CN1372592A - 生物组织薄切片制成的动物细胞培养载体以及利用该载体的动物细胞的培养方法和移植方法 - Google Patents
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Abstract
培养动物细胞的载体,是由生物组织薄切片构成的或者是由生物组织薄切片贴附于支持物或贴附伸展于支持物而成的。利用该载体的培养方法和移植方法。利用本发明作为培养动物细胞的载体,更接近生物组织的培养环境,即提供靶生物组织的场所以及时间上的环境信息。通过在本发明的培养载体上培养细胞能够对培养载体与靶细胞以及利用组织的场所上的以及时间上的信息的相互作用阐明细胞的各种性质和特性,以及利用这些相互作用对基因进行功能解析,以及利用生物体组织模板进行组织的再构建,以及再构建组织的移植都成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织薄切片制成的动物细胞培养载体以及利用该载体的动物细胞的培养方法和移植方法。更详细地讲,本申请的发明是关于能为动物细胞在培养体系中提供生物组织的场所以及时间上的环境信息的培养载体,以及在该载体上动物细胞的培养方法和在该载体上培养的细胞的移植方法的发明,由于在来自各种生物组织的载体上能够培养各种各样的细胞,所以利用该载体对维持功能细胞的培养、对细胞行为和功能的评价以及对接近生物体的组织再构建成为可能,因此该发明在基因功能的评价、培养脏器的开发以及细胞移植等方面是有用的。
背景技术
通过改善动物细胞的培养环境,培养的动物细胞的应用领域可扩大到医药品等生理活性物质的开发研究以及其制造手段、或者培养脏器的制造和其移植,对现代社会作贡献。而人们为了使取自动物的功能细胞发挥其功能一直在开发培养动物细胞用的各种各样的培养载体。因为通过在培养载体的原材料和形状上开动脑筋,可以对细胞的贴附、生长、移动、浸润、增殖、分化、极化、自身组织化等细胞行为以及细胞和培养液的相互作用机制进行控制。
到目前为止,动物细胞培养载体的材料可分为天然材料、人工材料以及天然材料和人工材料的混合材料,这些载体的形状各式各样:可吸在支持物上的吸附物、支持物的被膜、胶片、膜、平板、培养皿、烧瓶、中空纤维、纤维或其编织物、凝胶、中空颗粒等。作为天然材料有胶原、纤维连接蛋白、板蛋白、葡糖胺聚糖、蛋白聚糖或基底凝胶(由EHS肿瘤提取之后再构建的基底膜;Kleinman,H.K,et al.Basement membranecomplexes with biological activity,生物化学(Biochem.)25,312,1986.)等从动物组织提取的细胞外基质组成成分、由动物组织制备的无细胞真皮基质(Livesey,S.A.,et al.Transplanted acellularallograft dermal matrix.Transplant.60,1,1996)、来自贻贝的黏蛋白、绢或棉等。而作为培养载体开发的人工材料有尼龙等生物非吸收性的合成高分子、聚二醇酸等生物吸收性的合成高分子、或陶瓷等。
一般来说,动物的原代培养细胞如果使用塑料培养皿作为培养载体培养的话,就会使生物体内出现的组织特异性功能丧失掉;而如果使用含有细胞外基质组成成分的培养载体进行培养的话,比较能够维持其功能,特别是用基底凝胶作为培养载体对上皮细胞进行培养时,可以促进细胞分化,提高组织特异性功能。而如果使用无细胞真皮基质作为培养载体培养角质化细胞的话,角质化细胞分化,在无细胞真皮基质上可形成再构建的表皮。这些见识表明为了诱导培养细胞的组织特异功能或三维微细结构形态,要将该培养的细胞在原来生物体内存在场所的信息正确地反映在培养载体上是很重要的。在动物的组织内,细胞随着时间的推移从未分化状态过渡到终末分化的状态,随着细胞分化状态的变化细胞外基质也时时刻刻在变化着,所以各个细胞所在的细胞外基质环境也随着时间变化。就是说,处于生物体组织内的细胞的周围环境除了所处场所的信息之外,还有时间信息。
然而,反映处于各种各样分化状态的细胞构成的生物组织的环境的培养载体,就是说正确反映生物组织的场所以及时间信息的培养载体到目前为止还没有开发出来。
因此对于任意的动物细胞赋予它酷似生物体内的细胞外环境的培养体系是不可能实现的。
本申请的发明是针对上述那样的状况作出的发明,该发明的课题之一是作为动物细胞的培养载体提供更贴近生物组织的培养环境、即提供靶生物组织的场所以及时间信息综合环境;而本申请发明的另一个课题是通过在该培养载体上对细胞进行培养,利用与靶细胞的相互作用,与生物组织场所以及时间信息的相互作用阐明细胞的各种性质和特性,以及利用这些相互作用对基因的功能进行解析,利用生物组织的模型解析组织的再构建以及再构建组织的移植都成为可能。
发明的公开
本申请发明为动物细胞在培养体系中提供生物组织的场所以及时间上的环境信息的培养载体,发现了对通常在组织学和病理学领域为进行显微镜观察而将制备的薄的生物组织切片直接或实施无细胞化处理等之后用作培养载体的方法。因此,本申请发明包括以下一些内容,第1提供生物组织薄切片制成的动物细胞培养载体;第2提供的细胞培养载体是生物组织的薄切片贴附于支持物或贴附生长于支持物上而成;第3提供的细胞培养载体的支持物为玻璃、塑料、橡胶、金属、天然或合成的丝和/或其织物以及从生物体吸收性材料选出的1种以上材料;第4提供的细胞培养载体预先实施了促进切片贴附或贴附生长的处理。
第5提供的细胞培养载体中的生物组织是由新鲜组织或预先用固定液固定的组织制备的;第6提供的细胞培养载体是未切片的生物组织或对生物组织薄切片实施无细胞化处理的组织;第7提供的细胞培养载体其特征是:实施使生理活性物质能够结合于生物组织薄切片的抗体或核酸探针处理之后,在切片的特定部位导入外源生理活性物质;第8提供的细胞培养载体其特征是:对生物组织薄切片进行酶处理等生物学处理或者酸或碱或表面活性剂处理等化学处理之后,改变或修饰切片中的生物组成成分或微细结构;第9提供的细胞培养载体是由为对生物组织实施切片而预先使生物组织冻结或冻结包埋、石蜡包埋、或树脂包埋的组织制备的;第10提供的细胞培养载体来自动物或植物组织;第11提供的细胞培养载体是由哺乳动物组织制备的;第12提供的细胞培养载体,其中生物组织是取自处于出生前发育阶段的动物的全身或其一部分组织;第13提供的细胞培养载体,其中生物组织是取自处于出生后的动物的全身或其一部分组织。
另外本申请发明的第14提供细胞培养方法,其特征是将第1至第13发明中的任一个发明中的细胞培养载体装入培养容器中对动物细胞进行培养;第15提供细胞培养方法,其特征是:开始培养动物细胞的手段是通过接种细胞悬液、切碎的组织片、受精卵、或重新形成三维的多细胞凝集块进行的;第16提供细胞培养方法,其特征是在接种的动物细胞贴附增殖之后将切片或将从切片长出的组织从第2至第4发明中的支持物上剥离下来;第17提供细胞培养方法,其特征是从支持物上剥离后继续进行培养,形成摄入切片或摄入从切片长出的组织的三维多细胞凝集团;第18提供细胞培养方法,其特征是培养的动物细胞是原代培养细胞、株化细胞、受精卵和/或从导入外源基因的上述细胞中选出的1种或2种以上的细胞;第19提供细胞培养方法,其特征是培养的动物细胞取自于未分化的干细胞、处于分化过程的细胞、终末分化的细胞、和/或去分化的细胞;第20提供细胞培养方法,其特征是:未分化的干细胞是胚干细胞;第21提供第14~20发明的细胞培养方法,其特征是培养动物细胞的培养液是含有血清的培养液或不含血清的无血清培养液;第22提供细胞移植方法,其特征是将利用上述那些细胞培养方法培养的动物细胞移植到动物中;第23提供细胞移植方法,其中进行移植的动物是哺乳动物。
附图的简单说明
图1是将4块贴附生长牛胎盘5μm厚冷冻切片的载玻片放到菌液盘后的实体照片。
图2是对由5μm厚牛胎盘冷冻切片构成的细胞培养载体进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图3是使发情后第13天的未经产牛子宫的5μm厚石蜡切片进行贴附生长的直径35mm的聚苯乙烯亲水性培养皿的实体照片。
图4是使5μm厚的发情后第13天的未经产牛子宫的石蜡切片进行贴附生长的直径35mm的聚苯乙烯疏水性培养皿的实体照片。
图5是对经0.01%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图6是对经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图7是对经0.5%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图8是对经1.0%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图9是在没有贴附切片的载玻片上对BeWo细胞培养一天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图10是在没有贴附切片的载玻片上对BeWo细胞培养一天后的,用calcein荧光发色观察生存细胞的荧光显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图11是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养一天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图12是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养一天后的用calcein荧光发色观察生存细胞的荧光显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图13是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养一天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图14是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养一天后的用calcein荧光发色观察生存细胞的荧光显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图15是在没有贴附切片的载玻片上对BeWo细胞培养4天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图16是在没有贴附切片的载玻片上对BeWo细胞培养4天后用calcein荧光发色观察生存细胞的荧光显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图17是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养4天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图18是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养4天后用calcein荧光发色观察生存细胞的荧光显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图19是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养4天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图20是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养4天后用calcein荧光发色观察生存细胞的荧光显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图21是在没有贴附切片的载玻片上对BeWo细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图22是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图23是在10μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图24是在20μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图25是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图26是在经0.1%SDS无细胞化处理的10μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图27是在经0.1%SDS无细胞化处理的20μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对BeWo细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图28是在经0.1%SDS无细胞化处理的20μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上培养NHDF细胞,在切片上多层增殖的细胞培养到第7天时,摄入切片组织的细胞层开始从载玻片上剥离的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图29是在经0.1%SDS无细胞化处理的20μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上培养NHDF细胞,切片上多层增殖的细胞培养到第7天时,摄入切片组织的细胞层开始从载玻片上剥离的与图28不同部分的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图30是在20μm厚切片上多层增殖的NHDF细胞在培养液中完全剥离时的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图31是摄入切片组织的细胞层在疏水性培养皿内培养7小时后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图32是在疏水性培养皿内培养2天后形成的摄入切片组织的三维多细胞凝集团的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图33是在没有贴附切片的载玻片上对CPAE细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图34是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对CPAE细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图35是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对CPAE细胞培养1天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图36是在没有贴附切片的载玻片上对CPAE细胞培养3天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图37是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对CPAE细胞培养3天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图38是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对CPAE细胞培养3天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图39是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对CPAE细胞培养3天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图40是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对CPAE细胞培养3天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图41是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对PC-12细胞培养2天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。特别是在牛胎盘切片上相当于含有胎盘隔的绒毛丛的区域(照片上的黑线相当于200μm)
图42是在10μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对PC-12细胞培养2天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。特别是在牛胎盘切片上相当于含有胎盘隔的绒毛丛的区域(照片上的黑线相当于200μm)
图43是在20μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对PC-12细胞培养2天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。特别是在牛胎盘切片上相当于含有胎盘隔的绒毛丛的区域(照片上的黑线相当于200μm)
图44是在没有贴附切片的载玻片上对PC-12细胞培养2天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图45是在10μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对PC-12细胞培养2天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。特别是在牛胎盘切片上与绒毛丛连接的子宫小丘的结缔组织丰富的区域(照片上的黑线相当于200μm)
图46是在10μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对PC-12细胞培养2天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。特别是在牛胎盘切片上子宫小丘的粘膜固有层侧的区域(照片上的黑线相当于200μm)
图47是在没有贴附切片的载玻片上对PC-12细胞进行无血清培养5天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图48是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对PC-12细胞进行无血清培养5天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图49是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对PC-12细胞进行无血清培养5天后的相差显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图50是在经0.1%SDS无细胞化处理的5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对PC-12细胞进行无血清培养5天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
图51是在5μm厚牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上对PC-12细胞培养5天后进行苏木精曙红染色后的光学显微镜照片。(照片上的黑线相当于200μm)
实施发明的最佳方式
本申请发明具有如上所述的特征,以下就其实施状况进行说明。
本申请的发明中使用的生物组织可以是动物生前或生后的全身或一部分组织,也可以是整个植物或植物的一部分组织,而且这些组织可以是预先用固定液固定的组织,也可以是新鲜的组织。使用的固定液有甲醇、乙醇、丙酮、福尔马林、戊二醛等。利用的哺乳动物可以是人、猴、牛、绵羊、山羊、狒狒、猪、狗、兔子、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等。使用的动物组织只要是动物全身或一部分组织并没有特别限定,例如可以使用脑、脊髓、肌肉、皮肤、血管、食道、胃、小肠、大肠、心脏、肺、肝脏、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、骨、软骨、子宫、卵巢、输卵管、睾丸、胎盘、脐蒂等,进一步讲无论是正常组织,或者是以肿瘤为代表的各种病灶组织都可以。
在本发明中利用的生物组织薄切片可以是冷冻切片,也可以是石蜡切片,或树脂切片。在组织学和病理学领域中,制备动物或植物的整体或一部分组织的薄切片之后,将薄切片铺在载玻片上,在进行了各种染色后于显微镜下观察等一系列的实验手法都是极其常规的手法。不用说在生物组织的薄切片中包含着生物组织的场所信息的同时也包含了时间的信息,不仅可进行一般的染色而且可以通过免疫组织化学手法或原位杂交技术进行各种各样信息的解析。
利用这样的技术,利用能结合生理活性物质的抗体或核酸探针对薄切片进行处理,将外源生理活性物质导入切片上的特定场所是有可能的。生理活性物质可以是蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、肽、糖类、脂类、糖脂、核酸、低分子化合物等。这些生理活性物质可能具有抗体活性、酶活性、激素作用、细胞因子作用以及促进细胞粘接、增殖、分化、再生、形态形成等作用。
另外对薄切片实施酶作用等生物学上的处理,或是用酸或碱、表面活性剂等化学处理,也有可能改变或修饰薄切片中的生物组成成分或微细结构。在本申请发明中,冷冻切片是利用冷冻切片机对未固定的或用福尔马林等固定的生物组织直接切的,或是包埋于OCT化合物后于液氮等急剧冷冻后切的,切成厚度为1~50μm,最好是4~20μm的薄片。未固定的冷冻切片切后也可用福尔马林等固定。石蜡切片制备通常是将生物组织用福尔马林固定后,用乙醇脱水、二甲苯、石蜡置换后,包埋于石蜡后用切片机切成厚度为0.5~50μm、最好是2~20μm的薄片。另外树脂切片的制备通常是将生物组织用福尔马林固定后,用乙醇脱水,包埋于组织树脂(ヒストレジン)等树脂后,用切片机切成厚度为0.1~50μm、最好是O.5~20μm的薄片。
另外,本发明中可采用的无细胞化处理可以对切片前的生物组织实施处理,也可以对切成的生物组织的薄片实施处理。在无细胞化处理中可以单独或联合使用含有盐类、碱、表面活性剂、螯合剂或酶等溶液。可以使用的盐类,如氯化钠、氯化镁、磷酸钾等,可以使用的碱如氢氧化钠、氢氧化钙、氨水等。另外可以使用的表面活性剂如十二烷基硫酸钠、Triton X-100、Tween 20和80等,可使用的螯合剂如EDTA、EGTA等。另外可使用的酶如胰蛋白酶、胶原酶、デイスバ-ゼ、酯酶、木瓜蛋白酶、基质金属蛋白酶等蛋白分解酶、透明质酸酶等糖分解酶、脱氧核糖核酸酶等核酸分解酶等。
本发明中使用的生物组织薄切片培养载体可以是只由薄切片构成,也可以是由将薄切片贴附在或贴附伸展在玻璃、塑料、橡胶、金属、天然或合成的丝和/或其织物、以及贴附在或贴附伸展在生物体吸收性材料的支持物而构成的复合体构成。另外也可以对支持物实施促进切片贴附或贴附伸展的处理,如在支持物上连接聚赖氨酸、APS等被膜。另外当作为培养载体的薄切片混入了OCT化合物、石蜡、树脂等时也可以通过水洗、脱石蜡处理、或脱树脂处理等去除。还有对作为培养载体的薄切片可以进行乙醇处理、环氧乙烷气处理和γ射线或紫外线等灭菌处理。
在本发明中使用的动物细胞既可以是原代培养细胞,也可以是株化的细胞,也可以是受精卵,或导入了其他外源基因的这些细胞,细胞可以是一种,也可以是2种以上。
动物细胞可以是来自未分化干细胞、处于分化过程的细胞、终末分化的细胞、和/或去分化的细胞中的任一种细胞。未分化干细胞尤以胚胎干细胞最好。这样的动物细胞的培养是通过接种细胞悬液、切碎的组织片、受精卵、或重新形成的三维多细胞凝集团开始的。在动物细胞培养中使用的培养液只要是通常动物细胞培养用的培养液就可以,不管其基础培养液的组成如何,另外培养液中添加还是不添加血清、抗生素、维生素等物质都可以。为了使培养的动物细胞与切片的亲和力强于切片与支持物的亲和力,可通过选择适当的支持物使得动物细胞贴附增殖的切片或切片长出的组织从支持物上剥离下来。通过继续培养从支持物上剥离下来的组织,有可能形成摄入切片或切片长出的组织的三维多细胞凝集团。
另外使用本发明的培养载体通过如下步骤很容易培养动物细胞。例如,将动物组织切成厚6μm的冷冻切片1或2片贴附于1块或2块载玻片上,然后对其实施固定、无细胞化、灭菌、培养液的平衡化等必要的处理后,将该载玻片装入培养皿中,通过接种动物细胞悬液进行培养就可以了。另外,移植使用本发明的培养载体培养的动物细胞通过如下步骤也容易做到:例如将动物组织切成厚6μm的冷冻切片贴附于生物体吸收性的网格上,然后对其实施固定、无细胞化、灭菌、培养液的平衡化等必要的处理后,将该生物体吸收性网格装入培养皿中,接种动物细胞悬液进行培养后,通过移植培养载体移植动物细胞。
实施例
(实施例1:动物组织切片细胞培养载体的制备)
将通过处死采集到的妊娠241日龄的牛胎盘包埋于OCT化合物中,然后在液氮中急速冷冻。用冷冻切片机切成5、10、20μm的薄片,将薄片置于载玻片(松浪玻璃工业(株)制造S-0317)上。以后的操作在超净工作台内进行。将贴附在该冷冻切片的4块载玻片装入菌液槽内(住友电木(株)M-3300N)(参照图1)向该菌液槽内注入20m1的HBSS(Hanks平衡盐溶液Solution;GIBCO BRL#14025-092)后,于室温静置5分钟后再除去注入的溶液,通过该操作将OCT化合物从切片中除去。然后向菌液槽注入20ml的70%的乙醇,于室温静置10分钟后再除去注入的溶液,通过该操作对切片组织进行固定和灭菌。然后用20ml的HBSS洗两次,再用20m1的培养液洗一次。这样操作后牛胎盘冷冻切片细胞培养载体就可以在以载玻片为支持物、以后作为培养容器使用的菌液槽内制备了。根据常规方法通过苏木精曙红染色法可以观察该细胞培养载体。观察结果可以确认该细胞培养载体是牛胎盘组织(参照图2)。
另外,将通过处死采集到的发情后第13天的未经产牛的子宫用10%中性缓冲福尔马林液固定后,按照病理组织学的常规方法包埋于石蜡中。用冷冻切片机切成5μm的薄片,然后将薄片贴附在载玻片(松浪玻璃工业(株)制造S-0317)上。用二甲苯对该载玻片进行脱石蜡处理后,再依次用100%至50%的乙醇进行处理。这以后的操作在超净工作台内进行。将一块贴附切片的载玻片插入直径100mm的培养皿(Falcon#353001)中。向该培养皿注入100ml的HBSS,于室温下缓慢地搅拌5分钟,将切片从载玻片上剥离下来。用移液器将剥离的切片与少量的HBSS一起移入到直径35mm的聚苯乙烯亲水性(Falcon#353001)或疏水性培养皿(Falcon#351008)中,一个培养皿一块切片,在移入切片之前培养皿中注入了2ml的灭菌水。用2ml的灭菌水对各个培养皿内的切片洗2次。对于亲水性培养皿通过将切片铺开,尽可能除去灭菌水,然后风干。通过这样操作,以直径35mm聚苯乙烯的亲水性培养皿作为支持物制备出牛子宫石蜡切片细胞培养载体(参照图3)。对于疏水性培养皿用灭菌水洗2次之后,再用2ml的70%的乙醇洗一次。然后使切片铺开,尽可能除去70%的乙醇后再进行风干。通过这样的操作,以直径35mm聚苯乙烯疏水性培养皿作为支持物制备出牛子宫石蜡切片细胞培养载体(参照图4)。
(实施例2:无细胞化处理切片细胞培养载体的制作)
与实施例1一样,将贴附铺开的牛胎盘的冷冻切片装入位于超净工作台的菌液槽内,注入20ml的HBSS后,于室温静置5分钟将OCT化合物从切片中除去。然后将菌液槽内的贴附切片的载玻片移入直径100mm的培养皿(一个皿一块)(Falcon#351001)。分别注入SDS浓度各为0.01%、0.1%、0.5%和1.0%的10ml SDS(十二烷基硫酸钠)溶液,于室温下静置10分钟,然后除去。通过该操作研究对切片组织进行无细胞化。然后,用20ml的HBSS将培养皿内贴附切片的载玻片洗2次,再用培养液洗1次。按照常规方法对各个切片进行苏木精曙红染色后进行观察,结果可以确认经0.1%SDS处理牛胎盘的冷冻切片能够做到无细胞化(参照图5-8)。通过这样的操作,以载玻片为支持物可制作无细胞化牛胎盘冷冻切片细胞培养载体。
(实施例3:在牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上培养BeWo细胞)
使用人绒毛癌细胞株BeWo细胞研究牛胎盘冷冻切片细胞培养载体的毒性以及对细胞的贴附生长和增殖的影响、还有切片的厚度不同对细胞形态的影响。BeWo细胞(来自Human Science振兴财团JCRB9111)在含有培养液(15%灭活胎牛血清(SIGMA#F-2442)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(GIBCO BRL#15140-148))的Ham’s F12(GIBCOBRL#11765-054)进行传代培养。
将在实施例1中于载玻片上制作的牛胎盘5μm冷冻切片细胞培养载体和在实施例2中于载玻片上制作的经0.1%SDS处理无细胞化的牛胎盘5μm冷冻切片细胞培养载体各2块(共计4块)插入到菌液槽内。在该菌液槽内向20ml的培养液接种BeWo细胞悬液,使其终浓度为2.1×104/cm2,然后于5%CO2、95%空气、37℃的保湿保温箱内进行培养。在培养的第一天,将菌液槽内的载玻片移入加了10ml培养液的直径100mm的培养皿内(一个皿一块)。以后每日交换培养液,一直培养到第4天。在培养的第一天和第4天利用相差显微镜观察培养细胞的形态,以及通过荧光显微镜观察利用存活细胞的calcein AM(分子探针#L-3224)代谢能的calcein荧光发色。培养细胞的calcein AM代谢能是将培养皿内的培养液除去、用10ml的PBS将细胞洗2次后,用10ml含有2μM calceinAM的HBSS于5%CO2、95%空气、37℃的保湿保温箱内培养15分钟后,用荧光显微镜观察的。结果观察到无论是在切片上,还是在无细胞化处理的切片上与没有贴附切片的载玻片一样细胞在培养第1天贴附生长,而在培养的第4天进行增殖,而且贴附生长增殖的细胞无论在那一个载体上都能生存(参照图9-20)。该结果表明在切片以及经无细胞化处理的切片构成的细胞培养载体中没有毒性。
接下来将在实施例1中于载玻片上制作的牛胎盘的5、10、20μm冷冻切片细胞培养载体和在实施例2中于载玻片上制作的经0.1%SDS无细胞化处理的牛胎盘5、10、20μm冷冻切片细胞培养载体插入到菌液槽内。在该菌液槽内向20ml的培养液接种BeWo细胞悬液,使其终浓度为4.5×104/cm2,然后于5%CO2、95%空气、37℃的保湿保温箱内培养一天。利用相差显微镜观察培养细胞的形态,结果表明在没有贴附切片的载玻片上,粘附集落内的各个细胞生长成好看的砌石状,而在切片上以及经无细胞化处理的切片上随着切片厚度的增加粘附的集落内各个细胞有凝集成圆形的倾向(参照图21-27)。
(实施例4:在牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上培养NHDF细胞)
使用正常新生儿包皮皮肤成纤维细胞NHDF细胞研究摄入牛胎盘冷冻切片细胞培养载体的多细胞三维凝集团的形成。NHDF细胞(仓敷纺织(株)KF-4109)在含有培养液(15%灭活胎牛血清(SIGMA#F-2442)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(GIBCO BRL#15140-148))的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium;GIBCO BRL#11885-084)进行传代培养。
将在实施例1中于载玻片上制作的牛胎盘5、10、20μm冷冻切片细胞培养载体和在实施例2中于载玻片上制作的经无细胞化处理的牛胎盘5、10、20μm冷冻切片细胞培养载体插入到菌液槽内。在该菌液槽内向20ml的培养液接种NHDF细胞,使其终浓度为3.3×104/cm2,然后于5%CO2、95%空气、37℃的保湿保温箱内进行培养。培养4小时后,将菌液槽内的载玻片移入加了10ml培养液的直径100mm的培养皿内(一个皿一块)。以后每隔一日交换一次培养液,一直培养到第9天。利用相差显微镜观察培养细胞的形态,结果表明在培养的第7天在无细胞化处理的20μm切片上已多层增殖的细胞形成摄入从切片长出的组织的细胞层开始从载玻片上剥离(参照图28、29),通过轻轻地吸打后,完全剥离浮游在培养液中(参照图30)。将剥离下的细胞片与2ml培养液一起移入细胞难于贴附的直径35mm的聚苯乙烯疏水性培养皿中继续培养。摄入切片的组织的细胞层在疏水性培养皿内培养到第7天凝集得相当多(参照图31),在第2天(开始培养后的第9天)周围形成光滑的三维多细胞凝集团(参照图32)。而在培养开始后第8天在无细胞化处理的10μm切片上多层增殖的细胞也开始从载玻片上剥离,然后在培养开始后第9天,其余的5、10、20μm切片上以及无细胞化处理的5μm切片上多层增殖的细胞也开始从载玻片上剥离。
(实施例5:在牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上培养CPAE细胞)
使用牛肺动脉血管内皮细胞株CPAE研究切片细胞培养载体对细胞形态形成的影响。CPAE细胞(来自Human Science振兴财团JCRB9022)在含有培养液(15%灭活胎牛血清、20mM HEPES、100单位/ml青霉素以及含有100μg/ml链霉素的DMEM)进行传代培养。
将在实施例1中于载玻片上制作的牛胎盘的5μm冷冻切片细胞培养载体和在实施例2中于载玻片上制作的经0.1%SDS无细胞化处理的牛胎盘的5μm冷冻切片细胞培养载体插入到菌液槽内。在该菌液槽内向20ml的培养液接种CPAE细胞悬液,使其终浓度为3.4×104/cm2,然后于5%CO2、95%空气、37℃的保湿保温箱内进行培养。培养一天后,将菌液槽内的载玻片移入加了10ml培养液的直径100mm的培养皿内(一个皿一块)。以后每隔一日交换一次培养液,一直培养到第3天。在培养的第一天利用相差显微镜观察培养细胞的形态,结果表明在没有贴附切片的载玻片上培养的细胞很多都展成好看的砌石状,而在切片上以及经无细胞化处理的切片上培养的细胞很多形态都呈比较细长的伸展状(参照图33-35)。之后,培养第3天用相差显微镜观察培养细胞的形态,可见在没有贴附切片的载玻片上几乎全部为砌石状,与此相对,在切片上或经无细胞化处理的切片上培养的细胞摄入切片组织,形成血管网状结构。(参照图36-40)
(实施例6:在牛胎盘冷冻切片细胞培养载体上培养PC-12细胞)
使用大鼠褐色细胞瘤PC-12细胞通过通常传代培养用的培养液培养和通过无血清培养液培养研究由切片构成的细胞培养载体对细胞形态形成的影响。PC-12细胞(来自理化研究所基因文库细胞开发银行RCB0009)在含有培养液(10%灭活胎牛血清、20mM HEPES、100单位/ml青霉素以及含有100μg/ml链霉素的DMEM)进行传代培养。
将在实施例1中于载玻片上制作的牛胎盘5、10、20μm冷冻切片细胞培养载体插入到菌液槽内。在该菌液槽内向20ml的培养液接种PC-12细胞悬液,使其终浓度为14.5×104/cm2,然后于5%CO2、95%空气、37℃的保湿保温箱内进行培养。培养4小时后,将菌液槽内的载玻片移入加了10ml培养液的直径100mm的培养皿内(一个皿一块)。以后每日交换一次培养液,一直培养到第2天。在培养2天后,对载玻片进行苏木精曙红染色后在光学显微镜下观察,观察结果表明5、10、20μm中任一厚度的切片都没有观察到来自牛胎盘的细胞(参照图41-43),而切片上培养的细胞与没有贴附切片的载玻片上培养的细胞相比大而且贴附生长着(参照图44)。另外,在牛胎盘切片上相当于含有胎盘隔的绒毛丛的区域,在胎盘隔上主要是砌石状细胞贴附生长,沿着胎盘隔的边缘贴附增殖着扁平细胞(图42),在牛胎盘切片上的与绒毛丛连接的子宫小丘的结缔组织丰富的区域中贴附生长着砌石状细胞(图45);在牛胎盘切片上的子宫小丘的粘膜固有层侧区域沿着子宫腺和血管的内侧贴附生长着扁平化细胞(图46)。这些结果表明培养细胞识别切片上的微细结构使得细胞形态发生了变化。
其次将在实施例1中于载玻片上制作的牛胎盘5μm冷冻切片细胞培养载体和在实施例2中于载玻片上制作的经0.1%SDS无细胞化处理的牛胎盘5μm冷冻切片细胞培养载体插入到菌液槽内。在该菌液槽内向20ml无血清的培养液接种PC-12细胞悬液,使其终浓度为4.6×104/cm2,然后于5%CO2、95%空气、37℃的保湿保温箱内进行培养。培养一天后,将菌液槽内的载玻片移入加了10ml无血清培养液的直径100mm的培养皿内(一个皿一块)。以后每隔一日交换一次培养液,一直培养到第5天。在培养的第5天利用相差显微镜观察培养细胞的形态,结果表明在没有贴附切片的载玻片上培养的细胞几乎都死了(图47),但在经无细胞化处理的切片上培养的细胞有砌石状贴附生长的活细胞(图48)。另外在切片上培养的细胞几乎都是砌石状贴附生长的活细胞(图49)。进一步对培养到第5天的载玻片进行苏木精曙红染色后在荧光显微镜下观察,结果观察到在切片上和无细胞化处理的切片上培养的细胞都是呈砌石状贴附生长着的活细胞,另外在切片上进行细胞培养时也清楚地观察到有来自牛胎盘的细胞,在无细胞化处理的切片上培养细胞时,可以清楚地观察到除去了牛胎盘细胞的无细胞组织(图50、51)。这些结果表明由切片构成的载体在进行无血清培养时细胞的生存时间有可能长时间维持,而对细胞进行无血清培养时即使在长时间培养后也能维持切片的细胞和组织。
当然,本发明并不限定于以上的例子。不用说在载玻片上放置多个切片也是可以的。而且不用说制作切片的动物组织除了讲到的,有关作为培养对象的动物细胞、切片的状态、支持物、培养液组成、培养条件等可以是各种各样状态。本申请的发明应当包括这些各种各样的状态、式样。
发明的效果
利用本发明作为培养动物细胞的载体,更接近生物组织的培养环境,即提供靶生物组织的场所以及时间上的环境信息。通过在本发明的培养载体上培养细胞能够对培养载体与靶细胞以及利用组织的场所上的以及时间上的信息的相互作用阐明细胞的各种性质和特性,以及利用这些相互作用对基因进行功能解析,以及利用生物体组织模板进行组织的再构建,以及再构建组织的移植都成为可能。
Claims (23)
1.细胞培养载体,其特征在于动物细胞的培养载体是由生物组织薄切片构成的。
2.权利要求1记载的细胞培养载体,其中生物组织的薄切片贴附于支持物或贴附生长于支持物。
3.权利要求2记载的细胞培养载体,支持物为从玻璃、塑料、橡胶、金属、天然或合成的丝和/或其织物以及生物体吸收性材料选出的1种以上材料。
4.权利要求2或3记载的细胞培养载体,其中对支持物预先实施了促进切片贴附或贴附生长的处理。
5.权利要求1记载的细胞培养载体,其中的生物组织是新鲜组织或预先用固定液固定的组织。
6.权利要求1记载的细胞培养载体是,由对未切片的生物组织或生物组织薄切片实施无细胞化处理的组织制备的。
7.权利要求1记载的细胞培养载体,其特征是:实施使抗体或核酸探针能够结合于生物组织薄切片的处理之后,在切片的特定场所导入外源生理活性物质。
8.权利要求1记载的细胞培养载体,其特征是:对生物组织薄切片进行酶处理等生物学处理或酸或碱或表面活性剂处理等化学处理之后,改变或修饰切片中的生物组成成分或微细结构。
9.权利要求1记载的细胞培养载体,其中为对生物组织实施切片而预先将生物组织冻结或冻结包埋、石蜡包埋、或树脂包埋。
10.权利要求1记载的细胞培养载体,其中生物是动物或植物。
11.权利要求10记载的细胞培养载体,其中动物是哺乳动物。
12.权利要求1记载的细胞培养载体,其中利用的生物组织是取自处于出生前发育阶段的动物的全身或其一部分组织。
13.权利要求1记载的细胞培养载体,其中利用的生物组织是取自处于出生后的动物的全身或其一部分组织。
14.细胞培养方法,其特征是将权利要求1至13中任一项记载的细胞培养载体装入培养容器中对动物细胞进行培养。
15.权利要求14记载的细胞培养方法,其特征是:开始培养动物细胞的手段是通过接种细胞悬液、切碎的组织片、受精卵、或接种重新构建的三维多细胞凝集团进行的。
16.权利要求14~15记载的细胞培养方法,其特征是:在接种的动物细胞贴附增殖之后将切片或将由切片长出的组织从权利要求2至4中记载的支持物上剥离下来。
17.权利要求16记载的细胞培养方法,其特征是:从支持物上剥离后继续进行培养,形成摄入切片或摄入由切片长出的组织的三维多细胞凝集团。
18.权利要求14记载的细胞培养方法,其特征是:培养的动物细胞是原代培养细胞、株化细胞、受精卵和/或从导入外源性基因的上述细胞中选出的1种或2种以上的细胞。
19.权利要求14记载的细胞培养方法,其特征是:培养的动物细胞取自于未分化的干细胞、处于分化过程的细胞、终末分化的细胞、和/或去分化的细胞。
20.权利要求19记载的细胞培养方法,其特征是:未分化的干细胞是胚性干细胞。
21.权利要求14~20记载的细胞培养方法,其特征是:培养动物细胞的培养液是含有血清的培养液或不合血清的无血清培养液。
22.细胞移植方法,其特征是:将利用权利要求14~21记载的细胞培养方法培养的动物细胞移植到动物中。
23.权利要求22记载的细胞移植方法,其中进行移植的动物是哺乳动物。
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |