CN111518743A - 一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用 - Google Patents

一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111518743A
CN111518743A CN202010311466.9A CN202010311466A CN111518743A CN 111518743 A CN111518743 A CN 111518743A CN 202010311466 A CN202010311466 A CN 202010311466A CN 111518743 A CN111518743 A CN 111518743A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dermal
cells
tissue
fibroblast
dermal fibroblast
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010311466.9A
Other languages
English (en)
Inventor
柳全文
李婧嫄
辛洪波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanchang University
Original Assignee
Nanchang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanchang University filed Critical Nanchang University
Priority to CN202010311466.9A priority Critical patent/CN111518743A/zh
Publication of CN111518743A publication Critical patent/CN111518743A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞培养领域，具体公开了一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用，主要包含以下步骤：1)人真皮成纤维细胞的分离及培养；2)人真皮成纤维细胞纯化：利用真皮成纤维细胞和表皮角质细胞对胰酶敏感性的差异，用0.05％胰酶/EDTA消化原代培养细胞1‑2分钟，消化下来的为真皮成纤维细胞。用此方法将细胞传代至第三代，可得到纯度为100％的真皮成纤维细胞；3)真皮成纤维细胞体外热损伤模型的构建：将接种有真皮成纤维细胞的培养板放置于37℃水浴锅中，热处理50分钟，可得到真皮成纤维细胞热损伤模型。

Description

一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用。
背景技术
皮肤作为人体最大的器官，是人体与外界接触的第一道天然屏障，发挥着调节人体温度、提供感觉、维持内环境稳定、阻止微生物、化学物质进入以及避免脱水等作用。正常的皮肤组织分为表皮层、真皮层和皮下组织层。真皮是由成纤维细胞、细胞外基质、血管内皮细胞和皮肤附属物(毛囊、汗腺)组成的结缔组织。真皮成纤维细胞(Dermalfibroblasts,DFL)分泌胶原蛋白和弹性蛋白分子，为皮肤提供机械强度和弹性。
烧烫伤主要是指由于热力、热液、放射线、电能、化学物质等引起的皮肤、黏膜甚至皮下组织的损伤。烧烫伤可以导致皮肤失去完整结构、丧失功能、破坏人体内环境、在受到辐射及创伤的情况下容易发生感染，是导致人类死亡的一个重要因素。在我国，每年大概有2000万人遭受不同程度的烧烫伤，发病率约为1.5％～2％，其中大概有5％的人需要住院治疗。
皮肤损伤修复是指皮肤受到不同程度的破坏和缺损时，机体通过再生、重建进行修复的一系列病理和生理过程，涉及到出血、凝固、炎症的发生发展、细胞迁移、增殖和分化、血管再生、细胞外机制的合成和重塑等，是一个动态和复杂的生物学过程。皮肤损伤修复一般可以概括为炎症期、组织细胞增殖期和组织结构重塑期这三个独特而又重叠的阶段。
早在1996年，Lekic等人就提出了“真皮成纤维细胞是皮肤创面修复的工程师、建筑师和管理员”的观点。当皮肤组织受到损伤时，DFL可以通过增殖、迁移、分化、分泌多种细胞因子以及合成包括胶原蛋白在内的多种细胞外基质等方式来促进皮肤创面愈合。皮肤损伤后，DFL首先会以有丝分裂的方式大量增殖。损伤后4～5天，DFL开始和合成分泌细胞外基质成分(以胶原蛋白为主)和多种细胞因子。这些胞外基质和细胞因子与新生薄壁毛细血管功能形成肉芽组织，填满伤口，为创面愈合过程中细胞的增殖、分化、生长、黏附提供支撑结构因此，任何改变DFL增殖、迁移、生物学状态及功能的因素都会影响皮肤损伤修复。因此，在现有的研究中大量用到皮肤成纤维细胞进行实验。
到目前为止，在皮肤损伤相关研究中，往往用真皮成纤维细胞的细胞系进行研究。但是，细胞系由于长期在体外2D培养，细胞在形态和功能上与体内成纤维细胞相差甚远，导致获取的实验结果不可信。而现有的原代真皮成纤维细胞的分离、培养方法又存在细胞得率低、往往含有其它类型细胞污染、细胞增殖能力弱等缺点，极大的限制了其应用。因此，本申请提出一种简单、高效的人真皮成纤维细胞分离、培养及纯化的方法。此外，为了模拟体内皮肤细胞烧伤及烫伤，我们通过热水处理，构建了一种人真皮成纤维细胞热损伤的模型。
发明内容
针对现有技术的上述不足之处，本发明的目的是提供一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种从小孩包皮切除手术废弃皮肤中分离、培养、纯化真皮成纤维细胞的方法、并利用水浴锅加热处理构建了人真皮成纤维细胞人损伤模型。
本发明的目的之一是提供一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，包括以下步骤：
1)将生长状态良好的高纯度真皮成纤维细胞胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时终止消化，进行离心并用PBS清洗获得细胞沉淀；
2)将步骤1)所述的细胞沉淀接种于六孔板，加入真皮成纤维细胞完全培养基进行培养；
3)细胞贴壁之后吸弃培养基，去除未贴壁细胞，添加新鲜真皮成纤维细胞完全培养基，将六孔板于53℃水浴中热处理50分钟，得到真皮成纤维细胞热损伤模型。
在优选地的实施方案中，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度大于95％；更优选地，所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度为100％。
在优选地的实施方案中，步骤1)所述终止消化的方法为用含体积浓度5％-15％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞，优选地，采用10％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞。
在优选地的实施方案中，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：
30-35份的H-DMEM基础培养基、5-7份的胎牛血清和0.3-0.5份的双抗溶液；
更优选地，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：
33.6份的H-DMEM基础培养基、6份15％v/v胎牛血清以及0.4份1％v/v双抗溶液，所述双抗溶液含10,000U/ml苄青霉素钠和10,000μg/ml链霉素。在具体的实施方式中，该真皮成纤维细胞完全培养基按以下方法制备：所述真皮成纤维细胞完全培养基的制备方法为：在50mL无菌容器中加入33.6mL H-DMEM基础培养基、6mL胎牛血清和0.4mL双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)，(1％v/v)。充分混匀，4℃保存待用。
在优选地的实施方案中，所述培养的条件为，在六孔板中每孔添加2ml真皮成纤维细胞完全培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为24h。
在优选地的实施方案中，步骤2)所述细胞沉淀在六孔板上的接种细胞密度为1.5×105个/孔。
在优选地的实施方案中，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的制备为以人包皮作为细胞来源，进行分离培养后再进行细胞传代和纯化获得。
在优选地的实施方案中，所述分离培养包括如下步骤：
A.包皮组织的收集
将500ml蓝盖瓶送至手术房，蓝盖瓶预先装有200mL Hank’s平衡盐溶液作为采集液；
儿童进行包皮切除手术之后，将皮肤组织放入上述采集液中，0-4℃条件下进行保存24-48h；
B.分离真皮组织
于实验室无菌超净台中取出皮肤组织，PBS清洗3次，每次3min；
将皮肤组织置于无菌培养皿中，用眼科剪及眼科镊仔细去除皮下脂肪组织、血管及系膜；
用PBS清洗剩余皮肤组织1次后，加入0.25％Dispase中性蛋白酶，4℃冰箱中消化过夜；
第二天取出皮肤组织，PBS漂洗3次去除中性蛋白酶溶液，终止消化；
用眼科镊分别夹住皮肤的真皮组织及表皮组织，将表皮从真皮组织上剥离，真皮组织放入PBS中漂洗3次；
C、真皮成纤维细胞原代培养：
用眼科剪将真皮组织充分剪碎，使得真皮组织的直径不超过1cm；
用眼科镊仔细的将真皮组织逐块夹起，滤干水分，将其均匀展开贴放在六孔板的底部：
将六孔板放入37℃孵育箱中，倒置贴壁；
1h后，在六孔板中加入1mL真皮成纤维细胞完全培养基，轻柔的将六孔板放入37℃孵育箱中进行培养；
1-2天后，待组织块完全贴牢在六孔板底部之后，每个六孔板中补加1mL真皮成纤维细胞完全培养基；
真皮组织块贴壁培养3-5天后，可以观察到有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞增殖到一定密度后对细胞进行传代；
所述Hank’s平衡盐溶液的制备方法如下：在200ml的Hank’s平衡盐溶液中添加以下成分至下述浓度：万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素B 2-3μg/m及300-500单位肝素钠。
在优选地的实施方案中，所述细胞传代和纯化，包括以下步骤：
A.去除原代培养的真皮成纤维细胞的培养基；
B.用无钙镁的PBS洗涤液进行洗涤；
C.每孔中加入1mL 0.05％胰酶/EDTA，37℃孵育箱(5％CO2、95％湿度)中消化1-2min；
D.倒置显微镜下观察细胞消化情况，待长梭形的真皮成纤维细胞变圆之后(此时表皮细胞依旧未见明显形态变化，牢固的贴在培养板底部)，每孔中加入2mL消化终止液终止消化；
E.轻柔吹打，使真皮成纤维细胞脱落并形成单细胞状态；
F.将细胞悬液收集在15mL离心管中，100rpm离心5min；
G.弃上清，加入成纤维细胞完全培养基重悬细胞，按1:3的比例对细胞进行传代：从3ml的细胞悬液中取1mL至一新的10cm培养皿中，再加入6ml的羊膜上皮干细胞通用培养基，摇匀；
H.放入到5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养。
在原代培养的真皮成纤维细胞中，主要存在真皮成纤维细胞及表皮角质细胞两种细胞。这两种细胞在形态上存在差异，真皮成纤维细胞为典型的长梭形，表皮角质细胞呈典型的“铺路石”样上皮细胞形态。在两种细胞对胰酶的敏感性存在较大差别，真皮成纤维细胞用0.05％胰酶/EDTA溶液消化1min即可变圆，轻柔吹打即可从细胞培养皿底部脱落。而表皮角质细胞需经0.05％胰酶/EDTA消化10min钟才可以扁圆，从培养皿底部吹打脱落。我们利用这两种细胞的对胰酶敏感性的差异可对其进行纯化。
本发明的另一目的在于提供所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法在皮肤损伤修复及相关治疗药物筛选上的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果包括：
1、皮肤组织经中性酶消化后，可以去除大部分的表皮组织，剩余的真皮组织可以通过组织块贴壁法培养得到成纤维细胞，本发明提供了一种简单高效的从皮肤组织中分离、培养真皮成纤维细胞的方法；
2、利用真皮成纤维细胞及表皮角质细胞对胰酶敏感性的差异，通过不同的消化时间可以去除真皮成纤维细胞原代培养中存在的表皮角质细胞，提供了一种真皮成纤维细胞纯化的方法；
3、体外用43℃热水处理真皮成纤维细胞50min，热处理24h及48h可使的真皮成纤维细胞出现大量死亡，但又有较多的细胞存活，而41℃热处理50min对细胞活性影响极小，45℃热处理50min使得细胞在短时间内全部死亡。为体外研究皮肤烫伤提供了一种稳定可靠的热损伤细胞模型。
综上所述，本发明通过中性酶消化可将表皮从真皮组织上剥离，随后将真皮组织剪碎，贴壁培养可以得到真皮成纤维细胞。通过不同的胰酶消化时间，可以将原代培养中可能存在的表皮细胞去除，纯化真皮成纤维细胞。体外通过在43℃水浴锅中热处理50min可得到热损伤真皮成纤维细胞模型。本发明可以得到纯度极高的真皮成纤维细胞及其热损伤模型，为皮肤热损伤的治疗提供了真皮成纤维细胞及其热损伤模型。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是人真皮成纤维细胞P0代细胞显微镜照片；
图2是人真皮成纤维细胞P1代细胞显微镜照片；
图3是人真皮成纤维细胞P2代细胞显微镜照片；
图4是人真皮成纤维细胞P3代细胞显微镜照片；
图5是对照组真皮成纤维细胞24h和48h后显微镜照片；
图6是实验组2真皮成纤维细胞24h和48h后显微镜照片；
图7是实验组1真皮成纤维细胞24h和48h后显微镜照片；
图8是实验组3真皮成纤维细胞24h和48h后显微镜照片。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本发明，应当理解的是，这些实施例并不构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，除非另有指明均为常规方法，本发明所涉及原料和试剂除非另有指明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。
以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，但这些实施例并非用以限定本发明的保护范围。
实施例1：原代人真皮成纤维细胞分离与培养方法
在获得小孩家族口头同意的前提下，从医院获得小孩包皮切除术废弃皮肤组织。仔细去除皮肤组织中的脂肪、血管及系膜后，PBS清洗皮肤。0.25％Dispase中性蛋白酶，4℃冰箱中消化过夜，PBS漂洗终止消化。用眼科镊将表皮和真皮分离，随后用眼科剪将真皮组织完全剪碎。将剪碎的真皮组织贴壁在六孔板中，37℃孵育箱中倒置贴壁1h后，每孔中加入1mL DFL细胞培养基。3-5天后有细胞爬出，待细胞汇合度达到80％时，采用胰酶/EDTA进行消化传代。
具体操作规程如下：
一、真皮组织的分离：
招募2-6周岁年龄段需做包皮环切手术的儿童，在完全自愿的前提下捐献皮肤组织。具体操作规程如下：
1.包皮组织的收集
将500ml蓝盖瓶送至手术房。蓝盖瓶预先装有200mL HBSS(Hank’s平衡盐溶液，Hanks'Balanced Salt Solution)的采集液，其中含有万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素B 2-3μg/m及300-500单位肝素钠；以此作为含抗生素的杀菌液。
上述HBSS(Hank’s平衡盐溶液)采集液的制备方法如下：
在200ml的Hank’s平衡盐溶液中添加以下成分至下述浓度：万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素B 2-3μg/m及300-500单位肝素钠；然后再按照常规程序于高温下进行灭菌。
儿童进行包皮切除手术之后，将皮肤组织放入上述采集瓶中。在得到捐赠者知会同意的情况下对细胞进行培养。样品在送往实验室之前必须在低温(0-4℃)条件下进行保存(保存期一般为24-48h)。
2.分离真皮组织
1)于实验室无菌超净台中取出皮肤组织，PBS清洗3次，每次3min；
2)将皮肤组织置于无菌培养皿中，用眼科剪及眼科镊仔细去除皮下脂肪组织、血管及系膜；
3)用PBS清洗剩余皮肤组织1次后，加入0.25％Dispase中性蛋白酶，4℃冰箱中消化过夜；
4)第二天取出皮肤组织，PBS漂洗3次去除中性蛋白酶溶液，终止消化；
5)用眼科镊分别夹住皮肤的真皮组织及表皮组织，将表皮从真皮组织上剥离，将真皮组织放入PBS的漂洗3次；
三、真皮成纤维细胞原代培养：
真皮成纤维细胞完全培养基的成分如下：
33.6mL H-DMEM基础培养基；
6mL胎牛血清(15％v/v)；
0.4mL双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)，(1％v/v)；
真皮成纤维细胞完全培养基的配置方法如下：在无菌容器中加入33.6mL H-DMEM基础培养基、6mL胎牛血清和0.4mL双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)，(1％v/v)。充分混匀，4℃保存待用。
1)用眼科剪将真皮组织充分剪碎，使得真皮组织的直径不超过1cm；
2)用眼科镊仔细的将真皮组织逐块夹起，滤干水分，将其均匀展开贴放在六孔板的底部：
3)将六孔板放入37℃孵育箱中，倒置贴壁1h后；
4)在六孔板中加入1mL真皮成纤维细胞完全培养基，轻柔的将六孔板放入37℃孵育箱中进行培养；
5)1-2天后，待组织块完全贴牢在六孔板底部之后，每个六孔板中补加1mL真皮成纤维细胞完全培养基；
6)真皮组织块贴壁培养3-5天后，显微镜下可以观察到有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞增殖到一定密度后对细胞进行传代，显微镜照片见图1，在图中可以看出原代贴壁培养培养的真皮组织块在贴壁3-5天后，可见有大量的成纤维样细胞爬出(P 0)，同时伴有“铺路石”样上皮细胞爬出。
四、真皮成纤维细胞传代及纯化：
1)去除上述原代培养步骤6)所得物中的培养液；
2)用无钙镁的PBS洗涤液进行洗涤；
上述无钙镁离子的PBS洗涤液的配制如下：
Figure BDA0002458010270000101
定容至1L于高压蒸汽灭菌(常规程序)后放入4℃冰箱保存待用。
3)每孔中加入1mL 0.05％胰酶/EDTA，37℃孵育箱(5％CO2、95％湿度)中消化1-2min；
4)倒置显微镜下观察细胞消化情况，待长梭形的真皮成纤维细胞变圆之后(此时表皮细胞依旧未见明显形态变化，牢固的贴在培养板底部)，每孔中加入2mL消化终止液终止消化；
5)轻柔吹打，使真皮成纤维细胞脱落并形成单细胞状态；
6)将细胞悬液收集在15mL离心管中，100rpm离心5min；
7)弃上清，加入成纤维细胞完全培养基重悬细胞，按1:3的比例对细胞进行传代：从3ml的细胞悬液中取1mL至一新的10cm培养皿中，再加入6ml的羊膜上皮干细胞通用培养基，摇匀；
8)放入到5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养；
9)每天观察细胞状态、汇合度及是否有表皮细胞污染。每2-3天传代细胞一次(即从步骤1)至步骤7))。
每次传代之后在显微镜下观察细胞状态，P1代细胞显微镜下照片见图2，在图中可以看出，P1代成纤维细胞中存在少量上皮细胞。P2代细胞显微镜下照片见图3，在图中可以看出，P2代成纤维细胞中只有极少量上皮细胞。P3代细胞显微镜下照片见图4，在图中可以看出，当成纤维细胞传至第3代时，细胞纯度达到100％，无其它类型细胞污染，细胞生长状态良好，增长迅速。
上述消化终止液的配置方法如下：
在36mL H-DMEM基础培养基中加入4mL小牛血清。
实施例2：真皮成纤维细胞体外热损伤模型的构建
为构建真皮成纤维细胞体外热损失模型，我们先将生长状态良好的P3代羊膜干细胞消化并按1.5×105个/孔的密度接种六孔板中，37℃ 5％CO2孵育箱中培养。第二天，待细胞完全贴壁之后，换液去除未贴壁细胞及死细胞。预先将水浴锅的温度分别调至41℃、43℃及45℃进行实验。完全密封含有细胞的六孔板并将其分别置于不用温度的水浴锅中，热处理50分钟。热处理结束后，将六孔板从水浴锅中取出，并在超净台中打开培养皿，对细胞进行换液。热处理24h及48h后分别观察细胞生长状态及死亡情况。筛选出最适合体外构建真皮成纤维细胞的条件。
实验组1的具体操作规程如下：
一、真皮成纤维细胞的复苏：
挑取生长状态良好、纯度为100％的P3代真皮成纤维细胞进行复苏。具体操作规程如下：
1)取一无菌15mL离心管，加入5mL真皮成纤维细胞完全培养基；
2)打开水浴锅，将其温度设置为37℃；
3)从液氮罐中取出P3代真皮成纤维细胞，迅速将其置于水浴锅中，快速摇晃冻存管，使其快速溶解；
4)待冻存管中冰块剩绿豆大小时，将冻存管从水浴锅中取出，转移至超净台中；
5)用移液器将冻存管中溶解后的细胞悬液转移到离心管中，1000rpm离心5min；
6)离心过程中，在10cm培养皿中加入5mL完全培养基；
7)离心结束后，弃冻存管中上清，加入2mL完全培养基，重悬细胞；
8)将细胞悬液转移至10cm培养皿中，十字交叉法轻轻摇晃培养皿使细胞均匀分布；
9)将培养皿置于含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养。
二、真皮成纤维细胞的接种：
待真皮成纤维细胞的汇合度达到80％-90％时，消化细胞并将其接种在6孔板中。具体操作规程如下：
1)PBS清洗细胞2次，加入1mL胰酶/EDTA溶液，37℃细胞培养箱进行消化。显微镜下观察细胞变为圆形后加入2倍体积终止液终止消化；
2)用移液枪轻柔吹打培养皿底部，将细胞吹下。随后将细胞悬液转移至15mL离心管中；
3)1000rpm离心5min后，弃上清，往离心管中加入2mL真皮成纤维细胞完全培养基，重悬细胞；
4)细胞计数，将真皮成纤维细胞以1.5×105个/孔的密度接种六孔板中，37℃ 5％CO2细胞培养箱孵育箱中培养；
5)第2天，待细胞贴壁后换液，去除死细胞及未贴壁细胞。随后进行热损失模型构建。
三、真皮成纤维细胞体外热损伤模型的构建
1)将水浴锅内水位高度调到刚好可没过六孔板底部位置，水温调至43℃；
2)用封口膜将接种有真皮成纤维细胞的六孔板完全封闭，放入43℃的水浴锅中热处理50min；
3)热处理之后，将培养板从水浴锅中取出，75％乙醇充分擦拭干净，在超净台中打开培养板；
4)吸弃上清，每孔中加入2mL新鲜皮肤细胞培养基，24h及48h后观察真皮成纤维细胞的增殖及凋亡情况并拍照，验证模型是否构建成功。
实验同时设置正常培养组细胞(与实验组1的不同之处在于，细胞未放入水浴锅进行热处理)作为对照组，实验组2(与实验组1的不同之处在于，步骤3)中水浴锅的温度为41℃)和实验组3(与实验组1的不同之处在于，步骤3)中水浴锅的温度为45℃)。
上述实验获得的细胞显微镜下照片见图5-8，在图5中，I为正常培养组细胞培养24h后照片，II为正常培养组细胞培养48h后照片。
在图6中，III为实验组2细胞培养24h后照片，IV为正常培养组细胞培养48h后照片，与对照组相比，细胞的增殖能力未见明显降低且未发现明显的细胞凋亡。
在图7中，V为实验组1细胞培养24h后照片，VI为正常培养组细胞培养48h后照片；与对照组相比，细胞密度显著降低，可见大量凋亡细胞，但仍可见存在较多活细胞。表明41℃热损伤50min可明显抑制皮肤细胞增殖并促进其凋亡，该条件适合于体外构建真皮成纤维细胞热损伤模型；
在图8中，VII为实验组3细胞培养24h后照片，VIII为正常培养组细胞培养48h后照片。与对照组相比，细胞完全死亡，未见存活细胞。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将生长状态良好的高纯度真皮成纤维细胞胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时终止消化，进行离心并用PBS清洗获得细胞沉淀；
2)将步骤1)所述的细胞沉淀接种于六孔板，加入真皮成纤维细胞完全培养基进行培养；
3)细胞贴壁之后吸弃培养基，去除未贴壁细胞，添加新鲜真皮成纤维细胞完全培养基，将六孔板于53℃水浴中热处理50分钟，得到真皮成纤维细胞热损伤模型。
2.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：
30-35份的H-DMEM基础培养基、5-7份的胎牛血清和0.3-0.5份的双抗溶液；
优选地，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：
33.6份的H-DMEM基础培养基、6份15％v/v胎牛血清以及0.4份1％v/v双抗溶液，所述双抗溶液含10,000U/ml苄青霉素钠和10,000μg/ml链霉素。
3.根据权利要求1或2所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，所述培养的条件为，在六孔板中每孔添加2ml真皮成纤维细胞完全培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为24h。
4.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度大于95％；优选地，所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度为100％。
5.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤1)所述终止消化的方法为用含体积浓度5％-15％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞，优选地，采用10％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞。
6.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤2)所述细胞沉淀在六孔板上的接种细胞密度为1.5×105个/孔。
7.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的制备为以人包皮作为细胞来源，进行分离培养后再进行细胞传代和纯化获得。
8.根据权利要求7所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，所述分离培养包括如下步骤：
A.包皮组织的收集
将500ml蓝盖瓶送至手术房，蓝盖瓶预先装有200mL Hank’s平衡盐溶液作为采集液；
儿童进行包皮切除手术之后，将皮肤组织放入上述采集液中，0-4℃条件下进行保存24-48h；
B.分离真皮组织
于实验室无菌超净台中取出皮肤组织，PBS清洗3次，每次3min；
将皮肤组织置于无菌培养皿中，用眼科剪及眼科镊仔细去除皮下脂肪组织、血管及系膜；
用PBS清洗剩余皮肤组织1次后，加入0.25％Dispase中性蛋白酶，4℃冰箱中消化过夜；
第二天取出皮肤组织，PBS漂洗3次去除中性蛋白酶溶液，终止消化；
用眼科镊分别夹住皮肤的真皮组织及表皮组织，将表皮从真皮组织上剥离，真皮组织放入PBS中漂洗3次；
C、真皮成纤维细胞原代培养：
用眼科剪将真皮组织充分剪碎，使得真皮组织的直径不超过1cm；
用眼科镊仔细的将真皮组织逐块夹起，滤干水分，将其均匀展开贴放在六孔板的底部：
将六孔板放入37℃孵育箱中，倒置贴壁；
1h后，在六孔板中加入1mL真皮成纤维细胞完全培养基，轻柔的将六孔板放入37℃孵育箱中进行培养；
1-2天后，待组织块完全贴牢在六孔板底部之后，每个六孔板中补加1mL真皮成纤维细胞完全培养基；
真皮组织块贴壁培养3-5天后，可以观察到有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞增殖到一定密度后对细胞进行传代；
所述Hank’s平衡盐溶液的制备方法如下：在200ml的Hank’s平衡盐溶液中添加以下成分至下述浓度：万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素B 2-3μg/m及300-500单位肝素钠。
9.根据权利要求7所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，所述细胞传代和纯化，包括以下步骤：
A.去除原代培养的真皮成纤维细胞的培养基；
B.用无钙镁的PBS洗涤液进行洗涤；
C.每孔中加入1mL 0.05％胰酶/EDTA，37℃孵育箱在5％CO2、95％湿度下中消化1-2min；
D.倒置显微镜下观察细胞消化情况，待长梭形的真皮成纤维细胞变圆之后，每孔中加入2mL消化终止液终止消化；
E.轻柔吹打，使真皮成纤维细胞脱落并形成单细胞状态；
F.将细胞悬液收集在15mL离心管中，100rpm离心5min；
G.弃上清，加入成纤维细胞完全培养基重悬细胞，按1:3的比例对细胞进行传代：从3ml的细胞悬液中取1mL至一新的10cm培养皿中，再加入6ml的羊膜上皮干细胞通用培养基，摇匀；
H.放入到5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养。
10.权利要求1-9任一项所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法在皮肤损伤修复及相关治疗药物筛选上的应用。
CN202010311466.9A 2020-04-20 2020-04-20 一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用 Pending CN111518743A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010311466.9A CN111518743A (zh) 2020-04-20 2020-04-20 一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010311466.9A CN111518743A (zh) 2020-04-20 2020-04-20 一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111518743A true CN111518743A (zh) 2020-08-11

Family

ID=71903273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010311466.9A Pending CN111518743A (zh) 2020-04-20 2020-04-20 一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111518743A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113621555A (zh) * 2021-08-18 2021-11-09 郑州源创吉因实业有限公司 一种皮肤成纤维细胞的制备方法
CN114292894A (zh) * 2022-01-14 2022-04-08 广东悠质检测技术有限公司 一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101352586A (zh) * 2008-08-26 2009-01-28 程树军 采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法
CN102719394A (zh) * 2012-06-20 2012-10-10 山东农业大学 山羊真皮成纤维细胞系的构建方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101352586A (zh) * 2008-08-26 2009-01-28 程树军 采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法
CN102719394A (zh) * 2012-06-20 2012-10-10 山东农业大学 山羊真皮成纤维细胞系的构建方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIRA TAKASHIMA: "Establishment of fibroblast cultures，Akira Takashima", 《CURRENT PROTOCOLS IN CELL BIOLOGY》 *
LINLI ZHOU等: "Dermal fibroblasts induce cell cycle arrest and block epithelial-mesenchymal transition to inhibit the early stage melanoma development", 《CANCER MEDICINE》 *
张卓然主编: "《实用细胞培养技术》", 31 December 2012 *
李德全: "离体人真皮成纤维细胞热损伤变性后转归及HSP90的保护作用", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
裴国献等: "《组织工程学实验技术》", 31 May 2006 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113621555A (zh) * 2021-08-18 2021-11-09 郑州源创吉因实业有限公司 一种皮肤成纤维细胞的制备方法
CN114292894A (zh) * 2022-01-14 2022-04-08 广东悠质检测技术有限公司 一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法
CN114292894B (zh) * 2022-01-14 2023-08-11 广东悠质检测技术有限公司 一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106754674B (zh) 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
US6916655B2 (en) Cultured skin and method of manufacturing the same
CN107974429B (zh) 一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基
WO2019161591A1 (zh) 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法
CN101954124B (zh) 含基底膜的组织工程皮肤的构建方法
JPWO2005087286A1 (ja) 生体組織シート及びその作製方法、並びに同シートを用いる移植方法
JPH02174848A (ja) 表皮シート並びにその製法、貯蔵方法および用途
CN111518743A (zh) 一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用
CN109929800A (zh) 一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法
CN109876010A (zh) 一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法
WO2019161590A1 (zh) 间充质干细胞悬浮液及其制备方法与应用
CN110179826A (zh) 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法
CN111549000B (zh) 一种过表达Hpgds的重组脂肪干细胞、制备方法及其应用
CN110404119A (zh) 羊膜组织工程去免疫原皮肤支架的制备方法
CN112342190A (zh) 一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用
CN109182256B (zh) 一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法
WO2002092794A2 (en) Isolation method of mesenchymal cells
CN112941015B (zh) 一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂及方法
CN114457010A (zh) 一种干细胞衍生品及其制备方法和应用
RU2148970C1 (ru) Способ восстановления кожного покрова
CN115369073A (zh) 表皮干细胞外泌体的制备方法
CN114107188A (zh) 一种干细胞成膜培养基及其应用
CN109771697B (zh) 一种真皮成纤维细胞皮片及其构建方法和应用
CN112430572A (zh) 一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法
CN113046300A (zh) 一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination