CN102520172A - 单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用，属于分子生物学和免疫学领域。本发明是将分子生物学的聚合酶链式反应技术和免疫层析技术进行结合，实现对食品中单增李斯特氏菌的快速检测。本发明试剂盒包括DNA提取、PCR扩增及试纸条检测共三部分。其中通过对引物的修饰，并在制备试纸条中选择相应的包被物和标记物，从而实现分子生物学技术和免疫层析技术的结合，达到对食品中单增李斯特氏菌特异扩增产物的检测，与传统生化方法相比大大节省了检测时间，简化操作步骤，具有准确、迅速、便捷、安全等特点，适宜大量样品的检测。

Description

单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及快速检测食品中单增李斯特氏菌的试剂盒和方法。

背景技术

随着国家对食品安全及进出口贸易的日益重视，对食品安全检测技术的要求也越来越高。根据《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》对公共安全领域中食品安全与出入境检验检疫工作发展的要求，研究高效、快速、准确的检测技术已成为该领域课题的主要趋势和目标之一。

根据世界卫生组织掌握的资料，在食源性疾病危险因素中，微生物性食物中毒仍是首要危害；在我国，据中国疾病预防控制中心统计，我国流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒居首位，2006-2009年间每年所占比例分别为46.1％、37.1％和31.1％。单增李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜患病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李斯特氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，很多国家都已经采取措施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。

目前，致病微生物的检测主要采用生物化学分析方法，但始终存在检测耗时长等缺点，难以应付日益增多的检测样本量以及满足检验检疫工作高效率的要求。另一方面，随着聚合酶链式反应(PCR)技术的应用，基于分子水平的检验检疫技术得到了长足发展。荧光PCR方法除了需要高端的仪器设备外，使用的试剂价格昂贵，使得检测成本大大提高，数据处理及结果判断需要专业有经验的技术人员，不适合进行广泛的推广；基因芯片技术不仅操作复杂，而且需要配备很多昂贵仪器，技术成本高，对实验条件要求严，不利于普及推广，结果判断也不够直观；目前渐起的LAMP技术，由于灵敏度高，极易受到污染而产生假阳性结果，故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法，而且结果的判断方法存在一定的缺陷。

普通PCR方法可以采用多种方法对扩增产物进行分析，最常用的包括：凝胶电泳分析、分子杂交、限制性内切酶分析、核酸序列分析。凝胶技术对相关人员及环境的毒害作用大，需要一系列复杂操作，而且点样时操作误差会使样品漂移造成结果不准确，不适合进行大量样本的检测分析工作；分子杂交技术对操作人员技术要求较高，重现性不好；酶切分析技术操作复杂，增加污染几率；核酸序列分析法周期长、成本高不能满足快速检测的需求。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供食品中单增李斯特氏菌检测用核酸层析试剂盒及其检测方法和应用；发明主要目的在于克服传统的微生物检测方法存在检测时间长、步骤繁琐等缺陷，而提供一种更加快速、简捷、安全的检测试剂盒及其检测方法。

本发明设计试剂盒既可以保证PCR技术的灵敏度和特异性，还保留了免疫层析技术所具备的高效、便捷、低成本等特点。

食品中单增李斯特氏菌检测的试剂盒，包括细菌裂解液a、PCR反应液b、阴性对照品c、阳性对照品d、样品稀释液e和试纸条，所述试纸条所述试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上组成。结合垫上包被胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜上有包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线；PCR反应液b中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F为5′CCCCAAGTAGCAGGACAT 3′，下游引物R为5′AGATTACACTGGATAATT3′；所述上游引物F标记生物素，下游引物R标记地高辛。

结合垫上包被胶体金颗粒粒径为25nm，1mL胶体金颗粒标记8.4μg鼠抗地高辛抗体，形成的胶体金-抗体复合物在结合点垫上的包被量为2mL/30cm。

硝酸纤维素膜上检测线包被亲和素浓度为0.5mg/mL，包被量为1μL/cm；控制线上包被羊抗鼠抗体浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm。

细菌裂解液a组成为：10mM Tris-HCl，1％Triton-100pH7.0；

PCR反应液b组成如下：25μL反应体系包括以下组分

5×buffer                 5μL；

dNTP(各2.5mmol/L)         2μL；

MgCl₂(25mmol/L)           2μL；

引物F(10umol/L)         0.5μL；

引物R(10umol/L)         0.5μL；

Taq DNA聚合酶(5U/μL)   0.2μL；

H₂O                     12.8μL。

阴性对照品c：大肠埃希氏菌；

阴性对照品c制备方法：大肠埃希氏菌培养过夜后，稀释到10⁶CFU/mL，作为阴性对照品；

阳性对照品d：单增李斯特氏菌；

阳性对照品d制备方法：阳性菌培养过夜后，稀释到10⁶CFU/mL，作为阳性对照品；

样品稀释液e：PBS溶液(pH7.2)组成为

细菌裂解液a、PCR反应液b、阴性对照品c、阳性对照品d储存于-20℃。

样品稀释液e和试纸条常温储存于阴凉干燥处。

所述试纸条外部设置塑料卡盒，塑料卡盒上依次设置凹孔和观测口，所述试纸条的样品垫放置于凹孔对应处，硝酸纤维素膜上设置的质控线和检测线在观测口对应处；

应用本发明试剂盒检测食品中单增李斯特氏菌，包括以下步骤：

1)根据食品样本的检测标准(GB4789.30，SN/T0184等检测标准)进行增菌；

2)提取DNA：

3)从-20℃冰箱中取出PCR反应液管b，待溶液溶化后2000r/min离心30s；

4)向反应液管中加入2μL增菌液DNA，混匀；

5)将上述反应管置于普通PCR仪中，95℃变性30s后，95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，进行30个循环，之后72℃延伸10min，完成PCR扩增；

6)将上述10μL的扩增产物与90μL的样品稀释液e进行混合；

7)取出试纸条平放于水平桌面上，将上述混合液加在试纸条样品垫处；

8)反应10min后，根据试纸条层析情况判断检测结果，完成食品样本检测。

结果判定

阴性对照仅出现一条红线(在质控线C)。

阳性对照出现两条红线：一条位于检测线(T)，另一条位于质控线(C)。出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在单增李斯特氏菌；

根据试纸条显色，直接读取检测结果。

1)质控标准

每个测试样本至少出现一条质控线，有或无检测线。

2)结果描述及判定(见图1)

仅在质控线C出现一条红线，表示样品中单增李斯特氏菌或细菌拷贝数低于试剂盒最低检测限；

所述步骤(2)中提取DNA方法如下：1mL增菌液3000r/min离心2min沉淀培养物中的食品残渣，取上清于1.5mL离心管中12000r/min，离心10min，弃去上清，使用200μL裂解液a将底部沉淀重新悬起，然后在沸水浴中煮10min，取出后立即置于冰浴中5min。使用前3000r/min离心2min取上清2μL作为模板进行后续试验。

提取DNA也可采用市售基因组提取试剂盒进行提取。

本发明试剂盒的技术原理如下：

根据单增李斯特氏菌的遗传背景信息，选择保守、特异序列，筛选引物，并使用生物素、地高辛进行引物修饰，使得阳性核酸扩增产物带有双标记。同时胶体金试纸条上金标结合垫上包被鼠抗地高辛抗体，层析膜的检测线上包被能够与生物素进行特异结合的亲和素，质控线上包被羊抗鼠抗体。在层析过程中阳性扩增物的地高辛标记与金标结合垫上金标复合物进行结合，之后所带的生物素标记物与层析膜上检测线上亲和素结合，形成的“三明治”夹心结构复合物被检测线捕获从而显色，多余的金标复合物继续层析，达到控制线时与包被的羊抗鼠抗体结合，从而被控制线捕获而显色。阴性样品则因为没有双标记物的存在在层析过程中不能够被检测线捕获从而不显色。

有益效果：

该试剂盒是将PCR扩增技术和免疫层析技术相结合实现对核酸产物的快速检测，PCR扩增后，产物不需要通过复杂的凝胶电泳实验，在10-20min内即可实现对单增李斯特氏菌扩增产物的分析，与荧光PCR及普通PCR方法相比具有以下特点：

1.操作简单：只需将核酸产物与一定量PBS混合后滴加在试纸条样品孔即可，无需其他操作；

2.反应速度快：在10-20min内即可实现对单增李斯特氏菌扩增产物的分析，缩短了检测时间；

3.低成本：检测不需要复杂的仪器，普通PCR仪即可，也不需昂贵的特殊试剂，检测成本低；

4.降低了对实验人员的要求：由于该技术不需要复杂的仪器，操作过程简单，检测结果肉眼判读，所以任何人经过自学或者简单的培训即可胜任。

5.安全性：该技术不需要用到特殊试剂，避开凝胶电泳中EB等污染物，对操作者和试验环境都是安全无害的。

本发明所研究的核酸层析检测试剂盒，使用试纸条直接检测PCR的扩增产物，该反应模式既可以保证灵敏度和特异性，还保留了层析技术所具备的高效、便捷、低成本等特点，使得对PCR扩增产物的分析时间只需要10-20min；实现一步操作，完全省去制胶、电泳、染色分析等一系列复杂操作及相关仪器设备，极大提高了扩增产物分析的效率和成功率、降低了检测成本；同时还实现了对操作人员无毒害、对环境无污染。因此，核酸层析检测技术符合国家对食品安全与出入境检验检疫中检测技术的发展要求，有利于提高食品安全与出入境检验检疫工作的效率与准确率，有利于保证食品安全与进出口贸易，从而在公共安全领域发挥重要作用。

附图说明

图1：试剂盒结果判断；

图2：试剂盒检测特异性；

图3：试剂盒检测灵敏度。

图4试剂盒结构示意图

具体实施方式

以下对本发明做进一步的的具体实施说明，

实施例1试剂盒的检测特异性

以绵羊李斯特氏菌(1)、英诺克李斯特氏菌(2)、西尔李斯特氏菌(3)、威氏李斯特氏菌(4)、格氏李斯特氏菌(5)为李斯特氏菌属属内验证菌株，其它常见致病菌大肠埃希氏菌(6)、肠炎沙门氏菌(7)、枯草芽孢杆菌(8)、金黄色葡萄球菌(9)、福氏志贺氏菌(10)作为李斯特氏菌属属外验证菌株，提取其基因组作为模板进行PCR扩增，以单增李斯特氏菌作为阳性对照C⁺，检测结果见图2。

从图上结果可以看出只在阳性对照(C⁺)处显示阳性，其余为阴性，说明本发明的试剂盒特异性好，检测结果准确。

实施例2试剂盒的灵敏度

以单增李斯特氏菌DNA为基础，作梯度稀释浓度分别为(/μL)1ng、100pg、10pg、1pg、100fg分别作为模板进行PCR扩增，并通过试纸条进行检测，同时设置阴性对照(C^-)，结果见图3。

从结果可以看出在1pg处显示为弱阳，100fg处检测线不显色为阴性，说明本发明试剂盒检测单增李斯特氏菌灵敏度可达到1pg。

实施例3样品检测

从超市、市场购买奶制品、蛋类、蔬菜、鱼、虾、鸡肉、猪肉等共50份样品，增菌后取增菌液提取基因组进行PCR扩增，产物用试纸条进行检测，结果见表2，与传统微生物法GB 4789.30-2010结果比较没有显著差异，符合率为97.7％。

表2样品检测试验

χ2＝0  P＞0.03

以上结果说明本发明试剂盒与传统微生物法相比符合率高，省时且无漏检现象。传统方法对样品增菌效果有一定的要求，阳性样品增菌到一定的浓度后，平板划线才能够显示可疑菌落，并完成后续的生化鉴定试验，且在增菌液浓度较低时划线所用菌液量少，不一定能够挑到可疑菌落进行划线。在该比对试验中由于PCR技术本身灵敏度高，微量的模板经过扩增后呈指数级增长，从而使得该比对结果中有1例样品不符合。

Claims (7)

1.一种单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒，包括细菌裂解液a、阴性对照品c、阳性对照品d和试纸条，所述试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上组成；其特征在于试剂盒还包括PCR反应液b，PCR反应液b中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F为5’CCCCAAGTAGCAGGACAT 3′，下游引物R为5′AGATTACACTGGATAATT 3′；所述上游引物F标记生物素，下游引物R标记地高辛；所述结合垫上包被胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜上有包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线。

2.如权1所述单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述结合垫上包被胶体金颗粒粒径为25nm，1mL胶体金颗粒标记8.4μg鼠抗地高辛抗体，形成的胶体金-抗体复合物在结合点垫上的包被量为2mL/30cm。

3.如权1或2所述单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述硝酸纤维素膜上检测线包被亲和素浓度为0.5mg/mL，包被量为1μL/cm；控制线上包被羊抗鼠抗体浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm。

4.如权1或3所述单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应液b组成如下：25μL反应体系包括以下组分

5×buffer                5μL；

dNTP(各2.5mmol/L)        2μL；

MgCl₂(25mmol/L)          2μL；

引物F(10umol/L)        0.5μL；

引物R(10umol/L)        0.5μL；

Taq DNA聚合酶(5U/μL)  0.2μL；

H₂O                   12.8μL。

5.如权1或3所述单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述试纸条外部设置塑料卡盒，塑料卡盒上依次设置凹孔和观测口，所述试纸条的样品垫放置于凹孔对应处，硝酸纤维素膜上设置的质控线和检测线在观测口对应处。

6.如权1-5中任一权利要求所述单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

1)根据食品样本的检测标准进行增菌；

2)提取DNA：

3)取出PCR反应液管b，待溶液溶化后2000r/min离心30秒；

4)向反应液管中加入2μL增菌液DNA，混匀；

5)将上述反应管置于普通PCR仪中，95℃变性30s后，95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，进行30个循环，之后72℃延伸10min，完成PCR扩增；

6)将上述10μL的扩增产物与90μL的样品稀释液e进行混合；

7)取出试纸条平放于水平桌面上，将上述混合液加在试纸条样品垫中；

8)反应10min后，根据试纸条层析情况判断检测结果，完成食品样本检测；结果判定：出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在单增李斯特氏菌；仅出现一条红线(在质控线C)，则样品中不存在单增李斯特氏菌。

7.一种单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒在检测食品中单增李斯特氏菌中的应用。

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