CN102719394B

CN102719394B - 山羊真皮成纤维细胞系的构建方法

Info

Publication number: CN102719394B
Application number: CN 201210203927
Authority: CN
Inventors: 崔志峰; 胡艳霞; 王慧; 曾勇庆; 张娇; 董忠典
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2032-06-20
Also published as: CN102719394A

Abstract

本发明涉及一种山羊真皮成纤维细胞系的构建方法，是利用原代外植与酶消化相结合的方法，成功启动了DFB的原代培养，添加相关生长因子，成功建立了山羊真皮成纤维细胞系，采用该方法本细胞系已经稳定传至56代以上，其生长分裂状态良好。本发明不仅可为阐明相关激素、生长因子、紫外线等理化因素对皮肤及其附属器官生长分化的调节机制提供研究模型；为提高山羊毛皮产品产量和品质的育种改良奠定基础；还可为提高其它动物的毛皮品质、数量和花纹品质乃至医学领域的人类创伤修复、组织工程皮肤研究等奠定基础。

Description

山羊真皮成纤维细胞系的构建方法

一、技术领域

本发明涉及山羊真皮成纤维细胞系的构建方法，属于细胞生物学与生物技术领域。

二、技术背景

真皮成纤维细胞（Dermal fibroblast,DFB）是构成皮肤真皮组织的主要细胞，其正常的增殖分化对于皮肤生理机能调控、伤口愈合及组织工程皮肤重建等方面均发挥着重要作用。在皮肤组织中，真皮成纤维细胞能够分泌表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子-β（TGF-β）等多种生长因子，他们作用于表皮细胞、血管内皮细胞以及毛囊相关细胞，可诱导表皮形成，加速血管生长，调控毛囊生成与周期性再生。此外，真皮成纤维细胞还能够为其它细胞提供胶原蛋白、弹性蛋白等多种细胞外基质。这些细胞外基质作为真皮结构的重要组成部分，对皮肤正常结构维持、其它皮肤细胞的粘附以及毛囊等皮肤附属器官形态保持均具有重要作用。近年来研究发现，体外培养的真皮成纤维细胞中可分离得到真皮干细胞，该干细胞可在特定诱导条件下分化生成脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞、黑素细胞以及毛乳头细胞等多种其它组织细胞。同时，DFB因具有易于培养、增殖快速、形态和生物学特性相对稳定等特点，可为遗传资源保护、基因组文库构建、体细胞克隆、基因遗传多样性研究等领域提供理想的生物学材料。

常用的真皮成纤维细胞原代培养方法主要分为两类：单纯机械解离法与酶消化解离法（Christiano AM.et al.,2004;Schlabe J.et al.,2008）。单纯机械解离法是将皮肤真皮组织切割成小块（1mm²），经PBS润洗后，贴附于培养瓶或培养板中，待贴附牢固后加入含血清培养液，置于37℃、5%CO₂条件下进行原代培养。该方法操作简单，适用于从少量皮肤组织中分离细胞（Almqvist S.et al.,2009;Xiang Y.et al.,2011）。酶消化解离法是将真皮组织制成组织悬液，然后浸入温胰蛋白酶中进行消化处理。每隔半小时收集细胞一次，使用含血清培养液重悬细胞后，接种于培养瓶或培养板中启动原代培养（Park JK.,2007）。以上两种方法虽然均能获得真皮成纤维细胞，但仍存在组织块贴附不牢、细胞因酶消化而损伤等不足，且经多次传代后较多细胞出现异常二倍体核型，以致丧失其生物学特性。

上述真皮成纤维细胞的培养多以人的皮肤为细胞的组织来源。对于其它哺乳动物DFB的培养，上述培养方法与分离技术亦同样适用。研究表明，将小鼠、牛、猪、兔等多种动物的真皮组织小块贴附与培养器皿上，加入含FBS的商品化培养液（MEM系列、DMEM系列、RPMI-1640系列、F10和F12系列等），静置培养10~15天，便可获得较多量的DFB（Dame MK.et al.,2008;梅志强等，2007；马红等，2009）。另有学者应用改进的酶消化解离方法，成功分离培养了大鼠、牛、猪、兔等家畜以及大熊猫等濒危动物的成纤维细胞，并建立相应细胞系与细胞株（Ikumi S.et al.,2004;TaoY.et al.,2009;Li LF.et al.,2009;GuanWJ.et al.,2010;Liu CQ.et al.,2011;陈大元等，1999；朱庆等，2005）。尽管许多学者在动物真皮成纤维细胞培养方面进行了大量的研究，但有关山羊真皮成纤维细胞体外培养研究，尤其是山羊真皮成纤维细胞系（株）建立等方面的报道相对较少。

三、发明内容

技术问题

为进一步开展真表皮细胞互作、皮肤附属结构发育与分化、动物毛绒产品质量提升等研究建立离体细胞模型，并为人类创伤愈合、皮肤移植与重建等提供重要参考，本发明提供了一种山羊真皮成纤维细胞系的构建方法。本发明的目的是建立与完善山羊体外培养真皮成纤维细胞系（Dermal fibroblast cell line）的构建方法，不仅可为阐明相关激素、生长因子、紫外线等理化因素对皮肤及其附属器官生长分化的调节机制提供研究模型；为提高山羊毛皮产品产量和品质的育种改良奠定基础；还可为提高其它动物的毛皮品质、数量和花纹品质乃至医学领域的人类创伤修复、组织工程皮肤研究等奠定基础。

技术方案

本发明所述的构建真皮成纤维细胞系过程中，首先利用中性蛋白酶（Dispase）冷消化法分离皮肤的表皮层和真皮层，以利于纯化培养真皮成纤维细胞。然后，采用原代外植与酶消化相结合的方法，分离纯一的DFB：即先利用Dispase酶分离皮肤表、真皮层后，剪切真皮部分成1mm³的小块，再对小组织块进行酶（胰蛋白酶）消化处理，随即将真皮外植块接种于6孔培养板底壁上，待贴牢后添加含有碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、青霉素、链霉素、泰乐菌素（Tylosin）和10%FBS的DMEM/F12培养液中，置5%CO₂浓度的37℃饱和湿度培养箱中启动原代培养。当培养板中的真皮外植块迁移出大量细胞时（约5~6天），换为含有bFGF、青霉素、链霉素、泰乐菌素（Tylosin）和5%FBS的MEM培养液继续进行培养，每3天更换1次培养液。待原代真皮成纤维细胞生长至汇合时，进行传代，并于第一次传代时更换为25cm²培养瓶中培养，以利于真皮成纤维细胞在体外长期传代培养与冻存。采用该方法本细胞系已经稳定传至56代以上，其生长分裂状态良好。

建立山羊真皮成纤维细胞系的过程如下：

（1）活体采集1~3日龄济宁青山羊体侧偏背部皮肤0.5cm×0.5cm大小的完好皮肤组织样，将皮肤组织样用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后放入无血清培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；

（2）将步骤1）中采集的皮肤组织样经70%酒精浸泡，剪除表面毛发后，D-Hank’s液冲洗干净，吸去D-Hank’s液，加入约10mL0.25%中性蛋白酶，4℃消化过夜；分离皮肤表皮层与真皮层，将真皮组织剪成约1mm³的小块，采用原代外植与消化培养相结合的方法，将真皮组织小块进行胰蛋白酶消化处理后接种于6孔培养板中，干燥处理4h，待组织小块贴附牢固后，每孔加入3mL完全培养液，在37℃，5%CO₂浓度饱和湿度条件下启动原代培养。待外植块周围迁移出大量细胞后（约5~6天），更换为等量的维持培养液，在37℃，5%CO₂浓度饱和湿度培养箱中继续进行培养；待原代真皮成纤维细胞生长至汇合时，消化移入培养瓶中培养，按照每瓶10mL量加入完全培养液进行培养，3天后更换为等量维持培养液，此后2~3天更换一次维持培养液；所述的完全培养液为含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和10%FBS的DMEM/F12培养液；所述的维持培养液为含有10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和5%FBS的MEM培养液；

（3）当步骤2）所得的原代细胞生长至会合状态后，PBS液冲洗细胞1次，加入约1mL浓度为0.25%的胰蛋白酶浸润细胞约5秒，弃去，再加入4mL浓度为0.25%的胰蛋白酶消化处理约5min；当观察到有细胞贴附的瓶壁逐渐变白，且轻轻晃动有微小细胞团块脱落时，加入6mL完全培养液洗净残余消化液，1000r/min下离心5min后收集细胞，消化移入培养瓶中，按照每瓶10mL量加入完全培养液继续培养，3天后更换为等量维持培养液，此后每3天更换维持培养液1次；所述的PBS缓冲液由8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.56g/LNa₂HPO₄·H₂O和0.2/gL KH₂PO₄组成；所述的完全培养液为含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和10%FBS的DMEM/F12培养液；所述的维持培养液为含10ng/mLbFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和5%FBS的MEM培养液；

（4）选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记。将冻存管依次置于4℃1h、-20℃1h、-70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞。复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，按5×10⁵个/mL的细胞密度接种于培养瓶；所述的冻存培养液为含10%DMSO和30%FBS的DMEM/F12培养液。

有益效果

（1）本发明利用原代外植与酶消化相结合的方法，成功启动了DFB的原代培养，添加相关生长因子，成功建立了济宁青山羊真皮成纤维细胞系。

（2）本发明利用Dispase酶在4℃条件下消化处理皮肤组织，能够在较短时间内（约5~6天）收获大量活性良好的真皮成纤维细胞，还避免了37℃条件下酶消化对细胞表面蛋白质的破坏以及对细胞特性的改变。

（3）本细胞系已稳定传至第56代以上，其生长分裂状态良好，细胞群体倍增时间约为48h。染色体分析结果表明，体外培养细胞尽管出现了非整倍性染色体现象，但其特征染色体数仍为60条。

（4）通过对培养物进行细菌、真菌与支原体的检测，结果显示，培养至第56代的DFB培养液状态没有混浊或其它变化，培养液清亮透明，而阳性对照可见明显的混浊或沉淀。对培养物支原体污染检测结果为阴性，说明传至56代以上的细胞未受到细菌、真菌与支原体的污染，细胞生长状态正常。

经上述细胞染色体分析、微生物污染检测与荧光蛋白质粒转染的实验鉴定结果表明，所建真皮成纤维细胞系特征明显，细胞活力旺盛，可为研究皮肤细胞基因表达与调控，皮肤附属结构的生长与分化机制，尤其是皮肤主要细胞间的相互作用机制研究提供良好的实用模型。

四、附图说明

图1体外培养的青山羊真皮成纤维细胞（×100）

（a）新游离生长出的DFB，细胞呈圆形和多角形；（b）培养12天左右的DFB，大量细胞由外植块边缘长出并进入对数生长期；（c）传代培养至第10代的DFB，细胞呈长梭形平行排列；（d）经Giemsa染色后的第56代DFB。

图2冻存前与复苏后的山羊真皮成纤维细胞（×100）

（a）冻存前的DFB，冻存前24h测定的平均细胞活力为94.4%；（b）复苏后6h的DFB，多数细胞均贴附于培养瓶壁；（c）复苏后24h的DFB，经测定的平均细胞活力为92.1%。

图3青山羊真皮成纤维细胞生长曲线

图4第56代真皮成纤维细胞的微生物污染检测

（a）倒置显微镜下观察，第56代的DFB微生物检测呈阴性，即未被细菌和真菌污染（×100）；（b）肉眼观察培养体系未出现异常变化，培养液保持清亮；（c）被细菌污染的阳性对照（×100）；（d）被真菌污染的阳性对照（×100）；（e）支原体污染检测结果显示，第56代DFB不存在支原体污染，阳性对照在290bp处出现特异性条带。

图5第56代真皮成纤维细胞的染色体分析

（a）第56代DFB分裂中期染色体形态（×1000）；（b）第56代DFB染色体核型；（c）第56代DFB染色体数目，具有正常染色体的细胞数占总细胞数的76.7%；（d）青山羊正常组织细胞（外周淋巴细胞）染色体核型。

图64种荧光蛋白在体外培养的山羊真皮成纤维细胞中的表达（×100）

（a）增强型绿色荧光蛋白pEGFP-N3在转染细胞48h的转染率为47.9%；（b）增强型绿色荧光蛋白AcGFP1在转染细胞48h的转染率为50.3%；（c）红色荧光蛋白pDsRed1-N1在转染细胞48h的转染率为31.7%；（d）增强型青色荧光蛋白pECFP-N1在转染细胞48h的转染率为29.4%。

五、具体实施方案

本发明以济宁青山羊真皮成纤维细胞系的构建为例详细说明如下：

（一）材料与方法

（1）主要试剂与药品

DMEM/F12（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s Nutrient Mixture F12，1:1）培养基为Gibco公司产品；MEM（Minimum Essential Medium）培养基为Gibco公司产品；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）为MDgenics产品；中性蛋白酶（dispase）为Gibco公司产品；胰蛋白酶为Sigma公司产品；碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）为Sigma公司产品；青霉素钠（benzylpenicillin Sodium）为山东鲁抗辰欣药业有限公司产品；硫酸链霉素（streptomycin sulfate）为山东瑞阳药业有限公司产品；泰乐菌素（tylosin）为Sigma公司产品；秋水仙碱（colchicine）为Sigma公司产品；Giemsa染液（Giemsa stain）为Fluka公司产品；增强型绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-N3,AcGFP1）为Takara公司产品；增强型青色荧光蛋白质粒（pECFP-N1）为Takara公司产品；红色荧光蛋白质粒（pDsRed-N1）为Takara公司产品；阳离子脂质体（Lipofectamine^TM 2000）为Invitrogen公司产品。

完全培养液：含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和10%FBS的DMEM/F12培养液；

维持培养液：含10ng/mLbFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mLTylosin和5%FBS的MEM培养液；

D-Hank’s液：由8g/LNaCl、0.4g/LKCl、0.06g/LNa₂HPO₄·H₂O、0.06g/LKH₂PO₄、0.35g/LNaHCO₃和0.4g/L苯酚红组成；

PBS：由8g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.56g/LNa₂HPO₄·H₂O和0.2g/LKH₂PO₄组成；

冻存培养液：含10%DMSO和30%FBS的DMEM/F12培养液；

Carnoy’s固定液：3份甲醇加1份冰醋酸，现配现用并于冰上保存。

（2）实验动物与样品采集

怀孕母羊购自山东省济宁市嘉祥县种羊场，饲养于山东农业大学动物科技学院畜牧科技试验站羊场。活体采集出生1~3日龄的羔羊背部约0.5cm×0.5cm的皮肤组织样，先用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精，迅速将皮肤组织块放入无血清DMEM/F12培养液，于冰盒中带回实验室。在12h内进行原代培养。

（3）山羊真皮成纤维细胞的原代培养

将步骤2）中采集的皮肤组织样经70%酒精浸泡，剪除表面毛发后，D-Hank’s液冲洗干净，吸去D-Hank’s液，加入约10mL0.25%中性蛋白酶，4℃消化过夜。体式镜下，用无菌弯头镊分离皮肤表皮层与真皮层，用无菌眼科剪将真皮组织剪成约1mm³的小块，浸入0.25%胰蛋白酶中消化30min，随后将其均匀贴附于6孔培养板中，放在37℃，5%CO₂浓度的饱和湿度条件下，4h贴附牢固后按照每孔3mL加入完全培养液，放回培养箱中进行培养。待外植块迁移出大量细胞后，更换为相同体积的维持培养液，在37℃，5%CO₂浓度的饱和湿度培养箱中继续培养。待游离出的真皮成纤维细胞（DFB）生长成单层后，消化移入培养瓶中进行培养，按照每瓶10mL量加入完全培养液进行培养，3天后更换为等量维持培养液，此后2~3天更换维持培养液一次。

（4）细胞的传代培养

当真皮成纤维细胞（DFB）生长至汇合状态后，进行传代。首先弃掉旧维持培养液，PBS液冲洗细胞1次，加入约1mL浓度为0.25%的胰蛋白酶浸润细胞约5秒。弃去胰蛋白酶，再加入4mL浓度为0.25%的胰蛋白酶，常温下消化处理约5min。当观察到有细胞贴附的瓶壁逐渐变白，且轻轻晃动有微小细胞团块脱落时，便可加入6mL完全培养液洗净残余消化液，1000r/min下离心5min后收集细胞，分瓶后按每瓶10mL量加入完全培养液放回培养箱中继续培养，3天后更换为等量维持培养液，此后每3天更换维持培养液1次。挑选可稳定遗传的对数期真皮成纤维细胞进行形态学观察并测定生长曲线。

（5）山羊真皮成纤维细胞的Giemsa染色

将灭菌盖玻片放入一次性细胞培养皿中，取2mL真皮成纤维细胞悬液加入培养皿中，置于CO₂培养箱中培养。待DFB在盖玻片上长成良好单层后，取出玻片并浸入无水甲醇中固定15min，再用新的无水甲醇冲洗细胞，随即放入纯的Giemsa染液中染色5~10min。从Giemsa染液中取出玻片经过干燥和二甲苯透明。最后，中性树脂封片，显微镜下观察、拍照。

（6）真皮成纤维细胞的冷冻保存与复苏

选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入冻存培养液（含10%DMSO和30%FBS的DMEM/F12培养液），以每毫升5×10⁶个真皮成纤维细胞的细胞密度，分装入1.8mL无菌冻存管中，封口，标记。将冻存管依次置于4℃1h、-20℃1h、-70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞。

复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，然后逐滴加入10mL完全培养液缓慢稀释冻存液，混匀后低速离心，去上清。再用完全培养液适当稀释后，按5×10⁵个/mL的细胞密度接种于培养瓶。

（7）细胞活率与贴壁率的测定

运用Trypan蓝染料排斥法，计数1000个真皮成纤维细胞，测定DFB冻存前和复苏后的活率，并观察DFB复苏后的贴壁情况，统计分析DFB活率与贴壁率。

（8）细胞生长曲线的测定

收获生长状态良好的对数期DFB，采用细胞传代的方法制成细胞悬液。经计数后，将密度约为每mL含2.66×10⁴个细胞的细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，每孔1mL。每隔24h取出3个孔的细胞分别进行计数，取平均值。以培养时间为横轴，每天的细胞数平均值为纵轴，作图，即得到体外培养真皮成纤维细胞的生长曲线。

（9）微生物污染检测

将待检DFB接种于无抗生素的完全培养液中，置于37℃，5%CO₂浓度的饱和湿度培养箱中培养3d，与存在细菌污染及真菌污染的细胞进行比对，判断其是否存在细菌及真菌污染。

将传至56代的DFB培养于无抗生素的完全培养液中，一周内不更换培养液。随后用无菌细胞刮收集待检细胞，沸水浴10min，12000r/min下离心5min后，吸取上清液作为PCR反应模板，DNA阳性对照和阴性对照共同放入PCR仪进行PCR反应扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察，照相。

（10）山羊真皮成纤维细胞的染色体核型分析

待传代培养第56代的DFB生长至对数生长期时，将细胞移入25cm²培养瓶中，CO₂培养箱中培养48h。将0.08μg/mL秋水仙素加入维持培养液中，继续培养约2h。消化收集细胞，逐滴加入0.5mL 37℃的低渗液（即0.075mol/L的KCl溶液）并混匀，随即补加低渗液至5~10mL，用吸管轻轻吹打均匀，37℃孵育30min。低渗处理后向管中加入1mL新鲜Carnoy’s固定液进行预固定，离心去上清后加入10mL新鲜Carnoy’s液进行固定及再固定。最后，收集细胞进行Giemsa染色，中性树脂封片，镜检。

（11）脂质体介导转染山羊真皮成纤维细胞

收获传至56代或56代以上的生长良好的DFB，1×10⁶个/mL的细胞密度接种于6孔板中，在37℃，5%CO₂浓度的饱和湿度条件下培养至对数生长期，更换为无血清DMEM/F12培养液，采用Lipofectamine 2000介导方法分别转染pEGFP-N3，AcGFP1，pECFP-N1和pDsRed1-N1，6h后将无血清培养液更换为完全培养液继续培养，在荧光倒置显微镜下观察转染24h、48h和72h的DFB生长及荧光表达情况，并测定转染率。

（二）结果与分析

（1）原代外植法培养细胞的形态学及Giemsa染色的观察结果

利用原代外植法与酶消化法分离真皮成纤维细胞，在含完全培养液中，4~5天便可见真皮组织小块边缘向外游离生长出单个细胞，细胞呈圆形，随后伸展成多角形的形态（图1（a））。培养一周左右即可明显看到大量细胞从外植块边缘生长出来。随着游离生长细胞的增多，生长速率逐渐加快，在第12天左右时，细胞进入对数生长期（图1（b））。在倒置相差显微镜下观察，可见游离出的真皮成纤维细胞以长梭形和多角形为主，细胞饱满，透明度高，胞体向外伸出2~4个片足，胞核卵圆形，胞质较少。随后细胞向四周呈放射状生长，形成致密单层后细胞变化为梭状平行排列（图1（c））。

纯化的真皮成纤维细胞经Giemsa染色后，可见细胞形态均一，呈梭状或长条状，对数生长期后的DFB能够形成良好单层，漩涡状或平行排列。高倍镜下观察，细胞质呈淡蓝色，胞体近中央处有椭圆形的细胞核，呈深蓝色，其中可见2~4个核仁，细胞轮廓清晰，伸展良好，细胞间排列紧密规则。当培养瓶内的细胞形成单层后，经染色可见大部分细胞出现接触抑制，停止分裂。采用Giemsa染色法可使细胞质与细胞核具有强烈的颜色对比性，能够较清晰的显示出细胞的形态以及分裂的不同时相，从而有效判断细胞的生长状态与健康状况（图1（d））。

（2）细胞活率与贴壁率的测定结果

利用血球计数板测定细胞冻存前24h的平均活率及细胞复苏后24h的平均活率与贴壁率，统计分析结果表明，青山羊真皮成纤维细胞冻存前和复苏后平均活率分别为94.4%和92.1%（图2（a）、（c）），复苏6h后约有85%细胞贴附瓶底生长。由此可见，冻存和复苏对传代细胞活力状况的损害较小，细胞生长状态良好（图2（b））。

（3）传代培养的真皮成纤维细胞的生长特性

传代培养的DFB与其原代细胞在形态及生长速度上均无明显差异，细胞生长与分裂依然十分旺盛。单层细胞传代约5d后便可重新长成单层，其对于胰蛋白酶消化的敏感性也较原代培养细胞明显增强。从体外培养的DFB对数生长期的生长曲线可以看出，细胞贴壁生长的前2天为迟缓期；第3~5天为对数生长期；第5天后便进入平稳期和衰退期（图3）。细胞群体倍增时间为48h，说明DFB经传代培养后其生长与分裂能力依然旺盛（表1）。

表1青山羊真皮成纤维细胞接种8天的细胞密度

×10⁴个·mL^-1

Figure 2012102039276100002DEST_PATH_IMAGE001

（4）微生物污染检测结果

通过显微镜及肉眼比对观察显示，体外培养的DFB无异常变化，培养液清亮，显微镜视野中无其它生物繁殖（图4（a）、（b）），而阳性对照细胞培养体系明显混浊，且有大量细菌和真菌菌丝生长繁殖（图4（c）、（d）），因此证明所建立细胞系不存在细菌及真菌污染。

应用PCR技术对支原体16s-rRNA基因保守区域的特异性片段进行扩增，检测第56代DFB支原体污染情况，琼脂糖凝胶电泳结果显示检测样品与阴性对照相同，在290bp处未出现特异性条带，而阳性对照在290bp处出现清晰条带（图4（e））。由此说明传至第56代DFB未受到支原体污染。综上结果，本发明建立的真皮成纤维细胞系能够保证培养物洁净，有效避免微生物污染。

（5）山羊真皮成纤维细胞的染色体分析

选取传至第56代的细胞，进行染色体标本计数。结果表明，济宁青山羊染色体为2n=60的细胞占主体（图5（a）、（b）），但是个别细胞的染色体发生缺失与丢失，出现了典型的非整倍体性细胞系染色体特征，说明体外培养环境对细胞的遗传稳定性有影响作用。然而，在选取进行计数培养细胞中，拥有60条染色体的细胞数仍可占总细胞数的76.7%（图5（c）），且这些细胞与体内正常组织细胞相比，其染色体数目与核型均正常（图5（d））。因此，所建立的细胞系确为济宁青山羊细胞系。

（6）4种荧光蛋白质粒转染DFB效果

转染24、48、72h后，分别将细胞置于特定波长激发光下用荧光倒置显微镜观察，结果显示，4种荧光蛋白均能在体外培养的DFB中得到良好的表达。4种质粒之间的转染效率相比：AcGFP1获得的转染效率在3个时间点（24、48、72h）均为最高（图6（b）），其次为pEGFP-N3（图6（a）），pECFP-N1在3个时间点的转染率相对最低（图6（d））。对不同时间的转染率进行比较：4种质粒在转染48h的转染率均达到最高，此后随着转染时间的延长转染效率明显降低（表2）。然而总体水平表明，4种荧光蛋白质粒在DFB中均获得较高的转染率和基因表达率，说明本发明建立的细胞系活力旺盛、基因表达调控功能正常且对转染试剂的细胞毒性具有较强的耐受能力，能够满足转基因、体细胞克隆等相关研究的需要。

表24种荧光蛋白基因在青山羊真皮成纤维细胞中的转染率

Claims

1.一种山羊真皮成纤维细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取离体的1-3日龄济宁青山羊体侧偏背部皮肤0.5cm×0.5cm大小的完好皮肤组织样，将皮肤组织样用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后放入无血清培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；

（2）将步骤1）中采集的皮肤组织样经70%酒精浸泡，剪除表面毛发后，D-Hank’s液冲洗干净，吸去D-Hank’s液，加入约10mL0.25%中性蛋白酶，4℃消化过夜；分离皮肤表皮层与真皮层，将真皮组织剪成约1mm³的小块，采用原代外植与消化培养相结合的方法，将真皮组织小块进行胰蛋白酶消化处理后接种于6孔培养板中，干燥处理4h，待组织小块贴附牢固后，每孔加入3mL完全培养液，在37℃，5%CO₂浓度饱和湿度条件下启动原代培养；待5-6天外植块周围迁移出大量细胞后，更换为等量的维持培养液，在37℃，5%CO₂浓度饱和湿度培养箱中继续进行培养；待原代真皮成纤维细胞生长至汇合时，消化移入培养瓶中培养，按照每瓶10mL量加入完全培养液进行培养，3天后更换为等量维持培养液，此后2-3天更换一次维持培养液；所述的完全培养液为含10ng/mLbFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mLTylosin和10%FBS的DMEM/F12培养液；所述的维持培养液为含有10ng/mLbFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mLTylosin和5%FBS的MEM培养液；

（3）当步骤2）所得的原代细胞生长至会合状态后，PBS液冲洗细胞1次，加入约1mL浓度为0.25%的胰蛋白酶浸润细胞约5秒，弃去，再加入4mL浓度为0.25%的胰蛋白酶消化处理约5min；当观察到有细胞贴附的瓶壁逐渐变白，且轻轻晃动有微小细胞团块脱落时，加入6mL完全培养液洗净残余消化液，1000r/min下离心5min后收集细胞，消化移入培养瓶中，按照每瓶10mL量加入完全培养液继续培养，3天后更换为等量维持培养液，此后每3天更换维持培养液1次；所述的PBS缓冲液由8g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.56g/LNa₂HPO₄·H₂O和0.2g/LKH₂PO₄组成；所述的完全培养液为含10ng/mLbFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mLTylosin和10%FBS的DMEM/F12培养液；所述的维持培养液为含10ng/mLbFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mLTylosin和5%FBS的MEM培养液；

（4）选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于4℃1h、-20℃1h、-70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，按5×10⁵个/mL的细胞密度接种于培养瓶；所述的冻存培养液为含10%DMSO和30%FBS的DMEM/F12培养液。