CN104350143A - 保温器用于促进生物反应的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及保温器、或自主加热包用于对溶液进行加热并在适当的温度维持一段时间的用途，其中所述一段时间是完成化学、生物化学或生物反应所需的，尤其是在分子生物学或细胞生物学应用中。包含保温器的生物试剂盒也是本发明的部分。

Description

保温器用于促进生物反应的用途

技术领域

本发明涉及分子和细胞生物学试剂盒的领域，还涉及用于进行需要温和供热的化学反应的试剂盒的领域。本发明的主题尤其是包含简单价廉价的自主加热装置的用于处理活检的试剂盒。

背景技术

几年来，细胞尤其是自体细胞的移植，已经成为促进患病或受损组织再生的有效且安全的必要方式。某些治疗规程需要在再植之前对细胞进行离体增殖和/或修饰。其它规程基本上是为了从关注的组织的健康部分采集细胞并且所述细胞几乎立即再植于待治疗的病变处。对于治疗皮肤疾病或病变如某些烧伤(其程度并不需要细胞扩增)、创伤后和手术后的血红蛋白过少、消色差皮肤病、疤痕等的规程的情况尤其如此。在这些规程中，样本处理基本上等于细胞或多或少的彻底解离，适当时，随后是分离各种细胞类型以选择适于预期应用的细胞(例如，黑色素细胞用于消色差皮肤病)以及进行过滤以除去聚集物。通常通过在胰蛋白酶溶液中孵育样本进行细胞解离。对于胰蛋白酶活性的最佳温度为37℃。在此温度下，根据酶的浓度和所需解离程度，在文献中描述的孵育时间为50分钟至3小时之间(Guerra等人2003；Mulekar,2003；van Geel等人2004)。在较低温度下，酶活性较低，并且有必要将孵育时间延长几个小时，从而使得不可能在同一天中进行规程的所有步骤(Gauthier和Surleve-Bazeille,1992)。出于这个原因，目前进行这些规程至少部分要在具有技术平台的结构中，所述技术平台包含培养箱，而在皮肤科实践中通常不是这种情况。

为了使未配备培养箱的操作者能够治疗患有白癜风的患者，Clinical Cell Culture公司提供了一种试剂盒其包含进行所有步骤(从取样到细胞的再植)所需的消耗品，还包含配备有电池的电子加热单元。这种设备具有两个主要的缺点，价格非常高以及它的生态影响。

发明内容

本发明提供了对现有技术方案的一种有利的替代，尤其是对试剂盒，因为它基于在酶发挥作用所需时间段期间使用用于对酶溶液进行加热并维持在适当温度的保温器(chaufferette)。术语“保温器”在本文表示能够发射热量的小型物体，也被称为“神奇加热瓶(bouillotte)”或“自主加热包(pack)”，其操作是基于放热物理或化学过程。它们通常用于加热暴露于寒冷的手或脚。在本文的其余部分，术语“保温器”和“加热包”的使用没有区别。通过基于物理过程的保温器的实例，可以提及可重复使用的保温器，其由包含过冷乙酸钠饱和水溶液的袋(pochette)组成。通过弯曲液体内的金属盘，产生固化的乙酸盐结晶，其触发了结晶，从而溶液变为固体。由于这种相变在熔点(例如，对于20％的溶液为54℃)处发生，对袋进行加热，然后一旦固化完成便冷却到环境温度。当袋冷却时，通过将袋置于非常热的水中，(已经成为固体的)乙酸钠有可能变回液体状态。也存在化学保温器，其中的组分通过与空气接触发生氧化而激活。它们有效的时间较长(相较于基于过冷乙酸钠的保温器的约1小时而言，从8到60小时)，但只能使用一次。

本发明人已经显示(如下实施例1和3)，放置在置于保温器上的容器(典型地为平皿)中的溶液，在几分钟内，达到多种酶(例如胰蛋白酶)活性的最佳温度，并且在所述温度下维持至少15至20分钟。

因此，首先本发明涉及一种用于进行生物、生物化学或化学反应的方法，其中所述生物、生物化学或化学反应需要在30至40℃之间的温度进行孵育，其特征在于所述方法包括激活保温器的步骤、以及让所述保温器接触容器的步骤，其中保温器的操作基于放热物理或化学过程，所述容器包含参与所述反应的试剂。这种方法在生物、医学或诊断应用的内容中特别有利。

在这种方法的一个具体实施中，让保温器接触容器的步骤是通过将保温器和至少容器的下部分放置在为此目的而提供的支持物腔内进行的。首先，这种支持物使得能够适当地将容器楔入(caler)保温器上，从而限制了倾翻的风险。此外，利用具有低热导率的绝缘支持物，使得能够限制热从保温器损失并且促进热从保温器传递至待加热的溶液。在一个优选的实施方式中，腔的深度使得能够在其中放置保温器以及仅容器的下部分。以这种方式，容器被适当地楔入在保温器上，没有滑动的危险，并且它仍然易于操作者去抓握。

在上述方法中，保温器的使用、以及适当时绝缘支持物的使用，使得能够将生物、生物化学或化学溶液的温度在30至40℃之间维持所需的时间(从几分钟至几十分钟，例如5、10、15、18、20分钟或更长时间)。这种使用保温器(一种通常用于户外休闲活动(滑雪，、登山等)的简单廉价的物体)进行生物(分子或细胞生物学)或化学过程，来替代实验室设备的尖端产品是有利的，因为令人惊讶的是它使得能够非常节约而不损害所得结果的质量。

在上述中，术语“生物反应”适用于任何涉及源自活体元素的反应，例如活细胞(源自活检的动物细胞、植物细胞、酵母或细菌)、病毒、细胞器、酶、代谢产物等。“生物化学反应”利用涉及生命体(酶、糖、脂等)化学反应的物质。

根据本发明的方法的一个具体实施方式，容器包含酶溶液，并且保温器和容器的接触维持至少10分钟。根据一个具体的实施方式，在细胞生物学过程的情况下使用保温器，酶溶液包含源自活检的细胞，例如待解离的组织样本。在这种情况下，酶溶液包含，例如胰蛋白酶。

对于需要不到一小时孵育的反应，保温器优选由包含乙酸钠饱和水溶液的密闭塑料袋组成。然而，本发明也与化学保温器一起使用，从而实现更长的孵育。

根据本发明方法的一个具体实施方式，包含乙酸钠的袋类型的所用保温器是厚度在3至7mm，优选4至6mm之间且直径在7至11cm，优选8至10cm之间的盘，包含参与反应的试剂的溶液具有在3至10ml之间的体积，并且所述溶液包含在具有7至11cm，优选8至10cm之间的直径的平皿中、或所述皿的区室(compartiment)中。术语“平皿”在本文中的意思是指由玻璃或塑料制成的有盖的浅的透明圆柱型皿。在本发明的某些具体实施中，例如通过沿着一条直径设置小壁垒对平皿进行划分。当在这种具体实施方式的情况中使用支持物时，用于接纳保温器的腔也是圆形的，其直径比保温器的直径(在7至11.5cm之间)稍大，并且具有5至20mm的深度。

本发明还涉及一种用于解离细胞的方法，所述细胞源自新鲜获取的组织样本，所述方法包括如下步骤：

(i)在由包含乙酸钠饱和水溶液密闭塑料袋组成的保温器中起始结晶；任选地，将所述保温器置于在支持物中为此目的而提供的腔中，优选绝缘支持物；

(ii)将包含胰蛋白酶溶液的容器置于所述保温器上，胰蛋白酶的浓度在0.2％至1％之间；

(iii)将组织样本置于所述溶液中并且孵育至少10分钟，优选15至20分钟；

(iv)洗涤所述组织样本。

当然，在该方法的实施中，注意确保保温器的、容器的、以及适当时绝缘支持物腔的几何形状是这样的，即保温器和容器之间有大的交换表面积。根据一个具体的实施方式，如上述，保温器具有盘形，并且容器是平皿。在这种情况下，这两个元件的直径优选是相同的或几乎相同；如果使用支持物，用来接纳至少保温器的支持物的腔也是圆形的，其直径比保温器和容器的直径稍大。

在上述方法中，在适当情况下步骤(iv)之前或之后可以是通过添加抑制剂来抑制胰蛋白酶的步骤。然而，根据本发明方法的一个优选实施方式，没有加入胰蛋白酶抑制剂，组织样本的洗涤足以终止胰蛋白酶的作用。这使得能够尤其是限制将被施加到有细胞的患者中的物质数量。

本发明还涉及用于制备适合应用至患者皮肤的细胞悬液的方法，包括如下步骤：

(i)在包含细胞的皮肤组织样本上进行上述的解离方法，其中所述细胞适于移植到患者；

(ii)收获源自皮肤样本的适当细胞，并将其悬浮在溶液中；适当时，这一步骤需要从样本中分离和/或分选某些细胞的中间步骤；以及

(iii)在细胞筛上过滤步骤(ii)中获得的溶液。

根据一个具体的实施方式，上述方法包括向步骤(iii)中获得的细胞悬液中添加透明质酸的额外步骤。这一步骤使得能够获得粘性混合物，其易于应用至伤口床中。此外，透明质酸促进细胞活力。

上述方法的一个具体应用是治疗白癜风；在本申请中，步骤(ii)中回收的细胞至少包含黑色素细胞。

本发明还涉及一种用于生物应用(细胞生物学试剂盒和/或分子生物学试剂盒)的试剂盒，其特征在于其包含保温器，保温器的操作基于放热物理或化学过程。

根据本发明试剂盒的一个优选实施方式，保温器由包含过冷的乙酸钠饱和水溶液的密闭塑料袋组成。

根据本发明试剂盒的一个优选实施方式，试剂盒还包含支持物，所述支持物包含用于接纳保温器的腔。这种支持物包含例如绝热材料的板，板具有在5至35mm之间的厚度，其中用于接纳保温器的腔具有5至25mm之间的深度。支持物还可以由更薄的板(例如1mm厚)组成，经过弯曲或组装以形成中空支持物。优选地，用于支持物的材料在20℃时具有小于或等于0.4W.m^-1.K^-1的热传导率λ。更优选地，其热传导率小于0.15W.m^-1.K^-1，或甚至小于0.08W.m^-1.K^-1，或甚至小于或等于0.04W.m^-1.K^-1。通过可用材料的非限制性实例，可以提及的有木头(胶合板的λ＝0.11W.m^-1.K^-1)、硬纸板(λ＝0.07W.m^-1.K^-1)、软木(λ＝0.04W.m^-1.K^-1)、PVC(λ＝0.2W.m^-1.K^-1)、聚丙烯(λ＝0.1至0.22W.m^-1.K^-1)、硬质聚氨酯泡沫(λ＝0.025)以及发泡聚苯乙烯(λ＝0.036)。根据试剂盒设想的应用，支持物的绝缘性质或多或少是重要的。例如，在皮肤科实践中，对于预期用于根据上述方法制备细胞悬液的试剂盒而言，支持物的绝缘性质是次要的，因为使用所述试剂盒的前提是通常在至少18℃时，并且使用胰蛋白酶孵育细胞样本的时间不是很长。另一方面，某些应用可能施加极热条件和/或在30至40℃之间的温度下需要更长的孵育时间。在这种情况下，使用绝缘支持物是重要的，适当时其可以补充以盖子以便在容器中保持热量更久。通过这种需要在30至40℃之间孵育超过一小时的应用的非限制性实例，可以提及的有软骨的酶消化，以便分离软骨细胞；睾丸活检的消化，以便分离生殖细胞；从胰腺活检获得郎格罕氏岛；真皮的消化，以便分离成纤维细胞；以及牙龈活检的消化，以便分离牙龈成纤维细胞。

本发明的试剂盒还可以包含容器，其底部具有与保温器以及，适当时与支持物的腔相同的几何形状，以便允许有效的热交换。例如，保温器可以是厚度在3至7mm，优选4至6mm之间且直径在7至11cm，优选8至10cm之间的盘；在这种情况下，容器优选是具有直径约等于保温器直径的平皿，并且如果存在支持物时，用于接纳保温器的腔也是圆形的，其直径比保温器的直径稍大。

根据本发明的试剂盒还可以包含酶，例如胰蛋白酶。例如，这样的试剂盒被设计用于处理活检，并尤其包含用于解离所述活检的细胞所需的装置。根据一个具体的实施方式，这种试剂盒包含分成区室的平皿，其直径等于或非常接近保温器、细胞筛和胰蛋白酶(以冻干形式或在溶液中)的直径。

下面的实施例和附图说明本发明，而非限制其范围。

附图说明

图1：在20℃的房间中，为期40分钟，在置于乙酸钠保温器上的直径9cm的平皿中缓冲溶液的温度变化，所述保温器为盘形，其直径约等于平皿的直径。

图2：包含支持物和加热包(保温器)的设备的照片。1：加热包；2：支持物；3：置于加热包上的划分区域的盘。

图3：温度变化随时间的函数，无支持物。

图4：温度变化随时间的函数，有支持物V2。

图5：温度变化随时间的函数，有支持物V3。

图6：温度变化随时间的函数(无支持物和有支持物V2或V3的装置的比较)。

具体实施方式

实施例

实施例1：在置于保温器上的平皿中介质的温度

测量在置于乙酸钠保温器上的直径9cm的平皿中(缓冲)溶液的温度，其中保温器具有盘形，其直径约等于平皿的直径且厚度在4至6mm之间。

结果(图1)显示温度相当迅速的增加，因为温度在几分钟内达到30℃。然后温度在30至40℃之间维持20分钟多些。

这些结果显示了良好的再现性。

实施例2：在通过黑色素细胞的自体移植治疗白癜风情况下，应用 到真皮表皮分离

使用薄的皮肤活检(0.2mm-0.3mm)，伤口床上接种自体细胞。

混合群(主要是基底角质形成细胞，但也有朗格罕氏细胞、黑色素细胞和成纤维细胞)组成的移植物经解聚后得到细胞悬液。

使用的材料

如实施例1所述的保温器，以及由随附元件和仪器构成的一次性试剂盒：酶和应用溶液、无菌仪器，包括双区室的平皿。

规程

准备无菌手术区域。

一旦接收，试剂盒就被存储在+4℃下直到使用。试剂盒放置在环境温度下10分钟后使用。

酶溶液的制备和加热

·使用5ml注射器和针头，取5ml PBS溶液并将其注入冻干的胰蛋白酶的瓶中。吸取再生溶液之前充分匀浆，并在两区室的平皿中的一个区室中。

·通过扭弯金属板瞬间激活加热包；结晶瞬间固化。

·将两区室的平皿放置在激活的加热包上并等待5分钟。

取皮肤样本

待取样本的区域用外科毡尖笔进行划界，笔用在酒精溶液中的0.5％氯己定进行消毒，并用2％利多卡因麻醉。用皮刀取具有4cm²最小表面积和0.2-0.3mm厚度的薄带皮肤。

进行真皮表皮分离(SDE)

·使用无菌镊子(未提供)，将活检转移至在溶液中含有0.4％胰蛋白酶的平皿区室中。

·孵育15分钟。

·洗涤活检：

-使用相同的5ml注射器和针头，取5ml PBS溶液，并且置于平皿的第二区室中。

-在孵育结束时，用无菌镊子，将活检转移至第二区室中，以便用PBS进行快速洗涤。

·使用无菌镊子，将活检置于平皿的盖内，注意保持真皮表皮交界处的方向朝上。

·使用镊子，分开两个片段。

细胞悬液的制备

·使用第二个5ml注射器和枕头，取1.5ml的PBS，并将它们放置在活检片段上，从交界处表面用解剖刀(未提供)刮下细胞，并粗切表皮部分以便产生细胞的混合物。

·真皮部分搁置一旁并进行固定。

·倾斜平皿以便用5ml注射器抽吸整个体积，将细胞抽到注射器中并抽吸数次以便产生细胞悬液。

细胞过滤

·将细胞悬液转移到筛上，所述筛将要放置在带有红帽的罐(pot)上。

在透明质酸中制备细胞悬液

·移去筛。

·将包含在注射器中的透明质酸(即1.5ml)放置在带有红帽的罐中，所述罐包含经过滤的细胞悬液。

·使用注射器，混合透明质酸和细胞悬液，从而得到粘稠但均匀的悬液。

·这样制备的悬液易于通过注射器沉积在伤口床上。

结果

在三个不同的皮肤样本上，使用两种胰蛋白酶浓度(0.4％和0.8％)进行数次上述规程。

所得到的结果总结于下表1。

表1

胰蛋白酶浓度

根据van Geel等人(van Geel等人，2004)描述的技术调整用于获得活性物质的方法。

胰蛋白酶溶液的浓度进行了优化(0.4％或0.8％的胰蛋白酶，而不是0.25％胰蛋白酶/0.08％EDTA)。不同于由van Geel等人所描述的技术，不通过添加胎牛血清类型的抑制剂，而是通过用PBS洗涤进行胰蛋白酶的抑制，以便减少用于产物生产的生物来源的产物数量。这种模式的胰蛋白酶抑制之后验证了细胞活力。

细胞活力

按照常规的细胞培养技术来确定细胞活力：台盼蓝排除试验。台盼蓝和细胞悬液的体积-对-体积稀释在溶血管中进行。1至2分钟的接触时间后，用微量移液器在玻片和盖片之间在计数细胞上沉积混合物。死细胞染成蓝色，活细胞未染色，使用相差光学显微镜进行计数。

分离表皮细胞后，细胞活力非常令人满意(大于90％)。

放回培养后细胞的行为和克隆效率从一个活检到另一活检是均匀的，并且显示细胞悬液包含在胰蛋白酶消化后能够增殖的细胞。

分离的细胞数目/活检的cm²

基于上述测试的结果，进行计算。

个体之间分离的细胞数目是不同的，这取决于处理的活检的尺寸，但细胞产量/cm²相对恒定。因此，最终悬液的细胞密度在很大程度上取决于处理的活检的尺寸。

克隆效率测试(CFE)

克隆效率百分比使得可能评估能够粘附并形成集落的细胞的量。已知量的表皮细胞接种到3T25cm²的摇瓶中。培养的约第14天，当克隆足够大但尚未连接起来时，用结晶紫溶液(10％甲醛/0.5％结晶紫，适量蒸馏水)对摇瓶进行染色。通过每T25cm²摇瓶集落总数的平均值×100相对于每T25cm²接种的细胞数的比例计算克隆效率。

放回培养后细胞的行为和克隆效率从一个活检到另一个活检是均匀的，并且显示细胞悬液包含在胰蛋白酶消化后能够增殖的细胞。

通过流式细胞术的细胞悬液中的黑色素细胞含量

在PBS-1％BSA(牛血清白蛋白)-0.5％Triton的溶液中进行细胞膜的渗透化。孵育特异于正常黑色素细胞的一抗(NKI/beteb抗体)，然后用PBS-1％BSA洗涤。孵育二抗(Alexa Fluor 488驴抗鼠抗体)，然后用PBS-1％BSA洗涤。在PBS中吸取标记的细胞，并通过FACS-SCAN。

在得到的表皮悬液中黑色素细胞/角质形成细胞的比例，比得上Guerra等人计算的那些(在1:30至1:200之间)(Guerra等人,2003)。

在此处描述的方法中，分离的表皮细胞没有置于培养中，整个方法在一天内进行(活检、最终产物的生产以及移植非培养的自体表皮细胞)。

实施例3：用保温器使用绝缘支持物来优化介质温度的升高并维持

3.1材料和方法

材料和试剂

·PVC加热包(保温器)，CE标签。

·支持物板由1至2mm厚的聚丙烯(PP)片组成，折叠以获得支持物，其总厚度为15mm，具有直径为90mm的圆形腔(图2)。

·划分区域的平皿(参考Dutscher 020012)。

·温度探头(thermobouton)，其经过编程以便用ThermoTrack V4和/或A BT529软件进行操作。

方法

6毫升保存在+4℃的PBS在环境温度平衡20分钟，放置在直径90mm平皿的区室之一当中，其中放置温度探头(用于记录温度变化的装置)以便记录每分钟的温度。然后用平皿盖子盖上平皿。

温度探头与介质接触，激活加热包后使得能够直接测量溶液内的温度变化。通过将加热包和平皿放置或不放置在支持物的圆形腔中进行实验(图2)。对三种不同支持物进行了测试。它们的不同之处在于用于接纳保温器和平皿的圆形腔的或多或少的中心位置。

用不同的温度探头对每种条件测试5至6次。温度测量进行20分钟。针对此时间段内记录的所有值计算温度平均值。

通过学生t检验的方式，对有或没有支持物时在介质中测量的温度进行统计分析。

3.2结果

有加热包没有支持物时的介质温度变化

浸入介质中的温度探头所收集到的温度数据图表式显示在图3中。全部6个测试的平均温度为35.5℃，平均标准偏差为3.9℃。

这些结果表明用各种保温器在没有支持物时得到的温度的可再现性。

在支持物中有加热包时介质中的温度变化

测试了两个支持物(原型V2和V3)。它们的区别在于用于接纳保温器的圆形腔的位置。实际上，在支持物V3中，此腔是位于中心的从而允许支持物内部的热量是均匀的，以便在置于保温器上的分区平皿中优化温度的升高和维持。

通过浸入介质中的温度探头在20分钟所收集到的温度数据图表式地显示在图4(支持物V2)、图5(支持物V3)以及图6(两种支持物以及没有支持物时所得温度的比较)所示的图中，并总结在下表中。

表2；*：在21分钟的总实验时间期间获得的时间段

这些结果表明：

·保温器之间的再现性；

·当保温器放置在支持物中时，达到的温度更高(与V2相比差别为1.1℃，和V3相比差0.8℃)；

·有或没有支持物，包含在分区平皿中的介质在35℃以上的温度维持至少18分钟；

·没有支持物，在9min内达到39.5℃的最高气温，而利用支持物V2，其在6min内达到40.5℃。

为了确定观察到的差异是否是统计学上显著的，使用利用支持物V3获得的值进行通过学生t检验的统计分析。这个测试表明0.03的概率<0.05，表明在没有支持物和有支持物V3时获得的温度差异是显著的(表3)。因此，支持物V 3使得能够更迅速地且更加可再现性地获得比没有支持物时平均值更高的温度(e-t±1℃)。

表3

因此，支持物使得能够优化温度的升高和/或将温度维持。

根据实施例2中所述的用于产生表皮悬液的方法，在薄的皮肤活检酶消化期间使用试剂盒的支持物以便产生其真皮表皮分离，使得能够获得平均值更高的温度并且更加迅速。因此，支持物具有双重优点：工作平台(plateau de travail)以及优化加热包的温度升高。

参考文献

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Mulekar,S.V.(2003)Melanocyte-keratinocyte cell transplantation forstable vitiligo.Int J Dermatol,42,132-136.

van Geel,N.,Ongenae,K.,De Mil,M.,Haeghen,Y.V.,Vervaet,C.和Naeyaert,J.M.(2004)Double-blind placebo-controlled study of autologoustransplanted epidermal cell suspensions for repigmenting vitiligo.ArchDermatol,140,1203-1208.

Claims (15)

1.一种用于进行生物、生物化学或化学反应的方法，其中所述生物、生物化学或化学反应需要在30至40℃之间的温度进行孵育，其特征在于所述方法包括激活保温器的步骤和让所述保温器接触容器的步骤，其中激活保温器的操作基于放热物理或化学过程，所述容器包含参与所述反应的试剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于让所述保温器接触容器的步骤是通过将所述保温器和至少所述容器的下部分放置在为此目的而提供的支持物腔内进行的。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于所述容器包含酶溶液，并且保温器和容器之间接触维持至少10分钟。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于所述保温器由包含乙酸钠饱和水溶液的密闭塑料袋组成。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包含参与反应的试剂的溶液体积在3至10ml之间，包含所述溶液的所述容器是直径在7至11cm之间的平皿或者是所述皿的区室，以及所述保温器是厚度在3至7mm之间且直径在7至11cm之间的盘。

6.根据权利要求2和5所述的方法，其特征在于用来接纳保温器的所述支持物的腔是圆形的，直径在7至11.5cm之间，且深度在5至20mm之间。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其用于解离源自组织样本的细胞，所述方法包括如下步骤：

(i)在由包含乙酸钠饱和水溶液的密闭塑料袋组成的保温器中起始结晶；

(ii)将包含胰蛋白酶溶液的容器置于所述保温器上，所述胰蛋白酶的浓度在0.2％至1％之间；

(iii)将组织样本置于所述溶液中并且孵育至少10分钟；

(iv)洗涤所述组织样本。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其用于制备适合应用至患者皮肤的细胞悬液，包括如下步骤：

(i)让包含适于移植到患者的细胞的皮肤组织样本进行根据权利要求7所述的方法；

(ii)收获源自皮肤样本的适当细胞，并将其悬浮在溶液中；以及

(iii)在细胞筛上过滤在步骤(ii)中获得的溶液。

9.根据权利要求8所述的方法，其包括向步骤(iii)中获得的细胞悬液中添加透明质酸的额外步骤。

10.根据权利要求8和9所述的方法，其用于治疗白癜风，其特征在于在步骤(ii)中回收黑色素细胞。

11.一种用于生物应用的试剂盒，其特征在于其包含保温器，保温器的操作基于放热物理或化学过程。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述保温器由包含过冷乙酸钠饱和水溶液的密闭塑料袋组成。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的试剂盒，其特征在于其还包含支持物，所述支持物具有用于接纳所述保温器的腔。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的试剂盒，其特征在于其还包含容器，所述容器的基部具有与保温器相同的几何形状。

15.根据权利要求10至14中任一项所述的试剂盒，其特征在于其还包含酶。