水，

而且OVA、PVP、PEG的含量不同时为0wt%。