CN101381777A - 单增李斯特菌检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对样品中单增李斯特菌的检测装置及其检测方法。主要解决现有检测单增李斯特菌试剂盒存在的检测样品单一以及检测步骤繁琐、灵敏度底的技术问题。试剂盒由以下试剂组成：试剂A：前处理样品液；试剂B：磁珠；试剂C：DNA提取液；试剂D：PCR反应液，其中含有特定两对引物A08650和A08651；A08653和A08654，其序列分别为：5’GGGGAACCCACTATCTTTAGTC和5’GGGCCTTTCCAGACCGCTTCA；GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC和5’CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC。本发明主要用于对样品中单增李斯特菌的快速检测。
Description
技术领域：本发明涉及对样品中单增李斯特菌的检测装置及其检测方法。特别涉及一种单增李斯特菌检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌Lmonocytogenes，LMO)是一种人畜共患致病菌，可使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病，死亡率高达30％～70％。该病广泛存在于土壤、人和动物的粪便中，很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病大爆发。近年来已有不少国家报道了由于污染单增李氏菌发生的食物中毒事件。早在1929年，就有报道该菌对人有致病性，最严重的一次是1985年在美国加里福尼亚地区，应食用乳酪引起的单增李氏菌食物中毒。目前该菌每年在美国已成为由食物污染引起死亡的四大病原菌之一。此外由于该菌在4℃冰箱保存的食品中也可生长繁殖，故其危害性进一步增大。因此世界各国政府部门对其菌越来越重视，纷纷制定一些新的食品安全法规，并把单增李氏菌纳入法定强检项目。我国每年大量进口水产品，加入WTO以来，进出口贸易呈直线上升态势，传统的单增李斯特菌检验方法，检验周期冗长，至少需要5d～14d才能得出结果，步骤繁琐且检验精度低。为了适应对外贸易发展的新需要，实现与国际检测技术接轨，有必要建立一种简便、快速、准确的检出方法，以更好的为检验检疫事业服务。
近年来，国内外的研究人员建立了多种快速检测食品中单增李斯特菌的方法，包括商海涛等免疫磁性分离—PCR方法(商海涛，等.李斯特氏菌因子血清的制备及食品检测的免疫磁性分离—PCR(MIPA)方法的建立，中国兽医学报，1999，19(4)：339-343.)、寇运同等的免疫磁珠捕集法(ListerTest)【寇运同，等.用免疫磁珠捕集法快速检测食品中的单核细胞增生李斯特菌。检验检疫科学，2001，11(6)：12-13】、OConnor等的PCR/DNA探针方法【O’Connor-L et al.Rapidpolymerase chain reaction/DNA probe member-based assay for detection of Listeriaand Listeria monocytogenes in food.J-Food-Prot，2000，63(3)：337-342】、孙焕冬等的半套式PCR等方法【孙焕冬等。半套式聚合酶链反应检测牛奶中部分肠道致病菌。职业与健康，2002，18(3)：43-44】。上述方法样品均需前增菌，延长了检出的时间且检测的灵敏度低。还没有解决快速检出该菌的问题。Hudson-JA等的方法虽然能在24h快速检出该菌，但只对单一的火腿样品进行了试验。
发明内容：
本发明采用先进的IMS/PCR(immunomagnetic separation/polymerase chainreaction)方法，利用抗李斯特菌免疫磁性分离技术(anti-Listeria immunomagneticbeads)，其基本原理是抗原抗体反应。将包被有抗体的磁珠加至样品中，缓慢振荡，如样品中含李斯特菌，将被吸附在磁珠的抗体上，样品不需要进行富集，可直接从样品中浓缩获LMO，捕获的磁珠再通过消化、抽提、纯化该细菌的DNA，用一对L.monocytogenes的listeriolysinO(hlyA)基因特异性引物和一对Listeria23S rRNA区域的基因特异型引物分别作为PCR的靶基因，通过复合PCR得到特异性的700bp和240bp两个片断。
本发明的目的是提供一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，主要解决现有检测单增李斯特菌试剂盒存在的检测样品单一以及检测步骤繁琐、灵敏度底的技术问题。本发明可以快速、灵敏、准确地检出样品中单增李斯特菌，适合于各种样品的检测。
本发明的技术方案为：一种单增李斯特菌检测试剂盒，试剂盒由以下试剂组成：
试剂A：前处理样品液；
试剂B：磁珠；
试剂C：DNA提取液；
试剂D：PCR反应液，其中含有特定两对引物A08650和A08651；A08653和A08654，其序列分别为：5’GGGGAACCCACTATCTTTAGTC和5’GGGCCTTTCCAGACCGCTTCA；GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC和5’CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC。
试剂D PCR反应液中所含的特定引物A08650和A08651；A08653和A08654，每种含量应不少于5pmol/L。
PCR反应液，每管组成为每管单增李斯特菌的50μL扩增反应体系组成中含5μL 0.025mol/L MgCl2；5pmol/L 2对引物A08650和A08651为3μL、A08653和A08654为8μL；PCR buffre(PCR缓冲液)5μL；200μmol/LdNTP(脱氧核苷三磷酸)1μL；Taq酶(聚合酶)0.5μL；DNA 10μL(终浓度为2ng/mL)；ddH2O 6.5μL。
本发明所提供的快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒的检测方法包括如下步骤：
一、前处理样品
1.取待检样品25g，加至50mL试剂A；消化20min。弃去沉淀。
2.离心机选取参数1560g，离心2min，弃去沉淀。
3.离心机选取参数1560g，离心20min，弃上清液，重悬沉淀于700μLPBS/Tween20(磷酸盐缓冲溶液/吐温20)中。
二、磁珠吸附
1.加入20μL抗—Listeria磁珠，慢慢震荡10min后在磁性架上静置吸附10min。
2.弃去上清液，重悬沉淀于200μL TE缓冲液中。所述的TE缓冲液为Tris-HCl(盐酸三氨基甲烷)缓冲液和EDTA(乙二胺四乙酸)缓冲液的混合液。配比组成：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。
三、样品中DNA的提取
1.在步骤二的TE缓冲液中，加入20μL溶菌酶，室温放置5min。
2.加入SDS(十二烷基硫酸钠)12μL，4μL蛋白酶K，37℃水浴30min。裂解过程中上下混匀几次，降解完全的样品应为半透明粘稠液体，否则应继续保温处理。
3.加入236μL的苯酚、氯仿和异戊醇，苯酚:氯仿:异戊醇体积比＝25:24:1；混匀10min，离心机选取参数13800g离心5min。
4.弃去有机层，加入236μL的氯仿和异戊醇(氯仿:异戊醇的体积比＝24:1)，轻轻混匀，弃去有机层。
5.加入24μL 3mol/L醋酸钠，48μL的冷无水乙醇(—20℃隔夜)，离心沉淀DNA。
6.600μL 70％乙醇洗一次，倒置于干净的滤纸上，室温干燥。
7.待检样品DNA用50μL milliQ水(超纯水)溶解。
四、PCR反应
取10μL待检样品DNA加入反应管D中，混匀后在PCR仪中进行以下反应：
反应结束后，取20μL PCR产物，加2μL溴酚蓝混匀后进行确定扩增产物。如出现240bp和700bp的反应产物，说明待检样品中有单增李斯特菌。如只出现240bp的反应产物，说明待检样品中有李斯特菌，但不是单增李斯特菌。
本发明的有益效果是，减少了常规方法中增菌的培养过程。克服常规方法耗时长、繁琐及不够精确的缺点，直接利用IMS方法，从样品中抽提DNA，最大程度的提高该致病菌的检出率及灵敏度。本发明具有操作简便、快速、灵敏度高、经济等优点，在4h能够检出LMO。灵敏度可达15CFU/mL。比以前的试剂盒方法灵敏度大大提高，操作方便，且成本大大降低。
附图说明：
图1为本发明在模拟样品猪肉糜中的灵敏性检测电泳结果
图1中：1.DL2000分子量标记；2.单增李斯特菌(ATCC 7644)；3.英诺克李斯特菌(ATCC 33090)；4.阴性对照；5.阴性对照；6.10-1稀释度(标准菌株ATCC7644浓度)；7.10-2稀释度；8.10-3稀释度；9.10-4稀释度；10.10-5稀释度；11.10-6稀释度；12.10-7稀释度；13.DL2000分子量标记。
图2单增李斯特菌、李斯特菌属及阴性菌株比较
图2中：1.DL2000分子量标记；2.单增李斯特菌(ATCC 54003)；3.单增李斯特菌(ATCC 19115/413)；4.格氏李斯特菌(ATCC 700545)；5.英诺克李斯特菌(ATCC 33090)；6.绵羊李斯特菌(ATCC 19119)；7.依氏李斯特菌；8.斯氏李斯特菌(ATCC 35967)；9.韦尔希默氏李斯特菌(ATCC 35897)；10.金黄色葡萄球菌(ATCC 51816)；11.金黄色葡萄球菌(ATCC 27664)；12.枯草杆菌(ATCC 6051)；13.大肠埃希氏菌(ATCC51813)；14.肠炎沙门氏菌(ATCC 49214)；15.产气杆菌(ATCC 13048)；16.蜡样芽孢杆菌(ATCC 6051)17.DL2000分子量标记。
具体实施方式：
模拟样品：猪肉糜和青菜用快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒检测。试剂盒组成为：
试剂A：前处理样品液。其组成为0.1mol/L NaCl，0.02mol/L CaCl2，0.1％Tween，0.05％mg/mL胰蛋白酶，25mg/mL甘露糖，25mg/mL葡萄糖；
试剂B：磁珠，直径为250nm。组成为Anti-Listeria(抗李斯特菌)包被的抗体；
试剂C：DNA提取液。其组成为20％ SDS，苯酚:氯仿:异戊醇体积比＝25:24:1；氯仿:异戊醇体积比＝24:1；
试剂D：PCR反应液，每管单增李斯特菌50μL扩增反应体系组成中含5μL 0.025mol/L MgCl2；5pmol/L2对引物A08650和A08651为3μL、A08653和A08654为8μL；PCR buffre 5μL；200μmol/L dNTP 1μL；Taq酶0.5μL；DNA 10μL(终浓度为2ng/mL)；ddH2O 6.5μL；
按本发明所提供的快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒的使用方法，先用试剂A均质样品，磁珠吸附，之后提取样品中的DNA，进行PCR反应，反应结束后取20μL加2μL溴酚蓝混匀后进行2％琼脂糖凝胶电泳，即可发现样品中是否含有单增李斯特菌。整个检测过程4小时内即可完成。
把标准菌株单增李斯特菌ATCC 7644，接营养肉汤，37℃，24h培养后，分别进行10-1～10-7菌液稀释，每个稀释度添加到灭过菌的猪肉糜中，作模拟样品的灵敏度实验，同时相应的每一个稀释度分别涂布平板作为对照。PCR结果如图1。
由图1可知，模拟样品的灵敏度达到10-5稀释度，相应的平板上菌落数为15 CFU/mL，即模拟样品的灵敏度相当于15 CFU/mL。
方法的特异性实验
引用前面所述单增李斯特菌(LMO)特异性的2对基因引物A08650和A08651、A08653和A08654对LMO进行PCR鉴定检测。分别对应得到240bp和700bp二条扩增条带。结果如图2。
由图2可知，除第2及第3泳道的单增李斯特菌出现240bp和700bp的反应产物外，第3及第9泳道的李斯特菌属只出现240bp的反应产物。第10及第16泳道的阴性对照(非李斯特菌属)没有特异性反应产物条带。详见下表1。
表1 试剂盒所用特异性实验菌株PCR结果
| 菌种名 | hlyA基因(700bp) | Listeria 23S rRNA基因(240bp) |
| 单增李斯特菌(ATCC 54003) | + | + |
| 单增李斯特(ATCC 19115/413) | + | + |
| 格氏李斯特菌(ATCC 700545) | - | + |
| 英诺克李斯特菌(ATCC 33090) | - | + |
| 绵羊李斯特菌(ATCC 19119) | - | + |
| 斯氏李斯特菌(ATCC 35967) | - | + |
| 韦尔希默氏李斯特菌(ATCC35897) | - | + |
| 金黄色葡萄球菌(ATCC 51816) | - | - |
| 金黄色葡萄球菌(ATCC 27664) | - | - |
| 枯草杆菌(ATCC 6051) | - | - |
| 大肠埃希氏菌(ATCC 51813) | - | - |
| 肠炎沙门氏菌(ATCC 49214) | - | - |
| 产气杆菌(ATCC 13048) | - | - |
| 蜡样芽孢杆菌(ATCC 6051) | - | - |
Claims (6)
1.一种单增李斯特菌检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下试剂组成：
试剂A：前处理样品液；
试剂B：磁珠；
试剂C：DNA提取液；
试剂D：PCR反应液，其中含有特定两对引物A08650和A08651；A08653和A08654，其序列分别为：5’GGGGAACCCACTATCTTTAGTC和5’GGGCCTTTCCAGACCGCTTCA；GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC和5’CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所说的PCR反应液特定引物A08650和A08651；A08653和A08654，每种含量应不少于5pmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所说的试剂D：PCR反应液，每管组成为每管单增李斯特菌的50μL扩增反应体系组成中含5μL 0.025mol/L MgCl2，5pmol/L2对引物A08650和A08651为3μL，A08653和A08654为8μL，PCR缓冲液5μL，200μmol/L脱氧核苷三磷酸1μL，聚合酶0.5μL，DNA 10μL，ddH2O 6.5μL。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所说的DNA终浓度为2ng/mL。
5.根据权利要求1所述的单增李斯特菌检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
前处理样品步骤：
取待检样品25g，加至50mL试剂A，消化20min，弃去沉淀；
离心机选取参数1560g，离心2min，弃去沉淀；
离心机选取参数1560g，离心20min，弃上清液，重悬沉淀于700μL磷酸盐
缓冲溶液/吐温20中；
磁珠吸附步骤：
加入20μL抗—李斯特菌磁珠，慢慢震荡10min，在磁性架上静置吸附10min；
弃去上清液，重悬沉淀于200μL TE缓冲液中；
样品中DNA的提取步骤：
在TE缓冲液中，加入20μL溶菌酶，室温放置5min；
加入十二烷基硫酸钠12μL，4μL蛋白酶K，37℃水浴30min。裂解过程中上下混匀几次，降解完全的样品应为半透明粘稠液体，否则应继续保温处理；
加入236μL的苯酚、氯仿和异戊醇，苯酚:氯仿:异戊醇体积比＝25:24:1；混匀10min，离心机选取参数13800g离心5min；
弃去有机层，加入236μL氯仿和异戊醇，氯仿:异戊醇体积比＝24:1，轻轻混匀，弃去有机层；
加入24μL 3mol/L醋酸钠，48μL的冷无水乙醇，—20℃隔夜，离心沉淀DNA；
用600μL 70％乙醇洗一次，倒置于干净的滤纸上，室温干燥；
待检样品DNA用50μL超纯水溶解；
PCR反应步骤：
取10μL待检样品DNA加入反应管D中，混匀后在PCR仪中进行以下反应：
反应结束后，取20μL PCR产物，加2μL溴酚蓝混匀后进行确定扩增产物。
6、根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述的TE缓冲液为盐酸三氨基甲烷缓冲液和乙二胺四乙酸缓冲液的混合液，配比组成为10mmol/L盐酸三氨基甲烷缓冲液与1mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液进行混合。
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Granted publication date: 20130123 Termination date: 20211020 |