CA2875642A1 - Utilisation d'une chaufferette pour favoriser une reaction biologique - Google Patents
Utilisation d'une chaufferette pour favoriser une reaction biologique Download PDFInfo
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
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- Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
- Y02E60/14—Thermal energy storage
Abstract
La présente invention porte sur l 'utilisation de chaufferettes, ou packs de chaleur autonomes, pour chauffer et maintenir à une température convenable une solution, pendant la durée nécessaire à l'accomplissement d'une réaction chimique, biochimique ou biologique, notamment dans des applications de biologie moléculaire ou de biologie cellulaire. Des trousses de biologie contenant des chaufferettes font également partie de cette invention.
Description
UTILISATION D'UNE CHAUFFERETTE POUR FAVORISER UNE REACTION
BIOLOGIQUE' La présente invention concerne le domaine des trousSes de biologie.
moléculaire et cellulaire,. ainsi que celui des -trousses pour mettre en oeuvre une réaction Chimique nécessitant un apport modéré de chaleur. Elle a notamment-pour objet des trousses comprenant un moyen de chauffage. antonomeSimple et peucoûteux pour traitettjes biopsies.
Depuis plusieurs années, là .greffe de cellules, en particulier de cellules autôlogues, s'impose comme. un moyen efficace et .sécuritaire pour favoriser la régénération de tissus malades ou lésés. Certains protocoles thérapeutiques nécessitent. ià
prolifération et/ou là modification des. cellules- ex vivo: avant réimplantation. D'autres protocoles prévoient essentiellement le prélèVement de cellules dans une partie :saine du tissu.
coi:lierne et leur réimplantation quasi-imm.édiate au niveau dela lésion d traiter. Ceci est notamment le cas des protocoles pour le traitement de pathologies ou lésions cutanées: telles que certaines brûlures (d'étendue ne.= nécessitant pas d'expansion cellulaire),. les hypoebromies.
post-traumatiques et postopératOires, .les dermatoses achromatiques, les cicatrices etc.. Dalle .Ces prot0Coles, le traitement des échantillons se résume essentiellement à une .dissociation plus ou moins poussée des cellules, suivie, le cas échéant, de la séparation de différents types cellulaires pour sélectionner les. cellules appropriées pour l'application .visée:
.(mélanocytes pour lés dermatOses achromatiqties, par eXe.mple) et d'une -filtration pour éliminer les agrégats. La dissociation cellulaire est le plus souvent réalisée par incubation de l'échantillon dans une solution de trypsine. La température optimale pour ractivité de la trypsine est de 37 C. A
cette température, et suivant la concentration d'enzyme et le degré de dissociation sOnhaité, les temps d'incubation décrits dans la littérature sont compris entre 50 mintites -3 heures (Guetta et al, 2003; Mulekar, 2003.; van Geel et ai., 2004). A iule température inférieure, 'enzyme est moins :active, et il est nécessaire d'allonger le -temps d'incubation de plusieurs heures, ce qui rend impossible la réalisation de toutes .les étapes du protocole dans la Jerne journée (Gambier and Surleve-Bazeille, 1992)õ Pour cette raison., ces protocoles sont actuellement réalisés au moins partiellement dans des structures disposant -de plateformes techniques. .comportant un incubateur., ce -qui n'est pas souvent le cas des cabinets -de dermatologie.
Afin de permettre A des praticiens non équipés d'incubateur de traiter des:
patients atteint S de vitiligo, la. société .Clinicat Cell Culture propose. un kit (ReCelle) comportant les consommables: nécessaires pour effectuer toutes -les étapes, du prélèvement .à
la réimplantation des cellules, ainsi q-u'une unité de chauffage électronique équipée de .piles, Ce dispositif présente deux inconvénients majeurs, .qui sont son prix -très élevé et son impact écologique.
La présente invention propose une alternative avantageuse aux solutions de l'art antérieur, en particulier au kit ReCelle, puisqu'elle repose sur 'l'utilisation de
BIOLOGIQUE' La présente invention concerne le domaine des trousSes de biologie.
moléculaire et cellulaire,. ainsi que celui des -trousses pour mettre en oeuvre une réaction Chimique nécessitant un apport modéré de chaleur. Elle a notamment-pour objet des trousses comprenant un moyen de chauffage. antonomeSimple et peucoûteux pour traitettjes biopsies.
Depuis plusieurs années, là .greffe de cellules, en particulier de cellules autôlogues, s'impose comme. un moyen efficace et .sécuritaire pour favoriser la régénération de tissus malades ou lésés. Certains protocoles thérapeutiques nécessitent. ià
prolifération et/ou là modification des. cellules- ex vivo: avant réimplantation. D'autres protocoles prévoient essentiellement le prélèVement de cellules dans une partie :saine du tissu.
coi:lierne et leur réimplantation quasi-imm.édiate au niveau dela lésion d traiter. Ceci est notamment le cas des protocoles pour le traitement de pathologies ou lésions cutanées: telles que certaines brûlures (d'étendue ne.= nécessitant pas d'expansion cellulaire),. les hypoebromies.
post-traumatiques et postopératOires, .les dermatoses achromatiques, les cicatrices etc.. Dalle .Ces prot0Coles, le traitement des échantillons se résume essentiellement à une .dissociation plus ou moins poussée des cellules, suivie, le cas échéant, de la séparation de différents types cellulaires pour sélectionner les. cellules appropriées pour l'application .visée:
.(mélanocytes pour lés dermatOses achromatiqties, par eXe.mple) et d'une -filtration pour éliminer les agrégats. La dissociation cellulaire est le plus souvent réalisée par incubation de l'échantillon dans une solution de trypsine. La température optimale pour ractivité de la trypsine est de 37 C. A
cette température, et suivant la concentration d'enzyme et le degré de dissociation sOnhaité, les temps d'incubation décrits dans la littérature sont compris entre 50 mintites -3 heures (Guetta et al, 2003; Mulekar, 2003.; van Geel et ai., 2004). A iule température inférieure, 'enzyme est moins :active, et il est nécessaire d'allonger le -temps d'incubation de plusieurs heures, ce qui rend impossible la réalisation de toutes .les étapes du protocole dans la Jerne journée (Gambier and Surleve-Bazeille, 1992)õ Pour cette raison., ces protocoles sont actuellement réalisés au moins partiellement dans des structures disposant -de plateformes techniques. .comportant un incubateur., ce -qui n'est pas souvent le cas des cabinets -de dermatologie.
Afin de permettre A des praticiens non équipés d'incubateur de traiter des:
patients atteint S de vitiligo, la. société .Clinicat Cell Culture propose. un kit (ReCelle) comportant les consommables: nécessaires pour effectuer toutes -les étapes, du prélèvement .à
la réimplantation des cellules, ainsi q-u'une unité de chauffage électronique équipée de .piles, Ce dispositif présente deux inconvénients majeurs, .qui sont son prix -très élevé et son impact écologique.
La présente invention propose une alternative avantageuse aux solutions de l'art antérieur, en particulier au kit ReCelle, puisqu'elle repose sur 'l'utilisation de
2 chaufferettes pour chauffer et maintenir à une température convenable une solution enzymatique, pendant la durée nécessaire à l'action de l'enzyme. 'Le terme chaufferette désigne. ici les petits objets capables d'émettre de la chaleur, aussi .appelés . bouillottes magiques ou packs de chaleur autonomes >>õ et dont le fOnctionnement repose sur des processus physiques. ou chimiques exothermiques.. .Elles sont couramment utilisées pour réchauffer les mains ou les pieds exposés. au .froid. Dans ce qui suit, les termes chaufferette . et . pack de chaleur >.>. sont utilisés indifféremment A titre d'exemple de.
chaufferette reposant sur un processus physique, on. peut citer les chaufferettes réutilisables constituées d'une pochette contenant une solution aqueuse. saturée en acétate.
de sodium en surfusion. En tordant une plaquette métallique à l'intérieur du liqtaid.e, on génère des cristaux (acétate solidifié, qui déclenchent la cristallisation, et la solution devient. solide e Cette transition de phase se faisant à la. température de fusion (5e pour une solution 20%:õ par exemple), il y a échauffement de la pochette puis refroidissement jusqu'à la température .ambiante une fois la solidification terminée. Lorsque la pochette est refroidie, il est possible de remettre l'acétate de sodium (devenu solide) à l'état liquide, en plaçant la pochette dans de l'eau très. ehaude. Il existe aussi des chaufferettes chimiques dont le principe est activé par oxydation ..au contact de l'air. Elles sont efficaces plus longtemps fele 8 à
.0 heures contre .environ I heure pour les chaufferettes à base: d'acétate de sodium en surfiision) niais ne servent qu'une fois.
les inventeurs, ont montré (exemples 1 et 3 ci-dessous) qu'une solution placée dans un récipient, typiquement une. boîte de Petri, posée .sur une chaufferette, atteint en quelques minutes une température optimale pour l'activité de nombreuses enzymes telles que la trypsine, et s'y maintient pendant au moins 1.5 à. 20 minutes.
L'invention porte donc, en premier lieu, sur un procédé pour mettre en OniVre une réaction biologique, biochimique Qt1 chimique néeessitant une ineubation a une température comprise entre 30 et 40eeenracterisé en te qu'il comprend une étape d'activation d'une chaufferette dont le fonctionnement repose. sur un processus physique ou chimique exothermique, et une étape. de mise en contact de ladite chaufferette avec un récipient contenant les réactifs impliqués dans ladite réaction. Ce procédé est particulièrement.
avantageux dans le cadre. d'une application biologique, médicale ou de diagnestic.
Dans une mise en oeuvre particulière .de ce proeédé., l'étape .de mise en contact de la chaufferette avec le réeipient est effectuée en plaçant la chaufferette et au moins' la partie inférieure du récipient dans une cavité d'un support prévu à cet effet. Un tel support.
permet d'une part, .de bien, caler le recipiernsur la chaufferette,. limitant ainsi les risques de renversement, En. outre l'utilisation d'un support isolant, présentant une faible conductivité' thermique, permet de limiter lespertes de chaleur de la chaufferette, et de favoriser le transfert de la chaleur de la chaufferette vers la solution à chauffer. Dans: une mise en imuVre préféréee Id profondeur de la ca llç permet .d'y placer la chaufferette :et uniquement la ilartie inférieure
chaufferette reposant sur un processus physique, on. peut citer les chaufferettes réutilisables constituées d'une pochette contenant une solution aqueuse. saturée en acétate.
de sodium en surfusion. En tordant une plaquette métallique à l'intérieur du liqtaid.e, on génère des cristaux (acétate solidifié, qui déclenchent la cristallisation, et la solution devient. solide e Cette transition de phase se faisant à la. température de fusion (5e pour une solution 20%:õ par exemple), il y a échauffement de la pochette puis refroidissement jusqu'à la température .ambiante une fois la solidification terminée. Lorsque la pochette est refroidie, il est possible de remettre l'acétate de sodium (devenu solide) à l'état liquide, en plaçant la pochette dans de l'eau très. ehaude. Il existe aussi des chaufferettes chimiques dont le principe est activé par oxydation ..au contact de l'air. Elles sont efficaces plus longtemps fele 8 à
.0 heures contre .environ I heure pour les chaufferettes à base: d'acétate de sodium en surfiision) niais ne servent qu'une fois.
les inventeurs, ont montré (exemples 1 et 3 ci-dessous) qu'une solution placée dans un récipient, typiquement une. boîte de Petri, posée .sur une chaufferette, atteint en quelques minutes une température optimale pour l'activité de nombreuses enzymes telles que la trypsine, et s'y maintient pendant au moins 1.5 à. 20 minutes.
L'invention porte donc, en premier lieu, sur un procédé pour mettre en OniVre une réaction biologique, biochimique Qt1 chimique néeessitant une ineubation a une température comprise entre 30 et 40eeenracterisé en te qu'il comprend une étape d'activation d'une chaufferette dont le fonctionnement repose. sur un processus physique ou chimique exothermique, et une étape. de mise en contact de ladite chaufferette avec un récipient contenant les réactifs impliqués dans ladite réaction. Ce procédé est particulièrement.
avantageux dans le cadre. d'une application biologique, médicale ou de diagnestic.
Dans une mise en oeuvre particulière .de ce proeédé., l'étape .de mise en contact de la chaufferette avec le réeipient est effectuée en plaçant la chaufferette et au moins' la partie inférieure du récipient dans une cavité d'un support prévu à cet effet. Un tel support.
permet d'une part, .de bien, caler le recipiernsur la chaufferette,. limitant ainsi les risques de renversement, En. outre l'utilisation d'un support isolant, présentant une faible conductivité' thermique, permet de limiter lespertes de chaleur de la chaufferette, et de favoriser le transfert de la chaleur de la chaufferette vers la solution à chauffer. Dans: une mise en imuVre préféréee Id profondeur de la ca llç permet .d'y placer la chaufferette :et uniquement la ilartie inférieure
3 du récipient. De cette façon, le récipient est bien calé sur la chaufferette, :rte risque pas de gliSSer, et reste facile à saiSir par l'Opératettr.
Dans les procédés ci-dessus. l'utilisation d'une chaufferette et, le cas:
échéant, d'un support isolant, permet de maintenir la température d'une solution biologique, biochimique ou chimique entre 30 et 40QC pendant la durée nécessaire (de quelques: minutes à
quelques dizaines de minutes, par exemple 5,10, 15, 18:, 20 minutes ou davantage). Cette utilisation de la chaufferette, Objet simple, peu coûteux et en général destiné aux loisirs de grand air (ski., alpinisme pour mettre en oeuvre un procédé: biologique (biologie moléculaire ou cellulaire) ou chimique en remplacement d'un matériel de :laboratoire sophistiqué, est aussi avantageuse que surprenante, puisqu'elle permet des =éeOneenies considérables sans altérer la. qualité des résultats obtenus.
Dans ce qui précède, on appelle "réaction biologique" toute réaction impliquant des ékments issus d'un être vivent, comme per exemple des cellules vivantes, (celiale5 animales provenant d'une biopsie, eelluies végétales, levures ou bactéries), deS virus, des organelles, des enzymes, des produits du métabolisme, etc. Une "réaction biochimique met en, oeuvre des substances impliquées dans des réactions chimiques de la matière vivante (enzymes, sucres lipides, etc.).
Selon une mise en oeuvre particulière du procédé de l'invention, le récipient contient une solution :enzymatique et le contact entre la chaufferette et le récipient est maintenu pendant au moins 10 minutes: Selon un mode de réalisation particulier, la chaufferette est utilisée dans le cadre d'un procédé dg biologie cellulaire, et la solution enzymatique contient des cellules provenant d'une biopSie, par exemple un eehanti lion de tissu à dissocier. Dans ce cas, la solution enzymatique contient, par exemple,: de la trypsine.
Pour les réactions nécessitant une incubation de moins d'une heure:, la ehaufferette est de préférence constituée eine pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sddium, Toutefois, l'invention peut également être mise en oeuvre avec une chaufferette chimique, permettant une incubation plus longue.
Selon une mise en uvre particulière. du procédé de l'invention, la chaufferette utilisée, de type pochette contenant de l'acétate dç sodium, est un disque dont l'épaisseur est comprise 'entre 3 et 7 mm, de préférence 4 à 6 mm et le diamètre est compris entre 7 et 11 cm, de préférence 8 à 10 cm, et la. solution contenant les réactifs impliques dans la réaction a un volume compris entre 3 et 10 ml et est contenue dans une boîte: de Petri de diamètre compris entre 7 et 11 cm, de préférence entre 8 et 10 cm, ou un compartiment de ladite boite. Pur e. boite de Petri e, on entend ici une boite cylindrique transparente peu profonde, en verre ou en plastique, munie d'un convercle. Dans eertaines réalisations particulières de l'invention, la boite de Petri est compartimentée, par ekeeppie par une petite paroi le long d'un diamètre, Lorsqu'un support est utilisé dans le cadre de cette mise en: oeuvre partieulière, la cavité destinée à recevoir la chaufferette est égaleinent circulaire, de diamètre
Dans les procédés ci-dessus. l'utilisation d'une chaufferette et, le cas:
échéant, d'un support isolant, permet de maintenir la température d'une solution biologique, biochimique ou chimique entre 30 et 40QC pendant la durée nécessaire (de quelques: minutes à
quelques dizaines de minutes, par exemple 5,10, 15, 18:, 20 minutes ou davantage). Cette utilisation de la chaufferette, Objet simple, peu coûteux et en général destiné aux loisirs de grand air (ski., alpinisme pour mettre en oeuvre un procédé: biologique (biologie moléculaire ou cellulaire) ou chimique en remplacement d'un matériel de :laboratoire sophistiqué, est aussi avantageuse que surprenante, puisqu'elle permet des =éeOneenies considérables sans altérer la. qualité des résultats obtenus.
Dans ce qui précède, on appelle "réaction biologique" toute réaction impliquant des ékments issus d'un être vivent, comme per exemple des cellules vivantes, (celiale5 animales provenant d'une biopsie, eelluies végétales, levures ou bactéries), deS virus, des organelles, des enzymes, des produits du métabolisme, etc. Une "réaction biochimique met en, oeuvre des substances impliquées dans des réactions chimiques de la matière vivante (enzymes, sucres lipides, etc.).
Selon une mise en oeuvre particulière du procédé de l'invention, le récipient contient une solution :enzymatique et le contact entre la chaufferette et le récipient est maintenu pendant au moins 10 minutes: Selon un mode de réalisation particulier, la chaufferette est utilisée dans le cadre d'un procédé dg biologie cellulaire, et la solution enzymatique contient des cellules provenant d'une biopSie, par exemple un eehanti lion de tissu à dissocier. Dans ce cas, la solution enzymatique contient, par exemple,: de la trypsine.
Pour les réactions nécessitant une incubation de moins d'une heure:, la ehaufferette est de préférence constituée eine pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sddium, Toutefois, l'invention peut également être mise en oeuvre avec une chaufferette chimique, permettant une incubation plus longue.
Selon une mise en uvre particulière. du procédé de l'invention, la chaufferette utilisée, de type pochette contenant de l'acétate dç sodium, est un disque dont l'épaisseur est comprise 'entre 3 et 7 mm, de préférence 4 à 6 mm et le diamètre est compris entre 7 et 11 cm, de préférence 8 à 10 cm, et la. solution contenant les réactifs impliques dans la réaction a un volume compris entre 3 et 10 ml et est contenue dans une boîte: de Petri de diamètre compris entre 7 et 11 cm, de préférence entre 8 et 10 cm, ou un compartiment de ladite boite. Pur e. boite de Petri e, on entend ici une boite cylindrique transparente peu profonde, en verre ou en plastique, munie d'un convercle. Dans eertaines réalisations particulières de l'invention, la boite de Petri est compartimentée, par ekeeppie par une petite paroi le long d'un diamètre, Lorsqu'un support est utilisé dans le cadre de cette mise en: oeuvre partieulière, la cavité destinée à recevoir la chaufferette est égaleinent circulaire, de diamètre
4 légèrement supérieur à Celui de la :chaufferette (compris entre: 7 et 11,5 cm) et. a une profondeur comprise entre 5 et 20 min.
La présente invention porte également sur un procédé de dissociation de eelluicsissues d'un échantillon de tissu fraîchement prélevé, comportant les étapes suivantes :
(i) initier la cristallisation dans une chauftbrette constituëe d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium ;
optionnellement, placer ladite chaufferette dans une cavité prévue à. cet effet dans un support, de préférence isolant ;
(ii) placer sur ladite chaufferette un récipient contenant une solution de trypsine de concentration, comprise entre 0,2% et 1%;
(hi) placer l'échantillon de tissu dans ladite solution et laisser incuber au moins 10 minutes, de préférence 15 à 20 minutes.;
(iv) rincer l'échantillon de tissu.
Bien entendu, lors de la mise en ouvre de :cc procédé, on veillera e ce que les géométries de la chaufferette, du récipient: et, le cas échéant, de la cavité du support isolant, soient telles qu'il existe une surface d'échange importante entre la chaufferette et le récipient. Selon un mode de réalisation particulier, la chaufferette a une forme de disque et le récipient est une boîte de Petri, comme mentionné plus haut. Dans ce cas, les diamètres de: ces deux élérnents sont de préférence identiques ou quasi-identiques ; Si un support est utilisé, la cavité du support destinée à recevoir au moins la chaufferette est également circulaire, de diamètre légèrement supérieur au diamètre de la .chauffretteet du téeirient.
Dans le procédé ci-dessus l'étape (iv) peut, le cas échéant, étre précédée ou suivie d'une étape d'inhibition de la trypsine, par ajout d'un inhibiteur.
Toutefois, selon tin mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, aucun inhibiteur de la trypsine 2.5 n'est ajouté, le rinçage de: l'échantillon de tissu étant suffisant pour stopper l'actio.n de la trypsine. Ceci permet en particulier de limiter le nombre de substances el setont appliqUées au patiCnt avec les cellules.
La présente invention porte également sur un procédé de préparation d'une suspension cellulaire appropriée pour une application cutanée sur un patient, comprenant les étapes suivantes :
(i) mettre en uvre le procédé dé disSociation décrit plus haut sur un échantillon de tieu cutané comprenant des cellules appropriées pour une greffe à un patient ;
(ii) récolter les cellules appropriées provenant de l'échantillon cutané et les mettre en suspension: dans une solution ; le cas échéant, cette- étape nécessite une étape intermédiaire de séparation et/ou de tri de certaines cellules de récnentillon .;et (iii) filtrer la solution obtenue à. rétapo (ii) sur tamis cellulaire.
Selon une mise en oeuvre particulière, le procédé ci-dessuS comporte une étape supplémentaire d'ajout d'acide hyaluronique à la suspension cellulaire obtenue à l'étape (iii), Cette étape permet d'obtenir un mélange visqueux qui est facilement appliqué dans le lit de la plaie. En outre, l'acide hyaluronique favorise la viabilité des.
cellules.
Une application particulière des procédés ci-dessus est le traitement du vitiligo ; dans cette application, lés cellules récupérées à l'étape (ii) mprennent au Moins
La présente invention porte également sur un procédé de dissociation de eelluicsissues d'un échantillon de tissu fraîchement prélevé, comportant les étapes suivantes :
(i) initier la cristallisation dans une chauftbrette constituëe d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium ;
optionnellement, placer ladite chaufferette dans une cavité prévue à. cet effet dans un support, de préférence isolant ;
(ii) placer sur ladite chaufferette un récipient contenant une solution de trypsine de concentration, comprise entre 0,2% et 1%;
(hi) placer l'échantillon de tissu dans ladite solution et laisser incuber au moins 10 minutes, de préférence 15 à 20 minutes.;
(iv) rincer l'échantillon de tissu.
Bien entendu, lors de la mise en ouvre de :cc procédé, on veillera e ce que les géométries de la chaufferette, du récipient: et, le cas échéant, de la cavité du support isolant, soient telles qu'il existe une surface d'échange importante entre la chaufferette et le récipient. Selon un mode de réalisation particulier, la chaufferette a une forme de disque et le récipient est une boîte de Petri, comme mentionné plus haut. Dans ce cas, les diamètres de: ces deux élérnents sont de préférence identiques ou quasi-identiques ; Si un support est utilisé, la cavité du support destinée à recevoir au moins la chaufferette est également circulaire, de diamètre légèrement supérieur au diamètre de la .chauffretteet du téeirient.
Dans le procédé ci-dessus l'étape (iv) peut, le cas échéant, étre précédée ou suivie d'une étape d'inhibition de la trypsine, par ajout d'un inhibiteur.
Toutefois, selon tin mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, aucun inhibiteur de la trypsine 2.5 n'est ajouté, le rinçage de: l'échantillon de tissu étant suffisant pour stopper l'actio.n de la trypsine. Ceci permet en particulier de limiter le nombre de substances el setont appliqUées au patiCnt avec les cellules.
La présente invention porte également sur un procédé de préparation d'une suspension cellulaire appropriée pour une application cutanée sur un patient, comprenant les étapes suivantes :
(i) mettre en uvre le procédé dé disSociation décrit plus haut sur un échantillon de tieu cutané comprenant des cellules appropriées pour une greffe à un patient ;
(ii) récolter les cellules appropriées provenant de l'échantillon cutané et les mettre en suspension: dans une solution ; le cas échéant, cette- étape nécessite une étape intermédiaire de séparation et/ou de tri de certaines cellules de récnentillon .;et (iii) filtrer la solution obtenue à. rétapo (ii) sur tamis cellulaire.
Selon une mise en oeuvre particulière, le procédé ci-dessuS comporte une étape supplémentaire d'ajout d'acide hyaluronique à la suspension cellulaire obtenue à l'étape (iii), Cette étape permet d'obtenir un mélange visqueux qui est facilement appliqué dans le lit de la plaie. En outre, l'acide hyaluronique favorise la viabilité des.
cellules.
Une application particulière des procédés ci-dessus est le traitement du vitiligo ; dans cette application, lés cellules récupérées à l'étape (ii) mprennent au Moins
5 des mélanocytes.
La présente invention porte également sur une trousse pour application biologique (trousse de biologie cellulaire ettou trousse de biologie moléculaire), caractérisée en Ce qu'elle comprend une chaufferette dont le fonctionnement repose sur un processus physique ou chimique exothermique.
Selon un mode de réalisation préféré des trousses selon la présente invention, in chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aquetist Saturée en aatate de sodium en état de surfusion.
Selon un mode de réalisation préféré de la trousSe de la présente invention, la trousse contient également un support qui comprend une cavité destinée à
recevoir la chaufferette. Ce support comprend par exemple une plaque de matériau isolant thermique dlepaisSeur comprise .entre 5 et 35 mm, dans lequel la cavité destinée à
recevoir la chaufferette a une profondeur comprise entre 5 et 25 mm. Le support petit également être constitué d'une plaque plus fine (par exemple 1 mm d'épaisseur), pliée ou assemblée pour fOrmer nri support creux. De préférence.; :te matériau utilisé pour le suppurt a une conductivité
thermique 2, inférieure ou égale à 0,4 \\/..m-',K1 à 20C, De manière encore préférée, sa conductivité thermique est inférieure à 0,15 W,m-I.K'1, voire inférieure à
0,08 W.111-1 . ou même inférieure ou égale à 0,04 Wall-J.1(4. A titre d'exempleS non limitatifs de matériaux utilisables, on peut citer lie bois 0,, du contreplaqué = 0,11 W.nfj,W1), le carton 0, ¨ 0,07 W.rn-1.1<-5, le liège()¨ 0,04 W.m-I.K1), le PVC (TA
W.nfl.K.71), le polypropylène 0,-0,1 à 0,22 Wu:11'1.W' ), la mousse de polyuréthane rigide ¨ 0,025) et le polystyrène expansé Ok, --0,030. Suivant les applications envisagées pour la trousse, le caractère isolant du support ce plus ou moins important. Par exemple, pour une trousse destinée à préparer, dans un cabinet de dermatologie, une suspension cellulaire par un procédé tel que décrit ci-dessus, le caractère isolant du support est secondaire, car les locaux dans lesquels ta trousse Sera utilisée, sont généralement à au moins 18"C, et le. temps d'incubation de l'échantillon cellulaire avec la trypsine n'est pas très long, En revanche, certaines applications peuvent imposer des conditions thermiques extrêmes et/ou nécessiter un temps d'incubation plus long à une température comprise entre 30 et 40 C, Dans ce cas, il est important d'utiliser un ,riupport.
isolant, qui peut, le cas échéant et-ré effimplété par un couvercle permettant de onserver pins longtemps la chaleur dans le récipient. A titre d'exemples non limitatifs de telles applications, neeessitant une incubation de plus d'une heure entre 30 et 40"C on peut citer la digestion enzymatique de cartilage, afin d'isoler des Chondroeytes ; la digestion de biopsie testiculaire, pour isoler les cellules germinales l'obtention d'îlots de Langerbans à partir d'une biopsie de
La présente invention porte également sur une trousse pour application biologique (trousse de biologie cellulaire ettou trousse de biologie moléculaire), caractérisée en Ce qu'elle comprend une chaufferette dont le fonctionnement repose sur un processus physique ou chimique exothermique.
Selon un mode de réalisation préféré des trousses selon la présente invention, in chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aquetist Saturée en aatate de sodium en état de surfusion.
Selon un mode de réalisation préféré de la trousSe de la présente invention, la trousse contient également un support qui comprend une cavité destinée à
recevoir la chaufferette. Ce support comprend par exemple une plaque de matériau isolant thermique dlepaisSeur comprise .entre 5 et 35 mm, dans lequel la cavité destinée à
recevoir la chaufferette a une profondeur comprise entre 5 et 25 mm. Le support petit également être constitué d'une plaque plus fine (par exemple 1 mm d'épaisseur), pliée ou assemblée pour fOrmer nri support creux. De préférence.; :te matériau utilisé pour le suppurt a une conductivité
thermique 2, inférieure ou égale à 0,4 \\/..m-',K1 à 20C, De manière encore préférée, sa conductivité thermique est inférieure à 0,15 W,m-I.K'1, voire inférieure à
0,08 W.111-1 . ou même inférieure ou égale à 0,04 Wall-J.1(4. A titre d'exempleS non limitatifs de matériaux utilisables, on peut citer lie bois 0,, du contreplaqué = 0,11 W.nfj,W1), le carton 0, ¨ 0,07 W.rn-1.1<-5, le liège()¨ 0,04 W.m-I.K1), le PVC (TA
W.nfl.K.71), le polypropylène 0,-0,1 à 0,22 Wu:11'1.W' ), la mousse de polyuréthane rigide ¨ 0,025) et le polystyrène expansé Ok, --0,030. Suivant les applications envisagées pour la trousse, le caractère isolant du support ce plus ou moins important. Par exemple, pour une trousse destinée à préparer, dans un cabinet de dermatologie, une suspension cellulaire par un procédé tel que décrit ci-dessus, le caractère isolant du support est secondaire, car les locaux dans lesquels ta trousse Sera utilisée, sont généralement à au moins 18"C, et le. temps d'incubation de l'échantillon cellulaire avec la trypsine n'est pas très long, En revanche, certaines applications peuvent imposer des conditions thermiques extrêmes et/ou nécessiter un temps d'incubation plus long à une température comprise entre 30 et 40 C, Dans ce cas, il est important d'utiliser un ,riupport.
isolant, qui peut, le cas échéant et-ré effimplété par un couvercle permettant de onserver pins longtemps la chaleur dans le récipient. A titre d'exemples non limitatifs de telles applications, neeessitant une incubation de plus d'une heure entre 30 et 40"C on peut citer la digestion enzymatique de cartilage, afin d'isoler des Chondroeytes ; la digestion de biopsie testiculaire, pour isoler les cellules germinales l'obtention d'îlots de Langerbans à partir d'une biopsie de
6 pancréas la digestion de derme pour isoler des fibrobastes ; et la digestion d'une biopsie gingivale pour isoler des fibroblastes gingivaux.
Les ;rousses de l'invention peuvent également comprendre un récipient dont la base a la même géométrie que celle de la chaufferette et, le ças échéant de la cavité du support, afin de permettre des échanges thermiques efficacesõ Par exeMple, la chaufferette peut être un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 nrn de préférence 4 à 6 mm et le diamètre est compris entre 7 et I I cm, de préférence 8 à I 0 cm ; dans ce cas, le récipient est de préférence une boîte de Petri de diamètre sensiblement égal à celui de la chaufferette et, si un support est présent, la cavité deStin& à recevoir la chaufferette est 4.alernent circulaire, d'un diamètre légèrement supérieur à celui de la chaufferette.
Une trousse selon la présente invention peut également contenir une enzyme, par exemple de la trypsine. Une telle trousse est par exemple conçue pour le traitement d'une biopsie, et comprend notamment les moyens nécessaires pour la dissociation des cellules de ladite biopsie. Selon un mode de réalisation particulier, cette trousse comprend une boite de Petri compartimentée dent le diamètre est identique ou très proche de celui de la chaufferette., un tamis eellulaire, et de la trypsine (sous forme lyophilisée:
ou en solution).
Les: exemples et figures Stlivarits illustrent l'invention sans toutefois limiter son étendue.
Légendes des figures Figure I Evolution de la température d'une soluticn tampon dans une boite de Petri de 9 cm de diamètre, placée sur une chaufferette a l'acétate de:sodium, présentant une forme de disque d'un diamètre sensiblement égal à celui de la boite de Petri, sur une durée de 40 minutes, dans une pièce à 20')C
Figure : photos du dispositif comprenant un support et un pack de chaleur (chaufferette). 1 : pack de chaleur ; 2 : support ;. 3 boîte compartimentée posée sur le pack de:
chaleur.
Figure 3 : Evolution de la température en fonction du temps, Sans Support Eiguree4 EvOlution de la température en fonction du temps, avec le support V2.
Figure Evolution de la température en fonction du temps, avec le support "3.
Figure 6 : Evolution de la température en fonction du temps (comparaison des moyennes sans support et avec supports V2 ou W), Exeat p les Exemple 1 : Température du milieu dans une boîte de Petri placée 5.air une chaufferette température d'une solution (tampon) dans une boîte de Petri de 9 cm de digetre, placée sur une chaufferette à l'acétate de, sodium, présentant une forme de disque
Les ;rousses de l'invention peuvent également comprendre un récipient dont la base a la même géométrie que celle de la chaufferette et, le ças échéant de la cavité du support, afin de permettre des échanges thermiques efficacesõ Par exeMple, la chaufferette peut être un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 nrn de préférence 4 à 6 mm et le diamètre est compris entre 7 et I I cm, de préférence 8 à I 0 cm ; dans ce cas, le récipient est de préférence une boîte de Petri de diamètre sensiblement égal à celui de la chaufferette et, si un support est présent, la cavité deStin& à recevoir la chaufferette est 4.alernent circulaire, d'un diamètre légèrement supérieur à celui de la chaufferette.
Une trousse selon la présente invention peut également contenir une enzyme, par exemple de la trypsine. Une telle trousse est par exemple conçue pour le traitement d'une biopsie, et comprend notamment les moyens nécessaires pour la dissociation des cellules de ladite biopsie. Selon un mode de réalisation particulier, cette trousse comprend une boite de Petri compartimentée dent le diamètre est identique ou très proche de celui de la chaufferette., un tamis eellulaire, et de la trypsine (sous forme lyophilisée:
ou en solution).
Les: exemples et figures Stlivarits illustrent l'invention sans toutefois limiter son étendue.
Légendes des figures Figure I Evolution de la température d'une soluticn tampon dans une boite de Petri de 9 cm de diamètre, placée sur une chaufferette a l'acétate de:sodium, présentant une forme de disque d'un diamètre sensiblement égal à celui de la boite de Petri, sur une durée de 40 minutes, dans une pièce à 20')C
Figure : photos du dispositif comprenant un support et un pack de chaleur (chaufferette). 1 : pack de chaleur ; 2 : support ;. 3 boîte compartimentée posée sur le pack de:
chaleur.
Figure 3 : Evolution de la température en fonction du temps, Sans Support Eiguree4 EvOlution de la température en fonction du temps, avec le support V2.
Figure Evolution de la température en fonction du temps, avec le support "3.
Figure 6 : Evolution de la température en fonction du temps (comparaison des moyennes sans support et avec supports V2 ou W), Exeat p les Exemple 1 : Température du milieu dans une boîte de Petri placée 5.air une chaufferette température d'une solution (tampon) dans une boîte de Petri de 9 cm de digetre, placée sur une chaufferette à l'acétate de, sodium, présentant une forme de disque
7 d'un diamètre sensiblement égal à celui de la boîte de Petri et une épaisseur comprise entre =4 et 6 mm a été mesurée.
Les résultats (Figure 1) montrée une montée: en température assez rapide, puisque la température atteint 30 C en quelques minutes. La température t.Ç*
ensuite comprise entre 30 et 40 C pendant un peu plus de 20 minutes.
Ces résultats ont montré une bonne reproductibilité.
Exemple 2 Application à la séparation dermo-épidermique, dans le cadre du traitement du vitili 20 par eeffe autologue de mélanoevtes A partir d'une biopsie de peau fine (0,2 mrn-0,3 mm), le lit d'une plaie est ensemencée avec des cellules autologues.
La suspension cellulaire obtenue après désagrégation du greffon. est constituée d'une population mixte, principalement des cellules basales de kératinocytes, mais également des cellules de Langerhans, des mélanocyteS et des fibroblaStes.
Matériels utilisés Une chaufferette telle que décrite à l'exemple 1, et un kit à usage unique eornpesé d'éléments et d'instruments annexes solutions enzymatiques et d'application;
instruments stériles, dont une boîte de Petri à du X compartiments.
Protocole Préparer un champ chirurgical stérile.
A réception, le kit est conetvé à +49C jusqu'à utilisation. Le kit est disposé
à température ambiante 10 min avant utilisation.
Préparation et chauffage de la Solution errzymatique = A l'aide d'une seringue de 5 ml et d'une aiguille, prélever 5 ml solution de PBS et les injecter dans le flacon de trypsine lyophilisée, Bien homogénéiser avant de reprendre la solution régéne..teé e dans un compartiment de la boite de Petri double compartiment.
O Activer le pack de chaleur instantanée en froissant la plaque métallique ; lé cristal se solidifie instantanément.
e Placer la boite de Petri double compartiment sur le pack de chaleur activé et attendre 5 min.
Prélèvement cutané
La zone à prélever est délimitée au feutre chirurgical, désinfectée avec de la Chlorhexidine à 0,5% en solution alcoolique, et anesthésiée avec de la xylocabe a 2%. Un lambeau: de peau mince de 4 cm2 minimum de surfaee et 0,2-0,3 mm d'épaisseur est prélevé
avec un dermatotne.
Les résultats (Figure 1) montrée une montée: en température assez rapide, puisque la température atteint 30 C en quelques minutes. La température t.Ç*
ensuite comprise entre 30 et 40 C pendant un peu plus de 20 minutes.
Ces résultats ont montré une bonne reproductibilité.
Exemple 2 Application à la séparation dermo-épidermique, dans le cadre du traitement du vitili 20 par eeffe autologue de mélanoevtes A partir d'une biopsie de peau fine (0,2 mrn-0,3 mm), le lit d'une plaie est ensemencée avec des cellules autologues.
La suspension cellulaire obtenue après désagrégation du greffon. est constituée d'une population mixte, principalement des cellules basales de kératinocytes, mais également des cellules de Langerhans, des mélanocyteS et des fibroblaStes.
Matériels utilisés Une chaufferette telle que décrite à l'exemple 1, et un kit à usage unique eornpesé d'éléments et d'instruments annexes solutions enzymatiques et d'application;
instruments stériles, dont une boîte de Petri à du X compartiments.
Protocole Préparer un champ chirurgical stérile.
A réception, le kit est conetvé à +49C jusqu'à utilisation. Le kit est disposé
à température ambiante 10 min avant utilisation.
Préparation et chauffage de la Solution errzymatique = A l'aide d'une seringue de 5 ml et d'une aiguille, prélever 5 ml solution de PBS et les injecter dans le flacon de trypsine lyophilisée, Bien homogénéiser avant de reprendre la solution régéne..teé e dans un compartiment de la boite de Petri double compartiment.
O Activer le pack de chaleur instantanée en froissant la plaque métallique ; lé cristal se solidifie instantanément.
e Placer la boite de Petri double compartiment sur le pack de chaleur activé et attendre 5 min.
Prélèvement cutané
La zone à prélever est délimitée au feutre chirurgical, désinfectée avec de la Chlorhexidine à 0,5% en solution alcoolique, et anesthésiée avec de la xylocabe a 2%. Un lambeau: de peau mince de 4 cm2 minimum de surfaee et 0,2-0,3 mm d'épaisseur est prélevé
avec un dermatotne.
8 Réalisation de la séparation dermo-épidermique(SDE) 0. A raide de la pince stérile (non fournie) transférer la biopsie dans le compartiment de la boite de Petri contenant la trypsine en solution à:
0.4%.
etu Incuber 15 minutes.
= Rinçage de la biopsie - Avec la. même: seringue de. 5m1 et une aiguille, prélever 5m1 de solution de PBS et disposer dans le :second :compartiment de la boite de Petri.
- A la. fin de l'incubation, à l'aide de la pince...stérile, transférer la biopsie dans le second compartiment, pour rinçage rapide au PBS.
e5 A l'aide de la pince stérile, disposer la biopsie à l'intérieur du couvercle de la boite de Petri, en prenant. soin de conserver le sens jonction dermo-épidermique vers le haut, e. A l'aide de la pince,. procéder à la. séparation des deux fragmente.
Réalisation de la. suspension cellulaire O A l'aide de la seconde seringu.e de 5 ml.. et d'une aiguille, prélever 1,5 ml de PBS et les déposer sur les fragments de biopsie, racler les cellules des surfaces de jonetion .avec un scalpel (nen fourni) et découper la partie épidermique grossièrement pour réaliser un mélange de cellules.
Ecarter et immobiliser la partie dermique.
o Pencher la boite de Petri de fàoe à aspirer la totalité du volume à
l'aide dc la seringue de 5 ml, faire. monter les cellules dans là
seringue et aspirer plusieurs fois pour créer une suspension cellulaire.
Filtration des cellules es. Transférer la suspension cellulaire dans le tamis qui aura été placé:
sur le pot à bouchon rouge.
Réalisation de la suspension cellulaire dans l'acidelyaluronique.
= Retirer le tamis.
*u, Déposer l'acide hyaluronique contenu dans la .seringue (soit 1,5 rtil) dans le pot à bouchon rouge contenant la. suspension cellulaire filtrée, A l'aide de la .seringue, mélanger l'acide hyaluronique et le suspension cellulaire de fa.con. â obtenir une 'suspension visqueuse mais homogène,
0.4%.
etu Incuber 15 minutes.
= Rinçage de la biopsie - Avec la. même: seringue de. 5m1 et une aiguille, prélever 5m1 de solution de PBS et disposer dans le :second :compartiment de la boite de Petri.
- A la. fin de l'incubation, à l'aide de la pince...stérile, transférer la biopsie dans le second compartiment, pour rinçage rapide au PBS.
e5 A l'aide de la pince stérile, disposer la biopsie à l'intérieur du couvercle de la boite de Petri, en prenant. soin de conserver le sens jonction dermo-épidermique vers le haut, e. A l'aide de la pince,. procéder à la. séparation des deux fragmente.
Réalisation de la. suspension cellulaire O A l'aide de la seconde seringu.e de 5 ml.. et d'une aiguille, prélever 1,5 ml de PBS et les déposer sur les fragments de biopsie, racler les cellules des surfaces de jonetion .avec un scalpel (nen fourni) et découper la partie épidermique grossièrement pour réaliser un mélange de cellules.
Ecarter et immobiliser la partie dermique.
o Pencher la boite de Petri de fàoe à aspirer la totalité du volume à
l'aide dc la seringue de 5 ml, faire. monter les cellules dans là
seringue et aspirer plusieurs fois pour créer une suspension cellulaire.
Filtration des cellules es. Transférer la suspension cellulaire dans le tamis qui aura été placé:
sur le pot à bouchon rouge.
Réalisation de la suspension cellulaire dans l'acidelyaluronique.
= Retirer le tamis.
*u, Déposer l'acide hyaluronique contenu dans la .seringue (soit 1,5 rtil) dans le pot à bouchon rouge contenant la. suspension cellulaire filtrée, A l'aide de la .seringue, mélanger l'acide hyaluronique et le suspension cellulaire de fa.con. â obtenir une 'suspension visqueuse mais homogène,
9 ee La suspension ainsi préparée est prête à être déposée à la seringue sur le lit de la plaie.
Résultais Le protocole ci-dessus a été effectué plusieurs fois, à partir de trois:
échantillons cutanés différents, en utilisant deux concentrations de trypsine (0,4 et 028%), tes résultats obtenus sont résumés dans le tableau 1 .ci-dessous.
[ Identification Concentration Nombre de Viabilité I Test Présence de ..
de trypsine cellules cellulaire (%) d'efficacité
mélanocytes isolées x 106 de clonae en c ytométrie r cm- de flux Biopsie 1 0,4% 1,2 95,0% 3,4% > 0,1%
0,8% 1,2 97,0% 3,4% >0,1%
Biopsie 2 0.4% 3,4 98,0% 3,3% >0,1%
................ 0,8% 2,3 97,0% 3 f;%.
L>0,1%
Biopsie 3 0,4% 4.2 97,4%
0,1%
0.8% 3.49 99,4% 4,5% > 0,1%
Tableau I
Concentration de la irypsine Le procédé d'obtention de la substance active à été adapté de la technique décrite par van Geel et al. (van Geel et al., 2004).
La concentration de la solution de trypsine a été optimisée (trypsine 0,4% ou 0,8% au lieu de trypsine 0,25% IEDTA 0,08%), A la différence de la technique décri.te par :van Geel et al., l'inhibition de la trypsine n'a pas été. réalisée par ajout d'inhibiteur de type sérum de veau tbetal, niais par rinçage avec du PBS, ceci afin dé diminuer le nombre de produits d'origine biologique utilisé pour la fabrication du produit. La viabilité cellulaire après ce mode d'inhibition de la trypsine a été: validée.
Viabilitée,?ell4laire La détermination de là viabilité cellulaire a été réalisée selon une technique clasSique de culture cellulaire le test d'exclusion au bleu dé trypan. Une dilution. volume .à
volume de bleu trypan et de la suspension: cellulaire a été réalisée dans un tube à hémolyse;
Après un temps de contact de 1 à 2 minutes, :le mélange a été déposé avec une micropipette entre lame et lamelle stil' une cellule de numération. 1.,,es cellules mortes;
colorées en bleu, et les cellules vivantes, non colorées, ont été comptées à l'aide d'un microscope optique :à.
contrastede phase.
Là viabilité cellulaire était très satisfaisante après isolement des cellules épidermiques (supérieure a 90%).
Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficaeité de clonage étaient homogènes d'une biopsie à l'autre et montraient que la suspension cellulaire contenait des cellules capables de proliférer après trypsinatiom Nombre de cellules isolées lem2 de biopsie 5 Calcul effectifé â partir des résultats du test décrit ci-dessus.
Le nombre de cellules isolées était variable d'on individu à un autre en fonction de la taille des biopsies traitées, mais le rendement eellule/cm2 a été relativement constant. La densité eellulairc de la suspension finale dépend donc grandet-lient de la taille de le biopsie traitée.
Résultais Le protocole ci-dessus a été effectué plusieurs fois, à partir de trois:
échantillons cutanés différents, en utilisant deux concentrations de trypsine (0,4 et 028%), tes résultats obtenus sont résumés dans le tableau 1 .ci-dessous.
[ Identification Concentration Nombre de Viabilité I Test Présence de ..
de trypsine cellules cellulaire (%) d'efficacité
mélanocytes isolées x 106 de clonae en c ytométrie r cm- de flux Biopsie 1 0,4% 1,2 95,0% 3,4% > 0,1%
0,8% 1,2 97,0% 3,4% >0,1%
Biopsie 2 0.4% 3,4 98,0% 3,3% >0,1%
................ 0,8% 2,3 97,0% 3 f;%.
L>0,1%
Biopsie 3 0,4% 4.2 97,4%
0,1%
0.8% 3.49 99,4% 4,5% > 0,1%
Tableau I
Concentration de la irypsine Le procédé d'obtention de la substance active à été adapté de la technique décrite par van Geel et al. (van Geel et al., 2004).
La concentration de la solution de trypsine a été optimisée (trypsine 0,4% ou 0,8% au lieu de trypsine 0,25% IEDTA 0,08%), A la différence de la technique décri.te par :van Geel et al., l'inhibition de la trypsine n'a pas été. réalisée par ajout d'inhibiteur de type sérum de veau tbetal, niais par rinçage avec du PBS, ceci afin dé diminuer le nombre de produits d'origine biologique utilisé pour la fabrication du produit. La viabilité cellulaire après ce mode d'inhibition de la trypsine a été: validée.
Viabilitée,?ell4laire La détermination de là viabilité cellulaire a été réalisée selon une technique clasSique de culture cellulaire le test d'exclusion au bleu dé trypan. Une dilution. volume .à
volume de bleu trypan et de la suspension: cellulaire a été réalisée dans un tube à hémolyse;
Après un temps de contact de 1 à 2 minutes, :le mélange a été déposé avec une micropipette entre lame et lamelle stil' une cellule de numération. 1.,,es cellules mortes;
colorées en bleu, et les cellules vivantes, non colorées, ont été comptées à l'aide d'un microscope optique :à.
contrastede phase.
Là viabilité cellulaire était très satisfaisante après isolement des cellules épidermiques (supérieure a 90%).
Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficaeité de clonage étaient homogènes d'une biopsie à l'autre et montraient que la suspension cellulaire contenait des cellules capables de proliférer après trypsinatiom Nombre de cellules isolées lem2 de biopsie 5 Calcul effectifé â partir des résultats du test décrit ci-dessus.
Le nombre de cellules isolées était variable d'on individu à un autre en fonction de la taille des biopsies traitées, mais le rendement eellule/cm2 a été relativement constant. La densité eellulairc de la suspension finale dépend donc grandet-lient de la taille de le biopsie traitée.
10 Test eqfficacité de clonage (CFT) Le pourcentage d'efficacité de clonage permet dévaluer le taux de cellules capables d'adhérer et de fort= des 'colonies, Une quantité connue de cellules épidermiques a été ensemencée dans 3 flasques 125 cm2. Vers le J,4e'e jour de: culture, lorsque les :clones étaient suffisamment gros mais non jointifs, les fiasques ont été colorées:
par unesolution de Cristal Violet (10% forrnaldébyde 05% Cristal Violet, qsp eau distillée).
L'efficacité de clonage a été calculée en. effectuant le rapport de la moyenne du nombre total de colonies par fiasque T25em2x 100 sur le nombre de cellules e,risemencées par T25 cm2.
Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficacité de clonage ont été homogènes d'une biopsie :à. l'autre et ont montré que la suspension cellulaire conteõnait des cellules capables de proliférer après trypsination:
Tare de mélanocyte dans là eteceion cellulaire pat cytometrie en .140c .t,a membrane cellulaire a été perineabilisée dans une solution de PBS-BSA
(Bovine Serum Albumine) 1%: triton 0,5%. L'anticorps primaire spécifique des mélanocytes normaux. :(anticorps NKI/beteb) a été ince& puis rincé avec du PBS-BSA 1%.
L'anticorps secondaire (anticorps d'âne antisouris Alexa Fluor 488) a eé incubé puis tincé
avec du PRS,.
BSA 1%. Les cellules marquées ont été reprises dans du PBS et. passées au FACS-SCAN.
Les ratios de mélanocytes/kératinocytes dans les suspensions épidermiques obtenues ont été comparables à ceux. cale-1.11es par atterra et al: (entre 1 :30 et 1 :200) (Ciuerra et al., 2003).
Dans le procédé décrit ici, tee cellules épidermiques isolées teont pas été
mises en culture et l'ensemble du procédé a été effectué dans la journée (biopsie, fabrication du produit fini et greffe de cellules épidermiques autologues non cultivées), Exemple 3 ; utilisation d'un support isolant pour optimiser la montée et le maintien de la température du mi lieu_par la chaufferette 3 L Matériels et méthodes Matériels et Réacte Packs de chaleur (chaufferettes) en PVC, marquage CE
par unesolution de Cristal Violet (10% forrnaldébyde 05% Cristal Violet, qsp eau distillée).
L'efficacité de clonage a été calculée en. effectuant le rapport de la moyenne du nombre total de colonies par fiasque T25em2x 100 sur le nombre de cellules e,risemencées par T25 cm2.
Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficacité de clonage ont été homogènes d'une biopsie :à. l'autre et ont montré que la suspension cellulaire conteõnait des cellules capables de proliférer après trypsination:
Tare de mélanocyte dans là eteceion cellulaire pat cytometrie en .140c .t,a membrane cellulaire a été perineabilisée dans une solution de PBS-BSA
(Bovine Serum Albumine) 1%: triton 0,5%. L'anticorps primaire spécifique des mélanocytes normaux. :(anticorps NKI/beteb) a été ince& puis rincé avec du PBS-BSA 1%.
L'anticorps secondaire (anticorps d'âne antisouris Alexa Fluor 488) a eé incubé puis tincé
avec du PRS,.
BSA 1%. Les cellules marquées ont été reprises dans du PBS et. passées au FACS-SCAN.
Les ratios de mélanocytes/kératinocytes dans les suspensions épidermiques obtenues ont été comparables à ceux. cale-1.11es par atterra et al: (entre 1 :30 et 1 :200) (Ciuerra et al., 2003).
Dans le procédé décrit ici, tee cellules épidermiques isolées teont pas été
mises en culture et l'ensemble du procédé a été effectué dans la journée (biopsie, fabrication du produit fini et greffe de cellules épidermiques autologues non cultivées), Exemple 3 ; utilisation d'un support isolant pour optimiser la montée et le maintien de la température du mi lieu_par la chaufferette 3 L Matériels et méthodes Matériels et Réacte Packs de chaleur (chaufferettes) en PVC, marquage CE
11 - Plateaux de support constitués d'une plaque de polypropylène (PP)= de I
à 2 min d'épaisseur, pliée pour obtenir un support d'une épaisseur totale de 15 mm, présentant une cavité circulaire de 90 mm de diamètre: (Figure 2).
= Boite de Petri compartimentée (réf. Dutscher 020012) Sonde de température (Thermobouton) programmée pour fonétionner avec le logiciel ThermoTrack V4= et/ou A BI 529:
Méthodes Si: millilitres de PBS conservés a 4-4 C, équilibrés 2t) minutes a température ambiante, sont déposés dans un des compartiments d'une boite de Petri de diamètre 90 mm, dans lequel est placé tin thermobouton (dispositif permettant d'enregistrer les variations de température) pour réaliser des relevés de température toutes les minutes. La boîte de Petri est ensuite recouverte de: 804 couvercle.
Le thermobouton est eai contact avec le milieu, permettant de mesurer directement au. sein de la solution les variations: de température, après activation du pack: de chaleur. L'expérience est réalisée en plaçant ou non le pack de chaleur et la boîte de: Petri dans la cavité circulaire du support (Figure 2)'. Trois supports différents:
ont été testés, Ils diffèrent par la position plus ou moins centrale dé la culte circulaire destinée à accueillir le chaufferette et la boite de Petri.
chaque condition a: été testée 5 à 6 fois, avec des sondes de température différentes. Les mesures de température ont été réalisées pendant 20 min, La moyenne des températures a été .réalisée sur l'ensemble des valeurs relevées durant ce laps de temps.
Une analyse statistique des températures mesurées dans le Milieu avec ou sans support a été réalisée par un test t destudent.
3.2. Résultats Evolution de la tempéedture du milieu avec im pack de chaleur sans support Les données de température recueillies par la sonde de température plOngée dans le milieu sont schématisées d la Figure 3. La température moyenne sur les 6 tests était de 35,5 C, avec une moyenne des écarts-types de 3,9 C.
Ces résultats mettent en évidence la reproductibilité des températures obtenues: avec les différentes chaufferetteS, sans support.
Evolettiim de la température du milieu avec un pack de chaleur dans un support Deux supports (prototypes V2 et V3) ont été testés. Ils diffèrent pat la position de la cavité circulaire destinée à accueillir la chaufferette. En effet, dans lé support V3, cette cavité a été centralisée pour permettre une homogénéisation de la chaleur à
l'intérieur du support, afin d'optimiser la montée et le maintien .de la température dans la boite de Petri compartimentée disposée sur la chaufferette.
à 2 min d'épaisseur, pliée pour obtenir un support d'une épaisseur totale de 15 mm, présentant une cavité circulaire de 90 mm de diamètre: (Figure 2).
= Boite de Petri compartimentée (réf. Dutscher 020012) Sonde de température (Thermobouton) programmée pour fonétionner avec le logiciel ThermoTrack V4= et/ou A BI 529:
Méthodes Si: millilitres de PBS conservés a 4-4 C, équilibrés 2t) minutes a température ambiante, sont déposés dans un des compartiments d'une boite de Petri de diamètre 90 mm, dans lequel est placé tin thermobouton (dispositif permettant d'enregistrer les variations de température) pour réaliser des relevés de température toutes les minutes. La boîte de Petri est ensuite recouverte de: 804 couvercle.
Le thermobouton est eai contact avec le milieu, permettant de mesurer directement au. sein de la solution les variations: de température, après activation du pack: de chaleur. L'expérience est réalisée en plaçant ou non le pack de chaleur et la boîte de: Petri dans la cavité circulaire du support (Figure 2)'. Trois supports différents:
ont été testés, Ils diffèrent par la position plus ou moins centrale dé la culte circulaire destinée à accueillir le chaufferette et la boite de Petri.
chaque condition a: été testée 5 à 6 fois, avec des sondes de température différentes. Les mesures de température ont été réalisées pendant 20 min, La moyenne des températures a été .réalisée sur l'ensemble des valeurs relevées durant ce laps de temps.
Une analyse statistique des températures mesurées dans le Milieu avec ou sans support a été réalisée par un test t destudent.
3.2. Résultats Evolution de la tempéedture du milieu avec im pack de chaleur sans support Les données de température recueillies par la sonde de température plOngée dans le milieu sont schématisées d la Figure 3. La température moyenne sur les 6 tests était de 35,5 C, avec une moyenne des écarts-types de 3,9 C.
Ces résultats mettent en évidence la reproductibilité des températures obtenues: avec les différentes chaufferetteS, sans support.
Evolettiim de la température du milieu avec un pack de chaleur dans un support Deux supports (prototypes V2 et V3) ont été testés. Ils diffèrent pat la position de la cavité circulaire destinée à accueillir la chaufferette. En effet, dans lé support V3, cette cavité a été centralisée pour permettre une homogénéisation de la chaleur à
l'intérieur du support, afin d'optimiser la montée et le maintien .de la température dans la boite de Petri compartimentée disposée sur la chaufferette.
12 Les données de température recueillies pendant 20 minutes par la sonde de température plongée dans le milieu sont schématisées dans les graphes présentés la figure 4 (Support V2), à la figure 5 (support V$) e 4 la figure 6 (comparaison des deux supports et des températures obtenues sans support), é,..t résumées dans le tableau ci-desSous.
Durée de Température Temps pour Température maintien de la Maximale atteindre la moyenne des e température atteinte 1 température tests >35'C * maximale Test sens 18 min 39.5 C 9 min 35,5C 3.9 C
support Test avec 18 min 40.5C 6 min 36.79C 3.6 C
support V2 Test avec 18 min , 409C 1 9 min l'C
support V3 Tableau 2 ;
durée obtenue sur une durée totale de l'expérience de. 21 minutes Ces résultats mettent en évidence - la reproductibilité entre les chaufferettes ;
les températures eteinteS sont plus élevées lorsque les ehaufferetteS
sont disposées dans un support (1,19C de différence avec V2 et 0,8-c. avec V3).;
4, avec ou sans support, le milieu contenu dans la boite de Petri compartimenté est maintenu it une température supérieure à 3 5C pendant au moins 18 minutes ;
- Sans support, la température maximale de 39.5C est atteinte en 9 min, alors qu'avec le support V2 elle atteint 40.52C en 6 min.
Afin de déterminer si les différences observées sont statistiquement Significatives, une analyse statistique par un test t student a ete réalisée en utilisant les valeurs obtenues avec k Stipport 1J3. Ce test indique une probabilité de 0.03 < 0.05, detnontrant l'écart des températures obtenues sans support et avec le support. V3 est significatif (tableau 3): Le support V3 permet donc d'obtenir une température en moyenne plus élevée que sans support, plus rapidement et de façon plus reproductibit; (e-t 19C)õ
Durée de Température Temps pour Température maintien de la Maximale atteindre la moyenne des e température atteinte 1 température tests >35'C * maximale Test sens 18 min 39.5 C 9 min 35,5C 3.9 C
support Test avec 18 min 40.5C 6 min 36.79C 3.6 C
support V2 Test avec 18 min , 409C 1 9 min l'C
support V3 Tableau 2 ;
durée obtenue sur une durée totale de l'expérience de. 21 minutes Ces résultats mettent en évidence - la reproductibilité entre les chaufferettes ;
les températures eteinteS sont plus élevées lorsque les ehaufferetteS
sont disposées dans un support (1,19C de différence avec V2 et 0,8-c. avec V3).;
4, avec ou sans support, le milieu contenu dans la boite de Petri compartimenté est maintenu it une température supérieure à 3 5C pendant au moins 18 minutes ;
- Sans support, la température maximale de 39.5C est atteinte en 9 min, alors qu'avec le support V2 elle atteint 40.52C en 6 min.
Afin de déterminer si les différences observées sont statistiquement Significatives, une analyse statistique par un test t student a ete réalisée en utilisant les valeurs obtenues avec k Stipport 1J3. Ce test indique une probabilité de 0.03 < 0.05, detnontrant l'écart des températures obtenues sans support et avec le support. V3 est significatif (tableau 3): Le support V3 permet donc d'obtenir une température en moyenne plus élevée que sans support, plus rapidement et de façon plus reproductibit; (e-t 19C)õ
13 Moyennç sans support Moyenne avec support 35,4: 35,9 35,9 35,7 35,7 ------------- 36,9 ..
35,3 ............. 36,3 ..
35,1 36,8 35,6 ______________ NA
Moyenne 35,5 36,37 _________________ _ tt 0,03 Tableau 3 Les supports permettent donc d'optimiser la montée en température etlou son main lien.
L'utilisation du support du kit VitiCelb".., lors d'une digestion enzymatique de biopsie de peau fine afin d'en réaliser une séparation dermo-épidermique, selon le process de production de suspensions épidermiques décrit à l'exemple 2, permet d'obtenir en moyenne une température plus élevée et plus rapidement. te support presente donc un double intérêt plateau de travail et optimisation de la montée en température des packs de chaleur.
35,3 ............. 36,3 ..
35,1 36,8 35,6 ______________ NA
Moyenne 35,5 36,37 _________________ _ tt 0,03 Tableau 3 Les supports permettent donc d'optimiser la montée en température etlou son main lien.
L'utilisation du support du kit VitiCelb".., lors d'une digestion enzymatique de biopsie de peau fine afin d'en réaliser une séparation dermo-épidermique, selon le process de production de suspensions épidermiques décrit à l'exemple 2, permet d'obtenir en moyenne une température plus élevée et plus rapidement. te support presente donc un double intérêt plateau de travail et optimisation de la montée en température des packs de chaleur.
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Ciuerra, L.. Prirnavera, G., Raskovic, D., Pellegrini, G., Golisano, O., Bondanza, S,, Paterna, P., Sonego, G., Gobe , T., Atzori, F, Piazza, P., Luci., A. and Do 1...tica, n (2003) Erbium:YAG laser and euttured epid.erntis in the surgical therapy of stable vitiligo.
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Claims (15)
1. Procédé pour mettre en oeuvre une réaction biologique, biochimique ou chimique nécessitant une incubation à une température. comprise entre 30 et 40°C, caractérise en ce qu'il comprend une étape d'activation d'une chaufferette dont le fonctionnement repose.
sur un processus physique ou chimique exothermique, et une étape de mise en contact de ladite chaufferette avec un récipient contenant les réactifs impliqués dans ladite réaction.
sur un processus physique ou chimique exothermique, et une étape de mise en contact de ladite chaufferette avec un récipient contenant les réactifs impliqués dans ladite réaction.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de mise en contact de la chaufferette avec le récipient est effectuée en plaçant la chaufferette et au moins là partie inférieure du récipient dans une cavité d'un support prévu à
cet effet.
cet effet.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le récipient contient une solution enzymatique et en ce que le contact entre la chaufferette et le récipient est maintenu pendant au moins 10 minutes.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le volume de la solution contenant les réactifs impliqués dans la réaction est compris entre 3 et 10 ml, le récipient contenant ladite solution est une boîte de Petri de diamètre compris entre 7 et 11 cm ou un compartiment de ladite boîte et en ce que la chaufferette est un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 mm et le diamètre est compris entre 7 et 11 cm.
6. Procédé selon les revendications 2 et 5, caractérisé en ce que la cavité
du support destinée à recevoir la chaufferette est circulaire, de diamètre compris entre 7 et 11,5 cm, et a une profondeur comprise entre 5 et 2.0 mm.
du support destinée à recevoir la chaufferette est circulaire, de diamètre compris entre 7 et 11,5 cm, et a une profondeur comprise entre 5 et 2.0 mm.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour effectuer la dissociation de cellules issues d'un échantillon de tissu, comportant les étapes suivantes (i) initier la cristallisation dans une chaufferette constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium ;
(ii) placer sur ladite chaufferette un récipient contenant une solution de trypsine de concentration comprise entre 0,2% et 1%;
(iii) placer l'échantillon de tissu dans ladite solution et laisser incuber au moins 10 minutes ;
(iv) rincer l'échantillon de tissu.
(ii) placer sur ladite chaufferette un récipient contenant une solution de trypsine de concentration comprise entre 0,2% et 1%;
(iii) placer l'échantillon de tissu dans ladite solution et laisser incuber au moins 10 minutes ;
(iv) rincer l'échantillon de tissu.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour préparer une suspension cellulaire appropriée pour une application cutanée sur un patient, comprenant les étapes suivantes :
(i) soumettre un échantillon de tissu cutané comprenant des cellules appropriées pour une greffe à un patient, au procédé selon la revendication 7 ;
(ii) récolter les cellules appropriées provenant de l'échantillon cutané et les mettre en suspension dans une solution ; et (iii.) filtrer la solution obtenue à l'étape (ii) sur tamis cellulaire.
(i) soumettre un échantillon de tissu cutané comprenant des cellules appropriées pour une greffe à un patient, au procédé selon la revendication 7 ;
(ii) récolter les cellules appropriées provenant de l'échantillon cutané et les mettre en suspension dans une solution ; et (iii.) filtrer la solution obtenue à l'étape (ii) sur tamis cellulaire.
9.
Procédé selon la revendication 8, comportant une étape supplémentaire d'ajout d'acide hyaluronique à la suspension cellulaire obtenue à l'étape (iii).
Procédé selon la revendication 8, comportant une étape supplémentaire d'ajout d'acide hyaluronique à la suspension cellulaire obtenue à l'étape (iii).
10. Procédé selon les revendications 8 et 9, pour le traitement du vitiligo, caractérisé en ce qu'à l'étape (ii), les mélanocytes sont récupérés.
11. Trousse pour application biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend une chaufferette dont le fonctionnement repose sur un processus physique ou chimique exothermique.
12. Trousse selon la revendication 11, dans laquelle la chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium en état de surfusion.
13. Trousse selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend également un support pourvu d'une cavité destinée à
recevoir ladite chaufferette.
recevoir ladite chaufferette.
14. Trousse selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend également un récipient dont la base a la même géométrie que celle de la chaufferette.
15. Trousse selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend également une enzyme.
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Effective date: 20170418 |