CN105334319A - 一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，属于食品安全检测技术领域。本发明试纸条包括样品垫，胶体金结合垫，反应膜，吸水垫和底板，反应膜位于底板中间，反应膜的一侧从上至下依次设有交叠连接的样品垫和胶体金结合垫，另一侧设有吸水垫；胶体金结合垫和吸水垫均与反应膜交叠连接；反应膜上设有检测线和控制线；检测线上包被有玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物；控制线上包被有羊抗鼠IgG。本发明试纸条操作简单、检测成本低、检测时间短、特异性好、试纸条稳定性好、灵敏度高，检测范围为30ng/ml～200ng/ml，检测限可低达30ng/ml，测时间可控制在10分钟以内。

Description

一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条

技术领域

本发明涉及一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，属于食品安全检测技术领域。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalonone，ZEN)为一种白色结晶，又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物。1962年Stob等首先从发霉的玉米种分离得到了该毒素，命名为玉米赤霉烯酮；其主要衍生物为α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol)和β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol)。

ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品。受到ZEN污染的乳制品、肉制品等动物源性食品，会对动物及人类造成危害，主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后，会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN及其衍生物对肝脏系统，免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。

目前大多数国家对食品、谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分严格的规定。例如澳大利亚规定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.05mg/kg；意大利规定在谷物和谷类产品中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.1mg/kg；而在法国，植物油和谷类当中玉米赤霉烯酮的含量必须低于0.2mg/kg。我国GB13078.2-2006规定配合饲料、玉米中ZEN的MRL值为500μg/kg，GB2761-2011规定小麦(粉)、玉米(面、渣、片)中ZEN的MRL值为60μg/kg。

玉米赤霉烯酮及其衍生物的主要检测方法有薄层色谱法(TLC)、高压液相色谱法(HPLC)及质谱联用技术、酶联免疫吸附法(ELISA)和近几年发展起来的胶体金免疫层析法(GICA)。薄层色谱法是应用最早、最广的分析技术，但灵敏度低、重现差、操作烦琐、时间长且安全性差等缺点,已越来越不适用现代分析。高压液相色谱法及质谱联用技术是目前国内测定玉米赤霉烯酮使用最多、也最权威的方法，但前处理相对复杂、检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多。目前，仅有适用于检测谷物中玉米赤霉烯酮含量的试纸条，未有专门用于检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，该试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，反应膜3，吸水垫4和底板5，其特征在于，反应膜3位于底板5中间，反应膜3的一侧从上至下依次设有交叠连接的样品垫1和胶体金结合垫2，另一侧设有吸水垫4；所述胶体金结合垫2和吸水垫4均与反应膜3交叠连接；所述反应膜3上设有检测线31和控制线32；所述检测线31上包被有玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物；所述控制线32上包被有羊抗鼠IgG；所述玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物在检测线31上的包被量为每厘米检测线上包被2.0ug；所述羊抗鼠IgG在控制线32上的包被量为每厘米质控线32上包被0.8ug。

优选地，所述样品垫1长18mm～20mm，宽4mm～5mm；所述胶体金结合垫2长5mm～7mm，宽4mm～5mm；所述吸水垫4长18mm～20mm，宽4mm～5mm。

优选地，所述检测线31和控制线32间距4mm-7mm。

优选地，所述吸水垫4与反应膜3交叠3.1mm-3.7mm；所述胶体金结合垫2和反应膜3交叠3.1mm-3.5mm；所述样品垫1和胶体金结合垫2交叠3.1mm-3.5mm。

优选地，所述玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物，喷涂浓度为2mg/mL、喷量为1.0μL/cm；所述羊抗鼠IgG，喷涂浓度为1mg/mL、喷量为0.8μL/cm。

优选地，所述胶体金结合垫2的制备方法如下：

1)抗体-胶体金标记物溶液的制备：每1mL胶体金溶液，加入1μL0.1mol/LK₂CO₃和3μL0.9mg/mL抗玉米赤霉烯酮单抗，混匀后避光静置15min；然后加入100μL10％BSA溶液，混匀后避光静置15min；于4℃、10000r/min下离心15min，将弃去上清液后所得的沉淀用100μL20mM复溶液溶解，获得抗体-胶体金标记物溶液，4℃保存备用；所述复溶液为包含1％BSA、0.5％Tween20和5％海藻糖，且pH值为8.0的硼酸缓冲溶液；

2)将待处理的金标垫浸泡于含0.5％Tween20且pH为8.0的PBS溶液中，均匀浸湿后45℃烘干2h备用，获得预处理金标垫；

3)将步骤1所制备的抗体-胶体金标记物溶液用步骤1所述复溶液按照体积比为1:4进行稀释，获得抗体-胶体金标记物溶液的稀释液；

4)取步骤2所得预处理金标垫浸泡于步骤3所制备的抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，每6cm预处理金标垫浸于100μL抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，置于37℃烘干1h，获得胶体金结合垫2，置于干燥环境备用。

优选地，所述待处理的金标垫，为玻璃纤维膜。

优选地，所述反应膜3，为硝酸纤维素膜。

优选地，所述样品垫1，处理方法是将其浸于50mM硼酸缓冲液中，均匀浸湿后于45℃烘干备用；所述硼酸缓冲液包含1％BSA，0.5％Tween20，2％PVP和5％海藻糖，pH值为8.0。

本发明还提供了一种利用上述任一试纸条检测乳中玉米赤霉烯酮的方法，步骤如下：

1)在待检样品中加入等体积的乙腈，在5000r/min下离心5min，吸取上清液获得样品提取液；

2)取步骤1所得样品提取液滴加在权利要求1-8所述任一试纸条的样品垫1上，8min后观察检测结果；检测线31出现红色条带，样品呈阴性，检测线31未出现红色条带，样品呈阳性；若控制线32上无条带，试纸条无效。

本发明所述检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条是用于非诊断目的的，是检测可以作为原料乳来源的乳，如牛乳、羊乳等。

本发明有益效果：

本发明提供了一种乳中玉米赤霉烯酮残留检测试纸条，适应现代检测快速、简捷、现场化的要求。本发明试纸条操作简单、检测成本低、检测时间短、特异性好、灵敏度高。检测范围为30ng/ml～200ng/ml，检测限可低达30ng/ml,检测时间可控制在10分钟以内。试纸条稳定性较好，试纸条分别在4℃和25℃下密封保存3个月，灵敏度未发生改变；37℃密封保存的试纸条15d内灵敏度保持不变。

附图说明

图1试纸条结构组成示意图；

(1，样品垫；2，胶体金结合垫；3，反应膜；31，检测线；32，控制线；4，吸水垫；5，底板)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：

1.金标垫的制备

1.1胶体金溶液的制备：柠檬酸三钠法

试验用玻璃器皿要预先进行酸化和硅化。取100ml双蒸水倒入三角瓶，画一条100ml的线。用移液器吸出1ml水，加入1ml氯金酸，低转速煮沸，要保证三角瓶放平，加入1.5ml柠檬酸三钠，颜色不变时再煮15min，然后转凉至完全凉，最后用双蒸水定容。用紫外风光光度计和透射电镜鉴定胶体金的质量，胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，用透射电镜测得颗粒大小为25～40nm。

1.2抗体最佳标记量的确定

采用Mey氏稳定化实验，取16个2mlEP管，每管加入1ml胶体金，分别标为1～16号做正交实验。其中1、5、9、13号管不加K₂CO₃，2、6、10、14号管中加入1ulK₂CO₃，3、7、11、15号管中加入2ulK₂CO₃，4、8、12、16号管中加入3ulK₂CO₃。将抗玉米赤霉烯酮单抗稀释至0.9mg/ml,1～4号管每毫升胶体金溶液标记1ul抗体，5～8号管标记2ul抗体，9～12号管标记3ul抗体，13～16号管标记4ul抗体，混匀、避光静置15分钟。各管中加入20ul10％NaCl，混匀后避光静置15分钟。保持红色的最低添加组—K₂CO₃1ul，抗体2ul是抗体最小标记量及最适K₂CO₃添加量；抗体最小标记量的1.5倍，即抗玉米赤霉烯酮单抗的最适标记量为3ul0.9mg/ml。

1.3抗体-胶体金标记物的制备

取已制备好的胶体金溶液1mL,加入1ul0.1mol/LK₂CO₃，按3ul0.9mg/ml抗玉米赤霉烯酮单抗,边搅拌边加入抗玉米赤霉烯酮单抗,振荡混匀后避光静置15min。加入10％BSA100ul，振荡混匀，避光静置15分钟。4℃离心(10000r/min，15min)后弃上清，去除未结合的蛋白质，将沉淀用100ul含1％BSA、0.5％Tween20、5％海藻糖的20mM硼酸缓冲液(pH8.0,20mM)溶解；4℃保存备用。

1.4抗体-胶体金标记物复溶液的选择

分别对抗体-胶体金标记物复溶液的离子强度(20、50、100mM)，pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，BSA含量(1％、2％、3％)，表面活性剂(Tween20、PVP、PEG2000)及含量(0.5％、1％、2％)，海藻糖含量(5％、10％、15％)进行优化，通过T线显色情况确定选用20mM的硼酸缓冲液(PH8.0.1％BSA、0.5％Tween20、5％海藻糖)为抗体-胶体金标记物复溶液。

1.5抗体-胶体金标记物的最佳包被量的确定

为得到最适的抗体-胶体金标记物在金标垫上的包被量，取1.3中离心后复溶得到的抗体-胶体金标记溶液，分别按照1:1、1:2、1:3、1:4、1:5稀释，处理金标垫，制成试纸条后用0.01mol/LpH7.4的PBS滴定,观察检测线(T线)显色强度，选择显色能达到肉眼观察要求的最大稀释比例为最佳包被量。T线显色强度从原液到1:5递减，1:5的显色呈弱粉色，则选择1:4为抗体-胶体金标记物的最佳包被量，即取20ul的抗体-胶体金标记物溶液，添加80ul的复溶液，吹吸混匀得到的100ul溶液对金标垫进行处理。

1.6金标垫的制备

将金标垫浸泡于PBS(pH8.0，含0.5％Tween20)中，均匀浸湿后45℃烘干2h备用。取处理后的金标垫浸泡于制备好的抗体-胶体金标记物溶液中，每6cm结合物金标垫浸于100ul抗体-胶体金标记物溶液，于37℃烘干1h，置于干燥环境备用。

2.样品垫的制备

2.1样品垫处理液的选择

分别对样品垫处理液的离子强度(20、50、100mM)，PH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，BSA含量(1％、2％、3％)，表面活性剂(Tween20、PVP、PEG2000)及含量(0.5％、1％、2％)，海藻糖含量(5％、10％、15％)进行优化，通过T线显色情况确定选用50mM的硼酸缓冲液(PH8.0、1％BSA、0.5％Tween20，2％PVP、5％海藻糖)为样品垫的处理液。

2.2样品垫的处理方式

将样品垫浸泡于50mM硼酸缓冲液(PH8.0，含1％BSA，0.5％Tween20，2％PVP，5％海藻糖)中，均匀浸湿后45℃烘干2h备用。

3.NC膜(反应膜)的制备

3.1T线工作浓度范围的确定

将包被抗原ZEN-BSA用稀释液稀释成0.5、1、2、4、8mg/mL共7个浓度,按常规喷量1.0μL/cm包被到NC膜上作为T线,同时将羊抗鼠IgG稀释成1mg/mL按常规喷量1.0μL/cm包被到NC膜上作为控制线(C线),60℃干燥箱放置1h待稳定；上述NC膜与金标垫组装成试纸条,用0.01mol/LpH7.4的PBS滴定,观察T线显色强度，选择显色能达到肉眼观察要求的最小用量2mg/mL为最佳标记量。

3.2C线工作浓度范围的确定

根据T线工作浓度范围,将羊抗鼠IgG设置浓度为1mg/mL，按喷量0.2、0.4、0.6、0.8、1μL/cm包被到NC膜上作为C线,与金标结合垫组装后,用PBS液滴定,选择C线显色深度适中、比T线略浅的浓度0.8μL/cm作为C线的喷量。

3.3T线、C线以及金标抗体包被量配比的调试

在T线、C线工作浓度范围内,选择一组质量浓度按常规喷量包被到NC膜上,与金标垫组装后,37℃干燥箱放置24h,用PBS液和玉米赤霉烯酮标准溶液滴定,根据显色情况,再细调C、T线包被浓度配比。

T线、C线包被浓度配比选择标准：a.阴性溶液(PBS液)滴定时,C线和T线显色深度适中,T线显色大于等于C线。b.玉米赤霉烯酮标准品液滴定时,试剂板灵敏度越高越好。

3.4NC膜的制备

将玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物以2mg/mL、1.0μL/cm的条件包被到NC膜上构成T线，将羊抗鼠IgG以1mg/mL、0.8μL/cm的条件包被在NC膜上构成C线。

4试剂条的组装

将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫依次粘在PVC底板上，用切割机将组装好的大卡割成4mm宽的试纸条。所述的样品垫长18～20mm，宽4～5mm；结合垫长5～7mm，宽4～5mm；NC膜反应膜为Millipore315，检测线与质控线之间的距离为4～7mm，；吸水垫长18～20mm，宽4～5mm；所述吸水垫4与反应膜3交叠3.1-3.7mm；所述胶体金结合垫2和反应膜3交叠3.1mm-3.5mm；所述样品垫1和胶体金结合垫2交叠3.1mm-3.5mm。。试纸条组成结构如图1所示。

5样品前处理方法的选择

5.1提取液的选择

对常用的甲醇、乙腈、乙酸乙酯及1:1的甲醇和乙腈混合溶液的提取能力进行对比，发现乙腈沉淀蛋白能力，对玉米赤霉烯酮回收效果最优。

5.2脱脂方式的选择

乳及乳品中含有大量蛋白和脂肪，乙腈可除去大部分蛋白和少量脂类物质，但提取液中仍有脂肪干扰玉米赤霉烯酮的提取。对提取液用沉淀离心(5000r/min，5min)的方法脱脂。

5.3对样品的前处理

在样品中加入等体积的乙腈，将提取液进行离心(5000r/min，5min)处理，吸取上清液用于检测。

6检测方法

取100μLZEN标准溶液或样品提取液滴到样品垫上，液体会从样品垫经结合垫、NC膜最终被吸水垫吸收。8～15min后观察检测结果。检测线31(T线)出现红色条带，样品呈阴性，检测线31(T线)没出现红色条带，样品呈阳性。如果控制线32(C线)无条带，说明试纸条无效。

7试纸条的灵敏度和检测范围

取空白奶样，在其中分别添加玉米赤霉烯酮至终浓度为20、50、80、100、200ng/mL。用试纸条检测，每个浓度重复3次。

用试纸条检测样本时，当其中玉米赤霉烯酮添加浓度为30ng/ml时，试纸条C线显色，T线不显色，玉米赤霉烯酮添加浓度低于30ng/ml时，试纸条显示出两条红色，呈弱阴性，表明本试纸条对乳中玉米赤霉烯酮的检测灵敏度即最低检测限为30ng/ml；当玉米赤霉烯酮添加浓度为200ng/ml时，试纸条C线显色，T线不显色，呈阳性，当玉米赤霉烯酮添加浓度大于200ng/ml时，试纸条C线显色，T线也显色，呈弱阳性，表明本试纸条对乳中玉米赤霉烯酮的最高检测限为200ng/ml。综上可知，本发明提供的试纸条对玉米赤霉烯酮的检测范围为30ng/ml～200ng/ml，检测限可低达30ng/ml。

8试纸条的稳定性

将试纸条密封分别存放于37、25和4℃，观察不同温度对试纸条的影响。每天取出37℃保存的试纸条分别检测0、50、100ng/mLZEN标品溶液；每3d取出25℃保存的试纸条分别检测0、50、100ng/mL的ZEN标品溶液；每周取出4℃保存的试纸条分别检测0、50、100ng/mL的ZEN标品溶液，通过检测结果判断试纸条的保质期。

试纸条分别在4℃和25℃下密封保存3个月，灵敏度未发生改变；37℃密封保存的试纸条15d内灵敏度保持不变，表明本试纸条稳定性较好。

9试剂条的特异性

通过与结构类似物及其他霉菌毒素的交叉反应试验来研究试剂条的特异性，选用黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素为交叉反应物,试纸条C线和T线均显色，呈阴性。说明本试纸条对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素无交叉反应。

实施例2

按照实施例1中的方法制备一种检测牛乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，该试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，反应膜3，吸水垫4和底板5，其特征在于，反应膜3位于底板5中间，反应膜的一侧从上至下依次设有交叠连接的样品垫1和胶体金结合垫2，另一侧设有吸水垫4；胶体金结合垫2和吸水垫4均与反应膜3交叠连接；反应膜3上设有检测线31和控制线32；检测线31上包被有玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物；控制线32上包被有羊抗鼠IgG；玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物在检测线31上的包被量为2ug；羊抗鼠IgG在控制线32上的包被量为0.8ug。反应膜3，为硝酸纤维素膜。

样品垫1长18mm，宽4mm；胶体金结合垫2长5mm，宽4mm；吸水垫4长18mm，宽4mm。

检测线31和控制线32间距4mm。

吸水垫4与反应膜3交叠3.1mm；胶体金结合垫2和反应膜3交叠3.1mm；样品垫1和胶体金结合垫2交叠3.1mm。

玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物，喷涂浓度为2mg/mL、喷量为1.0μL/cm；所述羊抗鼠IgG，喷涂浓度为1mg/mL、喷量为0.8μL/cm。

胶体金结合垫2的制备方法如下：

1)抗体-胶体金标记物溶液的制备：每1mL胶体金溶液，加入1μL0.1mol/LK₂CO₃和3μL0.9mg/mL抗玉米赤霉烯酮单抗，混匀后避光静置15min；然后加入100μL10％BSA溶液，混匀后避光静置15min；于4℃、10000r/min下离心15min，将弃去上清液后所得的沉淀用100μL20mM复溶液溶解，获得抗体-胶体金标记物溶液，4℃保存备用；复溶液为包含1％BSA、0.5％Tween20和5％海藻糖，且pH值为8.0的硼酸缓冲溶液；

2)将浸泡于PBS溶液(pH8.0，含0.5％Tween20)中，均匀浸湿后45℃烘干2h备用，获得预处理金标垫；

3)将步骤1)所制备的抗体-胶体金标记物溶液用步骤1)所述复溶液按照体积比为1:4进行稀释，获得抗体-胶体金标记物溶液的稀释液；

4)取步骤2)所得预处理金标垫浸泡于步骤3)所制备的抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，每6cm预处理金标垫浸于100μL抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，置于37℃烘干1h，获得胶体金结合垫2，置于干燥环境备用。

样品垫1处理方法是将其浸于50mM硼酸缓冲液中，均匀浸湿后于45℃烘干2h备用；硼酸缓冲液包含1％BSA，0.5％Tween20，2％PVP和5％海藻糖，pH值为8.0。

利用本实施例制备的试纸条检测牛乳中玉米赤霉烯酮的方法，步骤如下：

1)在1mL牛乳中加入1mL的乙腈，在5000r/min下离心5min，吸取上清液获得样品提取液；

2)取100μL步骤1)所得样品提取液滴加在试纸条的样品垫1上，同时取100μLZEN标准溶液滴加在试纸条的样品垫1上，液体会从样品垫经结合垫、NC膜最终被吸水垫吸收，8min后观察检测结果；检测线31出现红色条带，样品呈阴性，检测线31未出现红色条带，样品呈阳性；若控制线32上无条带，试纸条无效。

实施例3

按照实施例1中的方法制备一种检测羊乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，该试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，反应膜3，吸水垫4和底板5，其特征在于，反应膜3位于底板5中间，反应膜的一侧从上至下依次设有交叠连接的样品垫1和胶体金结合垫2，另一侧设有吸水垫4；胶体金结合垫2和吸水垫4均与反应膜3交叠连接；反应膜3上设有检测线31和控制线32；检测线31上包被有玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物；控制线32上包被有羊抗鼠IgG；玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物在检测线31上的包被量为2ug；羊抗鼠IgG在控制线32上的包被量为0.8ug。反应膜3，为硝酸纤维素膜。

样品垫1长20mm，宽5mm；胶体金结合垫2长7mm，宽5mm；吸水垫4长20mm，宽5mm。

检测线31和控制线32间距7mm。

吸水垫4与反应膜3交叠3.7mm；胶体金结合垫2和反应膜3交叠3.5mm；样品垫1和胶体金结合垫2交叠3.5mm。

玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物，喷涂浓度为2mg/mL、喷量为1.0μL/cm；所述羊抗鼠IgG，喷涂浓度为1mg/mL、喷量为0.8μL/cm。

胶体金结合垫2的制备方法如下：

1)抗体-胶体金标记物溶液的制备：每1mL胶体金溶液，加入1μL0.1mol/LK₂CO₃和3μL0.9mg/mL抗玉米赤霉烯酮单抗，混匀后避光静置15min；然后加入100μL10％BSA溶液，混匀后避光静置15min；于4℃、10000r/min下离心15min，将弃去上清液后所得的沉淀用100μL20mM复溶液溶解，获得抗体-胶体金标记物溶液，4℃保存备用；复溶液为包含1％BSA、0.5％Tween20和5％海藻糖，且pH值为8.0的硼酸缓冲溶液；

2)将玻璃纤维膜(待处理的金标垫)浸泡于PBS溶液(pH8.0，含0.5％Tween20)中，均匀浸湿后45℃烘干2h备用，获得预处理金标垫；

3)将步骤1)所制备的抗体-胶体金标记物溶液用步骤1)所述复溶液按照体积比为1:4进行稀释，获得抗体-胶体金标记物溶液的稀释液；

4)取步骤2)所得预处理金标垫浸泡于步骤3)所制备的抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，每6cm预处理金标垫浸于100μL抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，置于37℃烘干1h，获得胶体金结合垫2，置于干燥环境备用。

样品垫1处理方法是将其浸于50mM硼酸缓冲液中，均匀浸湿后于45℃烘干2h备用；硼酸缓冲液包含1％BSA，0.5％Tween20，2％PVP和5％海藻糖，pH值为8.0。

利用本实施例制备的试纸条检测羊乳中玉米赤霉烯酮的方法，步骤如下：

3)在1mL羊乳中加入1mL的乙腈，在5000r/min下离心5min，吸取上清液获得样品提取液；

4)取100μL步骤1)所得样品提取液滴加在试纸条的样品垫1上，同时取100μLZEN标准溶液滴加在试纸条的样品垫1上，液体会从样品垫经结合垫、NC膜最终被吸水垫吸收，8min后观察检测结果；检测线31出现红色条带，样品呈阴性，检测线31未出现红色条带，样品呈阳性；若控制线32上无条带，试纸条无效。

实施例4：

本实施例与实施例2的区别在于：样品垫1长19mm，宽4mm；胶体金结合垫2长6mm，宽4mm；吸水垫4长19mm，宽4mm；检测线31和控制线32间距6mm；吸水垫4与反应膜3交叠3.5mm；胶体金结合垫2和反应膜3交叠3.2mm；样品垫1和胶体金结合垫2交叠3.2mm。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种检测乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，包括样品垫(1)，胶体金结合垫(2)，反应膜(3)，吸水垫(4)和底板(5)，其特征在于，反应膜(3)位于底板(5)中间，反应膜(3)的一侧从上至下依次设有交叠连接的样品垫(1)和胶体金结合垫(2)，另一侧设有吸水垫(4)；所述胶体金结合垫(2)和吸水垫(4)均与反应膜(3)交叠连接；所述反应膜(3)上设有检测线(31)和控制线(32)；所述检测线(31)上包被有玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物；所述控制线(32)上包被有羊抗鼠IgG；所述玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物在检测线(31)上的包被量为每厘米检测线上包被2.0ug；所述羊抗鼠IgG在控制线(32)上的包被量为每厘米质控线(32)上包被0.8ug。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫(1)长18mm-20mm，宽4mm-5mm；所述胶体金结合垫(2)长5mm-7mm，宽4mm-5mm；所述吸水垫(4)长18mm-20mm，宽4mm-5mm。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述检测线(31)和控制线(32)间距4mm-7mm。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述吸水垫(4)与反应膜(3)交叠3.1mm-3.7mm；所述胶体金结合垫(2)和反应膜(3)交叠3.1mm-3.5mm；所述样品垫(1)和胶体金结合垫(2)交叠3.1mm-3.5mm。

5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物，喷涂浓度为2mg/mL、喷量为1.0μL/cm；所述羊抗鼠IgG，喷涂浓度为1mg/mL、喷量为0.8μL/cm。

6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述胶体金结合垫(2)的制备方法如下：

1)抗体-胶体金标记物溶液的制备：每1mL胶体金溶液，加入1μL0.1mol/LK2CO₃和3μL0.9mg/mL抗玉米赤霉烯酮单抗，混匀后避光静置15min；然后加入100μL10％BSA溶液，混匀后避光静置15min；于4℃、10000r/min下离心15min，将弃去上清液后所得的沉淀用100μL20mM复溶液溶解，获得抗体-胶体金标记物溶液，4℃保存备用；

所述复溶液为包含1％BSA、0.5％Tween20和5％海藻糖，且pH值为8.0的硼酸缓冲溶液；

2)将待处理的金标垫浸泡于含0.5％Tween20且pH为8.0的PBS溶液中，均匀浸湿后45℃烘干2h备用，获得预处理金标垫；

3)将步骤1)所制备的抗体-胶体金标记物溶液用步骤1)所述复溶液按照体积比为1:4进行稀释，获得抗体-胶体金标记物溶液的稀释液；

4)取步骤2)所得预处理金标垫浸泡于步骤3)所制备的抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，每6cm预处理金标垫浸于100μL抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，置于37℃烘干1h，获得胶体金结合垫(2)，置于干燥环境备用。

7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜(3)，为硝酸纤维素膜。

8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫(1)，处理方法是将其浸于50mM硼酸缓冲液中，均匀浸湿后于45℃烘干备用；所述硼酸缓冲液包含1％BSA，0.5％Tween20，2％PVP和5％海藻糖，pH值为8.0。

9.一种利用权利要求1-8所述任一试纸条检测乳中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，步骤如下：

1)在待检样品中加入等体积的乙腈，在5000r/min下离心5min，吸取上清液获得样品提取液；

2)取步骤1)所得样品提取液滴加在权利要求1-8所述任一试纸条的样品垫(1)上，8min后观察检测结果；检测线(31)出现红色条带，样品呈阴性，检测线(31)未出现红色条带，样品呈阳性；若控制线(32)上无条带，试纸条无效。