KR20150027199A - 생물학적 반응을 촉진하기 위한 워머의 사용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특히 분자 생물학 또는 세포 생물학 적용에 있어서 화학적, 생화학적 또는 생물학적 반응을 수행하기 위해 요구되는 수행 시간에 적절한 온도에서 용액의 발열 및 유지를 위한, 워머(warmer), 또는 자율 열 팩(autonomous heat packs)의 사용에 관한 것이다.

Description

생물학적 반응을 촉진하기 위한 워머의 사용{USE OF A WARMER FOR PROMOTING A BIOLOGICAL REACTION}
본 발명은 분자 및 세포 생물학 키트의 분야에 관한 것이며, 상기 키트는 적당한 열 공급을 필요로 하는 화학 반응을 수행하기 위한 것이다. 본 발명의 대상은 생체 치료를 위한 수단으로써 간단하고 저렴한 자율 난방(autonomous heating)을 포함하는 특정 키트이다.
몇 년 동안, 세포, 특히 자가세포의 이식은 질환에 걸리거나 손상된 조직 재생을 촉진하기 위한 효과적이고 안정적인 수단으로써 필수적이었다. 특정한 치료 프로토콜은 재이식 전에 생체 외(in vitro)에서 세포의 확산 및/또는 조작을 필요로 한다. 다른 프로토콜은 필수적으로, 치료될 환부에 즉각적으로 재이식되는 관련 조직의 건강한 부분으로부터 세포를 채취해야 한다. 이것은 피부 질환 또는 특정한 화상(세포 확장을 필요로 하지 않는 범위에 있는), 외상 및 수술 후 색소감소(hypochromia), 무색피부병(achromatic dermatosis), 흉터 등과 같은 병변 치료를 위한 프로토콜로써 특별한 케이스이다. 이러한 프로토콜에서, 샘플의 치료는 본질적으로 의도한 용도(예를 들면 무색피부병을 위한 멜라닌 세포)를 위해 적절한 세포를 선택하기 위한 다양한 세포 타입의 분리 및 응집체를 제거하기 위한 여과를 통한 다소 세포의 완전한 분해가 된다. 세포의 분해는 보통 트립신(trypsin) 용액에서 샘플을 배양함으로써 수행된다. 트립신 활성을 위한 최적 온도는 37℃이다. 이 온도에서, 효소의 농도 및 원하는 분해의 정도에 따라, 문헌에 기재된 배양 시간은 50분 및 3시간 사이이다(Guerra et al., 2003; Mulekar, 2003; van Geel et al., 2004). 낮은 온도에서, 효소는 낮은 활성을 나타내며, 이는 동일한 날에 프로토콜의 모든 단계를 수행하기 위해서는 몇 시간 배양시간을 연장할 필요성이 있다(Gauthier and Surleve-Bazeille, 1992). 이러한 이유로, 이러한 프로토콜은 최근 인큐베이터를 포함한 기술 플랫폼을 가지는 구조에서 부분적으로 수행되며, 피부병학 관행에서 자주 쓰이는 케이스가 아니다.
인큐베이터를 구비하지 못한 의사들의 백반증(vitiligo)을 앓고 있는 환자 치료를 가능하게 하기 위해, Clinical Cell Culture 회사는 세포의 재이식을 위한 샘플링, 또한 배터리를 구비한 전기 가열 장치와 같은 모든 단계를 수행하기 위해 필요한 소모품을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 장비는 가격이 매우 비싸고 생태에 미치는 영향이 있다는 두 가지 주요 단점을 가지고 있다.
특히 ReCell®키트에서 본 발명은 효소의 활성을 위한 필요한 시간 및 기간 동안 적당한 온도로 효소 용액을 가열하고 유지하기 위한 워머(wamer)의 사용을 기반으로 하기 때문에 종래 기술의 해결책에 유리한 대안을 제공한다. 상기 용어 "워머(warmer)"는 물리적 또는 화학적 과정에 기초하는 작용이고, 또한 “magical heat packs” 또는 “autonomous heat packs”라고 하는 열을 방출할 수 있는 작은 물체를 지칭한다. 이는 일반적으로 추위에 노출된 손 또는 발을 따뜻하게 하기 위해 사용된다. 이하의 맥락에서 “워머(wamer)” 및 “열팩(heat pack)”은 구분 없이 사용된다. 물리적 과정에 기초한 워머의 예로는 과 냉각된 아세트산 나트륨 포화 용액을 포함하는 주머니로 구성된 재사용 가능한 워머로 제조될 수 있다. 액체 내부의 금속 디스크를 구부림으로 인해, 트리거 결정화(trigger crystallization)인 고체화 아세트산 결정이 생성되어 액체가 고체로 변한다. 이러한 위상의 변화는 녹는점(예를 들면, 20% 용액에서 54℃)에서 발생하기 때문에, 주머니의 고체화가 완료되면 가열된 주머니는 상온으로 냉각된다. 주머니가 냉각되었을 때, 상기 파우치를 매우 뜨거운 물에 담그어 둠으로써 (고체 상태가 된) 아세트산 나트륨을 액체 상태로 되돌릴 수 있다. 화학적 워머 또한 공기와 접촉하면 산화 반응으로 활성화되어 존재한다. 이는 오랜 시간 동안 유효하지만 (과냉각된 아세트산 나트륨 기반의 워머의 약 1시간과 비교하여 8시간 내지 60시간) 한번 만 사용할 수 있다.
Gauthier,　Y. and Surleve-Bazeille,　J.E. (1992) Autologous grafting with noncultured melanocytes: a simplified method for treatment of depigmented lesions. J Am Acad Dermatol, 26, 191-194. Guerra,　L., Primavera,　G., Raskovic,　D., Pellegrini,　G., Golisano,　O., Bondanza,　S., Paterna,　P., Sonego,　G., Gobello,　T., Atzori,　F., Piazza,　P., Luci,　A. and De　Luca,　M. (2003) Erbium:YAG laser and cultured epidermis in the surgical therapy of stable vitiligo. Arch Dermatol, 139, 1303-1310. Mulekar,　S.V. (2003) Melanocyte-keratinocyte cell transplantation for stable vitiligo. Int J Dermatol, 42, 132-136. van Geel,　N., Ongenae,　K., De Mil,　M., Haeghen,　Y.V., Vervaet,　C. and Naeyaert,　J.M. (2004) Double-blind placebo-controlled study of autologous transplanted epidermal cell suspensions for repigmenting vitiligo. Arch Dermatol, 140, 1203-1208.
본 발명자들은 워머에 배치한, 전형적인 페트리 디쉬와 같은 컨테이너에 넣은 용액은 몇 분 만에 트립신과 같은 수많은 효소의 활성에 최적화된 온도에 도달하였고, 적어도 15분에서 20분간 상기 온도로 유지시키는 것을 보여주었다(하기 실시예 1 및 3).
본 발명은 우선, 30 내지 40℃ 사이 온도에서 인큐베이션 하는 것을 요구하는 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응을 수행하는 방법과 관한 것이며, 발열 물리적(exothermic physical) 또는 화학적 과정에 기초한 작동을 하는 워머를 활성화시키는 단계를 포함하며, 반응과 관련된 시약이 담긴 컨테이너와 함께 워머를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 과정은 특히 생물학적, 의학적 또는 진단 응용의 맥락에서 유용하다.
본 과정의 특정 실시예에서, 워머를 컨테이너와 접촉시키는 단계는 워머를 위치시킴으로써 수행되며, 적어도 지지체의 공간 안에서 컨터이너의 하부는 상기 목적을 위해 제공된다. 상기 지지체는 우선, 워머의 컨터이너를 적절히 끼우는 것을 가능하게 하며 따라서 뾰족한 위험을 제한한다. 게다가, 낮은 열 전도율을 가지는 절연 지지체의 사용은 워머의 열 손실 제한을 가능하게 하며 가열될 용액에서 워머로의 열의 전달 촉진을 가능하게 한다. 바람직한 실시예에서, 공간의 깊이는 워머 및 컨테이너의 하부 배치하게 할 수 있다. 이러한 방식으로, 컨테이너는 적절히 워머에 끼워지게 되고, 미끄러질 위험이 없으며, 조작하는 사람이 잡기 쉽게 유지된다.
상기 공정에서, 워머의 사용 및, 절연 지지체는 적절히 요구되는 기간(수 분 내지 수십 분, 예를 들어 5, 10, 15, 18, 20분 또는 그 이상)에서 30 및 40℃의 생물학, 생화학적 또는 화학적 용액의 온도 유지를 가능하게 한다. 이러한 실험실 장비의 정교한 장치의 대체로써 생물학적(분자 또는 세포 생물학) 또는 화학적 공장을 수행하는, 야외 여가 활동(스키, 등산 등)을 위해 일반적으로 의도된 심플하고 저렴한 물질인 워머의 사용은 얻어진 결과의 품질을 손상시키지 않고 비용을 상당히 절감할 수 있기 때문에 놀라운 이점이 있다.
상기에서, "생물학적 반응"은 살아있는 세포(생검, 식물 세포, 효모 또는 박테리아로부터 유래한 동물 세포), 바이러스, 세포 소기관, 효소, 대사물 등과 같은 살아있는 것으로부터 유래한 요소에 관련된 어떠한 반응을 말한다. "생화학적 반응"은 살아있는 물질(효소, 당, 지질 등)의 화학적 반응에 관여하는 물질을 사용한다.
본 발명의 공정의 특정 실시예에 따르면, 컨테이너는 효소용액을 포함하며, 워머와 컨테이서 사이 접촉은 적어도 10분간 유지된다. 한 특정 실시예에 의하면, 워머는 세포 생물학 공정의 맥락에서 사용되며, 효소 용액은 예를 들어 조직 샘플이 해리되는 생검 유래 세포를 포함한다. 이러한 경우에서, 효소 용액은 예를 들어 트립신이다.
한 시간 미만의 인큐베이션을 요구하는 반응의 경우, 워머는 아세트산 나트륨 포화 수용액을 포함하는 밀폐 플라스틱 주머니로 구성된다. 그러나, 본 발명은 또한 장기간 인큐베이션을 가능하게 하는 화학적 워머로 사용될 수 있다.
본 발명의 과정의 특정 실시예에 따르면, 아세트산 나트륨을 함유하는 파우치 타입의 상기 워머는 두께가 3 및 7 mm, 바람직하게는 4 내지 6 mm이고, 직경이 7 및 11 cm, 바람직하게는 8 내지 10 cm인 디스크이며, 반응에 관련된 용액을 포함하는 용액은 부피가 3 및 10 ml 이며 직경이 7 및 11 cm, 바람직하게는 8 내지 10 cm사이, 또는 구획된 접시를 가지는 페트리 디쉬에 담긴다. 상기 "페트리 디쉬"는 뚜껑과 함께, 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 투명한 원통 모양의 얕은 접시를 의미한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 페트리 디쉬는 하나의 직경을 따라서 예를 들면 작은 벽에 의해 구획된다. 상기 특정 실시예의 맥락에 있어서 지지체의 사용은, 워머를 수용하기 위해 의도된 공동은 워머(7 및 11.5 cm) 보다 약간 큰 직경의 원형이며, 깊이는 5 및 20 mm이다.
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는, 갓 채취한 조직 샘플로부터 유래한 세포를 해리하는 공정에 관한 것이다:
(i) 아세트산 나트륨 포화 수용액을 포함하는 밀폐된 플라스틱 파우치로 구성된 워머에서 결정화(crystallization)를 개시하는 단계; 선택적으로, 상기 워머를 상기의 용도를 위해 지지체, 바람직하게는 절연성 지지체의 공동(cavity) 내에 구비하는 단계;
(ii) 상기 워머를 농도 0.2% 및 1%의 농도를 가지는 트립신(trypsin) 용액을 포함하는 컨테이너에 배치하는 단계;
(iii) 조직 샘플은 상기 용액에 배치하고, 적어도 10분, 바람직하게는 15 내지 20분간 배양(incubate) 하는 단계
(iv) 조직 샘플을 린스하는 단계.
물론, 본 과정의 실시 동안, 적절한 워머의 형상, 컨테이너의 형상 및, 절연 지지체의 공동 형상은 워머와 컨테이너 사이 변와의 큰 표면 영역에 있다는 것에 주의해야 한다. 한 특정 실시예에 의하면, 상기 워머는 디스크의 모양을 가지며, 컨테이너는 언급한 바와 같이 페트리 디쉬이다. 이 경우, 상기 두 요소의 직경은 바람직하게 유사하거나 거의 동일하다; 지지체가 사용되는 경우, 적어도 워머를 수용하기 위한 지지체의 공동은 또한 원형이며, 컨테이너 및 워머의 직경보다 약간 큰 지름을 가진다.
상기 방법에서, 단계 (iv)는 적절하게 선택되거나 억제제를 첨가함으로써 트립신을 억제하는 단계를 수행할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르는 공정의 적절한 하나의 실시예에 있어서, 트립신 억제제를 추가적으로 첨가하지 않고, 트립신의 활성을 중지시키기 충분하게 조직 샘플을 린스한다. 이것은 특히 세포와 함께 환자에 적용되는 물질의 수를 제한하는 것을 가능하게 한다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 환자의 피부에 적용하기 위한 적절한 세포 현탁액을 제조하기 위한 공정에 관한 것이다;
(i) 환자에게 이식하기 적합한 세포를 포함하는 피부 조직 샘플 상에 상기 해리 공정을 수행한다;
(ii) 피부 샘플 유래의 적합한 세포를 수합하고 이를 용액에 현탁한다; 적절한 경우, 상기 단계는 샘플로부터 특정 세포를 분리 및/또는 정렬하는 중간 단계를 필요로 한다; 및
(iii) 상기 단계 (ii)에서 얻은 용액을 세포 체(cell sieve)에서 여과한다.
한 특정 실시예에 따르면, 상기 공정은 상기 단계 (iii)에서 얻은 세포 현탁액에 히알루론산을 첨가하는 추가적인 단계를 포함한다. 상기 단계는 상처 하부에 쉽게 적용할 수 있는 점성 혼합물을 얻을 수 있다. 또한, 히알루론산은 세포 생존을 촉진한다.
상기 공정의 하나의 특정 적용은 백반증의 치료이다; 본 적용에서, 세포는 적어도 멜라닌형성세포(melanocyte)를 포함하는 상기 단계 (ii)에서 회복된다.
본 발명은 또한 생물학적 응용(세포 생물학 키트 및/또는 분자 생물학 키드)을 위한 키트에 관한 것으로, 발열 물리적 또는 화학적 과정에 기초가 되는 작용인 워머를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 키트의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 워머는 과냉각 아세트산 나트륨 포화 수용액을 포함하는 밀폐된 플라스틱 주머니로 구성된다.
본 발명의 키트의 바람직한 하나의 실시예에 따르면, 상기 키트는 워머를 수용하기 위한 공동으로 구성된 지지체를 포함한다. 상기 지지체는, 예를 들어, 두께가 5 및 35 mm 사이인 열적 발열 물질의 플레이트이며, 여기서 상기 워머를 수용하기 위한 공동은 깊이가 5 및 25 mm 사이이다. 상기 지지체는 또한 얇은 플레이드(예를 들면 1 mm 두께), 구부러지거나 중공 지지체(hollow support)를 형성하기 위해 조립된 것으로 구성된다. 바람직하게는, 지지체에 사용된 물질은 20℃에서 0.4　W.m-1.K-1보다 작거나 같은 열전도율 λ을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 이러한 열전도율은 0.15　W.m-1.K-1보다 작거나, 또는 0.08　W.m-1.K-1보다 작거나 또는 0.04　W.m-1.K-1보다 작거나 같다. 사용 가능한 물질의 비 제한적인 예로써, 나무로 만들어진 것(합판 λ= 0.11　W.m-1.K-1), 판지(λ= 0.07　W.m-1.K-1), 코르크(λ=　0.04　W.m-1.K-1), PVC(λ= 0.2　W.m-1.K-1), 폴리프로필렌(λ= 0.1에서 0.22　W.m-1.K-1), 경질 폴리우레탄 폼(λ= 0.025) 및 팽창된 폴리스티렌(λ= 0.036)을 언급할 수 있다. 키트의 구상 용도에 따라, 지지체의 절연 특성은 다소 중요하다. 예를 들어, 피부과 적용에 있어서, 상기와 같은 과정의 방법에 의한 세포 현탁액을 제조하기 위한 키트, 키트가 허용하는 일반적인 최소 온도는 18℃이기 때문에 지지체의 절연 특성은 부차적이고, 트립신과 함께 세포 샘플의 인큐베이션 시간은 길지 않다. 한편, 특정 적용은 고열 조건을 부과 및/또는 30 및 40℃ 사이의 온도에서 긴 인큐베이션 시간을 필요로 할 수 있다. 이러한 경우에는, 오랜 시간 동안 컨테이너 안에서 온도를 유지할 수 있는 적절하게 뚜껑이 보충될 수 있는 절연성 지지체를 사용하는 것이 중요하다. 30 및 40℃ 사이에서 한 시간 이상의 인큐베이션을 요구하는 응용의 비 제한적인 예로, 연골 세포(chondrocyte)를 분리하기 위한 연골(cartilage)의 효소 분해; 생식 세포(germ cell)를 분리하기 위한 고환 생검(testicular biopsy)의 분해; 췌장 조직 생검으로부터 랑게르한스섬(islets of Langerhans)을 획득; 섬유아세포를 분리하기 위한 진피의 분해; 및 치은 섬유아세포를 분리하기 위한 치은 생검(gingival biopsy)의 분해를 언급할 수 있다.
본 발명의 또한 워머 및, 효율적인 열 교환을 허용하기 위한 지지체의 공동의 같은 형상을 기본으로 하는 컨테이너를 포함한다. 예를 들어, 상기 워머는 3 및 7 mm, 바람직하게는 4 내지 6 mm이고, 직경은 7 및 11 cm, 바람직하게는 8 내지 10 cm인 디스크일 수 있으며, 상기의 경우, 컨테이너는 바람직하게는 워머와 거의 같은 직경을 가지는 것이 바람직하고, 만약 지지체가 존재한다면 워머를 수용하는 공동은 원형이고 워머의 직경보다 약간 크다.
본 발명의 키트는 효소, 예를 들면 트립신을 포함한다. 이와 같은 키트는, 예를 들면, 생검의 처리를 위해, 및 특히 상기 생검의 세포를 해리하기에 필요한 수단을 포함하기 위해 고안된다. 하나의 특정 실시예에 따르면, 상기 키트는 직경이 워머와 거의 동일한 구획이 분할된 페트리 디쉬, 세포 체(cell sieve), 및 트립신(동결건조된 형태 또는 용액)을 포함한다.
하기의 실시예 및 도면들은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 예시한다.
도 1: 페트리 디쉬와 직경이 거의 같은 디스크 모양을 가지는, 20℃의 실온에서 40 분 동안 초산 나트륨(sodium acetate) 워머에 배치한 직경 9cm의 페트리디쉬에서 완충용액의 온도 변화.
도 2: 지지체 및 열 팩(워머)를 포함하는 장비의 사진.
1: 열팩;
2: 지지체;
3: 열 팩에 배치된 구획된 디쉬.
도 3: 지지체 없이 시간 함수에 따른 온도의 변화.
도 4: 지지체 V2와 함께 시간 함수에 따른 온도의 변화.
도 5: 지지체 V3과 함께 시간 함수에 따른 온도의 변화
도 6: 시간 함수에 따른 온도의 변화(지지체 없이 및, 지지체 V2 또는 V3의 비교)
실시예 1 : 워머에 배치된 페트리 디쉬 상의 배지의 온도
페트리 디쉬의 직경과 거의 일치하고 두께는 4 및 6 mm인 디스크의 모양을 가지는, 소듐 아세테이트(sodium acetate) 워머에 배치된, 직경이 9 cm인 페트리 디쉬 상의 (버퍼) 용액의 온도를 측정하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 온도는 몇 분 안에 30℃까지 도달하는 매우 급격한 증가를 보였다. 온도는 거의 20분 이상 30 및 40℃ 사이를 유지하였다.
이러한 결과의 재현성은 양호하였다.
실시예 2 : 멜라닌 형성 세포( melanocytes )의 자가 이식에 의한 백반증의 치료에 있어서, 피부 표피 분리( dermo - epidermal separation )에의 적용
얇은 피부 생검(0.2　mm-0.3　mm)을 이용하여, 상처의 바닥은 자가 세포로 도말하였다.
세포 현탁액은 주로, 랑게르한스 세포(Langerhans cells), 멜라닌 형성 세포 및 섬유아세포 뿐만 아니라 기저 각질 세포로 혼합 구성된 이식물의 분해 후 얻는다.
사용된 재료
상기 실시예 1에 개시된 워머 및 일회용 키트는, 효소 및 적용 용액, 두 공간으로 구획된 페트리 디쉬를 포함한 멸균 장비와 같은 보조 요소 및 장비로 구성된다.
프로토콜
무균의 외과 분야 상태로 준비하였다.
수행 시, 상기 키트는 사용시까지 4℃에서 저장된다. 상기 키트는 사용하기 전 상온에서 10분간 유지시킨다.
효소 용액의 조제 및 발열
● 5 ml의 주사기와 바늘을 이용하여, PBS 용액 5 ml을 취하여 동결건조된 트립신에 주입한다. 재생된 용액을 취하기 전에 두 공간으로 구획된 페트리 디쉬의 한 공간에 완전히 균질화 시킨다.
● 금속판을 구김으로 인해 순간적으로 열 팩(heat pack)을 활성화 시킨다; 순간적인 결정 고체화.
● 활성화된 열 팩에 두 공간으로 구획된 페트리 디쉬를 위치시키고 5분간 기다린다.
피부 샘플의 채취
채취하려는 샘플의 영역은 수술용 펠트 팁 펜(surgical felt tip pen)으로 구분하고, 알코올 용액에 녹아있는 0.5% chlorhexidine으로 소독하고, 2% xylocaine로 마취한다. 4　cm2의 최소 면적 및 0.2-0.3　mm의 두께를 가지는 피부의 얇은 스트립을 피절한다.
피부 표피 분리(dermo-epidermal separation; DES)의 수행
● 무균 핀셋을 사용하여, 0.4%의 트립신 용액을 포함하는 페트리 디쉬 구획된 공간으로 생검을 옮긴다.
● 15분간 인큐베이트 한다.
● 상기 생검을 린스한다.
- 5 ml의 주사기와 바늘로 5 ml의 PBS 용액을 취하고 페트리 디쉬의 두번째 구역에 놓는다.
- 인큐베이션이 끝난 후, 멸균된 핀셋을 사용하여 PBS로 빠른 린스 작업과 함께 두번째 구역으로 생검을 옮긴다.
● 멸균된 핀셋을 사용하여, 위로 향한 피부 표피 접합체의 방향을 유지하는데 주의하면서, 페트리 디쉬의 뚜껑 내부로 생검을 배치한다.
● 핀셋을 이용하여, 두 조각을 분리한다.
세포 현탁액의 제조
● 두번째 5 ml의 주사기와 바늘을 이용하여, 1.5 ml의 PBS를 취하고 생검 조각에 배치시키고, 매스를 이용하여 접합체 표면으로부터 세포를 긁어서 세포의 혼합물을 생성하도록 표피 부분을 거칠게 자른다.
● 피부 부분을 옆으로 고정한다.
● 세포 현탁액을 생성하도록 5 ml 주사기를 이용하여 전체 부피를 흡입하도록 페트리 디쉬를 기울이고 수회 흡입을 반복한다.
세포 여과
● 빨간 캡과 함께 그릇에 배치된 체(sieve) 안으로 세포 현탁액을 옮긴다.
히알루론산(hyaluronic acid)에서 세포 현탁액의 제조
● 체를 제거한다.
● 여과된 세포 현탁액을 포함하는 빨간 캡과 함께 그릇 안에 있는 주사기(1.5 ml)에 포함된 히알루론산을 배치한다.
● 주사기를 사용하여 히알루론산 및 세포 현탁액을 점성을 가지지만 균질하게 섞는다.
● 이렇게 제조된 현탁액은 상처 바닥에 주사기로 증착시킬 준비가 되어 있다.
결과
상기 프로토콜은 세 번의 다른 피부 샘플로, 두 개의 트립신 농도(0.4% 및 0.8%)를 사용하여 수행되었다.
얻어진 결과는 하기 표 1에 요약하였다.
식별 트립신 농도 분리된 세포의 수 ×106/cm2 세포 생존률(%) 클로닝 효율 측정 유동세포계측법에 의한 멜라닌 세포의 존재
생검1 0.40% 1.2 95.00% 3.40% > 0.1%
0.80% 1.2 97.00% 3.40% > 0.1%
생검 2 0.40% 3.4 98.00% 3.30% > 0.1%
0.80% 2.3 97.00% 3.80% > 0.1%
생검 3 0.40% 4.2 97.40% 4.60% > 0.1%
0.80% 3.9 99.40% 4.50% > 0.1%
트립신 농도
활성 물질을 수득하기 위한 공정은 van Geel et al. (van Geel et al., 2004)에 의해 기재된 기술에서 채택하였다.
트립신 용액의 농도는 최적화되었다(0.25% 트립신/0.08% EDTA 대신에0.4% 또는 0.8% 트립신). van Geel et al.에 기술된 기술과는 달리, 생성물의 생산에 사용되는 생물학적 기원의 생성물을 감소시키기 위해서, 트립신의 저해는 fetal calf serum type의 억제제를 첨가하여서 일어난 것이 아니라 PBS로 린스하였기 때문이다. 세포 생존률은 트립신 저해 모드 후에 확인하였다.
세포 생존률
세포 생존률은 종래의 세포 배양 기술에 따라 수행하였다: 트립판 블루 배제 시험(trypan blue exclusion test). 트립판 블루 및 세포 현탁액의 부피 대 부피 희석은 용혈 튜브에서 수행되었다. 1 내지 2분의 접촉 후, 상기 혼합물은 세포 카운팅에 슬라이드 및 커버슬립 사이에서 마이크로 피펫으로 증착하였다. 죽은 세포는 블루로 염색되고, 살아있는 세포는 염색되지 않으며, 위상차 광학 현미경으로 계수하였다.
세포 생존률은 표피 세포(90% 이상)의 분리 후 매우 충분하였다.
배양액에 되돌려 놓은 세포의 동태 및 클로닝 효율은 하나의 생검에서 균일하였고, 세포를 포함하는 세포 현탁액은 트립신 처리 후 증식할 수 있는 세포를 포함하는 것으로 나타났다.
생검의 분리된 세포/ cm 2 의 수
계산은 상술한 시험 결과에 기초하여 실시하였다.
분리된 세포의 수는 하나로부터 다른 하나로 시험 생검의 사이즈에 따라 다양하지만, 세포 수율/cm2는 은 비교적 일정하였다. 최종 현탁액의 세포 밀도는 시험 생검의 크기에 크게 의존하였다.
클로닝 효율 시험( Cloning efficiency test ; CFE )
클로닝 효율 비율은 콜로니의 형성 및 부착이 가능한 세포의 수를 측정할 수 있게 한다. 표피 세포의 알려진 양은 3 T25　cm2 플라스크에 분주되었다. 14일의 배양 후, 클론이 충분히 크지 않지만 합류되지는 않았으며, 플라스크는 크리스탈 바이올렛(10% formaldehyde/0.5% crystal violet, qs distilled water)으로 염색되었다. 클로닝 효율은 T25　cm2 당 도말된 세포의 수에 대해 T25　cm2 flask X 100당 콜로니의 총 수의 평균 비율을 생성함으로써 산출하였다.
배양액에 되돌려진 후 세포의 동태 및 클로닝 효울은 하나의 생검에서 다른 하나로 일정하였으며, 세포 현탁액은 트립신 처리 후 증식할 수 있는 세포를 포함하였다.
유동 세포 계측법에 의한 세포 현탁액에서 멜라닌 형성 세포의 함량
PBS-1% BSA(bovine serum albumin)-0.5% triton의 용액에서 세포막은 투과가능하였다. 정상 멜라닌 세포에 특이적인 일차 항체(NKI/beteb antibody)를 인큐베이션 한 다음, PBS-1% BSA로 린스하였다. 두번째 항체()를 인큐베이션 한 다음 PBS-1% BSA로 린스하였다. 표지화된 세포는 PBS에 용해하여 FACS-SCAN를 통해 통과시켰다.
표피 현탁액에서 얻어진 멜라닌형성세포/켈틴생성세포 비율은 Guerra et al. (1:30 및 1:200 사이) (Guerra et al., 2003)에 의해 견주어 산출하였다.
여기서 설명된 과정에서, 분리된 표피 세포는 배양액에 배치되지 않고, 전체 과정은 하루만에 수행하였다(최종 산물 및 배양되지 않은 자가 표피 세포의 이식의 생산물인 생검).
실시예 3 : 워머를 이용한 배지의 온도의 증가 최적화 및 유지를 위한 절연 지지체의 사용
3.1 재료 및 방법
재료 및 시약
● EC 표지된 PVC 열 팩(워머)
● 90 mm직경의 원형 공동을 가지는 총 두께 15 mm의 지지체를 얻기 위해 절접한 1 내지 2 mm 두께의 폴리프로필렌 시트로 구성된 지지체를 배치하였다(도 2).
● 구획된 페트리 디쉬(ref. Dutscher 020012)
● 온도 프로브(thermobouton)는 ThermoTrack V4 및/또는 A BT 529 software를 이용하여 조작하였다.
방법
상온에서 20분간 정치시킨 4℃에 보관된 PBS의 6 mL를 매 분마다 온도를 측정하기 위해 thermobouton 프로브(온도 변화를 기록하는 장치)가 배치된 직경 90 mm의 페트리 디쉬의 하나의 구획에 배치시켰다. 상기 페트리 디쉬는 뚜껑으로 덮었다.
상기 thermobouton 프로브는 배지와 접촉하고, 열 팩의 활성화 후, 용액 안에서 온도의 변화를 직접적으로 측정 가능하게 한다. 실험은 지지체의 원형 공동에 열 팩 및 페트리 디쉬를 배치하거나 배치하지 않고 수행하였다(도 2). 세개의 다른 지지체를 시험하였다. 이들은 워머 및 페트리 디쉬를 수용하기 위한 원형 공동의 다소 중심 위치에서 다르다.
각 조건은 다른 온도 프로브를 이용하여 5-6회 시험 되었다. 온도 측정은 20분간 측정하였다. 온도의 평균은 이 기간 동안 기록된 모든 값에 대해 계산하였다.
지지체와 함께 또는 지지체 없이 배지에서 측정된 온도의 통계적 분석은 student's t test를 이용하여 수행하였다.
3.2 결과
지지체 없는 열 팩에서 배지의 온도 변화
배지에 고정된 온도 프로브에 의해 수집된 온도 데이터는 도 3에 도식화 하였다. 6번의 평균 온도는 35.5℃이며 표준편차는 3.9℃였다.
이러한 결과는 지지체 없이 다양한 워머의 온도 재현성을 보여준다.
지지체 상의 열 팩에서 배지의 온도 변화
두 개의 지지체(prototypes V2 및 V3)를 시험하였다. 이들은 워머를 수용하는 원형 공동의 위치의 관점에서 달랐다. 지지체 V3에서 공동은 워머에 배치된 구분된 페트리 디쉬에서 온도의 증가 및 유지를 최적화하기 위해 온도를 지지체 내로 균일하게 허용하면서 중앙화 하였다.
배지에 고정된 온도 프로브에 의해 20분 동안 수집된 온도 데이터는 도 4(지지체 V2), 도 5(지지체 V3) 및 도 6(지지체 없이 얻은 온도 및 두 개의 지지체의 비교)에 도식화하였으며, 하기 표 2에 요약하였다.
>35℃*의 온도가 유지되는 시간 최대 도달 온도 최대 온도에 도달하는 시간 6번 시험의 온도 평균
지지체 없이 실험 18 min 39.5°C 9 min 35.5°C ± 3.9°C
지지체V2 18 min 40.5°C 6 min 36.7°C ± 3.6°C
지지체V3 18 min 40°C 9 min 36.3°C ± 1°C
*: 21분의 총 시험시간을 통해 얻은 시간 주기
이러한 결과는 아래를 보여준다:
● 워머 간의 재현성
● 지지체에 배치된 워머에서 최고 온도에 도달한다(V2와의 차이 1.1? 및 V3과의 차이 0.8?);
● 지지체와 함께 또는 없이, 구획된 페트리 디쉬를 포함한 배지는 적어도 18분간 35℃ 이상의 온도를 유지하였다;
● 지지체와 함께, 39.5℃의 최고 온도는 9분 안에 도달하고, 반면에 지지체 V2와 함께 40.5℃까지 6분 안에 도달한다.
관찰된 차이가 통계적으로 유의한지 확인하기 위해, V3 지지체를 이용하여 얻어진 값으로 student? t test분석을 통해 통계적 분석을 수행하였다. 상기 시험은 지지체 없이 및 지지체 V3을 통해 얻은 온도에서 유의하게 차이가 있음을 보여줌으로써 0.03　<　0.05의 확률을 나타낸다(표 3). 지지체 V3은 보다 빠르고 보다 재현성 있게 지지체 없는 것보다 높은 평균의 온도를 얻게 할 수 있다(s.d.±1℃).
지지체 없는 것의 평균 지지체와 함께 한 것의 평균
35.4 35.9
35.9 35.7
35.7 36.9
35.3 36.3
35.3 36.8
35.6 NA
평균 35.5 36.32
t 0.03
지지체는 이들의 온도 증가 및/또는 유지시키는데 최적화할 수 있도록 한다.
실시예 2에 개시된 표피 현탁액을 제조하기 위한 방법에 따라 피부 표피 박리를 생산하기 위해 얇은 피부 생검의 효소 분해 동안 VitiCell®kit의 지지체의 사용은 보다 빠르고 높은 평균 온도를 얻을 수 있게 한다. 상기 지지체는 이중 장점을 갖는다: 작동되는 판 및 열 팩의 온도 증가의 최적화

Claims (15)

  1. 발열 물리적(exothermic physical) 또는 화학적 과정을 기반으로 하는 워머(warmer)를 활성화시키는 단계, 및 상기 워머를 반응과 관련된 시약이 포함된 컨테이너에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 30 및 40℃ 사이의 온도에서 인큐베이션을 필요로 하는 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응을 수행하기 위한 공정.
  2. 제 1항에 있어서, 워머를 컨터이너에 접촉시키는 단계는 워머와 이러한 목적을 위해 제공되는 지지체의 공동(cavity)안에 컨터이너의 적어도 하부(lower part)를 배치시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 공정.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 컨테이너는 효소 용액을 포함하고 워머 및 컨테이너 간의 접촉은 적어도 10분으로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
  4. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 워머는 아세트산 나트륨 포화 수용액(sodium acetate-saturated aqueous solution)을 포함하는 밀폐형 플라스틱 주머니로 구성된 것을 특징으로 하는 공정.
  5. 제 4항에 있어서, 반응에 관한 시약을 포함하는 상기 용액의 부피는 3 및 10 ml사이이며, 상기 용액을 포함하는 컨테이너는 직경 7 및 11 cm 을 가지거나 상기 디쉬의 구획 및 그 안의 워머가 3 및 7 mm사이의 두께 및 7 및 11 cm 사이의 직경을 가지는 디스크인 것을 특징으로 하는 공정.
  6. 제 2항 및 제 5항에 있어서, 상기 워머를 수용하기 위한 지지체의 공동은 직경 7 및 11.5 cm, 및 깊이 5 및 20 mm인 원형인 것을 특징으로 하는 공정.
  7. 제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 단계를 포함하는 조직 샘플 유래 세포를 해리하기 위한 공정:
    (i) 아세트산 나트륨 포화 수용액을 함유하는 밀폐형 플라스틱 주머니로 구성된 워머에서 결정화를 시작하는 단계;
    (ii) 상기 워머에 농도 0.2% 및 1%의 트립신 용액을 포함하는 컨테이너를 배치시키는 단계;
    (iii) 상기 용액 상의 조직 샘플을 배치시키고 적어도 10분간 배양하는 단계;
    (iv) 조직 샘플을 린스하는 단계.
  8. 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 단계를 포함하는 환자의 피부에 적절히 적용하기 위해 세포 현탁액을 제조하기 위한 공정:
    (i) 제 7항의 공정에서, 환자에 이식하기 적절한 세포를 포함하는 피부 조직 샘플을 만드는 단계;
    (ii) 피부 샘플로부터 유래한 적절한 세포를 수합하고 이를 용액에 현탁하는 단계; 및
    (iii) 상기 단계 (ii)에서 얻은 용액을 세포 체(cell sieve)에 여과하는 단계.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 단계 (iii)에서 얻은 세포 현탁액에 히알루론산(hyaluronic acid)을 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는 공정.
  10. 제 8항 및 제 9항에 있어서, 백반증 치료를 위해 상기 단계 (ii)에서 멜라닌 형성 세포(melanocytes)가 복원되는 것을 특징으로 하는 공정.
  11. 발열 물리적 또는 화학 공정을 기초로 하여 작동되는 워머를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 응용 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 워머는 과냉각된(super cooled) 아세트산 나트륨 포화 수용액을 함유하는 밀폐형 플라스틱 주머니로 구성된 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 워머를 수용하기 위한 공동(cavity)을 가지는 지지체를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 워머와 동일한 형상을 가지는 것을 기초로 하는, 컨테이너를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 효소를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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