JP2001340076A - 生物の組織を薄切した切片からなる動物細胞の培養担体と、この担体を用いる動物細胞の培養方法および移植方法 - Google Patents
生物の組織を薄切した切片からなる動物細胞の培養担体と、この担体を用いる動物細胞の培養方法および移植方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 より生体組織に近い培養環境、即ち、目的と
する生体組織の場所的かつ時間的情報が組込まれた環境
を提供し、目的とする細胞と、生体組織の場所的かつ時
間的情報との相互作用を利用した細胞の諸性質や特性の
解明、およびその相互作用を利用した遺伝子の機能解
析、さらには生体組織の鋳型を利用した組織の再構築、
およびその再構築組織の移植を可能とする。 【解決手段】 動物細胞を培養する担体が、生体の組織
を薄切した切片からなる細胞培養担体、もしくは生物の
組織を薄切した切片が、支持体に付着または付着伸展さ
れた細胞培養担体と、これを用いた培養方法並びに移植
方法とする。
する生体組織の場所的かつ時間的情報が組込まれた環境
を提供し、目的とする細胞と、生体組織の場所的かつ時
間的情報との相互作用を利用した細胞の諸性質や特性の
解明、およびその相互作用を利用した遺伝子の機能解
析、さらには生体組織の鋳型を利用した組織の再構築、
およびその再構築組織の移植を可能とする。 【解決手段】 動物細胞を培養する担体が、生体の組織
を薄切した切片からなる細胞培養担体、もしくは生物の
組織を薄切した切片が、支持体に付着または付着伸展さ
れた細胞培養担体と、これを用いた培養方法並びに移植
方法とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、生物の組
織を薄切した切片からなる動物細胞の培養担体と、この
担体を用いる動物細胞の培養方法および移植方法に関す
るものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、培
養系に於いて動物細胞に生体組織の場所的かつ時間的環
境情報を提供するための培養担体と、その培養担体上で
の動物細胞の培養方法、およびその培養担体上で培養し
た細胞の移植方法に関するものであり、様々な生体組織
由来の担体上で様々な細胞を培養できるので、当該担体
を利用した機能細胞の培養維持、細胞の挙動や機能の評
価、および生体に近い組織の再構築を可能とし、遺伝子
機能の評価、培養臓器の開発、もしくは細胞移植等に有
用である。
織を薄切した切片からなる動物細胞の培養担体と、この
担体を用いる動物細胞の培養方法および移植方法に関す
るものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、培
養系に於いて動物細胞に生体組織の場所的かつ時間的環
境情報を提供するための培養担体と、その培養担体上で
の動物細胞の培養方法、およびその培養担体上で培養し
た細胞の移植方法に関するものであり、様々な生体組織
由来の担体上で様々な細胞を培養できるので、当該担体
を利用した機能細胞の培養維持、細胞の挙動や機能の評
価、および生体に近い組織の再構築を可能とし、遺伝子
機能の評価、培養臓器の開発、もしくは細胞移植等に有
用である。
【０００２】
【従来の技術】培養下における動物細胞は、その培養環
境を工夫することで、医薬品等の生理活性物質の開発研
究やその製造手段、あるいは培養臓器の作製やその移植
へと活用領域が拡大し、現代社会に貢献している。そし
て従来より、動物由来の機能細胞に目的とする能力を発
揮させるために、動物細胞用の様々な培養担体が開発さ
れてきている。なぜなら、培養担体の素材と形状を創意
工夫することで、細胞の接着、伸展、移動、浸潤、増
殖、分化、極性、自己組織化等の細胞挙動、さらには細
胞と培養液の相互作用機構を制御することができるから
である。
境を工夫することで、医薬品等の生理活性物質の開発研
究やその製造手段、あるいは培養臓器の作製やその移植
へと活用領域が拡大し、現代社会に貢献している。そし
て従来より、動物由来の機能細胞に目的とする能力を発
揮させるために、動物細胞用の様々な培養担体が開発さ
れてきている。なぜなら、培養担体の素材と形状を創意
工夫することで、細胞の接着、伸展、移動、浸潤、増
殖、分化、極性、自己組織化等の細胞挙動、さらには細
胞と培養液の相互作用機構を制御することができるから
である。
【０００３】これまでの培養担体の素材は、天然物由来
素材、人工素材、および天然物由来素材と人工素材のハ
イブリッドに分類でき、それらの形状は、支持体への吸
着体、支持体の被膜、フィルム、膜、プレート、シャー
レ、フラスコ、中空糸、糸および／またはその織成体、
ゲル、ビーズ、等さまざまである。天然物由来素材とし
ては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、グリ
コサミノグリカン、プロテオグリカン、あるいはマトリ
ゲル（ＥＨＳ腫瘍から抽出して再構成された基底膜；Kl
einman, H. K., et al. Basement membrane complexes
with biological activity. Biochem. 25, 312, 1986.)
などの動物組織から抽出した細胞外マトリックス構成成
分、動物組織から調製した無細胞真皮マトリックス（Li
vesey, S. A., et al. Transplanted acellular allogr
aft dermal matrix. Transplant,60, 1, 1995.)、イガ
イ由来の接着蛋白質、絹、あるいは綿等が培養担体とし
て開発されている。また、人工素材としては、ナイロン
等の生体非吸収性の合成高分子、ポリグリコール酸等の
生体吸収性の合成高分子、あるいはセラミックス等が培
養担体として開発されている。
素材、人工素材、および天然物由来素材と人工素材のハ
イブリッドに分類でき、それらの形状は、支持体への吸
着体、支持体の被膜、フィルム、膜、プレート、シャー
レ、フラスコ、中空糸、糸および／またはその織成体、
ゲル、ビーズ、等さまざまである。天然物由来素材とし
ては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、グリ
コサミノグリカン、プロテオグリカン、あるいはマトリ
ゲル（ＥＨＳ腫瘍から抽出して再構成された基底膜；Kl
einman, H. K., et al. Basement membrane complexes
with biological activity. Biochem. 25, 312, 1986.)
などの動物組織から抽出した細胞外マトリックス構成成
分、動物組織から調製した無細胞真皮マトリックス（Li
vesey, S. A., et al. Transplanted acellular allogr
aft dermal matrix. Transplant,60, 1, 1995.)、イガ
イ由来の接着蛋白質、絹、あるいは綿等が培養担体とし
て開発されている。また、人工素材としては、ナイロン
等の生体非吸収性の合成高分子、ポリグリコール酸等の
生体吸収性の合成高分子、あるいはセラミックス等が培
養担体として開発されている。
【０００４】一般に、動物の初代培養細胞は、培養担体
としてプラスチックシャーレを用いて培養すると、生体
内で発現していた組織特異的機能を失ってしまうが、細
胞外マトリックス構成成分を含有する培養担体を用いて
培養すると、比較的機能が維持されること、特に培養担
体としてマトリゲルを用いて上皮系細胞を培養すると、
細胞は分化して組織特異的機能が向上することが知られ
ている。また、培養担体として無細胞真皮マトリックス
を用いて表皮角化細胞を培養すると、角化細胞は分化し
て再構築表皮を無細胞真皮マトリックス上に形成するこ
とが知られている。これらの知見は、培養細胞に組織特
異的機能もしくは三次元微細構造形態を誘導するために
は、元来その細胞が生体内で存在していた場所的情報を
培養担体に極力正確に反映することが重要であることを
示唆している。動物の生体内組織に於いては、細胞は時
間経過とともに未分化な状態から終末分化した状態へと
変遷し、細胞の分化状態に対応して細胞外マトリックス
も刻々と変化しているので、各々の細胞が局在している
細胞外マトリックス環境も時間的支配下にある。つま
り、生体内組織に於ける細胞の周囲環境は、場所的情報
に加えて時間的情報も有している。
としてプラスチックシャーレを用いて培養すると、生体
内で発現していた組織特異的機能を失ってしまうが、細
胞外マトリックス構成成分を含有する培養担体を用いて
培養すると、比較的機能が維持されること、特に培養担
体としてマトリゲルを用いて上皮系細胞を培養すると、
細胞は分化して組織特異的機能が向上することが知られ
ている。また、培養担体として無細胞真皮マトリックス
を用いて表皮角化細胞を培養すると、角化細胞は分化し
て再構築表皮を無細胞真皮マトリックス上に形成するこ
とが知られている。これらの知見は、培養細胞に組織特
異的機能もしくは三次元微細構造形態を誘導するために
は、元来その細胞が生体内で存在していた場所的情報を
培養担体に極力正確に反映することが重要であることを
示唆している。動物の生体内組織に於いては、細胞は時
間経過とともに未分化な状態から終末分化した状態へと
変遷し、細胞の分化状態に対応して細胞外マトリックス
も刻々と変化しているので、各々の細胞が局在している
細胞外マトリックス環境も時間的支配下にある。つま
り、生体内組織に於ける細胞の周囲環境は、場所的情報
に加えて時間的情報も有している。
【０００５】しかしながら、様々な分化状態にある細胞
で構成されている生体組織の環境を反映した培養担体、
つまり、生体組織の場所的かつ時間的情報を正確に反映
できるような培養担体は、これまで未開発であった。
で構成されている生体組織の環境を反映した培養担体、
つまり、生体組織の場所的かつ時間的情報を正確に反映
できるような培養担体は、これまで未開発であった。
【０００６】それ故、任意の動物細胞に対して生体内に
酷似した細胞外環境を付与する培養システムを実現する
ことは、不可能であった。
酷似した細胞外環境を付与する培養システムを実現する
ことは、不可能であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】この出願の発明は、こ
のような状況に鑑みてなされたものであり、動物細胞の
培養担体として、より生体組織に近い培養環境、即ち、
目的とする生体組織の場所的かつ時間的情報が組込まれ
た環境を、提供することを課題としている。さらに、こ
の出願の発明は、当該培養担体上で細胞を培養すること
により、目的とする細胞と、生体組織の場所的かつ時間
的情報との相互作用を利用した細胞の諸性質や特性の解
明、およびその相互作用を利用した遺伝子の機能解析、
さらには生体組織の鋳型を利用した組織の再構築、およ
びその再構築組織の移植を可能とすることを課題として
いる。
のような状況に鑑みてなされたものであり、動物細胞の
培養担体として、より生体組織に近い培養環境、即ち、
目的とする生体組織の場所的かつ時間的情報が組込まれ
た環境を、提供することを課題としている。さらに、こ
の出願の発明は、当該培養担体上で細胞を培養すること
により、目的とする細胞と、生体組織の場所的かつ時間
的情報との相互作用を利用した細胞の諸性質や特性の解
明、およびその相互作用を利用した遺伝子の機能解析、
さらには生体組織の鋳型を利用した組織の再構築、およ
びその再構築組織の移植を可能とすることを課題として
いる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、培養
系に於いて動物細胞に生体組織の場所的かつ時間的環境
情報を提供するために、通常は組織学や病理学の分野で
顕微鏡観察の目的で調製される生体組織の薄切切片を、
直接もしくは無細胞化するなどの処理を施した後に、培
養担体として用いる方法を見出した。そこで、この出願
の発明は、第１には生物の組織を薄切した切片からなる
動物細胞の培養担体を提供し、さらに、第２には、生物
の組織を薄切した切片が、支持体に付着または付着伸展
している細胞培養担体を、第３には、支持体が、ガラ
ス、プラスチック、ゴム、金属、天然または合成の糸お
よび／またはその織成体、および生体吸収性材料から選
ばれる１種以上である細胞培養担体を、第４には支持体
には予め切片の付着または付着伸展を促進する処理が施
されている細胞培養担体を提供する。
系に於いて動物細胞に生体組織の場所的かつ時間的環境
情報を提供するために、通常は組織学や病理学の分野で
顕微鏡観察の目的で調製される生体組織の薄切切片を、
直接もしくは無細胞化するなどの処理を施した後に、培
養担体として用いる方法を見出した。そこで、この出願
の発明は、第１には生物の組織を薄切した切片からなる
動物細胞の培養担体を提供し、さらに、第２には、生物
の組織を薄切した切片が、支持体に付着または付着伸展
している細胞培養担体を、第３には、支持体が、ガラ
ス、プラスチック、ゴム、金属、天然または合成の糸お
よび／またはその織成体、および生体吸収性材料から選
ばれる１種以上である細胞培養担体を、第４には支持体
には予め切片の付着または付着伸展を促進する処理が施
されている細胞培養担体を提供する。
【０００９】また、この出願の発明は、第５には、生物
の組織が、新鮮な組織または予め固定液で固定した組織
から調製される細胞培養担体を、第６には、薄切する前
の生物の組織、または生物の組織を薄切した切片に無細
胞化する処理が施されている組織から調製される細胞培
養担体を、第７には、生物の組織を薄切した切片に、生
理活性物質を結合できる抗体や核酸プローブの処理を施
して、切片上の特定の場所に外来性の生理活性物質を導
入することを特徴とする細胞培養担体を、第８には、生
物の組織を薄切した切片に、酵素の処理など生物学的処
理または酸やアルカリや界面活性剤の処理など化学的処
理を施して、切片に於ける生物の構成成分や微細構造を
改変もしくは修飾することを特徴とする細胞培養担体
を、第９には、生物の組織を薄切するために、予め生物
の組織が凍結または凍結包埋、パラフィン包埋、または
樹脂包埋されている組織から調製される細胞培養担体
を、第１０には、生物が動物または植物である細胞培養
担体を、第１１には、動物が哺乳動物である組織から調
製される細胞培養担体を、第１２には、生物の組織が、
生前の発生段階にある動物の全身または一部である組織
から調製される細胞培養担体を、第１３には、生物の組
織が、生後の動物の全身または一部である細胞培養担体
を提供する。
の組織が、新鮮な組織または予め固定液で固定した組織
から調製される細胞培養担体を、第６には、薄切する前
の生物の組織、または生物の組織を薄切した切片に無細
胞化する処理が施されている組織から調製される細胞培
養担体を、第７には、生物の組織を薄切した切片に、生
理活性物質を結合できる抗体や核酸プローブの処理を施
して、切片上の特定の場所に外来性の生理活性物質を導
入することを特徴とする細胞培養担体を、第８には、生
物の組織を薄切した切片に、酵素の処理など生物学的処
理または酸やアルカリや界面活性剤の処理など化学的処
理を施して、切片に於ける生物の構成成分や微細構造を
改変もしくは修飾することを特徴とする細胞培養担体
を、第９には、生物の組織を薄切するために、予め生物
の組織が凍結または凍結包埋、パラフィン包埋、または
樹脂包埋されている組織から調製される細胞培養担体
を、第１０には、生物が動物または植物である細胞培養
担体を、第１１には、動物が哺乳動物である組織から調
製される細胞培養担体を、第１２には、生物の組織が、
生前の発生段階にある動物の全身または一部である組織
から調製される細胞培養担体を、第１３には、生物の組
織が、生後の動物の全身または一部である細胞培養担体
を提供する。
【００１０】そしてこの出願の発明は、第１４には第１
ないし第１３の発明のいずれかの細胞培養担体を培養容
器に装入して動物細胞を培養することを特徴とする細胞
培養方法を、第１５には、動物細胞の培養を開始する手
段が、細胞懸濁液、細切組織片、受精卵、または三次元
再構築した多細胞性凝集塊の播種によることを特徴とす
る細胞培養方法を、第１６には、播種した動物細胞が付
着増殖して、切片または切片に由来する組織を、第２な
いし第４の発明の支持体から剥離することを特徴とする
細胞培養方法を、第１７には、支持体から剥離した後に
培養を続けることで、切片または切片に由来する組織を
取り込んだ三次元の多細胞性凝集塊を形成することを特
徴とする細胞培養方法を、第１８には、培養する動物細
胞が、初代培養細胞、株化細胞、受精卵および／または
それらに外来性遺伝子を導入した細胞から選ばれる１種
または２種以上である細胞培養方法を、第１９には、培
養する動物細胞が、未分化な幹細胞、分化過程にある細
胞、終末分化した細胞、および／または脱分化した細胞
に由来することを特徴とする細胞培養方法を、第２０に
は、未分化な幹細胞が、特に胚性幹細胞であることを特
徴とする細胞培養方法を、第２１には、動物細胞を培養
する培養液が、血清含有の培養液または血清非含有の無
血清培養液であることを特徴とする第１４ないし第２０
の発明の細胞培養方法を、第２２には、これらの細胞培
養方法により培養した動物細胞を、動物に移植すること
を特徴とする細胞移植方法を、第２３には、移植する動
物が哺乳動物である細胞移植方法を提供する。
ないし第１３の発明のいずれかの細胞培養担体を培養容
器に装入して動物細胞を培養することを特徴とする細胞
培養方法を、第１５には、動物細胞の培養を開始する手
段が、細胞懸濁液、細切組織片、受精卵、または三次元
再構築した多細胞性凝集塊の播種によることを特徴とす
る細胞培養方法を、第１６には、播種した動物細胞が付
着増殖して、切片または切片に由来する組織を、第２な
いし第４の発明の支持体から剥離することを特徴とする
細胞培養方法を、第１７には、支持体から剥離した後に
培養を続けることで、切片または切片に由来する組織を
取り込んだ三次元の多細胞性凝集塊を形成することを特
徴とする細胞培養方法を、第１８には、培養する動物細
胞が、初代培養細胞、株化細胞、受精卵および／または
それらに外来性遺伝子を導入した細胞から選ばれる１種
または２種以上である細胞培養方法を、第１９には、培
養する動物細胞が、未分化な幹細胞、分化過程にある細
胞、終末分化した細胞、および／または脱分化した細胞
に由来することを特徴とする細胞培養方法を、第２０に
は、未分化な幹細胞が、特に胚性幹細胞であることを特
徴とする細胞培養方法を、第２１には、動物細胞を培養
する培養液が、血清含有の培養液または血清非含有の無
血清培養液であることを特徴とする第１４ないし第２０
の発明の細胞培養方法を、第２２には、これらの細胞培
養方法により培養した動物細胞を、動物に移植すること
を特徴とする細胞移植方法を、第２３には、移植する動
物が哺乳動物である細胞移植方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】この出願の発明は、上記のとおり
の特徴を有するものであるが、以下にその実施の形態に
ついて説明する。
の特徴を有するものであるが、以下にその実施の形態に
ついて説明する。
【００１２】この出願の発明で用いられる生物の組織
は、動物の生前または生後の全身または一部の組織であ
っても、植物の全体または一部の組織であっても、さら
には、それらの組織が予め固定液で固定した組織であっ
ても新鮮な組織であってもよい。固定液としては、メタ
ノール、エタノール、アセトン、ホルマリン、グルター
ルアルデヒド等が挙げられる。哺乳動物としては、ヒ
ト、サル、ウシ、羊、ヤギ、ヒヒ、ブタ、イヌ、ウサ
ギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等が挙げ
られる。動物の組織は、全身または一部組織であれば特
に限定されないが、例えば、脳、脊髄、筋肉、皮膚、血
管、食道、胃、小腸、大腸、心臓、肺臓、肝臓、腎臓、
膵臓、脾臓、胸腺、骨、軟骨、骨髄、子宮、卵巣、卵
管、精巣、胎盤、臍帯等が挙げられ、さらにそれらの正
常組織であっても、腫瘍をはじめ各種病巣組織であって
もよい。
は、動物の生前または生後の全身または一部の組織であ
っても、植物の全体または一部の組織であっても、さら
には、それらの組織が予め固定液で固定した組織であっ
ても新鮮な組織であってもよい。固定液としては、メタ
ノール、エタノール、アセトン、ホルマリン、グルター
ルアルデヒド等が挙げられる。哺乳動物としては、ヒ
ト、サル、ウシ、羊、ヤギ、ヒヒ、ブタ、イヌ、ウサ
ギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等が挙げ
られる。動物の組織は、全身または一部組織であれば特
に限定されないが、例えば、脳、脊髄、筋肉、皮膚、血
管、食道、胃、小腸、大腸、心臓、肺臓、肝臓、腎臓、
膵臓、脾臓、胸腺、骨、軟骨、骨髄、子宮、卵巣、卵
管、精巣、胎盤、臍帯等が挙げられ、さらにそれらの正
常組織であっても、腫瘍をはじめ各種病巣組織であって
もよい。
【００１３】この発明で用いられる生物の組織を薄切し
た切片は、凍結切片であっても、パラフィン切片であっ
ても、または樹脂切片であってもよい。組織学や病理学
の分野では、動物や植物の全体または一部組織の薄切切
片を作製して、スライドグラス上に薄切切片を伸展し、
種々の染色を施した後に顕微鏡で観察するといった一連
の実験手法は、極めて日常的である。生体組織の薄切切
片には、言うまでもなく生体組織の場所的かつ時間的情
報が全て含まれており、各々の情報は一般染色のみなら
ず免疫組織化学的手法やin situハイブリダイゼーショ
ン技術により解析が可能である。
た切片は、凍結切片であっても、パラフィン切片であっ
ても、または樹脂切片であってもよい。組織学や病理学
の分野では、動物や植物の全体または一部組織の薄切切
片を作製して、スライドグラス上に薄切切片を伸展し、
種々の染色を施した後に顕微鏡で観察するといった一連
の実験手法は、極めて日常的である。生体組織の薄切切
片には、言うまでもなく生体組織の場所的かつ時間的情
報が全て含まれており、各々の情報は一般染色のみなら
ず免疫組織化学的手法やin situハイブリダイゼーショ
ン技術により解析が可能である。
【００１４】このような技術を利用して、薄切切片に生
理活性物質を結合できる抗体や核酸プローブの処理を施
して、切片上の特定の場所に外来性の生理活性物質を導
入することも可能である。生理活性物質としては、タン
パク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド、糖
質、脂質、糖脂質、核酸、低分子化合物、等が挙げられ
る。これら生理活性物質の作用としては、抗体活性、酵
素活性、ホルモン、サイトカイン、細胞接着、増殖、分
化、再生、形態形成、等が挙げられる。
理活性物質を結合できる抗体や核酸プローブの処理を施
して、切片上の特定の場所に外来性の生理活性物質を導
入することも可能である。生理活性物質としては、タン
パク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド、糖
質、脂質、糖脂質、核酸、低分子化合物、等が挙げられ
る。これら生理活性物質の作用としては、抗体活性、酵
素活性、ホルモン、サイトカイン、細胞接着、増殖、分
化、再生、形態形成、等が挙げられる。
【００１５】さらに、薄切切片に酵素の処理など生物学
的処理を施したり、もしくは酸やアルカリや界面活性剤
の処理など化学的処理を施したりして、薄切切片に於け
る生物の構成成分や微細構造を改変したり修飾したりす
ることも可能である。この出願の発明においても、凍結
切片は、未固定もしくはホルマリン等で固定した生物の
組織を直接、もしくはＯＣＴコンパウンドに包埋した後
に液体窒素等で急速冷凍した後、凍結ミクロトームで１
〜５０μｍ、好ましくは４〜２０μｍの厚さに薄切して
調製すること等ができる。未固定の凍結切片は、薄切後
にホルマリン等で固定することもできる。パラフィン切
片は、通常、生物の組織をホルマリン等で固定した後、
エタノールで脱水し、キシレン、パラフィンと置換し
て、パラフィンに包埋した後に、ミクロトームで０．５
〜５０μｍ、好ましくは２〜２０μｍの厚さに薄切して
調製する。また、樹脂切片は、通常、生物の組織をホル
マリン等で固定した後、エタノールで脱水し、ヒストレ
ジン等の樹脂に包埋した後に、ミクロトームで０．１〜
５０μｍ、好ましくは０．５〜１０μｍの厚さに薄切し
て調製する。
的処理を施したり、もしくは酸やアルカリや界面活性剤
の処理など化学的処理を施したりして、薄切切片に於け
る生物の構成成分や微細構造を改変したり修飾したりす
ることも可能である。この出願の発明においても、凍結
切片は、未固定もしくはホルマリン等で固定した生物の
組織を直接、もしくはＯＣＴコンパウンドに包埋した後
に液体窒素等で急速冷凍した後、凍結ミクロトームで１
〜５０μｍ、好ましくは４〜２０μｍの厚さに薄切して
調製すること等ができる。未固定の凍結切片は、薄切後
にホルマリン等で固定することもできる。パラフィン切
片は、通常、生物の組織をホルマリン等で固定した後、
エタノールで脱水し、キシレン、パラフィンと置換し
て、パラフィンに包埋した後に、ミクロトームで０．５
〜５０μｍ、好ましくは２〜２０μｍの厚さに薄切して
調製する。また、樹脂切片は、通常、生物の組織をホル
マリン等で固定した後、エタノールで脱水し、ヒストレ
ジン等の樹脂に包埋した後に、ミクロトームで０．１〜
５０μｍ、好ましくは０．５〜１０μｍの厚さに薄切し
て調製する。
【００１６】また、この発明で用いられる無細胞化の処
理は、薄切する前の生物の組織に施されても、もしくは
生物の組織を薄切した切片に施されてもよい。無細胞化
の処理には、塩類、アルカリ、界面活性剤、キレート
剤、または酵素等を含む溶液が単独もしくは組み合わせ
て用いられる。塩類としては、塩化ナトリウム、塩化マ
グネシウム、リン酸カリウム等が挙げられ、アルカリと
しては、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモ
ニア等が挙げられる。また、界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅ
ｅｎ２０および８０等が挙げられ、キレート剤として
は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等が挙げられる。さらに、酵素
としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、
エラスターゼ、パパイン、マトリックスメタロプロテア
ーゼ等の蛋白分解酵素、ヒアルロニダーゼ等の糖分解酵
素、デオキシリボヌクレアーゼ等の核酸分解酵素等が挙
げられる。
理は、薄切する前の生物の組織に施されても、もしくは
生物の組織を薄切した切片に施されてもよい。無細胞化
の処理には、塩類、アルカリ、界面活性剤、キレート
剤、または酵素等を含む溶液が単独もしくは組み合わせ
て用いられる。塩類としては、塩化ナトリウム、塩化マ
グネシウム、リン酸カリウム等が挙げられ、アルカリと
しては、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモ
ニア等が挙げられる。また、界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅ
ｅｎ２０および８０等が挙げられ、キレート剤として
は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等が挙げられる。さらに、酵素
としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、
エラスターゼ、パパイン、マトリックスメタロプロテア
ーゼ等の蛋白分解酵素、ヒアルロニダーゼ等の糖分解酵
素、デオキシリボヌクレアーゼ等の核酸分解酵素等が挙
げられる。
【００１７】この発明で用いられる生物組織の薄切切片
からなる培養担体は、薄切切片のみから構成されていて
も、薄切切片がガラス、プラスチック、ゴム、金属、天
然または合成の糸および／またはその織成体、および生
体吸収性材料等の支持体に付着または付着伸展した複合
体から構成されていてもよい。また、支持体に予め切片
の付着または付着伸展を促進する処理が施されていても
よい。切片の付着または付着伸展を促進する処理として
は、支持体へのポリリジン、ＡＰＳ等のコートが挙げら
れる。また、培養担体とする薄切切片にＯＣＴコンパウ
ンド、パラフィン、樹脂等が混入している場合は、水
洗、脱パラフィン処理、もしくは脱樹脂処理を施すこと
もできる。さらに、培養担体とする薄切切片には、エタ
ノール処理、エチレンオキサイドガス処理、およびγ線
や紫外線処理等の滅菌処理を施すこともできる。
からなる培養担体は、薄切切片のみから構成されていて
も、薄切切片がガラス、プラスチック、ゴム、金属、天
然または合成の糸および／またはその織成体、および生
体吸収性材料等の支持体に付着または付着伸展した複合
体から構成されていてもよい。また、支持体に予め切片
の付着または付着伸展を促進する処理が施されていても
よい。切片の付着または付着伸展を促進する処理として
は、支持体へのポリリジン、ＡＰＳ等のコートが挙げら
れる。また、培養担体とする薄切切片にＯＣＴコンパウ
ンド、パラフィン、樹脂等が混入している場合は、水
洗、脱パラフィン処理、もしくは脱樹脂処理を施すこと
もできる。さらに、培養担体とする薄切切片には、エタ
ノール処理、エチレンオキサイドガス処理、およびγ線
や紫外線処理等の滅菌処理を施すこともできる。
【００１８】そして、この発明で用いられる動物細胞
は、初代培養細胞であっても、株化細胞であっても、受
精卵であっても、またはそれらに外来性遺伝子を導入し
た細胞であってもよく、さらに細胞は１種類であっても
２種類以上であってもよい。
は、初代培養細胞であっても、株化細胞であっても、受
精卵であっても、またはそれらに外来性遺伝子を導入し
た細胞であってもよく、さらに細胞は１種類であっても
２種類以上であってもよい。
【００１９】さらに、動物細胞は、未分化な幹細胞、分
化過程にある細胞、終末分化した細胞、および／または
脱分化した細胞のいずれに由来してもよい。未分化な幹
細胞が、特に胚性幹細胞であってもよい。このような動
物細胞の培養は、細胞懸濁液、細切組織片、受精卵、ま
たは三次元再構築した多細胞性凝集塊を播種することで
開始できる。動物細胞の培養に用いる培養液は、通常の
動物細胞培養用の培養液であればよく、如何なる組成の
基礎培養液であっても、また血清、抗生物質、ビタミ
ン、等が添加されていても添加されていなくてもよい。
また、培養した動物細胞と切片の親和力が切片と支持体
の親和力より勝るように、適当な支持体を選択すること
で、動物細胞が付着増殖した切片または切片に由来する
組織を支持体から剥離することが可能となる。さらに、
支持体から剥離した後に培養を続けることで、切片また
は切片に由来する組織を取り込んだ三次元の多細胞性凝
集塊を形成することも可能となる。
化過程にある細胞、終末分化した細胞、および／または
脱分化した細胞のいずれに由来してもよい。未分化な幹
細胞が、特に胚性幹細胞であってもよい。このような動
物細胞の培養は、細胞懸濁液、細切組織片、受精卵、ま
たは三次元再構築した多細胞性凝集塊を播種することで
開始できる。動物細胞の培養に用いる培養液は、通常の
動物細胞培養用の培養液であればよく、如何なる組成の
基礎培養液であっても、また血清、抗生物質、ビタミ
ン、等が添加されていても添加されていなくてもよい。
また、培養した動物細胞と切片の親和力が切片と支持体
の親和力より勝るように、適当な支持体を選択すること
で、動物細胞が付着増殖した切片または切片に由来する
組織を支持体から剥離することが可能となる。さらに、
支持体から剥離した後に培養を続けることで、切片また
は切片に由来する組織を取り込んだ三次元の多細胞性凝
集塊を形成することも可能となる。
【００２０】また、この発明の培養担体を用いる動物細
胞の培養は、例えば、動物の組織を厚さ６μｍに薄切し
た凍結切片の１または２以上の１枚または２枚以上を付
着伸展したスライドグラスに、固定、無細胞化、滅菌、
培養液を用いた平衡化等の必要な処理を施した後に、そ
のスライドグラスを培養シャーレに装入して、動物細胞
の懸濁液を播種することで、容易に達成できる。さら
に、この発明の培養担体を用いる動物細胞の移植は、例
えば、動物の組織を厚さ６μｍに薄切した凍結切片を付
着した生体吸収性メッシュに、固定、無細胞化、滅菌、
培養液を用いた平衡化等の必要な処理を施した後に、そ
の生体吸収性メッシュを培養シャーレに装入して、動物
細胞の懸濁液を播種して培養した後の培養担体を移植す
ることで、容易に達成できる。
胞の培養は、例えば、動物の組織を厚さ６μｍに薄切し
た凍結切片の１または２以上の１枚または２枚以上を付
着伸展したスライドグラスに、固定、無細胞化、滅菌、
培養液を用いた平衡化等の必要な処理を施した後に、そ
のスライドグラスを培養シャーレに装入して、動物細胞
の懸濁液を播種することで、容易に達成できる。さら
に、この発明の培養担体を用いる動物細胞の移植は、例
えば、動物の組織を厚さ６μｍに薄切した凍結切片を付
着した生体吸収性メッシュに、固定、無細胞化、滅菌、
培養液を用いた平衡化等の必要な処理を施した後に、そ
の生体吸収性メッシュを培養シャーレに装入して、動物
細胞の懸濁液を播種して培養した後の培養担体を移植す
ることで、容易に達成できる。
【００２１】
【実施例】（実施例１：動物組織を薄切した切片からな
る細胞培養担体の作製）屠殺により採取した妊娠２４１
日齢のウシ胎盤をＯＣＴコンパウンドに包埋した後に、
液体窒素で急速凍結した。凍結ミクロトームで、５，１
０，２０μｍに薄切した切片を、スライドグラス（松浪
硝子工業（株）製S-0317）上に調製した。これ以降の操
作は、クリーンベンチ内で行った。この凍結切片を付着
伸展したスライドグラス４枚を、菌液トレイ（住友ベー
クライト（株）製MS-3300N）に装入した（図１参照）。
この菌液トレイに２０ｍｌのＨＢＳＳ(Hanks' Balanced
Salt Solution; GIBCO BRL#14025-092)を注入して、室
温で５分間静置した後に除去した。この操作で、切片よ
りＯＣＴコンパウンドを除去した。次に、菌液トレイに
２０ｍｌの７０％エタノールを注入して、室温で１０分
間静置した後に除去した。この操作で、切片組織の固定
および滅菌を行った。その後、菌液トレイ内の切片付着
スライドグラスを２０ｍｌのＨＢＳＳで２回、２０ｍｌ
の培養液で１回、リンスした。このようにして、ウシ胎
盤の凍結切片からなる細胞培養担体を、スライドグラス
を支持体として、以後培養容器として使用する菌液トレ
イ内に作製した。この細胞培養担体を、定法に従いヘマ
トキシリン・エオシン染色で観察した。その結果、この
細胞培養担体はウシ胎盤の組織であることが確認できた
（図２参照）。
る細胞培養担体の作製）屠殺により採取した妊娠２４１
日齢のウシ胎盤をＯＣＴコンパウンドに包埋した後に、
液体窒素で急速凍結した。凍結ミクロトームで、５，１
０，２０μｍに薄切した切片を、スライドグラス（松浪
硝子工業（株）製S-0317）上に調製した。これ以降の操
作は、クリーンベンチ内で行った。この凍結切片を付着
伸展したスライドグラス４枚を、菌液トレイ（住友ベー
クライト（株）製MS-3300N）に装入した（図１参照）。
この菌液トレイに２０ｍｌのＨＢＳＳ(Hanks' Balanced
Salt Solution; GIBCO BRL#14025-092)を注入して、室
温で５分間静置した後に除去した。この操作で、切片よ
りＯＣＴコンパウンドを除去した。次に、菌液トレイに
２０ｍｌの７０％エタノールを注入して、室温で１０分
間静置した後に除去した。この操作で、切片組織の固定
および滅菌を行った。その後、菌液トレイ内の切片付着
スライドグラスを２０ｍｌのＨＢＳＳで２回、２０ｍｌ
の培養液で１回、リンスした。このようにして、ウシ胎
盤の凍結切片からなる細胞培養担体を、スライドグラス
を支持体として、以後培養容器として使用する菌液トレ
イ内に作製した。この細胞培養担体を、定法に従いヘマ
トキシリン・エオシン染色で観察した。その結果、この
細胞培養担体はウシ胎盤の組織であることが確認できた
（図２参照）。
【００２２】一方、屠殺により採取した発情後１３日目
の未経産ウシの子宮を、１０％中性緩衝ホルマリン液で
固定した後、病理組織学の定法に従いパラフィンに包埋
した。ミクロトームで５μｍに薄切した切片を、スライ
ドグラス（松浪硝子工業（株）製S-0317）上に付着伸展
した。このスライドグラスを、キシレンで脱パラフィン
処理した後、１００％から５０％までのエタノールで順
次処理した。これ以降の操作は、クリーンベンチ内で行
った。切片を付着伸展したスライドグラス１枚を、直径
１００ｍｍの培養皿(Falcon #351001)に挿入した。この
培養皿に、１０ｍｌのＨＢＳＳを注入して、室温で５分
間穏やかに攪拌することで、切片をスライドグラスより
剥離した。剥離した切片を、ピペットで少量でのＨＢＳ
Ｓと共に、予め２ｍｌの滅菌水を注いである直径３５ｍ
ｍのポリスチレン製の親水性培養皿(Falcon #353001)あ
るいは疎水性培養皿(Falcon #351008)に、１枚の培養皿
に１切片ずつ移し入れた。各々の培養皿内で、切片を２
ｍｌの滅菌水で２回リンスした。親水性培養皿について
は、切片を伸展した状態で、できるだけ滅菌水を除去し
てから風乾した。このようにして、ウシ子宮のパラフィ
ン切片由来の細胞培養担体を、直径３５ｍｍのポリスチ
レン製の親水性培養皿を支持体として作製した（図３参
照）。疎水性培養皿については、滅菌水で２回リンスし
た後、２ｍｌの７０％エタノールで１回リンスした。そ
して、切片を伸展した状態で、できるだけ７０％エタノ
ールを除去してから風乾した。このようにして、ウシ子
宮のパラフィン切片由来の細胞培養担体を、直径３５ｍ
ｍのポリスチレン製の疎水性培養皿を支持体として作製
した（図４参照）。 （実施例２：無細胞化処理した切片からなる細胞培養担
体の作製）実施例１と同様に、クリーンベンチ内の菌液
トレイへウシ胎盤の凍結切片を付着伸展したスライドグ
ラスを装入して、２０ｍｌのＨＢＳＳを注入し室温で５
分間静置して、切片よりＯＣＴコンパウンドを除去し
た。次に、菌液トレイ内の切片付着スライドグラスを１
枚ずつ、直径１００ｍｍの培養皿(Falcon #351001)に移
し入れた。各々１０ｍｌの０．０１，０．１，０．５、
および１．０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を注
入して、室温で１０分間静置した後に除去した。この操
作で、切片組織を無細胞化することを検討した。その
後、培養皿内の切片付着スライドグラスを２０ｍｌのＨ
ＢＳＳで２回、１０ｍｌの培養液で１回、リンスした。
各々の切片を、定法に従いヘマトキシリン・エオシン染
色で観察した。その結果、０．１％ＳＤＳで処理するこ
とで、ウシ胎盤の凍結切片は無細胞化できることが確認
できた（図５−８参照）。このようにして、ウシ胎盤の
凍結切片を無細胞化した細胞培養担体を、スライドグラ
スを支持体として作製した。 （実施例３：ウシ胎盤凍結切片からなる細胞培養担体上
でのＢｅＷｏ細胞の培養）ヒトの絨毛癌細胞株であるＢ
ｅＷｏ細胞を用いて、切片からなる細胞培養担体の毒
性、および細胞の接着伸展や増殖性に対する影響、さら
に切片の厚さの違いによる細胞形態への影響を検討し
た。ＢｅＷｏ細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より
分譲ＪＣＲＢ９１１１）は、培養液（１５％非動化牛胎
仔血清(SIGMA #F-2442）、１００units／ｍｌペニシリ
ン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(GIBCO
BRL#15140-148)を含有するHam's Ｆ１２(GIBCO BRL #1
1765-054) で継代培養した。
の未経産ウシの子宮を、１０％中性緩衝ホルマリン液で
固定した後、病理組織学の定法に従いパラフィンに包埋
した。ミクロトームで５μｍに薄切した切片を、スライ
ドグラス（松浪硝子工業（株）製S-0317）上に付着伸展
した。このスライドグラスを、キシレンで脱パラフィン
処理した後、１００％から５０％までのエタノールで順
次処理した。これ以降の操作は、クリーンベンチ内で行
った。切片を付着伸展したスライドグラス１枚を、直径
１００ｍｍの培養皿(Falcon #351001)に挿入した。この
培養皿に、１０ｍｌのＨＢＳＳを注入して、室温で５分
間穏やかに攪拌することで、切片をスライドグラスより
剥離した。剥離した切片を、ピペットで少量でのＨＢＳ
Ｓと共に、予め２ｍｌの滅菌水を注いである直径３５ｍ
ｍのポリスチレン製の親水性培養皿(Falcon #353001)あ
るいは疎水性培養皿(Falcon #351008)に、１枚の培養皿
に１切片ずつ移し入れた。各々の培養皿内で、切片を２
ｍｌの滅菌水で２回リンスした。親水性培養皿について
は、切片を伸展した状態で、できるだけ滅菌水を除去し
てから風乾した。このようにして、ウシ子宮のパラフィ
ン切片由来の細胞培養担体を、直径３５ｍｍのポリスチ
レン製の親水性培養皿を支持体として作製した（図３参
照）。疎水性培養皿については、滅菌水で２回リンスし
た後、２ｍｌの７０％エタノールで１回リンスした。そ
して、切片を伸展した状態で、できるだけ７０％エタノ
ールを除去してから風乾した。このようにして、ウシ子
宮のパラフィン切片由来の細胞培養担体を、直径３５ｍ
ｍのポリスチレン製の疎水性培養皿を支持体として作製
した（図４参照）。 （実施例２：無細胞化処理した切片からなる細胞培養担
体の作製）実施例１と同様に、クリーンベンチ内の菌液
トレイへウシ胎盤の凍結切片を付着伸展したスライドグ
ラスを装入して、２０ｍｌのＨＢＳＳを注入し室温で５
分間静置して、切片よりＯＣＴコンパウンドを除去し
た。次に、菌液トレイ内の切片付着スライドグラスを１
枚ずつ、直径１００ｍｍの培養皿(Falcon #351001)に移
し入れた。各々１０ｍｌの０．０１，０．１，０．５、
および１．０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を注
入して、室温で１０分間静置した後に除去した。この操
作で、切片組織を無細胞化することを検討した。その
後、培養皿内の切片付着スライドグラスを２０ｍｌのＨ
ＢＳＳで２回、１０ｍｌの培養液で１回、リンスした。
各々の切片を、定法に従いヘマトキシリン・エオシン染
色で観察した。その結果、０．１％ＳＤＳで処理するこ
とで、ウシ胎盤の凍結切片は無細胞化できることが確認
できた（図５−８参照）。このようにして、ウシ胎盤の
凍結切片を無細胞化した細胞培養担体を、スライドグラ
スを支持体として作製した。 （実施例３：ウシ胎盤凍結切片からなる細胞培養担体上
でのＢｅＷｏ細胞の培養）ヒトの絨毛癌細胞株であるＢ
ｅＷｏ細胞を用いて、切片からなる細胞培養担体の毒
性、および細胞の接着伸展や増殖性に対する影響、さら
に切片の厚さの違いによる細胞形態への影響を検討し
た。ＢｅＷｏ細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より
分譲ＪＣＲＢ９１１１）は、培養液（１５％非動化牛胎
仔血清(SIGMA #F-2442）、１００units／ｍｌペニシリ
ン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(GIBCO
BRL#15140-148)を含有するHam's Ｆ１２(GIBCO BRL #1
1765-054) で継代培養した。
【００２３】実施例１でスライドグラス上に作製したウ
シ胎盤の５μｍの凍結切片からなる細胞培養担体、およ
び実施例２でスライドグラス上に作製したウシ胎盤の５
μｍの凍結切片を０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細
胞培養担体を、菌液トレイ内に各々スライドグラス２枚
ずつ計４枚を挿入した。この菌液トレイに、２０ｍｌの
培養液に懸濁したＢｅＷｏ細胞を、終濃度が２．１×１
０4／ｃｍ2となるように播種して、５％ＣＯ2、９５％
空気、３７℃の保湿インキュベータ内で培養した。培養
１日目に、菌液トレイ内のスライドグラスを、１０ｍｌ
の培養液を入れた直径１００ｍｍの培養皿内へ１枚ずつ
移し入れた。以後、毎日培養液の交換を行い、４日目ま
で培養した。培養１日目と４日目に、培養細胞の位相差
顕微鏡による形態観察、および生存細胞のcalcein ＡＭ
（Molecular Probes #L-3224）代謝能を利用したcalcei
n蛍光発色の蛍光顕微鏡による観察を行った。培養細胞
のcalcein ＡＭ代謝能は、培養皿内の培養液を除去し、
１０ｍｌのＰＢＳで細胞を２回リンスした後、１０ｍｌ
の２μＭ calcein ＡＭを含むＨＢＳＳで１５分間、５
％ＣＯ2、９５％空気、３７℃の保湿インキュベータ内
で培養した後、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、切片
上、および無細胞化処理した切片上でも、切片の付着し
ていないスライドグラス上と同様に、細胞は培養１日目
で接着伸展し、培養４日目には増殖していること、さら
に、接着伸展し増殖した細胞は、いずれの担体上でも生
存していることが分かった（図９−２０参照）。この結
果は、切片、および無細胞化処理した切片からなる細胞
培養担体には、細胞毒性が無いことを示唆する。
シ胎盤の５μｍの凍結切片からなる細胞培養担体、およ
び実施例２でスライドグラス上に作製したウシ胎盤の５
μｍの凍結切片を０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細
胞培養担体を、菌液トレイ内に各々スライドグラス２枚
ずつ計４枚を挿入した。この菌液トレイに、２０ｍｌの
培養液に懸濁したＢｅＷｏ細胞を、終濃度が２．１×１
０4／ｃｍ2となるように播種して、５％ＣＯ2、９５％
空気、３７℃の保湿インキュベータ内で培養した。培養
１日目に、菌液トレイ内のスライドグラスを、１０ｍｌ
の培養液を入れた直径１００ｍｍの培養皿内へ１枚ずつ
移し入れた。以後、毎日培養液の交換を行い、４日目ま
で培養した。培養１日目と４日目に、培養細胞の位相差
顕微鏡による形態観察、および生存細胞のcalcein ＡＭ
（Molecular Probes #L-3224）代謝能を利用したcalcei
n蛍光発色の蛍光顕微鏡による観察を行った。培養細胞
のcalcein ＡＭ代謝能は、培養皿内の培養液を除去し、
１０ｍｌのＰＢＳで細胞を２回リンスした後、１０ｍｌ
の２μＭ calcein ＡＭを含むＨＢＳＳで１５分間、５
％ＣＯ2、９５％空気、３７℃の保湿インキュベータ内
で培養した後、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、切片
上、および無細胞化処理した切片上でも、切片の付着し
ていないスライドグラス上と同様に、細胞は培養１日目
で接着伸展し、培養４日目には増殖していること、さら
に、接着伸展し増殖した細胞は、いずれの担体上でも生
存していることが分かった（図９−２０参照）。この結
果は、切片、および無細胞化処理した切片からなる細胞
培養担体には、細胞毒性が無いことを示唆する。
【００２４】次に、実施例１でスライドグラス上に作製
したウシ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片からなる細
胞培養担体、および実施例２でスライドグラス上に作製
したウシ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片を０．１％
ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、菌液トレイ
内に挿入した。この菌液トレイに、２０ｍｌの培養液に
懸濁したＢｅＷｏ細胞を、終濃度が４．５×１０4／ｃ
ｍ2となるように播種して、５％ＣＯ2、９５％空気、３
７℃の保湿インキュベータ内で１日間培養した。位相差
顕微鏡による培養細胞の形態観察を行った結果、切片の
付着していないスライドグラス上では、接着したコロニ
ー内で個々の細胞は敷石状によく伸展していたが、切片
上および無細胞化処理した切片上では切片の厚みが増す
につれて、接着したコロニー内で個々の細胞は丸く凝集
する傾向を示すことが分かった（図２１−２７参照）。 （実施例４：ウシ胎盤凍結切片からなる細胞培養担体上
でのＮＨＤＦ細胞の培養）正常ヒト新生児包皮皮膚線維
芽細胞であるＮＨＤＦ細胞を用いて、切片からなる細胞
培養担体を取り込んだ多細胞性三次元凝集塊の形成を検
討した。ＮＨＤＦ細胞（倉敷紡績（株）KF-4109 ）は、
培養液（１０％非動化牛胎仔血清、２０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ(GIBCO BRL #15630-080)、１００units／ｍｌペニシ
リン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含
有するＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle Medium; G
IBCO BRL #11885-084)）で継代培養した。
したウシ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片からなる細
胞培養担体、および実施例２でスライドグラス上に作製
したウシ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片を０．１％
ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、菌液トレイ
内に挿入した。この菌液トレイに、２０ｍｌの培養液に
懸濁したＢｅＷｏ細胞を、終濃度が４．５×１０4／ｃ
ｍ2となるように播種して、５％ＣＯ2、９５％空気、３
７℃の保湿インキュベータ内で１日間培養した。位相差
顕微鏡による培養細胞の形態観察を行った結果、切片の
付着していないスライドグラス上では、接着したコロニ
ー内で個々の細胞は敷石状によく伸展していたが、切片
上および無細胞化処理した切片上では切片の厚みが増す
につれて、接着したコロニー内で個々の細胞は丸く凝集
する傾向を示すことが分かった（図２１−２７参照）。 （実施例４：ウシ胎盤凍結切片からなる細胞培養担体上
でのＮＨＤＦ細胞の培養）正常ヒト新生児包皮皮膚線維
芽細胞であるＮＨＤＦ細胞を用いて、切片からなる細胞
培養担体を取り込んだ多細胞性三次元凝集塊の形成を検
討した。ＮＨＤＦ細胞（倉敷紡績（株）KF-4109 ）は、
培養液（１０％非動化牛胎仔血清、２０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ(GIBCO BRL #15630-080)、１００units／ｍｌペニシ
リン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含
有するＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle Medium; G
IBCO BRL #11885-084)）で継代培養した。
【００２５】実施例１でスライドグラス上に作製したウ
シ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片からなる細胞培養
担体、および実施例２でスライドグラス上に作製したウ
シ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片を０．１％ＳＤＳ
処理で無細胞化した細胞培養担体を、菌液トレイ内に挿
入した。この菌液トレイに、２０ｍｌの培養液に懸濁し
たＮＨＤＦ細胞を、終濃度が３．３×１０4／ｃｍ2とな
るように播種して、５％ＣＯ2、９５％空気、３７℃の
保湿インキュベータ内で培養した。培養４時間後に、菌
液トレイ内のスライドグラスを、１０ｍｌの培養液を入
れた直径１００ｍｍの培養皿内へ１枚ずつ移し入れた。
以後、１日おきに培養液の交換を行い、９日目まで培養
した。位相差顕微鏡による培養細胞の形態観察を行った
結果、培養７日目に、無細胞化処理した２０μｍ切片上
で多層化増殖した細胞は、切片由来組織を取り込んでシ
ート状にスライドグラスから剥離し始め（図２８、２９
参照）、軽くピペッティングすることで完全に剥離し培
養液中に浮遊した（図３０参照）。この剥離した細胞シ
ートを、細胞が接着し辛いとされている直径３５ｍｍの
ポリスチレン製の疎水性培養皿へ、２ｍｌの培養液と共
に移し入れて培養を続けた。切片由来組織を取り込んだ
細胞シートは、疎水性培養皿内で培養して７時間目には
かなり凝集し（図３１参照）、２日目（培養開始後９日
目）には周囲が滑らかな三次元の多細胞性凝集塊を形成
した（図３２参照）。なお、培養開始後８日目には、無
細胞化処理した１０μｍ切片上で多層化増殖した細胞も
スライドグラスから剥離し始めることが、さらに、培養
開始後９日目には、残りの５，１０，２０μｍ切片上お
よび無細胞化処理した５μｍ切片上で多層化増殖した細
胞も、スライドグラスから剥離し始めることが分かっ
た。 （実施例５：ウシ胎盤凍結切片からなる細胞培養担体上
でのＣＰＡＥ細胞の培養）ウシの肺動脈血管内皮細胞株
であるＣＰＡＥ細胞を用いて、切片からなる細胞培養担
体による形態形成を検討した。ＣＰＡＥ細胞（ヒューマ
ンサイエンス振興財団より分譲JCRB9022）は、培養液
（１０％非動化牛胎仔血清、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１
００units／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ
ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）で継代培養し
た。
シ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片からなる細胞培養
担体、および実施例２でスライドグラス上に作製したウ
シ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片を０．１％ＳＤＳ
処理で無細胞化した細胞培養担体を、菌液トレイ内に挿
入した。この菌液トレイに、２０ｍｌの培養液に懸濁し
たＮＨＤＦ細胞を、終濃度が３．３×１０4／ｃｍ2とな
るように播種して、５％ＣＯ2、９５％空気、３７℃の
保湿インキュベータ内で培養した。培養４時間後に、菌
液トレイ内のスライドグラスを、１０ｍｌの培養液を入
れた直径１００ｍｍの培養皿内へ１枚ずつ移し入れた。
以後、１日おきに培養液の交換を行い、９日目まで培養
した。位相差顕微鏡による培養細胞の形態観察を行った
結果、培養７日目に、無細胞化処理した２０μｍ切片上
で多層化増殖した細胞は、切片由来組織を取り込んでシ
ート状にスライドグラスから剥離し始め（図２８、２９
参照）、軽くピペッティングすることで完全に剥離し培
養液中に浮遊した（図３０参照）。この剥離した細胞シ
ートを、細胞が接着し辛いとされている直径３５ｍｍの
ポリスチレン製の疎水性培養皿へ、２ｍｌの培養液と共
に移し入れて培養を続けた。切片由来組織を取り込んだ
細胞シートは、疎水性培養皿内で培養して７時間目には
かなり凝集し（図３１参照）、２日目（培養開始後９日
目）には周囲が滑らかな三次元の多細胞性凝集塊を形成
した（図３２参照）。なお、培養開始後８日目には、無
細胞化処理した１０μｍ切片上で多層化増殖した細胞も
スライドグラスから剥離し始めることが、さらに、培養
開始後９日目には、残りの５，１０，２０μｍ切片上お
よび無細胞化処理した５μｍ切片上で多層化増殖した細
胞も、スライドグラスから剥離し始めることが分かっ
た。 （実施例５：ウシ胎盤凍結切片からなる細胞培養担体上
でのＣＰＡＥ細胞の培養）ウシの肺動脈血管内皮細胞株
であるＣＰＡＥ細胞を用いて、切片からなる細胞培養担
体による形態形成を検討した。ＣＰＡＥ細胞（ヒューマ
ンサイエンス振興財団より分譲JCRB9022）は、培養液
（１０％非動化牛胎仔血清、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１
００units／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ
ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）で継代培養し
た。
【００２６】実施例１でスライドグラス上に作製したウ
シ胎盤の５μｍ凍結切片からなる細胞培養担体、および
実施例２でスライドグラス上に作製したウシ胎盤の５μ
ｍ凍結切片を０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培
養担体を、菌液トレイ内に挿入した。この菌液トレイ
に、２０ｍｌの培養液に懸濁したＣＰＡＥ細胞を、終濃
度が３．４×１０4／ｃｍ2となるように播種して、５％
ＣＯ2、９５％空気、３７℃の保湿インキュベータ内で
培養した。培養１日後に、菌液トレイ内のスライドグラ
スを、１０ｍｌの培養液を入れた直径１００ｍｍの培養
皿内へ１枚ずつ移し入れた。以後、１日おきに培養液の
交換を行い、３日目まで培養した。その結果、培養１日
目の位相差顕微鏡による培養細胞の形態観察では、切片
の付着していないスライドグラス上で培養した細胞は敷
石状形態を示す細胞が多いのに対して、切片上および無
細胞化処理した切片上で培養した細胞は比較的細長く伸
展した形態を示す細胞が多いことが分かった（図３３−
３５参照）。さらに、培養３日目の位相差顕微鏡による
培養細胞の形態観察、およびヘマトキシリン・エオシン
染色したスライドグラスの光学顕微鏡による観察では、
切片の付着していないスライドグラス上で培養した殆ど
の細胞は敷石状形態を示すのに対して、切片上および無
細胞化処理した切片上で培養した細胞は、切片由来組織
を取り込んで血管網様構造を形成することが分かった
（図３６−４０参照）。 （実施例６−ウシ胎盤凍結切片からなる細胞培養担体上
でのＰＣ−１２細胞の培養）ラット褐色細胞腫であるＰ
Ｃ−１２細胞を用いて、切片からなる細胞培養担体によ
る形態形成を、通常の継代培養に用いる培養液による培
養と無血清培養液による培養の両方で検討した。ＰＣ−
１２細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行より
分譲RCB0009）は、培養液（１０％非動化牛胎仔血清、
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００units／ｍｌペニシリ
ン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有
するＤＭＥＭ）で継代培養した。
シ胎盤の５μｍ凍結切片からなる細胞培養担体、および
実施例２でスライドグラス上に作製したウシ胎盤の５μ
ｍ凍結切片を０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培
養担体を、菌液トレイ内に挿入した。この菌液トレイ
に、２０ｍｌの培養液に懸濁したＣＰＡＥ細胞を、終濃
度が３．４×１０4／ｃｍ2となるように播種して、５％
ＣＯ2、９５％空気、３７℃の保湿インキュベータ内で
培養した。培養１日後に、菌液トレイ内のスライドグラ
スを、１０ｍｌの培養液を入れた直径１００ｍｍの培養
皿内へ１枚ずつ移し入れた。以後、１日おきに培養液の
交換を行い、３日目まで培養した。その結果、培養１日
目の位相差顕微鏡による培養細胞の形態観察では、切片
の付着していないスライドグラス上で培養した細胞は敷
石状形態を示す細胞が多いのに対して、切片上および無
細胞化処理した切片上で培養した細胞は比較的細長く伸
展した形態を示す細胞が多いことが分かった（図３３−
３５参照）。さらに、培養３日目の位相差顕微鏡による
培養細胞の形態観察、およびヘマトキシリン・エオシン
染色したスライドグラスの光学顕微鏡による観察では、
切片の付着していないスライドグラス上で培養した殆ど
の細胞は敷石状形態を示すのに対して、切片上および無
細胞化処理した切片上で培養した細胞は、切片由来組織
を取り込んで血管網様構造を形成することが分かった
（図３６−４０参照）。 （実施例６−ウシ胎盤凍結切片からなる細胞培養担体上
でのＰＣ−１２細胞の培養）ラット褐色細胞腫であるＰ
Ｃ−１２細胞を用いて、切片からなる細胞培養担体によ
る形態形成を、通常の継代培養に用いる培養液による培
養と無血清培養液による培養の両方で検討した。ＰＣ−
１２細胞（理化学研究所ジーンバンク細胞開発銀行より
分譲RCB0009）は、培養液（１０％非動化牛胎仔血清、
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００units／ｍｌペニシリ
ン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有
するＤＭＥＭ）で継代培養した。
【００２７】実施例１でスライドグラス上に作製したウ
シ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片からなる細胞培養
担体を、菌液トレイ内に挿入した。この菌液トレイに、
２０ｍｌの培養液に懸濁したＰＣ−１２細胞を、終濃度
が１４．５×１０4／ｃｍ2となるように播種して、５％
ＣＯ2、９５％空気、３７℃の保温インキュベータ内で
培養した。培養４時間後に、菌液トレイ内のスライドグ
ラスを、１０ｍｌの培養液を入れた直径１００ｍｍの培
養皿内へ１枚ずつ移し入れた。以後、毎日培養液の交換
を行い、２日目まで培養した。２日間培養した後に、ス
ライドグラスをヘマトキシリン・エオシン染色して光学
顕微鏡による観察を行った結果、５，１０，２０μｍの
いずれの厚みの切片においてもウシ胎盤由来の細胞が観
察できないこと（図４１−４３参照）、および切片上で
培養した細胞は、切片の付着していないスライドグラス
上で培養した細胞に比べて大きく接着伸展していること
（図４４参照）が分かった。さらに、ウシ胎盤切片上
で、胎盤中隔がある絨毛叢に相当する領域では、胎盤中
隔上で敷石状細胞が主に接着伸展して、胎盤中隔の縁に
沿って扁平化細胞が接着伸展していること（図４２参
照）、ウシ胎盤切片上で、絨毛叢に接する子宮小丘の結
合織が豊富な領域では、敷石状細胞が接着伸展している
こと（図４５参照）、および、ウシ胎盤切片上で、子宮
小丘の粘膜固有層側の領域では、子宮腺や血管の内腔側
に沿って扁平化細胞が接着伸展していること（図４６参
照）が分かった。この結果は、培養細胞が、切片上の微
細構造を認識して細胞形態を変化させていることを示唆
する。
シ胎盤の５，１０，２０μｍ凍結切片からなる細胞培養
担体を、菌液トレイ内に挿入した。この菌液トレイに、
２０ｍｌの培養液に懸濁したＰＣ−１２細胞を、終濃度
が１４．５×１０4／ｃｍ2となるように播種して、５％
ＣＯ2、９５％空気、３７℃の保温インキュベータ内で
培養した。培養４時間後に、菌液トレイ内のスライドグ
ラスを、１０ｍｌの培養液を入れた直径１００ｍｍの培
養皿内へ１枚ずつ移し入れた。以後、毎日培養液の交換
を行い、２日目まで培養した。２日間培養した後に、ス
ライドグラスをヘマトキシリン・エオシン染色して光学
顕微鏡による観察を行った結果、５，１０，２０μｍの
いずれの厚みの切片においてもウシ胎盤由来の細胞が観
察できないこと（図４１−４３参照）、および切片上で
培養した細胞は、切片の付着していないスライドグラス
上で培養した細胞に比べて大きく接着伸展していること
（図４４参照）が分かった。さらに、ウシ胎盤切片上
で、胎盤中隔がある絨毛叢に相当する領域では、胎盤中
隔上で敷石状細胞が主に接着伸展して、胎盤中隔の縁に
沿って扁平化細胞が接着伸展していること（図４２参
照）、ウシ胎盤切片上で、絨毛叢に接する子宮小丘の結
合織が豊富な領域では、敷石状細胞が接着伸展している
こと（図４５参照）、および、ウシ胎盤切片上で、子宮
小丘の粘膜固有層側の領域では、子宮腺や血管の内腔側
に沿って扁平化細胞が接着伸展していること（図４６参
照）が分かった。この結果は、培養細胞が、切片上の微
細構造を認識して細胞形態を変化させていることを示唆
する。
【００２８】次に、実施例１でスライドグラス上に作製
したウシ胎盤の５μｍ凍結切片からなる細胞培養担体、
および実施例２でスライドグラス上に作製したウシ胎盤
の５μｍ凍結切片を０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した
細胞培養担体を菌液トレイ内に挿入した。この菌液トレ
イに、２０ｍｌの無血清培養液に懸濁したＰＣ−１２細
胞を、終濃度が４．６×１０4／ｃｍ2となるように播種
して５％ＣＯ2、９５％空気、３７℃の保温インキュベ
ータ内で培養した。培養４時間後に、菌液トレイ内のス
ライドグラスを、１０ｍｌの無血清培養液を入れた直径
１００ｍｍの培養皿内へ１枚ずつ移し入れた。以後、１
日おきに無血清培養液の交換を行い、５日目まで培養し
た。その結果、培養５日目の位相差顕微鏡による培養細
胞の形態観察では、切片の付着していないスライドグラ
ス上で培養した細胞は、殆んど全てが死んでいる（図４
７参照）のに対して、無細胞化処理した切片上で培養し
た細胞は、敷石状に接着伸展して生きている細胞もいる
こと（図４８参照）、さらに、切片上で培養した細胞
は、殆んど全てが敷石状に接着伸展して生きていること
（図４９参照）が分かった。さらに、培養５日目のスラ
イドグラスをヘマトキシリン・エオシン染色した後の光
学顕微鏡による観察では、切片上および無細胞化処理し
た切片上で培養した細胞は、敷石状に接着伸展して生き
ていること、さらに、切片上で培養した場合にもウシ胎
盤由来の細胞が明瞭に観察できること、および無細胞化
処理した切片上で培養した場合は、ウシ胎盤由来の細胞
が除去された無細胞組織が明瞭に観察できることが分か
った（図５０、５１参照）。この結果は、切片からなる
細胞培養担体は、無血清培養した際に、細胞の長期間生
存維持を可能にすること、および、細胞を無血清培養す
ることで、長期間培養後でも切片由来の細胞や組織を維
持できることを示唆する。
したウシ胎盤の５μｍ凍結切片からなる細胞培養担体、
および実施例２でスライドグラス上に作製したウシ胎盤
の５μｍ凍結切片を０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した
細胞培養担体を菌液トレイ内に挿入した。この菌液トレ
イに、２０ｍｌの無血清培養液に懸濁したＰＣ−１２細
胞を、終濃度が４．６×１０4／ｃｍ2となるように播種
して５％ＣＯ2、９５％空気、３７℃の保温インキュベ
ータ内で培養した。培養４時間後に、菌液トレイ内のス
ライドグラスを、１０ｍｌの無血清培養液を入れた直径
１００ｍｍの培養皿内へ１枚ずつ移し入れた。以後、１
日おきに無血清培養液の交換を行い、５日目まで培養し
た。その結果、培養５日目の位相差顕微鏡による培養細
胞の形態観察では、切片の付着していないスライドグラ
ス上で培養した細胞は、殆んど全てが死んでいる（図４
７参照）のに対して、無細胞化処理した切片上で培養し
た細胞は、敷石状に接着伸展して生きている細胞もいる
こと（図４８参照）、さらに、切片上で培養した細胞
は、殆んど全てが敷石状に接着伸展して生きていること
（図４９参照）が分かった。さらに、培養５日目のスラ
イドグラスをヘマトキシリン・エオシン染色した後の光
学顕微鏡による観察では、切片上および無細胞化処理し
た切片上で培養した細胞は、敷石状に接着伸展して生き
ていること、さらに、切片上で培養した場合にもウシ胎
盤由来の細胞が明瞭に観察できること、および無細胞化
処理した切片上で培養した場合は、ウシ胎盤由来の細胞
が除去された無細胞組織が明瞭に観察できることが分か
った（図５０、５１参照）。この結果は、切片からなる
細胞培養担体は、無血清培養した際に、細胞の長期間生
存維持を可能にすること、および、細胞を無血清培養す
ることで、長期間培養後でも切片由来の細胞や組織を維
持できることを示唆する。
【００２９】もちろん、この発明は、以上の例によって
何ら限定されるものではない。スライドグラスの上に
は、複数個(枚)の切片が載置されていてもよいことは言
うまでもない。そして切片を作製する動物組織はもとよ
り、培養対象となる動物細胞、切片の状態、支持体、培
養液組成、培養条件などにつても様々な態様が可能であ
ることは多言を要しない。この出願の発明は、これら各
種の形態、態様を包括するものである。
何ら限定されるものではない。スライドグラスの上に
は、複数個(枚)の切片が載置されていてもよいことは言
うまでもない。そして切片を作製する動物組織はもとよ
り、培養対象となる動物細胞、切片の状態、支持体、培
養液組成、培養条件などにつても様々な態様が可能であ
ることは多言を要しない。この出願の発明は、これら各
種の形態、態様を包括するものである。
【００３０】
【発明の効果】この出願の発明により、動物細胞の培養
担体として、より生体組織に近い培養環境、即ち、目的
とする生体組織の場所的かつ時間的情報が組込まれた環
境が提供される。この出願の発明の培養担体上で細胞を
培養することにより、目的とする細胞と、生体組織の場
所的かつ時間的情報との相互作用を利用した細胞の諸性
質や特性の解明、およびその相互作用を利用した遺伝子
の機能解析、さらには生体組織の鋳型を利用した組織の
再構築、およびその再構築組織の移植が可能となる。
担体として、より生体組織に近い培養環境、即ち、目的
とする生体組織の場所的かつ時間的情報が組込まれた環
境が提供される。この出願の発明の培養担体上で細胞を
培養することにより、目的とする細胞と、生体組織の場
所的かつ時間的情報との相互作用を利用した細胞の諸性
質や特性の解明、およびその相互作用を利用した遺伝子
の機能解析、さらには生体組織の鋳型を利用した組織の
再構築、およびその再構築組織の移植が可能となる。
【図１】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を付着伸
展したスライドグラス４枚を、菌液トレイに装入した実
体写真。
展したスライドグラス４枚を、菌液トレイに装入した実
体写真。
【図２】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からなる
細胞培養担体を、ヘマトキシリン・エオシン染色した光
学顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
細胞培養担体を、ヘマトキシリン・エオシン染色した光
学顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図３】５μｍに薄切した発情後１３日目の未経産ウシ
子宮のパラフィン切片を、付着進展した直径３５ｍｍの
ポリスチレン製の親水性培養皿の実体写真。
子宮のパラフィン切片を、付着進展した直径３５ｍｍの
ポリスチレン製の親水性培養皿の実体写真。
【図４】５μｍに薄切した発情後１３日目の未経産ウシ
子宮のパラフィン切片を、付着伸展した直径３５ｍｍの
ポリスチレン製の疎水性培養皿の実体写真。
子宮のパラフィン切片を、付着伸展した直径３５ｍｍの
ポリスチレン製の疎水性培養皿の実体写真。
【図５】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．０
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、ヘマト
キシリン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、ヘマト
キシリン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
【図６】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．１
％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、ヘマトキ
シリン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上の
バーは、２００μｍに相当）
％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、ヘマトキ
シリン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上の
バーは、２００μｍに相当）
【図７】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．５
％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、ヘマトキ
シリン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上の
バーは、２００μｍに相当）
％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、ヘマトキ
シリン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上の
バーは、２００μｍに相当）
【図８】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を１．０
％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、ヘマトキ
シリン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上の
バーは、２００μｍに相当）
％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体を、ヘマトキ
シリン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上の
バーは、２００μｍに相当）
【図９】切片の付着していないスライドグラス上で、Ｂ
ｅＷｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真
上のバーは、２００μｍに相当）
ｅＷｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真
上のバーは、２００μｍに相当）
【図１０】切片の付着していないスライドグラス上で、
ＢｅＷｏ細胞を１日間培養し、calcein 蛍光発色で生存
細胞を観察した蛍光顕微鏡写真。（写真上のバーは、２
００μｍに相当）
ＢｅＷｏ細胞を１日間培養し、calcein 蛍光発色で生存
細胞を観察した蛍光顕微鏡写真。（写真上のバーは、２
００μｍに相当）
【図１１】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
【図１２】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養したca
lcein蛍光発色で生存細胞を観察した蛍光顕微鏡写真。
（写真上のバーは、２００μｍに相当）
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養したca
lcein蛍光発色で生存細胞を観察した蛍光顕微鏡写真。
（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図１３】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
【図１４】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を１日間培養し、calcein蛍光発色で生存細胞
を観察した蛍光顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００
μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を１日間培養し、calcein蛍光発色で生存細胞
を観察した蛍光顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００
μｍに相当）
【図１５】切片の付着していないスライドグラス上で、
ＢｅＷｏ細胞を４日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
ＢｅＷｏ細胞を４日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
【図１６】切片の付着していないスライドグラス上で、
ＢｅＷｏ細胞を４日間培養し、calcein 蛍光発色で生存
細胞を観察した蛍光顕微鏡写真。（写真上のバーは、２
００μｍに相当）
ＢｅＷｏ細胞を４日間培養し、calcein 蛍光発色で生存
細胞を観察した蛍光顕微鏡写真。（写真上のバーは、２
００μｍに相当）
【図１７】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を４日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を４日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
【図１８】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を４日間培養し、ca
lcein蛍光発色で生存細胞を観察した蛍光顕微鏡写真。
（写真上のバーは、２００μｍに相当）
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を４日間培養し、ca
lcein蛍光発色で生存細胞を観察した蛍光顕微鏡写真。
（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図１９】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を４日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を４日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
【図２０】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を４日間培養し、calcein蛍光発色で生存細胞
を観察した蛍光顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００
μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を４日間培養し、calcein蛍光発色で生存細胞
を観察した蛍光顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００
μｍに相当）
【図２１】切片の付着していないスライドグラス上で、
ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
【図２２】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
る細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
【図２３】１０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片から
なる細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した
位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
なる細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した
位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
【図２４】２０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片から
なる細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した
位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
なる細胞培養担体上で、ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した
位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
【図２５】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、Ｂｅ
Ｗｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
【図２６】１０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を
０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、
ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、
ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
【図２７】２０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を
０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、
ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、
ＢｅＷｏ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
【図２８】２０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を
０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、
ＮＨＤＦ細胞を培養した。切片上で多層化増殖した細胞
は、培養７日目に、切片由来組織を取り込んでシート上
にスライドグラスから剥離し始めた。その位相差顕微鏡
写真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、
ＮＨＤＦ細胞を培養した。切片上で多層化増殖した細胞
は、培養７日目に、切片由来組織を取り込んでシート上
にスライドグラスから剥離し始めた。その位相差顕微鏡
写真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図２９】２０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を
０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、
ＮＨＤＦ細胞を培養した。切片上で多層化増殖した細胞
は、培養７日目に、切片由来組織を取り込んでシート上
にスライドグラスから剥離し始めた。図２８と異なる部
分の位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍ
に相当）
０．１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、
ＮＨＤＦ細胞を培養した。切片上で多層化増殖した細胞
は、培養７日目に、切片由来組織を取り込んでシート上
にスライドグラスから剥離し始めた。図２８と異なる部
分の位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍ
に相当）
【図３０】２０μｍの切片上で多層化増殖したＮＨＤＦ
細胞が、完全に培養液中に剥離したときの位相差顕微鏡
写真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
細胞が、完全に培養液中に剥離したときの位相差顕微鏡
写真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図３１】切片由来組織を取り込んだ細胞シートを、疎
水性培養皿内で培養して７時間後の位相差顕微鏡写真。
（写真上のバーは、２００μｍに相当）
水性培養皿内で培養して７時間後の位相差顕微鏡写真。
（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図３２】疎水性培養皿内で培養して２日後に形成され
た、切片由来組織を取り込んだ三次元の多細胞性凝縮塊
の位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに
相当）
た、切片由来組織を取り込んだ三次元の多細胞性凝縮塊
の位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに
相当）
【図３３】切片の付着していないスライドグラス上で、
ＣＰＡＥ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
ＣＰＡＥ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
【図３４】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＣＰＡＥ細胞を１日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
る細胞培養担体上で、ＣＰＡＥ細胞を１日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
【図３５】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＣＰ
ＡＥ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＣＰ
ＡＥ細胞を１日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
【図３６】切片の付着していないスライドグラス上で、
ＣＰＡＥ細胞を３日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
ＣＰＡＥ細胞を３日間培養した位相差顕微鏡写真。（写
真上のバーは、２００μｍに相当）
【図３７】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＣＰＡＥ細胞を３日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
る細胞培養担体上で、ＣＰＡＥ細胞を３日間培養した位
相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
【図３８】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＣＰ
ＡＥ細胞を３日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＣＰ
ＡＥ細胞を３日間培養した位相差顕微鏡写真。（写真上
のバーは、２００μｍに相当）
【図３９】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＣＰＡＥ細胞を３日間培養した後
に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡写
真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
る細胞培養担体上で、ＣＰＡＥ細胞を３日間培養した後
に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡写
真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図４０】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＣＰ
ＡＥ細胞を３日間培養した後に、ヘマトキシリン・エオ
シン染色した光学顕微鏡写真。（写真上のバーは、２０
０μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＣＰ
ＡＥ細胞を３日間培養した後に、ヘマトキシリン・エオ
シン染色した光学顕微鏡写真。（写真上のバーは、２０
０μｍに相当）
【図４１】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養した
後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡写
真。特に、ウシ胎盤切片上で、胎盤中隔がある絨毛叢に
相当する領域。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
る細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養した
後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡写
真。特に、ウシ胎盤切片上で、胎盤中隔がある絨毛叢に
相当する領域。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図４２】１０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片から
なる細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養し
た後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡
写真。特に、ウシ胎盤切片上で、胎盤中隔がある絨毛叢
に相当する領域。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
なる細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養し
た後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡
写真。特に、ウシ胎盤切片上で、胎盤中隔がある絨毛叢
に相当する領域。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
【図４３】２０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片から
なる細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養し
た後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡
写真。特に、ウシ胎盤切片上で、胎盤中隔がある絨毛叢
に相当する領域。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
なる細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養し
た後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡
写真。特に、ウシ胎盤切片上で、胎盤中隔がある絨毛叢
に相当する領域。（写真上のバーは、２００μｍに相
当）
【図４４】切片の付着していないスライドグラス上で、
ＰＣ−１２細胞を２日間培養した後に、ヘマトキシリン
・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上のバー
は、２００μｍに相当）
ＰＣ−１２細胞を２日間培養した後に、ヘマトキシリン
・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上のバー
は、２００μｍに相当）
【図４５】１０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片から
なる細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養し
た後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡
写真。特に、ウシ胎盤切片上で、絨毛叢に接する子宮小
丘の結合織が豊富な領域。（写真上のバーは、２００μ
ｍに相当）
なる細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養し
た後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡
写真。特に、ウシ胎盤切片上で、絨毛叢に接する子宮小
丘の結合織が豊富な領域。（写真上のバーは、２００μ
ｍに相当）
【図４６】１０μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片から
なる細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養し
た後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡
写真。特に、ウシ胎盤切片上で、子宮小丘の粘膜固有層
側の領域。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
なる細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を２日間培養し
た後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡
写真。特に、ウシ胎盤切片上で、子宮小丘の粘膜固有層
側の領域。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図４７】切片の付着していないスライドグラス上で、
ＰＣ−１２細胞を５日間無血清培養した位相差顕微鏡写
真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
ＰＣ−１２細胞を５日間無血清培養した位相差顕微鏡写
真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図４８】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＰＣ
−１２細胞を５日間無血清培養した位相差顕微鏡写真。
（写真上のバーは、２００μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＰＣ
−１２細胞を５日間無血清培養した位相差顕微鏡写真。
（写真上のバーは、２００μｍに相当）
【図４９】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を５日間無血清培
養した位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μ
ｍに相当）
る細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を５日間無血清培
養した位相差顕微鏡写真。（写真上のバーは、２００μ
ｍに相当）
【図５０】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片を０．
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＰＣ
−１２細胞を５日間無血清培養した後に、ヘマトキシリ
ン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上のバー
は、２００μｍに相当）
１％ＳＤＳ処理で無細胞化した細胞培養担体上で、ＰＣ
−１２細胞を５日間無血清培養した後に、ヘマトキシリ
ン・エオシン染色した光学顕微鏡写真。（写真上のバー
は、２００μｍに相当）
【図５１】５μｍに薄切したウシ胎盤の凍結切片からな
る細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を５日間無血清培
養した後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕
微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
る細胞培養担体上で、ＰＣ−１２細胞を５日間無血清培
養した後に、ヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕
微鏡写真。（写真上のバーは、２００μｍに相当）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 高橋 透 茨城県つくば市松代５−15−503−402 (72)発明者 橋爪 一善 東京都葛飾区堀切１−41−９−403
Claims (23)
- 【請求項１】 動物細胞を培養する担体が、生物の組織
を薄切した切片からなることを特徴とする細胞培養担
体。 - 【請求項２】 生物の組織を薄切した切片が、支持体に
付着または付着伸展している請求項１記載の細胞培養担
体。 - 【請求項３】 支持体が、ガラス、プラスチック、ゴ
ム、金属、天然または合成の糸および／またはその織成
体、および生体吸収性材料から選ばれる１種以上である
請求項２記載の細胞培養担体。 - 【請求項４】 支持体には予め切片の付着または付着伸
展を促進する処理が施されている請求項２または３記載
の細胞培養担体。 - 【請求項５】 生物の組織が、新鮮な組織または予め固
定液で固定した組織である請求項１記載の細胞培養担
体。 - 【請求項６】 薄切する前の生物の組織、または生物の
組織を薄切した切片に無細胞化する処理が施されている
請求項１記載の細胞培養担体。 - 【請求項７】 生物の組織を薄切した切片に、生理活性
物質を結合できる抗体や核酸プローブの処理を施して、
切片上の特定の場所に外来性の生理活性物質を導入する
ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。 - 【請求項８】 生物の組織を薄切した切片に、酵素の処
理など生物学的処理または酸やアルカリや界面活性剤の
処理など化学的処理を施して、切片に於ける生物の構成
成分や微細構造を改変もしくは修飾することを特徴とす
る請求項１記載の細胞培養担体。 - 【請求項９】 生物の組織を薄切するために、予め生物
の組織が凍結または凍結包埋、パラフィン包埋、または
樹脂包埋されている請求項１記載の細胞培養担体。 - 【請求項１０】 生物が動物または植物である請求項１
記載の細胞培養担体。 - 【請求項１１】 動物が哺乳動物である請求項１０記載
の細胞培養担体。 - 【請求項１２】 生物の組織が、生前の発生段階にある
動物の全身または一部である請求項１記載の細胞培養担
体。 - 【請求項１３】 生物の組織が、生後の動物の全身また
は一部である請求項１記載の細胞培養担体。 - 【請求項１４】 請求項１ないし１３記載のいずれかの
細胞培養担体を培養容器に装入して動物細胞を培養する
ことを特徴とする細胞培養方法。 - 【請求項１５】 動物細胞の培養を開始する手段が、細
胞懸濁液、細切組織片、受精卵、または三次元再構築し
た多細胞性凝集塊の播種によることを特徴とする請求項
１４記載の細胞培養方法。 - 【請求項１６】 播種した動物細胞が付着増殖して、切
片または切片に由来する組織を、請求項２ないし４記載
のいずれかの支持体から剥離することを特徴とする請求
項１４ないし１５記載の細胞培養方法。 - 【請求項１７】 支持体から剥離した後に培養を続ける
ことで、切片または切片に由来する組織を取り込んだ三
次元の多細胞性凝集塊を形成することを特徴とする請求
項１６記載の細胞培養方法。 - 【請求項１８】 培養する動物細胞が、初代培養細胞、
株化細胞、受精卵、および／またはそれらに外来性遺伝
子を導入した細胞から選ばれる１種または２種以上であ
る請求項１４記載の細胞培養方法。 - 【請求項１９】 培養する動物細胞が、未分化な幹細
胞、分化過程にある細胞、終末分化した細胞、および／
または脱分化した細胞に由来することを特徴とする請求
項１４記載の細胞培養方法。 - 【請求項２０】 未分化な幹細胞が、特に胚性幹細胞で
あることを特徴とする請求項１９記載の細胞培養方法。 - 【請求項２１】 動物細胞を培養する培養液が、血清含
有の培養液または血清非含有の無血清培養液であること
を特徴とする請求項１４ないし２０記載のいずれかの細
胞培養方法。 - 【請求項２２】 請求項１４ないし２１記載のいずれか
の細胞培養方法により培養した動物細胞を、動物に移植
することを特徴とする細胞移植方法。 - 【請求項２３】 移植する動物が哺乳動物である請求項
２２記載の細胞移植方法。
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2001
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