CN112342190A - 一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用 - Google Patents

一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，使用微囊作为间充质干细胞的生长体系，在三维条件下培养间充质干细胞，培养环境更接近体内，有利于提高间充质干细胞分泌的外泌体产量。微囊的半透膜可以有效截留外泌体，提高微囊内外泌体浓度，为下游的分离纯化节省工艺成本及时间；也可以避免培养基血清来源的外泌体进入微囊内，避免使用特定的商品化无血清培养基，降低培养成本。本发明提供的三维培养提高间充质干细胞外泌体产量的方法，有望解决解决外泌体产量不足的技术瓶颈。

Description

一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种提高间充质干细胞的外泌体产量的方法及其应用。
背景技术
外泌体是由细胞分泌的直径为30-150 nm的小囊泡，内含来源于细胞相关的蛋白质与核苷酸等生物分子，在细胞交流间起重要作用。近期研究发现，干细胞来源的外泌体可以有效转运mRNA、microRNA及蛋白质等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能，在调控组织再生方面存在良好的临床应用前景。在多种疾病/损伤模型中，间充质干细胞源性外泌体干预后已被证明可恢复组织功能，在体外试验中也有类似效果，主要由细胞外囊泡miRNAs介导，胞外囊泡具有脂质双层结构，容易穿透细胞膜，不易引起免疫反应，并且可防止内部RNA和蛋白质降解。因为外泌体不含DNA成分，避免不同个体间遗传信息传递带来的风险，与细胞治疗相比，间充质干细胞源性外泌体的非细胞疗法更安全、易操作，有巨大的潜力。
目前大多通过平面培养间充质干细胞获得外泌体，外泌体的低产量阻碍了其临床应用。同时，外泌体的分离纯化效率较低，也提高了外泌体的生产成本。
因此，本领域亟待开发细胞培养方法增加外泌体产量以推进外泌体技术的临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法，解决外泌体产量不足的技术瓶颈。
本发明的技术方案是这样实现的：
1.分离间充质干细胞。从人来源的脐带、脂肪、骨髓中分离得到间充质干细胞，加入10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，细胞接种密度为1-5×105 cells/cm2，三天后清洗掉未贴壁细胞，当间充质干细胞融合度达到80-90%，加入0.05%的胰酶消化，按1:3比例进行传代培养。
2.微囊化包埋间充质干细胞。收集干细胞，按照1-10×106 cells/mL密度接种于1-2%的海藻酸钠溶液，混合均匀后使用微胶囊高压静电制备仪滴加到1-2%的二价氯化盐溶液中，反应20-60分钟后得到海藻酸盐胶珠。将海藻酸盐胶珠与0.5-1%α-聚赖氨酸溶液按照体积比1:10进行成膜反应，反应5-15分钟后使用PBS洗涤三次。加入柠檬酸钠溶液进行液化反应，反应5-10分钟后，得到粒径200-500 μm具有液化核心和半透膜的微胶囊。
3.在培养瓶（皿）或生物反应器中，微囊化培养间充质细胞。将微囊化间充质干细胞与培养液按照1:10比例接种到培养容器中，使用IMDM基础培养基进行培养。
4.收获外泌体。培养结束后，将微囊混悬液经过不锈钢筛网进行分离，微囊被截留在筛网上方，将截留的微囊转移至50 mL离心管中，加入一定体积生理盐水，使用一次性注射器反复吸取挤压进行机械破囊。
5.外泌体分离纯化。将破囊后混悬液进行超速离心，300g离心10分钟去除活细胞，1000-2000g离心10分钟去除死细胞，10000-20000g离心30分钟去除细胞碎片，100000-200000g离心70分钟得到纯化后的外泌体。
6.外泌体的鉴定和检测。使用透射电镜观察外泌体形态，使用纳米颗粒追踪计算外泌体产量，使用Westen blot检测外泌体指标蛋白。
7.外泌体的临床应用。将数量为1010-1012的外泌体注射到患者关节软骨损伤、皮肤损伤等部位进行器官组织的修复。
本发明的优点在于：
1）在三维环境中培养间充质干细胞，三维环境接近于在体组织，干细胞生长及代谢更接近体内状态，有利于提高外泌体的生产。
2）微囊膜孔径大部分是25 nm，可以有效截留外泌体，提高微囊内外泌体浓度，为下游的分离纯化节省工艺成本及时间；
3）微囊膜孔径大部分是25 nm，也可以避免培养基血清来源的外泌体进入微囊内，避免使用特定的商品化无血清培养基，降低培养成本。
附图说明
下面以微囊化脐带间充质干细胞在75mL培养瓶中培养进行说明。
图1是本发明所述的一种三维培养间充质干细胞的方法操作流程图。
图2 是本发明所述的一种三维培养微囊化间充质干细胞的操作示意图。
图3是本发明中制备的微囊化间充质干细胞的显微照片（10倍镜）。
图4 是本发明所述的一种提高间充质干细胞的外泌体产量方法中超速离心分离纯化外泌体的示意图。
图5是本发明所述的一种三维培养微囊化间充质干细胞收获并分离纯化后外泌体在电镜下的观察图，检测外泌体形态。
图6 是本发明所述的一种三维培养微囊化间充质干细胞收获并分离纯化后外泌体在纳米颗粒追踪仪的检测图，检测外泌体数量，并与平面培养的间充质干细胞收获并分离纯化后外泌体的产量进行对比。
图7是本发明所述的一种三维培养微囊化间充质干细胞收获并分离纯化后外泌体的Western Blot检测图，检测外泌体的指标蛋白。
图中：1.注射泵；2.注射器；3.烧杯；4.微胶囊高压静电制备仪。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例进行进一步的说明。
实施例1 一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法，包括以下步骤：
1.实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。
2.脐带间充质干细胞的分离和鉴定
1）在健康产妇知情情况下获得脐带30 cm，在手术室采集后即使用无菌PBS浸泡并运送到实验室，75%酒精浸泡1分钟并冲洗后放在10 cm平皿中，无菌PBS冲洗3次。
2）将脐带剪成5 cm小段，用镊子撕开脐带并小心去除血管（包括2根动脉、1根静脉），小心将脐带撕成细丝。
3）将细丝转移到50 mL离心管中，加入10 mL PBS混匀后，将手术剪插入离心管进行快速剪碎。
4）向离心管加入10 mL 0.1%的I型胶原酶，将离心管放置在摇速90 rpm，温度37℃的恒温摇床上进行消化2小时。
5）取出离心管，此时组织块已消化，液体呈现粘稠状态，使用巴氏吸管进行吹打，并使用80目钢筛过滤，收集滤过液中细胞。
6）将滤过液进行离心，转速1200 rpm，离心5分钟，使用PBS离心洗涤2次。
7）将离心后的细胞平均接种到4个25 cm2培养瓶中，在CO2培养箱37℃培养，24小时后观察无细胞污染现象，继续培养48小时。
8）取出培养瓶观察，有少量细胞贴壁，继续培养到细胞融合度80%，加入胰酶消化并传代。
3.微囊化间充质干细胞的制备
取第3代脐带间充质细胞，按照2×106 cells/mL细胞密度与1.8%海藻酸钠溶液混匀，使用微胶囊高压静电制备仪进行微囊制备，海藻酸钠混悬液通过针头滴加到1.2%的氯化钙溶液中，反应30分钟后得到海藻酸钙胶珠。将海藻酸钙胶珠与0.6%α-聚赖氨酸溶液按照体积比1:10进行成膜反应，反应15分钟后使用PBS洗涤三次。加入柠檬酸钠溶液进行液化反应，反应10分钟后，得到粒径300 μm具有液化核心和半透膜的微胶囊。
4.收获外泌体
培养细胞至第7天，将微囊混悬液经过不锈钢筛网进行分离，微囊被截留在筛网上方，将截留的微囊转移至50 mL离心管中，加入1.2倍体积生理盐水，使用一次性注射器反复吸取挤压进行机械破囊。
5.外泌体分离纯化
将破囊后的混悬液进行超速离心，依次经过300g离心10分钟去除活细胞，2000g离心10分钟去除死细胞，10000g离心30分钟去除细胞碎片，180000g离心70分钟得到纯化后的外泌体。
6.外泌体的鉴定和检测
使用透射电镜观察外泌体形态，使用纳米颗粒追踪仪检测并计算外泌体产量，使用Westen Blot检测外泌体指标蛋白。
检测结果：微囊化培养间充质干细胞分泌的外泌体在电镜下呈现出双层膜茶托样形态，符合外泌体形态特征，并且经过Western Blot检测具有CD63、CD9、CD81和Alix等外泌体指标蛋白的表达。经过纳米颗粒追踪仪检测外泌体数量并计算微囊化培养和平面培养条件下外泌体的产量，发现微囊化培养将间充质干细胞的外泌体产量提高了200倍。
此实施例说明，微囊化培养条件提高了间充质干细胞的外泌体产量，有望解决临床上外泌体产量不足的瓶颈。
实施例2 一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法的临床应用
将分离纯化后的外泌体进行计数，按照107/kg剂量对10名骨性关节炎患者进行关节腔内注射，并于治疗后1、2、3个月进行疗效评价。结果显示，10名患者均无不良反应，膝疼痛减轻，关节活动度较前增大，关节面软骨厚度增加，生活质量提高。
本发明仅以实施例1和2为例进行描述，并不意味着对本发明构成限制，参照本发明的描述，其他来源的间充质干细胞、微囊制备材料以及实施例的其他变形，对于本领域的技术人员是可预料的，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。

Claims (7)

1.一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，实现此发明主要包括以下步骤：（1）分离间充质干细胞；（2）微囊化包埋间充质干细胞；（3）在培养瓶（皿）或生物反应器中，微囊化培养间充质细胞；（4）收获外泌体；（5）外泌体分离纯化；（6）外泌体的鉴定和检测；（7）外泌体的临床应用。
2.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述间充质干细胞包括脐带、骨髓、脂肪来源的间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述微囊制备材料包括但不限定于但不限定于海藻酸钠、α-聚赖氨酸、壳聚糖、二价氯化盐。
4.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述的微囊粒径在200-500 μm。
5.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述的微囊膜可以截留外泌体在囊内，提高微囊内外泌体浓度，为下游的分离纯化节省工艺成本及时间。
6.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述的微囊膜可以避免培养基血清来源的外泌体进入微囊内，避免使用特定的商品化无血清培养基，降低培养成本。
7.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，临床应用包括但不限于关节软骨损伤、皮肤损伤等慢性损伤性疾病。
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Application publication date: 20210209

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