TR2022015865A2 - Ölü organi̇zmalardan alinan kemi̇k i̇li̇ği̇ mezanki̇mal kök hücreleri̇ni̇n ci̇vci̇v koryoallantoyi̇k membrane (cam) modeli̇nde üreti̇mi̇ - Google Patents

Abstract

ÖZET ÖLÜ ORGANİZMALARDAN ALINAN KEMİK İLİĞİ MEZANKİMAL KÖK HÜCRELERİNİN CİVCİV KORYOALLANTOYİK MEMBRANE (CAM) MODELİNDE ÜRETİMİ Mevcut buluş, bir teknik prosedür olup ölü organizmadan alınan kemik iliği dokularından mezankimal kemik iliği kök hücre izolasyonunu ve izole edilen mezankimal kök hücrelerin embriyonik tavuk yumurtasında kültüvasyonunu içermektedir.Bu özelliğiyle önerilen prosedür, ölü organizmaların kemik iliği kök hücrelerinin çoğaltılmasını gerçekleştirmesi ile uluslararası alanda uygulanan diğer CAM modellerinden farklılık gösterir. Prosedür ucuz ve etkili olup ,geleceğin en önemli tedavi yöntemlerinden biri olan kök hücre araştırmalarında kolaylık sağlayacaktır. Embriyonik tavuk yumurtalarında yer alan civciv koryoallantoik membran (CAM) , yoğun kılcal ağ damarı içermesi nedeniyle farklı dokuların kültüvasyonunda mükemmel bir besin kaynağı sunar. Günümüzde kök hücreler, laboratuvar koşullarında özel bir seçilim yapılmaksızın kemik iliği santrifüjü ile elde edilebileceği gibi, özel hücre kültürlerinde de üretilebilmektedirler. Kültürde üretilen kök hücrelerin maliyetinin yüksek oluşu, kültür için gerekli olan zamanın uzun olması, enfeksiyon riski ve hücrelerin canlılıklarını yitirme ihtimali nedeniyle özel standartlara sahip laboratuvarlar gerektiren bu işlemin uygulanması hem pahalıdır hem de teknik zorluklar içerir. Bu nedenlerden dolayı, kök hücre üretimi ve farklılaşması hakkında yeni farklı prosedürlerin geliştirilmesi gereği önemlilik arz etmektedir. Patenti önerilen teknik prosedür, kadavradan alınan kemik iliği kök hücre dokusu (1) , 10 mL DMEM (2), Santrifüj makinası (3), 1 mL steril PBS (4), Neubauer lamı (5), Tripan blue solüsyonu (6), Işık mikroskobu (7), Ependorf tüpü (8), Leghorn Hen cinsi döllenmiş tavuk yumurtası (9), Işıldak (10), İnce uçlu raptiye (11),Hava pompası (12), Kuluçka makinesi (13) kullanımını içeren işlem basamaklarını kapsar.Mezankimal kök hücre ekiminin yapıldığı inkübasyonun 2. gününde CAM yüzeyinde; mezankimal kök hücre yoğunluğunun arttığı, mezankimal kök hücrelerin bir kısmınında yağ dokuya dönüştüğü gözlenmiştir. Kültüvasyonun ilk gününde kütlece yüzde artışın, ikinci ve üçüncü güne daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. İkinci günün sonunda kütlece yüzde artış %33, üçüncü günün sonunda ise %25 olarak hesaplanmıştır. Ağırlıkça artış miktarı, mezankimal kök hücre inokulasyonunda başarılı yumurta örnekleri üzerinde elde edilen veriler kıyaslanmış, bulgular birbirleriyle uyumluluk göstermiştir.

Description

TARIFNAME ÖLÜ ORGANIZMALARDAN ALINAN KE_M_IK ILIGI CIVCIV KORYOALLANTOYIK MEMBRANE (CAM) MODELINDE URETIMI Kimyasal ve Biyolojik Alan: Mevcut bulus ,bir teknik prosedür olup, ölmüs hayvanlarin kemik iligi kök hücrelerinin, Leghorn tipi döllenmis tavuk yumurtalarinda kültüvasyonunu gerçeklestiren deney asamalarini içermektedir. Prosedür ucuz ve etkili olup ,gelecegin en önemli tedavi yöntemlerinden biri olan kök hücre arastirmalarinda kolaylik saglayacak,bu yöndeki teknik prosedürlerin gelisimine ön ayak olacaktir. Embriyonik tavuk yumurtalarinda yer alan civciv koryoallantoik membran (CAM) , yogun kilcal ag damari içermesi nedeniyle farkli dokularin kültüvasyonunda mükemmel bir besin kaynagi sunabilir. Kök Hücre üretimi prosedürlerinin Bilinen Durumu: Günümüzde kök hücreler, laboratuvar kosullarinda özel bir seçilim yapilmaksizin kemik iligi santrifüjü ile elde edilebilecegi gibi, özel hücre kültürlerinde de üretilebilmektedirler. Kültürde üretilen kök hücrelerin maliyetinin yüksek olusu, kültür için gerekli olan zamanin uzun olmasi, enfeksiyon riski ve hücrelerin canliliklarini yitirme ihtimali nedeniyle özel standartlara sahip laboratuvarlar gerektiren bu islemin uygulanmasi hem pahalidir hem de teknik zorluklar içerir. Bu nedenlerden dolayi, kök hücre üretimi ve farklilasmasi hakkinda yeni farkli prosedürlerin gelistirilmesi geregi önemlilik arz etmektedir. Döllenmis tavuk yumurtalari, yüksek oranda vaskülarize ekstraembriyonik koryoallantoik zari (CAM) içerir. Bu çalisma, civciv embriyosu koryoallantoik zari, (CAM) kuzu kemik iligi mezankimal ve hemotopoetik kök hücre gelisimini incelemek için, bir biyoreaktör olarak kullanilip kullanilamayacagi yönündeki hipotezin geçerliligini arastirmaktadir. Bu yöntem diger hücre kültür yöntemlerine kiyasla basit, kolay erisilebilir ve ucuz bir yöntem sunabilir.Önerilen patent kuzu ve dana kemik iliginden izole edilen mezankimal kök hücrelerin üretim asamasinda, CAM'in uygulanmasini,prosedür adimlarini özetlemektedir. Farkim ne? Günümüzde hücre temelli tedaviler, bilimsel ve tibbi topluluklarda büyük ilgi uyandirmis özellikle kök hücreler, rejeneratif tip, ilaç taramasi ve diger biyomedikal uygulamalar için çok çekici hale gelmistir. Bu özellesmemis hücreler, sinirsiz kendini yenileme kapasitesiyle; kan hücreleri, sinir hücreleri veya kalp kasi gibi özel islevlere sahip, olgun hücreler üretme konusunda olaganüstü bir yetenege sahiptir. Özellikle kök hücrelerin yogun rejenerasyon ve differansiyasyon kapasitesinin ortaya çikmasi doku mühendisligi ve hücresel tedavilerde bu hücrelerin uzun süre ilk tercih edilecek hücreler olacagina isaret etmektedir. Ancak, mevcut donörlerden elde edilebilecek gerçek hücre sayisi çok düsüktür. Çesitli uygulamalar için ilgili sayida hücrenin üretilmesi için olasi bir çözüm, bu hücrelerin kültür yöntemlerinin gelistirilmesi ve genisletilmesidir. (Borys ve ark., 2020) Bulus, diger prosedürlerden farkli olarak ölü organizmalardan alinan kemik iligi kök hücrelerinin CAM üzerinde üretim sürecini içerdigi için farklilik sunar. Bu alanda yapilan ilk çalisma arasinda gösterilebilinir. Sekillerin Açiklamasi Sekil 1- En az yedi günlük döllenmis Leghorn Hen cinsi tipi tavuk yumurtasina (1) ölmüs bir hayvandan alinan kemik iligi kök hücre dokusunun (6) asilanmasini göstermekte dir. Koryoallantoik CAM modelini sematize etmektedir. Referanslar: Teknik prosedür içeriginde , embriyonik Leghorn Hen cinsi tavuk yumurtasi (1); Kuluçka makinesi (2) Santrifüj makinasi (3), 10 mL DMEM (4), 1 mL steril gentamycin antibiyotigi (5), Ölmüs bir hayvandan alinan kemik iligi kök hücre dokusu (6), hava pompasi (7) ,isildak (8), ependorf tüpleri (9) ince uçlu raptiye (10) laboratuvar ekipmani ve malzeme listesinin kullanimini içeren islem basamaklari kapsar. 1. Ölmüs bir hayvandan alinan kemik iligi kök hücre dokusu (1) 2. 10 mL DMEM (2), 3. Santrifüj makinasi (3), 4. 1 mL steril PES (4), . Neubauer lami (5), 6. Tripan blue solüsyonu (6), 7. Isik mikroskobu (7), 8. Ependorf tüpü (8), 9. Leghorn Hen cinsi döllenmis tavuk yumurtasi (9), . Isildak (10), 11. Ince uçlu raptiye (11), 12. Hava pompasi (12), 13. Kuluçka makinesi (13) Bulusun Açiklanmasi: Hayvan Deneyleri Etik Kurullari Çalisma Usul ve Esaslarina Dair Yönetmelik, Madde 4-d kapsaminda deney hayvani tanimina giren herhangi bir organizmanin kullanilacak olmasi durumunda,ilgili yönetmelik geregi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kuruluna danisilmis, etik kurul izin belgesi ile ilgili gerekli bilgi temin edilmistir. (HADYEK) e göre, kuluçka süresi 21 gün olan tavuk yumurtalarinin bilimsel süreçlerde kullanimina iliskin olarak, embriyonun 1. gününden 14. gününe kadar olan prosedürler için (kuluçka döneminin ilk üçte ikisi )etik kurul beyanina gerek duyulmadigi ,l4.günden sonra gerçeklestirilecek çalismalar için etik kurul izin belgesinin gerekliligini beyan etmektedir.Bu nedenle projede yapilan tüm çalismalar,embriyonik tavuk yumurtasinda damarlanmanin basladigi 7. gün ile 13. gün arasinda sinirlandirilmistir. Mezbahadan alinan kuzu kaval kemikleri %70 etanol ile iyice temizlendi steril temiz bir tezgâha alindi. Kemik ucu bas kisminin alt bölgesinden kesildi. Kemik iligini açiga çikarmak için, her iki taraftaki kemigin içi bosaltildi. Kemik iligi steril bir cam pipeti ile toplanarak 10 mL DMEM içeren ortama aktarildi. Kemik iliginin beyaz olan yag dokusundan olabildigince az örnek alinmasina dikkat edildi. Tek düze hücre süspansiyonu elde etmek için, 5 mL,lik genis çapli cam pipet kullanilarak kitle parçalandi. RBC dahil kan hücrelerini çökeltmek amaciyla tüm içerik 1200 rpm'de 5 dakika süreyle santrifüjlendi Süpernatant atildi. Pellet olan hücre kütlesi tekrar parçalandi. Pellet 1 mL steril gentamycin-PBS(% 10 gentamycin içeren PBS) yukari ve asagi pipetleme ve ardindan 4 mL gentamycin-PBS ilavesi ile 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj islemi yeniden gerçeklestirildi. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant uzaklastirildi.Istege bagli olarak yikama adimi yukarida açiklandigi gibi tekrarlanabilir. Neubauer lami kullanilarak hücre sayimi ve hücre fizibilite dogrulamasi yapildi. Yasayan hücre sayisi, tripan blue solüsyonu (GIBCO® Invitrogen Corporation) kullanilarak hesaplandi. Bu hücre süspansiyonu, bir Pasteur pipetinin yardimiyla Neubauer lamina aktarildi ve daha sonra, mavi lekelenme gösteren hücreler (uygun olmayan ölü hücreler) hariç olmak üzere, hücreler sayildi. Hücre sayisini hesaplamak için asagidaki denklem kullanildi: NC X D X 104 / # Q, burada NC = sayilan yasayan hücre sayisi; D = örnek seyreltme (10) ve # Q = hücreleri saymak için Neubauer lamindaki kare sayisi olup elde edilen veriler grafige aktarildi. (Bittencouit ve ark, 2016) Kemik iliginden izole edilen kök hücre topluluklari 5mm, 6mm, 7mm,lik küçük parçalara ayrildi parçalarin uzunluk ve genislikleri bir cetvel yardimiyla ölçüldü. Ilk agirliklari tartildi. DMEM çözeltisi içinde ependorf tüplerine konuldu etiketlendi. Ticari bir firmadan temin edilen, patojen içermeyen, döllenmis alti farkli tavuk yumurtasi türünde (Australorp, Atak-S, Denizli tavugu, Hint tavugu, Ameraucana, Leghorn Hen) uygulama yapildi. Yumurtalarin döllenme sonrasi, birkaç günlük taze olmasina özen gösterildi. Deneysel olarak grup basina alti yumurta, 8 gün boyunca %54 nem altinda 37°C ila 38,5°C sivri tarafi asagi gelecek %55 ila %80 arasinda degisen çesitli sicaklik ve nem ayarlarinda kuluçka makinasina kuluçkaya yatirildi. Embriyonun yumurta zarlarina yapismasini önlemek için yumurtalarin düzenli mekanik dönüsü gerçeklestirildi. Hayatta kalma oranini önemli ölçüde azaltabileceginden yumurtalara %70 etanol veya herhangi bir sivi dezenfektan püsküitülmedi. Yumurta yüzeyleri alkolsüz islak mendille silindi. Kuluçka makinesine konulmayan diger yumurtalarin embriyonik gelisimlerini en fazla 1 hafta durdurabilmek için yumurtalar 18 oC,de bekletildi. Inkübasyonun besinci gününde yumurtalarin karanlik bir odada canlilik kontrolleri yapildi. Bu muayenede güçlü bir isik kaynagi altinda embriyonun hareketi ve damarlari gözlendi. Damarlanmanin oldugu yerler ve yumurtanin hava kesesi bir kalemle isaretlendi. Hava kesesini görsellestirmek için yumurta isik kaynagina yerlestirildi. Hava kesesinin ortasi bir kalemle isaretlendi. Yumurtaya hava akisi saglamak için isaretli bölgeden noktasal bir delik açildi. Yumurtayi kirmaktan veya zarar vermekten kaçinmak için yumurtaya çok fazla baski uygulamamaya dikkat edildi. Ameliyat penceresi alaninin tayini için , embriyonun tutundugu bölgenin en az 2 cm uzakliginda iyi damarlanmis bir alan seçildi ve bu bölgeye 1,5 cm çapinda bir daire çizildi. Tespit edilen bu alan yani CAM üzerinde yumurta kabugu steril bir raptiye araciligiyla delindi. Damlalik bir kauçuk ampulle, hava kesesi alanindan açilan küçük delige basinç uygulandi. Çalisma penceresi alanindaki iki zarin ayristirilmasini görene kadar ampuldeki basinç serbest birakildi. Çalisma penceresi alanindaki membranlarin tamamen ayrilmasini saglamak için bu adim tekrarlandi (Schmitd ve ark.,2019). Yumurtalar yatay olarak tutuldu. CAMyumurta yüzeyinden yaklasik 1 cm derinlikte tanimlandi. Kontaminasyonu önlemek için açilan her yumurta geçici olarak bir selofan bant ile örtüldü. Çalisma alani için, küçük bir kare pencere (3mm<3mm<1mm) olusturuldu. Deney grubundaki yumurtalara kuzu mezankimal kök hücre süspansiyonu ( aktarildi. Islem sonrasi yumurtalar selofan bant ile kapatildi. Kuluçkanin 12. gününde yumurtalar inkübatörden ve CAM dokularindan dogrudan çikarildi. Tüm islemler steril olarak gerçeklestirildi. Her gruptan bir diseksiyon mikroskobu (10X) kullanilarak görüntüler alindi ve sayim yapildi. Kültüvasyonun ilk gününde kütlece yüzde artisin, ikinci ve üçüncü güne daha yüksek oldugu tespit edilmistir. Ikinci günün sonunda kütlece yüzde artis %33, üçüncü günün sonunda ise %25 olarak hesaplanmistir. Agirlikça artis miktari, mezankimal kök hücre inokulasyonunda basarili yumurta örnekleri üzerinde elde edilen veriler kiyaslanmis, bulgular birbirleriyle uyumluluk göstermistir. Projede mezankimal kök hücrelerin CAM yüzeyi üzerinde kültüvasyonu yapilmis mevcut morfolojilerini koruduklarini gözlemlenmistir. CAM kültüvasyonu sonucunda hacimsel ve agirlikça doku büyümesi gözlenmis fakat hiçbir zaman yüzde yüz saIlikta mezankimal kök hücre doku örnegine rastlanilmamistir. CAM hasatlarindan elde edilen tüm örneklerde mezankimal kök hücre ile adipoz dokuya da rastlanilmistir. Bu olusumun nedeni olarak kesilen hayvanlarin kemik yasinin yüksek olmasi, mezankimal kök hücrelerin CAM üzerinde bir kisminin adipoz dokuya dönüsüm sürecinin programli olarak devam ettirdigini düsündürmüstür.Kültüre edilen mezankimal hücrelerin damar boyunca dagilan bir gelisim göstererek ekim yapilan alanin disinda kümelesmeler gösterdikleri tespit edilmistir. TR TR

Claims (1)

1.ISTEMLER Istem 1 - Bulus bir teknik prosedür olup, ölmüs bir hayvandan alinan kemik iligi kök hücre dokusu (1) 10 mL DMEM (2), Santrifüj makinasi (3), 1 mL steril PES (4), Neubauer lami (5), Tripan blue solüsyonu (6), Isik mikroskobu (7), Ependorf tüpü (8), Leghorn Hen cinsi döllenmis tavuk yumurtasi (9), Isildak (10), Ince uçlu raptiye (11), Hava pompasi (12), Kuluçka makinesi (13) kullanimi içeren islem basamaklarini kapsar. Istem 2 - Istem 1,e göre uygun malzeme listesine sahip bir prosedür olup, ölmüs bir hayvandan alinan kemik iligi kök hücre dokusu (1) kuzu kaval kemik iliginden izole edilen yogunlugu degisebilen 0.5 mm uzunlukta ve 0.5 mm genisligindeki 40 mg agirligindaki mezankimal doku örneklerini içerir. Istem 3. Istem 1,e göre uygun malzeme listesine sahip bir prosedür olup ,Leghorn Hen cinsi döllenmis tavuk yumurtasi (9) en az yedi günlük embriyonik gelisime ahip olmalidir. Istem 4 - Istem 1,e göre uygun malzeme listesine sahip bir prosedür olup, Kuluçka makinesi (13) kök hücre gelisimi için %54 nem , 37°C ila 38,5°C degisen çesitli sicaklik ve nem ayarinda olmalidir. Istem 5- Istem 1,e göre uygun malzeme listesine sahip bir prosedür olup, 10 mL DMEM (2) yüksek glikoz içerigine sahip olup (4.5 g/l), L-Glutamine içerir. Istem 6 - Istem 1,e göre uygun bir prosedür olup , 1 mL steril PES (4) % 10 gentamycin antibiyotigi içerir. TR TR