CN109913409A - 三维培养间充质干细胞来源外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三维培养间充质干细胞来源外泌体及其制备方法与应用。所述三维培养间充质干细胞来源外泌体的制备方法包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养，之后分离获得三维培养间充质干细胞来源外泌体。本发明还公开了所述三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备能够治疗阿尔兹海默病的药物中的应用。本发明利用三维支架材料作为载体培养间充质干细胞，可以提高间充质干细胞来源外泌体的产量，调控外泌体内含物成分及其功能，尤其是在阿尔兹海默病治疗中，可以有效抑制淀粉样蛋白沉积和改善记忆认知能力。

Description

三维培养间充质干细胞来源外泌体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种三维支架材料及其在间充质干细胞来源外泌体制备中的应用，以及所获三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备治疗阿尔兹海默病的产品中的应用，属于生物医学材料技术领域。

背景技术

阿尔兹海默病是一种最常见的老年痴呆症状，表现为认知水平和记忆功能下降。2018年全球大概有5,000万患者，而这一数字将于2050年提高至15,200万。阿尔兹海默病主要病理特征是细胞外淀粉样蛋白沉积形成老年斑和细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成神经原缠结，最终造成神经元功能的丧失及死亡。目前，临床上尚无有效的治疗手段或药物能够抑制淀粉样蛋白沉积、神经元死亡以及病人记忆功能的衰退。

随着干细胞技术的不断发展，发现干细胞可以自我更新并分化为各种中枢神经系统的细胞，为阿尔兹海默病治疗带来希望。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类成体干细胞，广泛存在于多种组织和器官中，并具有低免疫原性的特点，被认为是最具治疗潜力的种子细胞。研究表明，间充质干细胞能够抑制淀粉样蛋白沉积、缓解神经炎症、恢复胶质细胞功能并最终改善记忆缺陷。然而，进一步研究发现间充质干细胞在体内分化较低且并不稳定，移植的间充质干细胞大部分发生了凋亡，并未直接参与组织再生。因此认为间充质干细胞在阿尔兹海默病症治疗方面的作用主要是通过旁分泌功能实现的。利用间充质干细胞培养条件培养基而不是细胞本身移植可以达到衰减淀粉样蛋白沉积的体内外研究，进一步证实了上述观点。另外，间充质干细胞移植在阿尔兹海默病治疗中还存在着一定的毒副作用和安全性问题。

外泌体是一类直径为30-150nm的双层膜纳米囊泡，是间充质干细胞分泌物的重要组分之一。外泌体通过运输蛋白质、mRNA、miRNA等活性生物分子，实现细胞-细胞之间的通讯，并参与调控生理过程和疾病的发生。

研究发现间充质干细胞来源外泌体能抑制淀粉样蛋白沉积并改善记忆缺陷；更重要的是，来源细胞所处微环境的变化决定了外泌体内含物的组成，将对阿尔兹海默病的治疗具有特殊作用。例如，在可释放一氧化氮的聚合物作用下，间充质干细胞来源外泌体中表皮生长因子和miR-126水平有所增加，进而改善了小鼠下肢缺血症状(Biomaterials.2017.133:70-81.)；Cui,G.,等人发现缺氧处理的外泌体能够提供额外的miR-21，进而改善小鼠的认知功能和病理症状(FASEB J.2018.32(2):654-668.)。另一方面研究者验证了生物材料的表面拓扑结构以及维度等因素能够明显提高间充质干细胞的旁分泌功能(Biomaterials.2017.141:74-85.；Biomaterials.2017.140:103-114.)，但仅限于因子水平的检测研究，并没有深入了解生物材料对间充质干细胞来源外泌体的影响及其功能。

三维支架培养中细胞的表现与传统二维培养基底明显不同，三维培养中细胞-细胞、细胞-基质相互作用能够更好地模拟机体微环境。另外，三维支架材料的物理特性，如弹性模量、表面拓扑结构等，在细胞粘附、增殖、迁移分化以及旁分泌功能调控上发挥了关键作用。目前为止，尚未有三维支架材料是否能够调控间充质干细胞来源外泌体功能影响阿尔兹海默病治疗的研究报道。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种三维培养间充质干细胞来源外泌体及其利用三维支架材料作为载体的制备方法，以克服现有技术中的不足。

本发明的另一目的还在于提供前述三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备治疗阿尔兹海默病的产品中的应用。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了三维支架材料在制备间充质干细胞来源外泌体中的应用。

本发明实施例还提供了一种三维培养间充质干细胞来源外泌体的制备方法，其包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养，之后分离获得三维培养间充质干细胞来源外泌体。

本发明实施例还提供了由前述方法制备的三维培养间充质干细胞来源外泌体。

本发明实施例还提供了前述的三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备能够抑制淀粉样蛋白沉积和/或改善记忆认知能力的功能性产品中的应用。

本发明实施例还提供了前述的三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备能够治疗阿尔兹海默病的功能性产品中的应用。

本发明实施例还提供了一种治疗阿尔兹海默病的药物，其包含前述的三维培养间充质干细胞来源外泌体。

与现有技术相比，本发明首次发现三维支架材料作为细胞培养载体可提高间充质干细胞来源外泌体产量，并影响外泌体内含物成分(miRNA和蛋白质，包括脑啡肽酶、胰岛素降解酶、热休克蛋白70等)及其功能，并在阿尔兹海默病理小鼠模型上得以验证；三维培养来源外泌体能更有效抑制阿尔兹海默病理小鼠海马区淀粉样蛋白沉积并改善小鼠改善记忆认知能力；认为其中差异表达的miRNA调控了淀粉样蛋白生成过程中分泌酶的表达，减少了淀粉样蛋白生成；另一方面，脑啡肽酶、胰岛素降解酶、热休克蛋白70发挥了淀粉样蛋白降解的作用，因此达到有效抑制阿尔兹海默病理小鼠海马区淀粉样蛋白沉积的目的，进而改善小鼠记忆认知能力，可应用于阿尔兹海默病症治疗。

附图说明

图1A为本发明一典型实施例中利用透射电子显微镜技术观察二维外泌体的形貌图及粒径大小示意图。

图1B为本发明一典型实施例中利用透射电子显微镜技术观察三维培养间充质干细胞来源外泌体的形貌图及粒径大小示意图。

图1C为本发明一典型实施例中纳米示踪技术检测二维外泌体的粒径分布及浓度示意图。

图1D为本发明一典型实施例中纳米示踪技术检测三维培养间充质干细胞来源外泌体的粒径分布及浓度示意图。

图2为本发明一典型实施例中利用Western blot技术检测二维外泌体和三维外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、Alix、TSG101的表达示意图。

图3为本发明一典型实施例中miRNA芯片技术检测二维外泌体和三维外泌体中miRNA水平表达变化示意图。

图4为本发明一典型实施例中Western blot检测二维外泌体和三维外泌体内含物蛋白水平变大变化示意图。

图5A为本发明一典型实施例中定位航行试验中小鼠逃避潜伏期示意图。

图5B为本发明一典型实施例中空间探索试验中小鼠典型运动轨迹的示意图。

图5C为本发明一典型实施例中空间探索试验中小鼠穿越平台次数示意图。

图5D为本发明一典型实施例中空间探索试验中小鼠在目标象限活动距离百分比示意图。

图5E为本发明一典型实施例中空间探索试验中小鼠在目标象限活动时间百分比示意图。

图6A为本发明一典型实施例中DiO标记外泌体(绿色)在小鼠大脑分布情况示意图。

图6B-图6E为本发明一典型实施例中免疫组织化学染色标记淀粉样蛋白在小鼠右侧海马区积聚水平及定量分析示意图。

图6F-图6G分别为本发明一典型实施例中荧光实时定量PCR检测ADAM10和BCAE1于mRNA水平变化示意图。

图6H为本发明一典型实施例中Western blot检测ADAM10和BCAE1于蛋白水平变化示意图。

图7为采用本发明一典型实施例中三维培养间充质干细胞来源外泌体治疗阿尔兹海默病理小鼠的实验过程示意图。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是提供一种利用三维支架材料作为载体培养间充质干细胞调节其来源外泌体功能的方法，并将获得的三维培养间充质干细胞来源外泌体应用于阿尔兹海默病症治疗。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

首先需说明的是，本发明说明书中述及的术语的释义均是本领域技术人员所知悉的。例如，其中一些术语的定义如下：

1.三维支架材料：具有一定空间结构、多孔性、骨架可提供细胞生长的生物材料。

2.间充质干细胞：是一种成体干细胞，来源于发育早期的中胚层，具有自我复制和多向分化能力。在体内或体外特定条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。骨髓、脂肪、脐带、脐带血及胎盘中可分离和制备间充质干细胞。

3.外泌体：外泌体是一类具有双层生物膜结构的囊性小体，粒径为30-150nm。外泌体中含有来源于细胞的功能性生物成分，如脂质、蛋白质和核酸(mRNA，miRNA等)。外泌体携带来自亲本细胞的生物分子到受体细胞，在细胞与细胞之间交流通讯发挥重要作用，并影响多种生理与病理过程。外泌体来源于多种细胞，其中包括间充质干细胞。

4.miRNA：是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最终影响蛋白的合成表达，进而参与调节机体的生理病理过程。

5.阿尔兹海默病：又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，是老年期痴呆最常见的类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。

本发明实施例的一个方面提供了三维支架材料在制备间充质干细胞来源外泌体中的应用。

在一些优选实施例中，所述三维支架材料包括具有三维空间结构、多孔性及表面拓扑结构的生物材料，其孔隙率为99.5％±0.2％，平均孔径大小为100～300μm。

进一步地，本发明使用的三维支架材料是三维石墨烯泡沫支架材料，当然还可替换为其他具有三维空间结构、多孔性、表面拓扑结构的生物材料。

在一些优选实施例中，所述应用包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养，之后分离获得间充质干细胞来源外泌体。

进一步地，本发明中的间充质干细胞来源于人脐带间充质干细胞，当然还可以替换为其他物种的、其他来源的间充质干细胞或者其他可获得外泌体的细胞种类。

进一步地，所述间充质干细胞在三维支架材料上的接种密度为1×10⁵～1×10⁷个/100mm²。

在一些更为优选的实施例中，所述应用具体包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养6～24h，之后更换无外泌体血清继续培养24～72h，收集培养上清液进行处理，获得间充质干细胞来源外泌体。

本发明实施例的另一个方面提供了一种三维培养间充质干细胞来源外泌体的制备方法，其包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养，之后分离获得三维培养间充质干细胞来源外泌体。

在一些优选实施例中，本发明使用的三维支架材料是三维石墨烯泡沫支架材料，当然还可替换为其他具有三维空间结构、多孔性、表面拓扑结构的生物材料。

进一步地，本发明中的间充质干细胞来源于人脐带间充质干细胞，当然还可以替换为其他物种的、其他来源的间充质干细胞或者其他可获得外泌体的细胞种类。

进一步地，所述间充质干细胞在三维支架材料上的接种密度为1×10⁵～1×10⁷个/100mm²。

在一些优选实施例中，所述间充质干细胞来源外泌体的制备方法具体包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养6～24h，之后更换无外泌体血清继续培养24～72h，收集培养上清液进行处理，获得三维培养间充质干细胞来源外泌体。

本发明实施例的另一个方面还提供了由前述任一种方法制备的三维培养间充质干细胞来源外泌体，其形貌特征为具有双层生物膜结构的囊泡结构，粒径分布平均值为118.4nm，浓度为4.23×10⁸±3.25×10⁶/mL。

而二维培养间充质干细胞来源外泌体粒径分布平均值为107.5nm，浓度为2.12×10⁸±8.81×10⁶/mL。

进一步地，所述三维培养间充质干细胞来源外泌体中的miRNA含量存在差异表达。

进一步地，所述三维培养间充质干细胞来源外泌体中的4种特定蛋白质存在表达差异，其中脑啡肽酶、胰岛素降解酶、热休克蛋白70的含量明显上调，而热休克蛋白90的含量不变。

进一步地，所述三维培养间充质干细胞来源外泌体与二维培养间充质干细胞来源外泌体相比，三维培养间充质干细胞来源外泌体中有195种miRNA表达发生显著性差异，其中上调表达68种，下调表达127种。

进一步地，所述三维培养间充质干细胞来源外泌体与二维培养间充质干细胞来源外泌体相比，三维培养间充质干细胞来源外泌体中热休克蛋白70、胰岛素降解酶和脑啡肽酶在蛋白水平表达升高。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备能够抑制淀粉样蛋白沉积和/或改善记忆认知能力的功能性产品中的应用。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备能够治疗阿尔兹海默病的功能性产品中的应用。

其中，本发明验证在阿尔海默病上的治疗效应，还可替换为其他疾病类型。

本发明的药物可例如包含溶剂和稀释剂如氯化钠溶液或含有任何药物学可接受的缓冲剂的溶液。另外，本发明的药物可以是适于施用到患者的任何形式，例如可注射形式、作为片剂或胶囊、或者作为吸入组合物。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种治疗阿尔兹海默病的药物，其包含前述任一种三维培养间充质干细胞来源外泌体。

进一步地，所述药物还包含药物学可接受的佐剂和/或载体。

藉由上述技术方案，本发明利用三维支架材料作为载体培养间充质干细胞，可以提高间充质干细胞来源外泌体产量，调控内含物成分及其功能，尤其是在阿尔兹海默病治疗中，可以有效抑制淀粉样蛋白沉积和改善记忆认知能力。

以下通过若干实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。

实施例1

(1)采用传统CVD的方法，制备二维石墨烯薄膜与三维石墨烯泡沫支架：在氩气与氢气环境中将洁净的铜箔加热至950℃，之后在950℃条件下暴露于氢气和甲烷环境中5min，之后在氩气和氢气环境中降至室温，制备获得二维石墨烯薄膜；同样的，以孔隙率约为95％、孔径在30-300μm的金属镍为模板及催化剂，在950℃条件下以甲烷为碳源制备有金属泡沫的三维多孔石墨烯支架；在封闭的玻璃容器中，采用FeCl₃酸性溶液作为腐蚀液去除金属催化剂，并依次使用硝酸溶液及去离子水清洗。

(2)将步骤(1)所获得三维石墨烯泡沫支架与二维石墨烯薄膜于空气等离子体仪器中处理90s，以改善其表面亲水性；用75％乙醇浸泡30min，之后在超净工作台中于紫外灯照射30min，达到灭菌目的；于37℃孵育多聚赖氨酸2h，之后37℃孵育层粘连蛋白12h，以提高材料生物相容性。

(3)剖宫产术获得的新鲜的足月胎儿脐带，磷酸盐缓冲液清洗3次，从脐带上切除动脉血管和静脉血管；暴露Wharton胶，切成0.5-1cm³小块；贴壁于普通细胞培养皿底部，加入DMEM/F12培养基，含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素；置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，隔天换液至细胞迁移出组织块；待细胞融合度超过90％，进行传代培养及冻存；利用免疫荧光染色标记技术及流式细胞术对间充质干细胞标志蛋白进行鉴定，结果显示几乎所有细胞都为CD105和CD90阳性，CD34均为阴性。

(4)将步骤(3)中获得人脐带间充质干细胞以1×10⁵～1×10⁷个/100mm²分别接种于步骤(2)中获得的三维石墨烯泡沫支架与二维石墨烯薄膜表面，培养6～24h使之贴壁培养；更换无外泌体血清继续培养24～72h，收集培养上清液。

(5)将步骤(4)中获得细胞培养上清通过常规超速离心机分离外泌体，具体为：4℃，200g离心10min，以除去死细胞；4℃，2000g离心10min，以除去细胞碎片；4℃，10,000g离心60min，以除去微囊泡；4℃，100,000g离心60min，获得外泌体沉淀，磷酸缓冲液重悬后重复2次，以获得纯净外泌体。

(6)外泌体鉴定：将步骤(5)中获得外泌体10μL滴加于直径2mm的载样铜网上，室温静置1min，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，滴加10μL 2％的磷钨酸进行负染，室温静置1min，利用透射电子显微镜技术观察外泌体的形貌及粒径大小，其中二维外泌体的形貌图及粒径大小示意图请参阅图1A，三维培养间充质干细胞来源外泌体(以下可简称为“三维外泌体”)的形貌图及粒径大小示意图请参阅图1B。将步骤(5)中获得两种的外泌体10μL稀释到90μL磷酸盐缓冲液中，利用纳米粒子示踪技术检测各外泌体的粒径分布及浓度，其中，二维外泌体的粒径分布及浓度示意图请参阅图1C，三维外泌体的粒径分布及浓度示意图请参阅图1D。将步骤(5)中获得两种外泌体50μL，加入上样缓冲液煮沸变性，利用Western blot技术检测各外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、Alix、TSG101的表达示意图请参阅图2。其中纳米示踪技术结果显示，三维支架培养微环境来源外泌体的量明显高于二维培养环境获得外泌体的量，可参阅图1C和图1D。

(7)利用miRNA微阵列芯片技术(上海伯豪生物公司完成)检测步骤(5)中获得外泌体中miRNA表达差异，具体步骤为：通过mirVana^TM miRNA提取试剂盒分离外泌体中总RNA，之后使用miRNA完全标记试剂和Hyb试剂盒对总RNA进行标记，每张微阵列载玻片使用100ngcy3标记的RNA在杂交箱中进行杂交，之后用基因表达缓冲试剂冲洗载玻片，采用Aligent微阵列扫描仪扫描并利用软件程序分析数据。检测结果发现，相对于二维培养来源外泌体，三维支架材料培养来源外泌体中195种miRNA含量发生了变化，其中上调表达68种，下调表达127种，如图3所示。

(8)利用Western blot技术检测步骤(5)中获得各外泌体中4种特定蛋白质表达差异；其中脑啡肽酶(neprilysin，NEP)、胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)、热休克蛋白70(heat shock protein 70)在三维支架材料培养来源外泌体中有明显上调，热休克蛋白90没有明显变化，如图4所示。

(9)将步骤(5)中获得各外泌体以2mg/mL重悬于生理盐水中，100μL体积注入植入式缓释胶囊内，将以0.25μL/d的速率持续释放14天，对照组以生理盐水注射。

(10)本发明中步骤(5)中获得外泌体功能使用APP/PS1双转基因的阿尔兹海默病理小鼠模型进行验证，如图7所示。24只9月龄阿尔兹海默病理小鼠随机分为三组(生理盐水组、二维外泌体给药组、三维外泌体给药组)，各8只，另取8只野生型小鼠作为对照，不做任何处理；将小鼠用10％水合氯醛按照0.3mg/mL机灵进行腹腔注射麻醉；将小鼠头部通过耳棒固定于脑立体定位仪；小鼠头部颅顶区备皮，常规消毒手术区域皮肤；沿小鼠颅顶中线作长3cm纵行切口，用双氧水腐蚀颅顶骨膜；定位前卤往后2mm、左右1mm，用牙科钻在颅骨上钻孔；小鼠颈背部后方用止血钳钝性分离，将植入式胶囊放入；使用脑立体定位仪将脑注射套管植入颅骨开孔处，深度为2mm；使用生物胶水将脑注射套管固定于颅骨；术后常规消毒，缝合皮肤，腹腔注射抗生素，常规饲养。

(11)步骤(10)中小鼠连续给药14天后通过水迷宫测试进行行为功能学鉴定，检测小鼠空间学习和记忆能力变化：训练期，即定位航行试验历时5d，每天分上下午两次，每次训练2个象限，每次60s，2次训练间隔60s；小鼠上午分别从I、II象限入水，下午分别从III、IV象限入水；将小鼠面向池壁放入水中，动物行为分析系统自动记录小鼠寻找并爬上平台的线路图，以及小鼠从入水到找到水下隐蔽平台并立于其上所需时间(逃避潜伏期)，见图5A；平台期设定为3s，如果小鼠在60s内未找到平台，则需将其引至平台，潜伏期以60s计，让小鼠停留10s，再放回笼中；检测期，即空间探索试验，训练结束后，撤去平台，然后选择任一象限为入水点将小鼠面向池壁放人水中，记录每只小鼠运动轨迹图、60s内经过平台的次数以及在原平台所在象限内逗留的时间、路程百分比等信息；结果显示经外泌体给药处理后阿尔兹海默病理小鼠的空间学习和记忆能力所有提高，而三维外泌体给药组明显好于二维外泌体给药组，可参见图5B-图5E。

(12)为了观察外泌体在小鼠大脑内的分布，进行了外泌体荧光示踪实验：外泌体重悬于无菌生理盐水中，与终浓度为5μM DiO(绿色荧光)共同孵育20min；生理盐水清洗并超速离心，重复3次，除去游离DiO；0.22μm滤器过滤除菌，将DiO标记的外泌体注射植入式缓释胶囊，同样方法移植到阿尔兹海默病理小鼠体内；给药结束后行心脏灌注前固定；取脑组织，置于4％多聚甲醛后固定，4℃，过夜；将组织依次置于10％、30％蔗糖中脱水处理24h；将组织置于冰冻切片机样品托上，加入冷冻包埋剂包埋；设置10μm厚度进行切片，并粘附于载玻片上，通过荧光显微镜拍照观察；发现小鼠右侧海马区有较多外泌体聚集，而左侧海马区及大脑其他部位也均有外泌体出现，如图6A所示为DiO标记外泌体(绿色)在小鼠大脑分布情况。

(13)步骤(11)中行为功能学实验测试结束后行心脏灌注前固定；取脑组织，置于4％多聚甲醛后固定，4℃，过夜；经梯度乙醇脱水后于石蜡包埋，连续5μm厚度进行切片；免疫组织化学染色标记淀粉样蛋白于海马区表达水平：切片经5％羊血清白蛋白封闭后，孵育淀粉样蛋白抗体，4℃，过夜；清洗后，孵育辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h；进行显色封片并拍照观察，统计淀粉样蛋白的含量；结果显示与二维外泌体给药组相比，三维外泌体给药组能更有效抑制淀粉样蛋白在海马区的积聚，如图6B-图6E所示为免疫组织化学染色标记淀粉样蛋白在小鼠右侧海马区积聚水平及定量分析示意图。

(14)步骤(11)中行为功能学实验测试结束后行腹动脉放血后，取实验小鼠右侧海马区，液氮冻存；将小鼠海马组织移入无RNase的离心管中，加入1mL TRIzol裂解液，于组织超声处理2min，进行总RNA提取，并逆转录获得第一链cDNA；以cDNA为模板进行荧光实时定量PCR检测ADAM10和BACE1基因表达；ADAM10作为α-分泌酶在淀粉样蛋白生产过程中发挥作用，可以抑制淀粉样蛋白的产生；BACE1作为β-分泌酶在淀粉样蛋白生产过程中发挥作用，可以促进淀粉样蛋白的产生；荧光实时定量PCR结果显示三维外泌体能更好的促进ADAM10基因的表达而抑制BACE1基因的表达，进而可能达到抑制淀粉样蛋白产生的结果，如图6F-图6G所示为荧光实时定量PCR检测ADAM10和BCAE1于mRNA水平变化示意图；本案发明人认为可能是三维外泌体差异表达的miRNA在ADAM10和BACE1基因表达过程中发挥了调节作用。

(15)将步骤(14)中提取总RNA提取后的样品进行总蛋白提取，即总RNA提取过程中移出水相后的蛋白层及有机层加入加入1.5mL异丙醇孵育沉淀10min；4℃，12,000g，离心10min；移出上清液，加入含0.3M盐酸胍的95％乙醇洗涤沉淀，孵育20min；4℃，7,500g，离心5min，重复两次；加入无水乙醇孵育20min，4℃，7,500g，离心5min；室温晾干沉淀，10-20min；加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂，冰浴裂解30min；4℃，12,000g，30min，移出上清；BCA法蛋白定量，剩余加入上样缓冲液，沸水浴5min，-20℃保存；Western blot检测ADAM10和BACE1于蛋白水平表达变化；结果显示三维外泌体能更好的促进ADAM10蛋白的表达而抑制BACE1蛋白的表达，进而可能达到抑制淀粉样蛋白产生的结果，如图6H所示。

综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明首次发现三维支架材料作为细胞培养载体可提高间充质干细胞来源外泌体产量，并影响外泌体内含物成分(miRNA和蛋白质，包括脑啡肽酶、胰岛素降解酶、热休克蛋白70)及其功能，并在阿尔兹海默病理小鼠模型上得以验证；三维培养来源外泌体能更有效抑制阿尔兹海默病理小鼠海马区淀粉样蛋白沉积并改善小鼠改善记忆认知能力；认为其中差异表达的miRNA调控了淀粉样蛋白生成过程中分泌酶的表达，减少了淀粉样蛋白生成；另一方面，脑啡肽酶、胰岛素降解酶、热休克蛋白70发挥了淀粉样蛋白降解的作用，因此达到有效抑制阿尔兹海默病理小鼠海马区淀粉样蛋白沉积的目的，进而改善小鼠记忆认知能力，可应用于阿尔兹海默病症治疗。

应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (16)

1.三维支架材料在制备间充质干细胞来源外泌体中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述三维支架材料包括三维石墨烯泡沫支架材料。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养，之后分离获得间充质干细胞来源外泌体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述间充质干细胞包括人脐带间充质干细胞。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述间充质干细胞在三维支架材料上的接种密度为1×10⁵～1×10⁷个/100mm²。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于具体包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养6～24h，之后更换无外泌体血清继续培养24～72h，收集培养上清液进行处理，获得间充质干细胞来源外泌体。

7.一种三维培养间充质干细胞来源外泌体的制备方法，其特征在于包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养，之后分离获得三维培养间充质干细胞来源外泌体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述三维支架材料包括三维石墨烯泡沫支架材料。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞在三维支架材料上的接种密度为1×10⁵～1×10⁷个/100mm²。

11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于具体包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养6～24h，之后更换无外泌体血清继续培养24～72h，收集培养上清液进行处理，获得三维培养间充质干细胞来源外泌体。

12.由权利要求7-11中任一项所述方法制备的三维培养间充质干细胞来源外泌体。

13.权利要求12所述的三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备能够抑制淀粉样蛋白沉积和/或改善记忆认知能力的功能性产品中的应用。

14.权利要求12所述的三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备能够治疗阿尔兹海默病的功能性产品中的应用。

15.一种治疗阿尔兹海默病的药物，其特征在于包含权利要求12所述的三维培养间充质干细胞来源外泌体。

16.根据权利要求15所述的治疗阿尔兹海默病的药物，其特征在于还包含药物学可接受的佐剂和/或载体。