CN106591492A - 一种lamp检测试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种LAMP检测试剂盒及应用，属于生物技术领域。本发明提供的试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；所述LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；所述LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；所述LAMP扩增反应液含有Taq SSB蛋白，Bst DNA聚合酶，Bst buffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O本发明试剂盒操作简单、检测成本低、检测时间短、特异性好、灵敏度高，能够防止引物产生多聚体现象，降低或阻止引物二聚体的产生，防止假阳性的产生，同时提高LAMP反应的扩增效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种LAMP检测试剂盒及应用，属于生物技术领域。
背景技术
克罗诺杆菌，2008年经过重新鉴定分型后分为：阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌(Cronobacter turicensis)、穆汀斯克罗诺杆菌(Cronobacter muytjensii)、康帝蒙提克罗诺杆菌(Cronobacter condimenti)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(Cronobacter universalis)、都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis)。由克罗诺杆菌引起的致病事件虽然较少，但是一旦发生，就会导致极高的致病率，由克罗诺杆菌引起的致病能够导致能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和败血症等疾病，对于婴幼儿奶粉造成了极大的威胁。虽然并不是所有的种能够导致婴幼儿疾病，但2016年国际微生物标准建议所有的克罗诺杆菌在婴幼儿奶粉中不得检出，因此建立一种高效、快速的检测方法尤为重要。克罗诺杆菌所有种的检测尤为重要，迅速发展的分子学生物方法PCR需要仪器复杂，仪器昂贵，检测灵敏度低，而直接利用抗体特异性的检测技术的试纸条方法能通过直接观察方式进行检测，但是目前针对阪崎克罗诺杆菌的抗体特异性差，所筛选的抗体存在大量的阪崎克罗诺杆菌的漏检现象，因此存在一定的错检风险。并且目前还没有研究将LAMP技术应用到检测克罗诺杆菌这个属的水平。
传统的克罗诺杆菌分离检测方法，国际上通常以美国FDA颁布的“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离计数”作为经典方法，依赖于生化和形态学特点来鉴定分离，但是传统的检测方法存在操作繁琐、耗时长、不易分辨结果等缺点。迅速发展的分子学生物方法PCR需要仪器复杂，仪器昂贵，检测灵敏度低。
近年来快速发展的LAMP技术灵敏度高，所需仪器简单，仅需一个水浴锅即可完成检测，但目前LAMP方法检测阪崎克罗诺杆菌的结果检测大多数利用的是电泳检测方法和染料检测方法。电泳检测方法所用的凝胶染料EB是一种致癌致突变试剂，严重伤害人体健康，并且检测时间约40分钟左右；而染料法包括SYBR Green,钙黄绿素，羟基萘酚蓝等检测，其在反应前后颜色差别存在一定的交叉性，因此会影响人体肉眼对其检测结果判断的准确性。
直接利用抗体特异性的检测技术的试纸条方法能通过直接观察方式进行检测，但是目前针对阪崎克罗诺杆菌的抗体特异性差，所筛选的抗体存在大量的克罗诺杆菌的漏检现象，因此存在一定的风险。现有的LAMP技术结合试纸条的方法多数是用于病毒的检测，很少用于致病菌的检测，目前还没有研究将LAMP技术结合到试纸条方法检测阪崎克罗诺杆菌这个种的水平。同时，LAMP技术大多采用设计探针标记FITC来进行扩增产物的标记，但是这种方式增加了产品的成本和费用，并且需要额外设计探针，假阳性的概率增加。此外，LAMP检测中由于LAMP引物多，产生的引物二聚体的概率增加，并且会导致标有标记物的产物在试纸条上产生的假阳性的结果。
引物二聚体是一种非特异性扩增反应下产生的非目标DNA片段，由于碱基只有4个，在引物设计以及扩增反应中不可避免的会产生非特异性扩增反应，产生引物二聚体，一方面这样消耗了反应基质中的反应底物，会降低反应的扩增效率，另一方面产生的引物二聚体会对一些最后结果判断产生误判的现象，加大了研究者的研究困难。有研究通过采用纳米金区分反应底物的方式来提高反应的扩增效率，降低引物二聚体的生成，但是采用纳米金的方式加大了实验难度和实验操作；还有研究通过采用设计核酸序列的方式来进行消除引物二聚体的方法，但是这样同样加大了实验的设计的难度，造成实验的繁琐。目前还没有一种方式来有效消除引物二聚体，从而提高LAMP的扩增效率的方式。
LAMP扩增体系通常包括LAMP引物，水，dNTP,镁离子，甜菜碱，Bst酶，缓冲液等基础反应底物。LAMP特异性的引物是在针对特定性待检物进行设计的，dNTP用来提供4中碱基，Bst酶是LAMP反应体系中的核心，镁离子是用来通过影响BstDNA酶的活性来影响扩增反应，甜菜碱添加能够有效减少碱基的堆叠，从而促进LAMP的反应，以上成分缺一不可。
发明内容
为解决LAMP引物过多，易发生引物错配，从而反应中消耗反应底物，降低了反应的扩增效率，甚至在试纸条的标记结果中出现假阳性问题，本发明提供了一种LAMP检测试剂盒，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；所述LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；所述LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；所述LAMP扩增反应液含有Taq SSB蛋白，Bst DNA聚合酶，Bst buffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O。
本发明中所述Taq SSB蛋白在LAMP扩增反应体系中的浓度为1ng/μL-7ng/μL。
优选地，所述Taq SSB蛋白在LAMP扩增反应体系中的浓度为3ng/μL-5ng/μL。
最优选地，所述Taq SSB蛋白在LAMP扩增反应体系中的浓度为4ng/μL。
所述LAMP引物组中的任意两条引物分别直接标记生物素和FITC；所述胶体金试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，底板3，反应膜4和吸水垫5；所述胶体金结合垫2上包被有FITC抗体-胶体金标记物；所述反应膜4上设有检测线41和控制线42；所述检测线上埋有SA；所述控制线上埋有羊抗鼠IgG。
优选地，所述SA的包被量为每厘米检测线上包被4.0μg-8.0μg；所述羊抗鼠IgG的包被量为每厘米控制线42上包被0.6μg-1.0μg。
更优选地，所述SA的包被量为每厘米检测线上包被5.0μg；所述羊抗鼠IgG的包被量为每厘米控制线42上包被0.8μg。
更优选地，所述试剂盒由LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条组成；所述LAMP扩增反应体系由LAMP引物组、LAMP扩增反应液组成；所述LAMP引物组由内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB组成；所述LAMP引物组中的任意两条引物分别直接标记生物素和FITC；所述LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；所述LAMP扩增反应液含有Taq SSB蛋白，Bst DNA聚合酶，Bst buffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O；所述胶体金试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，底板3，反应膜4和吸水垫5；所述胶体金结合垫2上包被有FITC抗体-胶体金标记物；所述反应膜4上设有检测线41和控制线42；所述检测线上埋有SA；所述控制线上埋有羊抗鼠IgG。
优选地，每25uL所述LAMP扩增反应体系包括：内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，1ng/μL-7ng/μLTaq SSB蛋白，0.6μL-1μL 8U Bst DNA聚合酶，1μL-3μL 10×Bst buffer，0.8mM-2.8mM dNTPs，1mM-5mM Mg2+，1μL-2μL DNA模板和ddH2O；所述外引物和内引物的浓度之比为1:3-1:8；所述外引物和环引物的浓度之比为1:2-1:5。
更优选地，每25uL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，0.9μL 8U Bst DNA聚合酶，2.5μL 10×Bst buffer，2mM dNTPs，4mM Mg2+，4ng/μL TaqSSB蛋白，2μL DNA模板和ddH2O。
本发明还提供了一种上述的试剂盒在检测检测细菌和病毒中的应用，尤其是在检测克罗诺杆菌中的应用。
优选地，该应用中内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，该应用中每25uL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，4ng/μLTaq SSB蛋白，0.9μL 8U Bst DNA聚合酶，2.5μL 10×Bst buffer，2mM dNTPs，4mM Mg2+，4ng/μLTaqSSB蛋白，2μL DNA模板和ddH2O。
更优选地，该试剂盒检测乳中克罗诺杆菌的具体步骤如下：
1)煮沸法提取DNA：取1mL待检测乳样，离心后弃上清，将沉淀物重悬于TE缓冲溶液中，将所得的混合物置于94℃-100℃下水浴5min-10min，将上述所得混合液离心，取上清获得DNA；所述TE缓冲溶液包含10mM Tris，1mM EDTA，pH为8；
2)以步骤1)获得的DNA作为LAMP反应中的DNA模板，进行LAMP扩增反应，获得LAMP扩增产物，稀释后避光静置；所述LAMP扩增反应程序为65℃水浴25min，80℃终止2min；
3)将步骤2)稀释后的LAMP扩增产物滴加到胶体金试纸条上，5min后观察检测结果；若控制线42上无条带，试纸条无效；若控制线42上出现红色条带，检测线41未出现红色条带，样品呈阴性；若控制线42上出现红色条带，检测线41出现红色条带，样品呈阳性，且红色信号越强，扩增产物浓度越高，待检的阪崎克罗诺杆菌数量越多。
本发明中SA为链霉亲和素；TaqSSB蛋白为热稳定单链结合蛋白。TaqSSB protein结合到引物上，提高反应的扩增效率，防止引物发生非特异性反应，进而降低错配率。
本发明中引物上特异性标记FITC和生物素，获得LAMP扩增产物标记有FITC和生物素，胶体金上结合的抗FITC抗体以及试纸条上T线上包被的链霉亲和素分别于FITC和生物素结合，形成双抗夹心，在T线上显现出红色条带，C线上包被的羊抗鼠IgG与多余的金标抗体结合，形成红色的C线。当T线和C线同时显色时表示呈现阳性结果，当C线显色T线不显色时呈现阴性结果，当C线不显色线显色表示试纸条无效。。
本发明中六条引物中的任意两条均可以和生物素和FITC进行任意组合标记，生物素和FITC与引物的组合标记的目的是为了防止额外加入的探针一步会增加气溶胶污染的概率，防止假阳性结果的产生，两条引物任意标记即可达到在扩增产物上形成带标记的标记物质，具体与生物素和FITC具体与哪条引物连接无关，只要是生物素和FITC与六条引物中的两条组合标记即可，如内引物FIP上直接标记生物素，内引物BIP上直接标记FITC；或内引物FIP上直接标记FITC，外引物F3上直接标记生物素；或外引物F3上直接标记生物素，环引物LF上直接标记FITC；或其他组合均可以实现本发明的目的，本发明不一一列举。
本发明有益效果：
1、本发明提供了一种结合LAMP技术检测克罗诺杆菌的试剂盒，本发明首次鉴定克罗诺杆菌鉴定到属的水平，本发明试剂盒操作简单、检测成本低、检测时间短、特异性好、灵敏度高，克服了LAMP技术的通用检测的灵敏度低，直接通过抗体检测特异性差，毒性大对人体伤害大，检测的耗时长的缺点，同时解决了试纸条直接检测克罗诺杆菌的抗体特异性差引起的漏检现象，适用于现场快速检测。
2、LAMP反应的进行依赖于多条引物进行扩增，引物之间的错配现象会带来试纸条的假阳性结果，造成结果的不准确，本发明首次引入TaqSSB蛋白进入LAMP反应体系，一方面利用TaqSSB蛋白能够结合到引物上，防止引物产生多聚体现象，降低或阻止引物二聚体的产生，防止假阳性的产生，另一方面阻止了非特异性扩增，特异性扩增的效率提高，从而提高LAMP反应的扩增效率；
3、发明体系通过添加Taq SSB蛋白还可以省去甜菜碱的添加，同样达到防止碱基堆叠的效果，同时省去甜菜碱添加Taq SSB蛋白不会对检测效果产生影响，本发明节省了原料，降低了成本。
4、本发明大大提高了检测的灵敏度，本发明试剂盒针对纯培养物的检测灵敏度低达100cfu/mL，现有LAMP方法检测奶粉中克罗诺杆菌灵敏度为102-103cfu/mL，而本发明针对奶粉中克罗诺杆菌的检测限可低达101CFU/mL，检测灵敏度提高了十倍。并且本发明大大缩短了检测时间，传统LAMP扩增反应需要40-60min，而本发明中LAMP扩增反应时间只需25min，大大缩短了LAMP扩增反应时间，最终整个检测过程可控制在40min以内。
5、本发明采用直接标记法来进行扩增反应，去除探针设计步骤，解决探针标记法的繁琐出错率高问题。同时可以挑选六条引物中的任意两条引物进行生物素和FITC的标记，用来进行试纸条的特异性识别，完成结果的呈现。
6、本研究的试纸条通过结合高效快速的LAMP技术稳定性较好，试纸条分别在37℃下密封保存30d，灵敏度未发生改变；试纸条分别在4℃下密封保存6个月，灵敏度未发生改变；室温下密封保存的试纸条30d内灵敏度保持不变。
7、本发明还提供了一种利用本发明试剂盒检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，采用了煮沸法方式来提取克罗诺杆菌的DNA，简单快速，节约时间。
附图说明
图1为阳性LAMP的扩增效率结果图；
(M，marker；1，不加TaqSSB蛋白；2，1ng/μL；3，2ng/μL；4，3ng/μL；5，4ng/μL；6，5ng/μL；7，6ng/μL；8，7ng/μL)。
图2为阴性LAMP的扩增效率结果图；
(M，marker；1，阳性组；2，不加TaqSSB蛋白；3，1ng/μL；4，2ng/μL；5，3ng/μL；6，4ng/μL；7，5ng/μL；8，6ng/μL；9，7ng/μL)。
图3为外引物与内引物浓度比的优化结果图；
(M，marker；1，1:2；2，1:3；3，1:4；4，1:5；5,1:6；6，1:7；7，1:8；9，为阴性)。
图4为外引物与环引物的浓度比优化结果图；
(M，marker；1，1:1；2，1:2；,3，1:3；4，1:4；5，1:5；6,1:6；7，为阴性)。
图5为镁离子浓度的优化结果图；
(M，marker；1，0mM；2，1mM；3，2mM；4，3mM；5，4mM；6，5mM；7，6mM；8，阴性)。
图6为Bst酶添加量的优化甜菜碱结果图；
(M，marker；1，0μL；2，0.5μL；3，0.6μL；4，0.7μL；5，0.8μL；6，0.9μL；7，1.0μL；8，1.1μL；9，1.2μL；10，阴性)。
图7为dNTP浓度的优化结果图；
(M，marker；1，0mM；2，1.2mM；3，1.6mM；4，2mM；5，2.4mM；6，2.8mM；7，3.2mM；8，3.6mM；9，阴性)。
图8为试纸条结构示意图；
(M，marker；1，样品垫；2，胶体金结合垫；3，底板；4，反应膜；41，检测线；42，控制线；5，吸水垫)。
图9为试纸条检测原理示意图。
图10为试纸条检测结果示意图。
图11为纯培养物中灵敏度的检测结果；
(a，电泳结果图；b，试纸条结果图；其中M，marker；1，106CFU/mL；2，105CFU/mL；3，104CFU/mL；4，103CFU/mL；5，102CFU/mL；6，101CFU/mL；7，100CFU/mL；8，10-1CFU/mL；9，阴性对照)。
图12为奶粉中的灵敏度检测结果；
(a，电泳结果图；b，试纸条结果图；其中M，marker；1，106CFU/mL；1，105CFU/mL；2，104CFU/mL；3，103CFU/mL；4，102CFU/mL；5，101CFU/mL；6，100CFU/mL；7，，阴性对照)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中采用的LAMP反应程序为将25uL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并黑暗处放置。
以下实施例中以如下LAMP引物组为例进行实验，各引物的核苷酸序列为：
内引物FIP(SEQID NO.1)：CCGTGTACGCTTGTTCGCTTTCTCTCAAACTCGCAGCAC；
内引物BIP(SEQID NO.2)：GGCAGTCAGAGGCGATGCGCCGGTTATAACGGTTCA；
外引物F3(SEQID NO.3)：AAATGCGCGGTGTGTCAG；
外引物B3(SEQID NO.4)：GGTTTCCCCATTCGGACAT；
环引物LF(SEQID NO.5)：AACCTCACAACCCGAAGA；
环引物LB(SEQID NO.6)：AGCGCCGGTAAGGT GATA。
以下实施例中使用的菌株名称及来源如表1所示。
表1菌株名称及来源
实施例1：LAMP反应体系的优化
菌种的培养和DNA的提取：
选取阪崎克鲁诺杆菌ATCC29544作为实验菌株进行相关实验，菌株从保藏在-80℃冰箱中取出，按3％的接种量接种到TSB液体培养基中，活化培养12h，之后进行TSA固体培养基上进行三区划线,培养16h,挑取单菌落于TSB液体培养基中，12h后进行DNA提取。
采用水浴法提取培养后的菌液的DNA，10000r/min离心3min后，加入TE缓冲液50uL,水浴100℃，10min后进行冰浴5min,然后离心10000r/min，1min取上清，上清即为DNA模板。
1、Taq SSB蛋白的添加效果及添加量优化
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，0.8μM环引物LF和0.8μM环引物LB，1μL 8UBst 2.0DNA WarmStart TM polymerase large fragment，2μL 10×Bst ThermoPolbuffer，1.5mM dNTPs，3mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
分别添加Taq SSB蛋白，使Taq SSB蛋白在体系中达到不同的浓度，按照上述方法进行LAMP反应，同时进行琼脂糖凝胶电泳的方式，通过观察引物二聚体生成的亮度以及LAMP产物的亮度来确定该蛋白的效果，以此评估引物二聚体的生成量。具体实验分组如下：
空白组：不添加Taq SSB蛋白，即Taq SSB蛋白添加量为0；实验组：分别向LAMP扩增反应体系添加Taq SSB蛋白，使Taq SSB蛋白在反应体系中的浓度分别为1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、4ng/μL、5ng/μL、6ng/μL、7ng/μL。
通过琼脂糖凝胶电泳方法检测阳性LAMP的扩增效率，结果如图1所示，其中泳道1为空白组即为不加TaqSSB蛋白，泳道2为TaqSSB蛋白的浓度为1ng/μL，泳道3为TaqSSB蛋白的浓度为2ng/μL，泳道4为TaqSSB蛋白的浓度为3ng/μL，泳道5为TaqSSB蛋白的浓度为4ng/μL，泳道6为TaqSSB蛋白的浓度为5ng/μL，泳道7为TaqSSB蛋白的浓度为6ng/μL，泳道8为TaqSSB蛋白的浓度为7ng/μL。条带越亮代表扩增效率越好，通过观察图1中条带的亮度可知：添加Taq SSB蛋白的实验组(泳道2-8)条带的亮度明显亮于没有添加Taq SSB蛋白的实验组(泳道1)，并且当TaqSSB蛋白的浓度在2ng/μL-5ng/μL之间(泳道3-6)时，条带亮度优于其他泳道亮度，当TaqSSB蛋白的浓度在4ng/μL之间(泳道5)时，条带最亮，因此，添加TaqSSB蛋白可以明显提高LAMP的反应扩增效率，减少引物二聚体的生成，TaqSSB蛋白的浓度在2ng/μL-5ng/μL之间LAMP的反应扩增效率更高，TaqSSB蛋白的浓度在4ng/μL时LAMP的反应扩增效率最好。
通过琼脂糖凝胶电泳方法检测阴性LAMP中引物二聚体的生成量，结果如图2所示，其中泳道1为阳性组，泳道2为空白组即为不加TaqSSB蛋白，泳道3为TaqSSB蛋白的浓度为1ng/μL，泳道4为TaqSSB蛋白的浓度为2ng/μL，泳道5为TaqSSB蛋白的浓度为3ng/μL，泳道6为TaqSSB蛋白的浓度为4ng/μL，泳道7为TaqSSB蛋白的浓度为5ng/μL，泳道8为TaqSSB蛋白的浓度为6ng/μL，泳道9为TaqSSB蛋白的浓度为7ng/μL。最底端极为二聚体的生成量，条带越亮代表引物二聚体的生成量越多，通过图2可知不加TaqSSB蛋白的泳道2中条带最亮，生成的引物二聚体的量最多，泳道3-9中添加了TaqSSB蛋白并且浓度不同，条带亮度明显低于泳道2条带亮度，说明引物二聚体的生成量明显减少，因此通过比较泳道2-9可知：添加TaqSSB蛋白可以明显减少引物二聚体的生成。泳道3、4、8、9中存在引物二聚体的条带，但条带亮度低于泳道2，说明引物二聚体的生成量减少，而泳道5、6、7中引物二聚体的条带亮度极弱，几乎没有，说明引物二聚体的生成量极少，几乎没有，因此当TaqSSB蛋白的浓度在1ng/μL-7ng/μL(泳道3-9)之间时，可以减少引物二聚体的生成量，而当TaqSSB蛋白的浓度在3ng/μL-5ng/μL(泳道5-7)之间时，可以阻止引物二聚体的生成。综上，TaqSSB蛋白的浓度在1ng/μL-7ng/μL之间均可以达到减少引物二聚体生成的效果，TaqSSB蛋白的浓度在3ng/μL-5ng/μL之间均可以达到阻止引物二聚体生成的效果。
2、外引物与内引物浓度比的优化
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，0.8μM环引物LF和0.8μM环引物LB，1μL 8U Bst 2.0 DNA WarmStart TMpolymerase large fragment，2μL 10×Bst ThermoPol buffer，1.5mM dNTPs，3mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
固定其他成分的浓度，调整外引物与内引物的浓度比进行LAMP反应优化：泳道1-8分别为1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，9为阴性。根据上述外引物与内引物浓度比配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择外引物与内引物的最佳浓度比，由图3可知，泳道5-8(外引物与内引物的浓度比为1:6-1:9)条带亮度明显优于其他条带，泳道5–9扩增效果较好，其中泳道6(外引物与内引物的浓度比为1:7)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度比为1:7。3、外引物与环引物的浓度比优化
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.8μM环引物LF和0.8μM环引物LB，1μL 8U Bst 2.0 DNA WarmStart TMpolymerase large fragment，2μL 10×Bst ThermoPol buffer，1.5mM dNTPs，3mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
固定其他成分的浓度，调整外引物与环引物的浓度比例为以下比例优化：条带1-6分别为1；1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6,7为阴性。根据上述外引物与环引物浓度比配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择外引物与环引物的最佳浓度比由图4可知，泳道4–6(外引物与环引物的浓度比1:4-1：5)条带亮度明显优于其他条带，泳道4–6扩增效果较好，其中泳道5(外引物与环引物的浓度比1:5)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度比为1：5。
4、镁离子浓度的优化
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，1μL 8U Bst2.0DNA WarmStart TM polymerase large fragment，2μL 10×Bst ThermoPol buffer，1.5mM dNTPs，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
镁离子的浓度影响DNA聚合酶的活性，进而产生对反应产物产量的影响，还会影响到引物的退火。固定其他成分的浓度，调整镁离子浓度为以下浓度：条带1-7分别为0mM，1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM。根据上述镁离子的浓度配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择镁离子的最佳浓度，由图5可知，泳道4–7(3mM-6mM)条带亮度明显优于其他条带，泳道–扩增效果较好，其中泳道5(4mM)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度为4mM。
5、dNTP浓度的优化
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，1μL 8U Bst2.0DNA WarmStart TM polymerase large fragment，2μL 10×Bst ThermoPol buffer，4mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
dNTP的浓度大小会影响DNA聚合酶的扩增效率。固定其他成分的浓度，调整dNTP的浓度为以下浓度：条带1-8分别为0mM，1.2mM，1.6mM，2mM，2.4mM，2.8mM，3.2mM，3.6mM，9为阴性。根据上述dNTP的浓度配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择dNTP的最佳浓度，由图6可知，泳道3–6(1.6mM–2.8mM)条带亮度明显优于其他条带，泳道3–6扩增效果较好，其中泳道5(2mM)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度为2mM。
6、Bst DNA聚合酶添加量的优化
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB2μL 10×BstThermoPol buffer，2mM dNTPs，3mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
Bst酶是LAMP反应体系中的核心。固定其他成分的浓度，调整Bst酶的添加量为下：条带1-9为0μL，0.5μL，0.6μL，0.7μL，0.8μL，0.9μL，1.0μL，1.1μL，1.2μL，10为阴性。选取最优添加量。根据上述Bst酶的添加量配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择BstDNA聚合酶的添加量。，由图7可知，泳道5–8(0.8μL-1.1μL)条带亮度明显优于其他条带，泳道5–8扩增效果较好，其中泳道6(0.9μL)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度为0.9μL。
通过上述优化过程得到的扩增效果最好的LAMP体系为：每25uL LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，0.9μL 8U Bst DNA聚合酶，2.5μL 10×Bst buffer，2mM dNTPs，4mM Mg2+，4ng/μL TaqSSB蛋白，2μL DNA模板和ddH2O。将25uL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并黑暗处放置。将上述所示的LAMP体系中引物任意选择两条分别标记FITC和生物素。
实施例2：试剂盒的制备
本发明的目的在于提供一种LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；LAMP扩增反应液含有Taq SSB蛋白，Bst DNA聚合酶，Bst buffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O。
每25uL所述LAMP扩增反应体系组分如下：内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，3ng/μL Taq SSB蛋白，0.6μL 8U Bst DNA聚合酶，1μL 10×Bst buffer，0.8mM-2.8mM dNTPs，1mM-5mM Mg2+，1μL DNA模板；所述外引物和内引物的浓度之比为1:3；所述外引物和环引物的浓度之比为1:2，其余用ddH2O补足。
所述LAMP引物组中的任意两条引物分别直接标记生物素和FITC；本实施例中以内引物FIP上直接标记生物素，且内引物BIP引物上直接标记FITC为例。
胶体金试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，底板3，反应膜4和吸水垫5；胶体金结合垫2上包被有FITC抗体-胶体金标记物；反应膜4上设有检测线41和控制线42；检测线上埋有SA；控制线上埋有羊抗鼠IgG。SA的包被量为每厘米检测线上包被4.0μg；羊抗鼠IgG的包被量为每厘米控制线42上包被0.6μg。
胶体金结合垫2的制备步骤包括1)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；2)将FITC抗体标记在胶体金颗粒上；3)将链霉亲和素(SA)标记在硝酸纤维素膜上的T线上，将鼠抗IgG抗体包被在硝酸纤维膜上的C线上；4)按顺序组装粘合一起得到胶体金试纸条。
上述底板3可以采用硬质聚氯乙烯背衬板，反应膜4可以采用硝酸纤维膜，硝酸纤维膜粘贴于在硬质聚氯乙烯背衬板上，在硝酸纤维膜的一端粘贴有胶体金结合垫，在胶体金结合垫上粘贴有样品垫，吸水垫置于硝酸纤维膜的另一端上，试纸条的组成和反应原理图见图8-9。
试剂盒的检测方法：取5μL LAMP扩增产物于100μL稀释液混匀滴到样品垫上，液体会从样品垫1经结合垫2、NC膜4最终被吸水垫5吸收。5～10min后观察检测结果。如果控制线42(C线)出现红色条带，检测线41(T线)不出现红色条带，样品呈阴性，检测线4-1(T线)出现红色条带，样品呈阳性。如果控制线4-2(C线)无条带，说明试纸条无效。试纸条检测结果示意图见图10。
实施例3：试剂盒的制备
本发明的目的在于提供一种LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；LAMP扩增反应液含有Taq SSB蛋白，Bst DNA聚合酶，Bst buffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O。
每25μL所述LAMP扩增反应体系组分如下：内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，5ng/μLTaq SSB蛋白，1μL 8U Bst DNA聚合酶，3μL 10×Bst buffer，2.8mM dNTPs，5mM Mg2+，2μL DNA模板；所述外引物和内引物的浓度之比为1:8；所述外引物和环引物的浓度之比为1:5，其余用ddH2O补足。
所述LAMP引物组中的任意两条引物分别直接标记生物素和FITC；本实施例中以内引物FIP上直接标记生物素，且内引物BIP引物上直接标记FITC为例。
胶体金试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，底板3，反应膜4和吸水垫5；胶体金结合垫2上包被有FITC抗体-胶体金标记物；反应膜4上设有检测线41和控制线42；检测线上埋有SA；控制线上埋有羊抗鼠IgG。SA的包被量为每厘米检测线上包被8.0μg；羊抗鼠IgG的包被量为每厘米控制线42上包被1.0μg。
胶体金结合垫2的制备步骤包括1)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；2)将FITC抗体标记在胶体金颗粒上；3)将链霉亲和素(SA)标记在硝酸纤维素膜上的T线上，将鼠抗IgG抗体包被在硝酸纤维膜上的C线上；4)按顺序组装粘合一起得到胶体金试纸条。
上述底板3可以采用硬质聚氯乙烯背衬板，反应膜4可以采用硝酸纤维膜，硝酸纤维膜粘贴于在硬质聚氯乙烯背衬板上，在硝酸纤维膜的一端粘贴有胶体金结合垫，在胶体金结合垫上粘贴有样品垫，吸水垫置于硝酸纤维膜的另一端上，试纸条的组成和反应原理图见图8-9。
试剂盒的检测方法：取5μL LAMP扩增产物于100μL稀释液混匀滴到样品垫上，液体会从样品垫1经结合垫2、NC膜4最终被吸水垫5吸收。5～10min后观察检测结果。如果控制线42(C线)出现红色条带，检测线41(T线)不出现红色条带，样品呈阴性，检测线4-1(T线)出现红色条带，样品呈阳性。如果控制线4-2(C线)无条带，说明试纸条无效。试纸条检测结果示意图见图10。
实施例4：试剂盒的制备
本发明的目的在于提供一种LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；LAMP扩增反应液含有Taq SSB蛋白，Bst DNA聚合酶，Bst buffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O。
每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，0.9μL 8U Bst DNA聚合酶，2.5μL10×Bst buffer，2mM dNTPs，4mM Mg2+，4ng/μL TaqSSB蛋白，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足。
所述LAMP引物组中的任意两条引物分别直接标记生物素和FITC；本实施例中以内引物FIP上直接标记生物素，且内引物BIP引物上直接标记FITC为例。
胶体金试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，底板3，反应膜4和吸水垫5；胶体金结合垫2上包被有FITC抗体-胶体金标记物；反应膜4上设有检测线41和控制线42；检测线上埋有SA；控制线上埋有羊抗鼠IgG。SA的包被量为每厘米检测线上包被5.0μg；羊抗鼠IgG的包被量为每厘米控制线42上包被0.8μg。
胶体金结合垫2的制备步骤包括1)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；2)将FITC抗体标记在胶体金颗粒上；3)将链霉亲和素(SA)标记在硝酸纤维素膜上的T线上，将鼠抗IgG抗体包被在硝酸纤维膜上的C线上；4)按顺序组装粘合一起得到胶体金试纸条。
上述底板3可以采用硬质聚氯乙烯背衬板，反应膜4可以采用硝酸纤维膜，硝酸纤维膜粘贴于在硬质聚氯乙烯背衬板上，在硝酸纤维膜的一端粘贴有胶体金结合垫，在胶体金结合垫上粘贴有样品垫，吸水垫置于硝酸纤维膜的另一端上，试纸条的组成和反应原理图见图8-9。
试剂盒的检测方法：取5μL LAMP扩增产物于100μL稀释液混匀滴到样品垫上，液体会从样品垫1经结合垫2、NC膜4最终被吸水垫5吸收。5～10min后观察检测结果。如果控制线42(C线)出现红色条带，检测线41(T线)不出现红色条带，样品呈阴性，检测线4-1(T线)出现红色条带，样品呈阳性。如果控制线4-2(C线)无条带，说明试纸条无效。试纸条检测结果示意图见图10。
实施例5：试剂盒的性能试验
1.试剂条的特异性
针对7株克罗诺杆菌和16株非克罗诺杆菌(如表1)进行特异性验证试验来研究试剂条的特异性，其中选用7株克罗诺杆菌试验的试纸条C线和T线均显色，呈阳性，其余16株非阪崎克罗诺杆菌试验的试纸条C线和T线均显色，呈阴性。说明本试剂盒对检测克罗诺杆菌特异性强。
2.试纸条的灵敏度和检测范围
取纯培养物的菌液，平板计数法所得菌液浓度为5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105CFU/mL，采用上述1中叙述方法提取DNA，并采用上述2中进行LAMP扩增实验，将所得产物进行试纸条检测，每个扩增产物检测重复3次。
用试剂盒中的试纸条检测纯培养物中的克罗诺杆菌时，当其中克罗诺杆菌浓度为5×100CFU/mL时，试纸条C线显色，T线也显色较弱，当浓度低于5×100CFU/mL时，试纸条试纸条C线显色，T线不显色，呈阴性，表明本试剂盒对纯培养物中克罗诺杆菌的检测灵敏度即最低检测限为100CFU/mL；菌液浓度高于5×100CFU/mL时，随着浓度增加，T线颜色加深。
利用上述方法对实施例2、实施例3和实施例4方法制备的试剂盒进行灵敏度实验，结果发现，实施例2试剂盒针对克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度为5×101cfu/mL，实施例3试剂盒针对克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度为5×101cfu/mL，实施例4试剂盒针对克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度为5×100cfu/mL。综上可知，本发明提供的试剂盒对克罗诺杆菌纯培养物的检测限可低达5×100CFU/mL。
实施例4试剂盒灵敏度检测结果图如图11所示，其中M，marker；1，106CFU/mL；2，105CFU/mL；3，104CFU/mL；4，103CFU/mL；5，102CFU/mL；6，101CFU/mL；7，100CFU/mL；8，10-1CFU/mL；9，阴性对照。
3.试剂盒的稳定性
将试纸条密封分别存放于37、25和4℃，观察不同温度对试纸条的影响。每天取出37℃保存的试纸条分别检测菌液浓度为5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105CFU/mL的阪崎克罗诺杆菌的LAMP扩增的DNA核酸产物；每3d取出25℃保存的试纸条分别检测5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105CFU/mL的DNA扩增产物；每周取出4℃保存的试纸条分别检测5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105CFU/mL的DNA扩增产物，通过检测结果判断试纸条的保质期。
试纸条分别在4℃和25℃下密封保存6个月，灵敏度未发生改变；37℃密封保存的试纸条30d内灵敏度保持不变，表明本试纸条稳定性较好。
实施例6：利用试剂盒检测奶粉中克罗诺杆菌杆菌
1)取纯培养物的菌液，平板计数法所得菌液浓度为5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106CFU/mL，分别取1g奶粉溶于8mL 0.85％的生理盐水中中,并加入分别加入不同浓度的克罗诺杆菌杆菌菌液5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106CFU/mL，获得样品不同浓度的污染量5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105、5×105CFU/g，采用上述1中叙述方法提取DNA，并采用上述2中进行LAMP扩增实验，将所得产物进行试纸条检测，每个扩增产物检测重复3次。
2)将不同浓度的污染菌液的奶粉进行煮沸法的DNA提取，将所获得的DNA(2μL)加入到LAMP体系中，进行LAMP方法的扩增，将所获得的LAMP产物进行试纸条检测。
3)任意选择LAMP引物FIP和BIP进行分别标记FITC和生物素，将上述所优化的LAMP体系于65℃中反应25min后，80℃终止5min后获得带标记的LAMP产物。
4)取100μL步骤3)所得样品稀释液与LAMP产物进行混合，将混合物滴加在试纸条的样品垫1上，液体通过毛细血管力会从样品垫经结合垫、NC膜最终被吸水垫吸收，5min后观察检测结果；检测线4-1和控制线4-2都出现红色条带，样品呈阳性，若只控制线4-2出现红色条带，样品为阴性；若控制线4-2上无条带，试纸条无效。
煮沸法提取DNA的方法如下：
取1mL待提取的样品，于10000r/min离心2min,弃上清，将所得的沉淀物重悬于50μL，10mM TE缓冲液中，将所得的混合物置于100℃下水浴10min，将上述所得混合液于10000r/min，离心2min，取上清作为DNA模板用于后续LAMP反应；TE buffer为10mM Tris,1mM EDTA,pH＝8.0。
通过以上实验还可以得出本发明试剂盒检测奶粉中灵敏度，奶粉中灵敏度结果图12所示，其中泳道1-6分别为5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100CFU/g，泳道7为阴性对照。
用试剂盒中的试纸条检测奶粉中的克罗诺杆菌时，当其中克罗诺杆菌浓度为5×101CFU/g时，试纸条C线显色，T线也显色较弱，当浓度低于5×101CFU/g时，试纸条试纸条C线显色，T线不显色，呈阴性，表明本试剂盒对奶粉中克罗诺杆菌的检测灵敏度即最低检测限为101CFU/g；菌液浓度高于5×101CFU/g时，随着浓度增加，T线颜色加深。
利用上述方法对实施例2、实施例3和实施例4方法制备的试剂盒进行灵敏度实验，结果发现，实施例2试剂盒针对奶粉中克罗诺杆菌的检测灵敏度为5×102cfu/g，实施例3试剂盒针对奶粉中克罗诺杆菌的检测灵敏度为5×102cfu/g，实施例4试剂盒针对奶粉中克罗诺杆菌的检测灵敏度为5×101cfu/g。
综上可知，本发明提供的试剂盒针对奶粉中对克罗诺杆菌的检测，检测限可低达5×101CFU/mL。
传统LAMP扩增反应需要40-60min，扩增反应加电泳结果呈现时间需要80-100min；而本申请中LAMP扩增反应时间只需25min，比传统LAMP扩增反应时间缩短了15-35min；本申请利用试纸条方式直接呈现结果，检测结果呈现时间降低至5-15min，因此本申请利用试剂盒检测克罗诺杆菌的整个检测过程可控制在40min以内；同时，传统LAMP反应终止反应需要5min，本申请利用冰浴降温法可将直接终止反应，无需终止反应。因此，本申请相比于现有LAMP方法大大缩短了LAMP反应时间和检测时间。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种LAMP检测试剂盒及应用
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 内引物FIP
<400> 1
ccgtgtacgc ttgttcgctt tctctcaaac tcgcagcac 39
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 内引物BIP
<400> 2
ggcagtcaga ggcgatgcgc cggttataac ggttca 36
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 外引物F3
<400> 3
aaatgcgcgg tgtgtcag 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 外引物B3
<400> 4
ggtttcccca ttcggacat 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 环引物LF
<400> 5
aacctcacaa cccgaaga 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 环引物LB
<400> 6
agcgccggta aggtgata 18
Claims (10)
1.一种LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括LAMP扩增反应体系和胶体金试纸条；所述LAMP扩增反应体系包括LAMP引物组、LAMP扩增反应液；所述LAMP引物组包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB；所述LAMP扩增反应液含有Taq SSB蛋白，BstDNA聚合酶，Bst buffer，dNTPs，Mg2+，模板和ddH2O。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Taq SSB蛋白在LAMP扩增反应体系中的浓度为1ng/μL-7ng/μL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP引物组中的任意两条引物分别直接标记生物素和FITC；所述胶体金试纸条包括样品垫(1)，胶体金结合垫(2)，底板(3)，反应膜(4)和吸水垫(5)；所述胶体金结合垫(2)上包被有FITC抗体-胶体金标记物；所述反应膜(4)上设有检测线(41)和控制线(42)；所述检测线上埋有SA；所述控制线上埋有羊抗鼠IgG。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述SA的包被量为每厘米检测线上包被4.0μg-8.0μg；所述羊抗鼠IgG的包被量为每厘米控制线(42)上包被0.6μg-1.0μg。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每25uL所述LAMP扩增反应体系包括：内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，1ng/μL-7ng/μLTaq SSB蛋白，0.6μL-1μL 8UBst DNA聚合酶，1μL-3μL 10×Bst buffer，0.8mM-2.8mM dNTPs，1mM-5mM Mg2+，1μL-2μLDNA模板和ddH2O；所述外引物和内引物的浓度之比为1:3-1:8；所述外引物和环引物的浓度之比为1:2-1:5。
6.权利要求1-5任一所述的试剂盒在检测细菌和病毒中的应用。
7.权利要求1-5任一所述的试剂盒在检测克罗诺杆菌中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，0.9μL 8U Bst DNA聚合酶，2.5μL 10×Bst buffer，2mM dNTPs，4mM Mg2+，4ng/μLTaqSSB蛋白，2μL DNA模板和ddH2O。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测乳中克罗诺杆菌的具体步骤如下：
1)煮沸法提取DNA：取1mL待检测乳样，离心后弃上清，将沉淀物重悬于TE缓冲溶液中，将所得的混合物置于94℃-100℃下水浴5min-10min，将上述所得混合液离心，取上清获得DNA；所述TE缓冲溶液包含10mM Tris，1mM EDTA，pH为8；
2)以步骤1)获得的DNA作为LAMP反应中的DNA模板，进行LAMP扩增反应，获得LAMP扩增产物，稀释后避光静置；所述LAMP扩增反应程序为65℃水浴25min，80℃终止2min；
3)将步骤2)稀释后的LAMP扩增产物滴加到胶体金试纸条上，5min后观察检测结果；若控制线(42)上无条带，试纸条无效；若控制线(42)上出现红色条带，检测线41未出现红色条带，样品呈阴性；若控制线(42)上出现红色条带，检测线(41)出现红色条带，样品呈阳性，且红色信号越强，扩增产物浓度越高，待检的阪崎克罗诺杆菌数量越多。
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