CN107881145A - 一种分选大鼠心成纤维细胞cd90+亚群的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细胞培养技术，涉及一种分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的方法及其应用。步骤如下：复苏并扩大培养大鼠心成纤维细胞株；用PE‑标记CD90抗体分选心成纤维细胞CD90⁺亚群；收集分选的心成纤维细胞CD90⁺亚群，离心去上清后得沉淀，接种沉淀至培养瓶中，进行扩大培养，完成大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的分选。分选出的心成纤维细胞CD90⁺亚群作为筛选心成纤维细胞优势亚群，调动心成纤维细胞的心肌修复潜能，为高效利用心成纤维细胞提供实验依据和理论支撑。

Description

一种分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的方法及其应用

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术，涉及一种分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的方法及其应用。

背景技术

缺血性心脏病已成为威胁人类健康和生命的头号杀手，如何预防和治疗缺血性心脏病引起了极大关注。目前，修复受损心肌主要是补充或替代坏死的心肌细胞，同时阻止心肌纤维化。近年来，随着干细胞研究逐步深入，细胞移植被认为是一种极具临床应用前景的治疗缺血性心脏病的再生医学疗法。那么，除干细胞的定向修复外，可否调动心肌组织自身的、增殖能力较强的其他细胞，使其诱导分化为新的心肌细胞，从而使心功能得以有效改善，心成纤维细胞(Cardiac Fibroblasts, CFs)，数量巨大（占心肌组织细胞的60%），分布广泛，且抗缺氧损伤能力强，即使在长期纤维化状态下，仍具有较高的增殖和代谢活性，在心脏疾病发生、发展中起重要作用。

由于心肌细胞增殖能力有限，尤其是在心肌受到损伤时，心肌细胞增殖的速度难于迅速满足恢复心功能的需要。越来越多的证据表明，诱导自体CFs向心肌细胞转化则是修复受损心肌的最直接和最有效途径之一。2006年，Takahashi和Yamanaka报道了将小鼠成纤维细胞，通过过表达四个关键转录因子Oct3/4，sox2，c-Myc和Klf4，可转化为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）。2010年，Ieda等联合三种心脏发育转录因子Gata4、Mef2C和Tbx5(GMT)，体外将成纤维细胞诱导转化为心肌样细胞。2012年，两个不同研究团队在体内也验证了成纤维细胞可以直接重编程为心肌样细胞，并且，Song等除了使用GMT外，还加入第四种转录因子Hand2，大大提高了心成纤维细胞向心肌样细胞转化的效率。Wada等尝试Mesp1和Myocd，联合GMT，也可使成纤维细胞向心肌样细胞转化。培养细胞微环境改变也可提高成纤维细胞重编程效率，Wada等将转录因子组合重编程的成纤维细胞与心肌细胞共培养，发现诱导的心肌样细胞与原代培养心肌细胞间出现了同步收缩，表明可能在共培养的微环境中心肌细胞分泌的某些蛋白、细胞因子或者是电机械刺激促进了成纤维细胞的分化。前期研究发现，心肌急性梗死动物模型中，在梗死区和梗死边缘区，CFs可以表达cTnT，表明微环境中的某些物质可在成纤维细胞向心肌样细胞转变中起决定作用。

已有研究表明，除小分子物质可以诱导成纤维细胞重编程为心肌细胞外，Deng等联合用维生素A酸（Retinoic acie，RA），二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）和5-aza诱导人胎儿肝间充质干细胞（Human fetal liver-derived mesenchymal stem cells，HFMSCs）向心肌样细胞转化。有大量研究发现5-aza可诱导骨髓间充质干细胞（Bonemarrow-derived MSCs, BMSCs）和脐血间充质干细胞（human umbilical cord-derivedMSCs, hucMSCs）向心肌细胞分化。5-aza是一种DNA甲基化酶抑制剂，为胞嘧啶核苷的类似物，在DNA复制过程中可替代正常的胞嘧啶核苷酸形成新的DNA双链，可与DNA甲基转移酶共价结合，使酶活性降低，使细胞基因组DNA在复制中进行性去甲基化，激活表型特异的基因表达。也有研究证实，5-aza可使成纤维细胞向心肌细胞分化，汤成春等将体外培养CFs经5-aza诱导后，可检测到β-MHC的表达，移植入心肌梗死区及其周围区域，4 w后通过电镜和免疫组化证实CFs转化为心肌样细胞。

前期研究发现，在心肌损伤情况下，大鼠CFs可以表达心肌特有的肌钙蛋白（cTnT）和干细胞的标记物nanog。在体外培养状态下，部分CFs既表达nanog、也表达c-kit和sca-1等多种心肌干细胞标记物，同时也表达CD73和CD90等间充质干细胞表面标记，体外定向诱导可使其向成心肌、成神经、成骨和成脂分化，提示CFs可能是由不同的干细胞亚群组成，具有高度的幼稚性，在一定的条件下具备分化为心肌样细胞的潜能。因此，如果能将具有分化潜能的CFs转化为心肌细胞，不但可以减少对心脏的不利影响（如瘢痕等），而且可以高效增加心肌细胞数量，改善心功能。

已有研究发现，CD90（Thy1）在其他组织成纤维细胞中也有表达，大鼠肺、心及人的眼眶和生殖道的成纤维细胞均可分为Thy1^-群和Thy1⁺群，在细胞增殖和胶原合成上有显著差异，但CD90⁺ CFs在向心肌细胞分化中，及其细胞移植后对心肌损伤的修复作用，尚未见报道。

发明内容

本发明为解决受损心肌修复的技术难题，公开了一种分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的方法及其应用。

为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：

一种分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的方法，步骤如下：

（1）复苏并扩大培养大鼠心成纤维细胞株；

（2）用PE-标记CD90⁺抗体分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群；

（3）收集分选的大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群，离心去上清后得细胞沉淀，接种细胞沉淀至培养瓶中，进行扩大培养，完成大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的分选。

一种分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的应用，其特征在于：作为筛选心成纤维细胞优势亚群，调动心成纤维细胞修复心肌的应用，操作如下：

（1）向分选的大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的细胞内，加入心肌细胞诱导分化液，诱导25-30天，制得CD90⁺心成纤维细胞悬液；

（2）用DAPI标记大鼠心成纤维细胞CD90⁺悬液中的细胞核，结扎大鼠左冠状动脉前降支制备急性心肌梗死模型，待心电图确认模型制备成功30 min后，把DAPI标记的细胞悬液，多点微量注射到心肌梗死边缘区肌层。

所述心肌细胞诱导分化液为物质的量浓度13-18 μmoL/L 5-氮杂胞苷溶液。

所述心肌细胞诱导分化液的最优物质的量浓度为15μmoL/L。

本发明的有益效果在于：本发明通过流式细胞仪分选CD90⁺ CFs群，扩大培养并经心肌化诱导后移植入急性心肌梗死模型大鼠梗死边缘区，小动物超声影像系统和病理切片检测修复心肌效果，将为筛选CFs优势亚群，调动CFs的心肌修复潜能，为高效利用CFs提供实验依据和理论支撑。

附图说明

图1为免疫组化检测细胞株成纤维细胞标记物表达；其中A为细胞骨架波形蛋白vimentin表达，B为盘状结构域蛋白DDR2表达，C为成纤维细胞特异蛋白FSP1表达；标尺：20μm。

图2为CFs细胞株经CD90⁺免疫荧光染色图。

图3为流式细胞仪检测并分选图。

图4为细胞免疫荧光检测CD90⁺表达和细胞移植前DAPI标记图；其中A为白光下细胞形态，B为CD90⁺表达阳性细胞，C为A和B的叠加，D为CD90⁺细胞移植入心肌梗死模型前DAPI标记细胞；红色为Cy3标记的CD90⁺阳性细胞，蓝色为DAPI标记细胞核；标尺：50 μm。

图5为细胞免疫荧光检测CD90⁺心肌化诱导；其中A为细胞CD90阳性表达，Cy3标记，呈红色荧光；B为细胞cTnT阳性表达，FITC标记，呈绿色荧光；C为细胞核，DAPI标记，呈蓝色荧光；D示A、B和C叠加；标尺：50 μm。

图6为HE和Masson染色示心肌梗死区和梗死边缘区；其中左侧图表示HE染色，呈条索状，苏木素重染的区域为梗死区，两侧为梗死边缘区；右侧图表示Masson染色，呈条索状，蓝色染增生的结缔组织胶原纤维为梗死区，两侧有红色肌原纤维分布的为梗死边缘区；标尺：200 μm。

图7为超声心动检测细胞移植前后参数变化图；A示正常对照组大鼠心电图和心功能检测，B示急性心肌梗死大鼠2 h心电图和心功能检测，C示心肌化诱导CD90⁺细胞移植入心肌梗死动物模型后7d心电图和心功能检测，D示心肌化诱导CD90⁺细胞移植入心肌梗死动物模型后14d心电图和心功能检测。

图8为超声心动检测各组别在不同时间点左室射血分数(LVEF)比较；其中*示差异有显著统计意义（P<0.05）；**示差异有极显著统计意义（P<0.01）。

图9为超声心动检测各组别在不同时间点左室短轴缩短率(LVFS)比较；其中*示差异有显著统计意义（P<0.05）；**示差异有极显著统计意义（P<0.01）。

图10为CD90⁺细胞移植后14 d部分细胞表达cTnT和VIII；A和E为DAPI标记移植CD90+细胞核，呈蓝色；B和F分别为cTnT和VIII阳性染色，Cy3标记，呈红色；C和G为vimentin阳性染色，FITC标记，呈绿色；D为A、B和C叠加；H为E、F和G叠加；标尺：50 μm。

具体实施方式

材料与方法

1.1 实验动物 成年SD大鼠80只，雌雄不限，体重205.6 ± 0.56 g，由新乡医学院实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK（豫）2010-0002）。

细胞株 大鼠心成纤维细胞（R6300，购自美国ScienCell公司）

1.3细胞株复苏与扩大培养

将细胞株冻存管于37℃水浴锅中迅速解冻，1000 rpm离心3 min，弃上清，接种至75 m²培养瓶中，24 h后更换培养基。以后每48 h换液，待细胞生长至汇集状态时，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化收集细胞并计数，以1×10⁵个/mL置于培养瓶中，37℃、5%CO₂培养箱中扩大培养。

细胞爬片，经4%多聚甲醛固定、PBS冲洗、3％H₂O₂孵育5-10 min，PBS冲洗，山羊血清室温封闭10-15 min。分别滴加兔抗大鼠vimentin抗体（1:100，Abcam）、山羊抗大鼠DDR2多克隆抗体（1:200，Santa Cruz）和兔抗大鼠FSP1多克隆抗体（1:100，Abcam），4 ℃过夜，PBS冲洗，滴加相应的生物素化二抗工作液，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），室温孵育12 min。空白对照为PBS代替一抗，其余相同。DAB显色，苏木素复染细胞核，自来水返蓝，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察、图像采集和分析。

细胞免疫荧光显色

细胞爬片，经4% 多聚甲醛固定，PBS冲洗，0.3%的Triton透膜10 min，PBS浸洗3次，每次3 min。正常山羊血清室温封闭20 min。加入小鼠抗大鼠CD90⁺单克隆抗体（1:500，Abcam）和山羊抗大鼠DDR2多克隆抗体（1:200，Santa Cruz），4 ℃孵育过夜；PBS漂洗3次，每次5 min；滴加FITC标记山羊抗小鼠抗体（1:500，碧云天）和Cy3标记的驴抗山羊抗体（1:500，碧云天），37 ℃孵育40 min，PBS漂洗3次，每次5 min；5 mg/L DAPI室温孵育5 min，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察摄像。空白对照为PBS代替一抗工作液，其余步骤相同。荧光显微镜行图像采集。

流式细胞仪分选

将扩大培养的CFs细胞株加入适量胰蛋白酶-EDTA消化液，1,000 rpm离心3 min，弃上清，PBS重悬细胞，行细胞计数后，调整每组细胞浓度为1×10⁶个/mL。200目滤网滤过，在500μL反应体系中分别加入PE-标记CD90（1:500稀释度）和PE-标记阴性对照（1:500稀释度），37℃，避光孵育30 min，1,000 rpm离心3 min，弃上清，PBS漂洗三次，加入500 μL PBS重悬细胞，同时设立不加抗体的空白对照，流式细胞仪（FACS Aria II）检测分选，软件分析结果。

收集分选的CD90⁺ CFs，1,000 rpm离心3 min，完全培养基接种至25 cm²培养瓶中，行扩大培养，一部分进行细胞爬片用于免疫荧光检测CD90⁺表达，一部分用于后续试验。

+群心肌化诱导

成心肌细胞诱导分化液（含15 μmoL/L 5-aza的低糖完全培养基）培养C90⁺ CFs和未分选的CFs，37℃，含5% CO₂细胞培养箱中孵育24 h；去除诱导液，PBS洗3次，每次5 min；加入低糖完全培养基继续培养，每3d换液，同时设置完全低糖培养基培养细胞的对照组，在诱导后7d，14d，21d和28 d行细胞免疫荧光检测。

200×视野下，每张细胞爬片随机选取5个视野，共取30个视野，以下公式计算心肌样细胞的阳性率：心肌样细胞阳性率=阳性细胞数（N1）/同一视野下细胞总数（N）×100%。

急性心肌梗死模型制备

SD大鼠用异戊巴比妥钠腹腔麻醉后，仰卧位固定，颈正中、左前胸手术部位经常规备皮、消毒、铺洞巾，首先在颈正中线做切口，钝性分离并暴露气管，沿3、4气管软骨环之间行气管切开术，在此过程中应注意清理呼吸道分泌物。在距胸骨左侧约0.5 cm处沿4、5肋之间做纵行切口约2 cm，依次切开皮肤、浅筋膜和深筋膜，钝性分离肋间外肌和肋间内肌。插管并接通小型动物呼吸机，调整呼吸参数，剪断2根肋骨，打开胸壁，暴露心脏，小心剪开心包，用无菌棉签轻轻向右下压左室前壁，可清楚看到左心耳，左冠状动脉从其后下缘发出。在左心耳下约3～4 mm处左冠状动脉前降支与后降支分叉处，用8-0无创伤丝线穿过左冠脉前降支，进针深度为0.2～0.4 mm，打结后可见左室前壁及心尖部颜色变暗、搏动减弱。关闭胸腔，生理盐水冲洗确认闭合完好，然后依次缝合肌肉及皮肤。术后单笼饲养，肌注青霉素预防感染。

心肌内细胞移植

分选出CD90⁺ CFs群，体外扩大培养，当细胞生长至汇集状态时，更换为15 μmoL/L 5-aza的低糖完全培养基，37 ℃、5% CO₂ 条件下培养40 min，细胞消化液消化，收集细胞后PBS稀释至1×10⁶个/mL，吸取50 μL 细胞悬液，在左冠状动脉前降支结扎后30 min，直视下用微量注射器把DAPI标记的各组，分多点注射到心肌梗死边缘区肌层。每次推注后停留针头数秒以减少细胞外渗。对照组注射等量PBS，其余步骤同实验组。

超声心动图心功能检测

在冠脉结扎前、结扎后40 min、移植细胞7 d和14 d，高分辨率小动物超声影像系统对大鼠进行超声心动图检测。记录心功能指标：左室射血分数（LVEF）、左室收缩末期容积（LVESV）、左室舒张末期容积（LVEDV）、左室内压力随时间变化比值（LVdp/dtmax和LV dp/dtmin）、动物存活率、心电图和梗死区域左心室壁厚度，评价各组疗效差异，确证筛选出的优势亚群治疗心肌损伤的效果。

心肌梗死模型的病理组织切片检测

移植细胞的各实验组在不同时段取出心脏，分别做连续石蜡切片和冰冻切片，切片厚度为6-8 μL。

（1）HE染色：常规脱蜡，行苏木素和伊红染色，封片，光镜下观察梗塞区域的病理变化。

（2）Masson染色：常规脱蜡，按常规Masson染色步骤染色，中性树胶封固，光镜下观察梗塞区域的病理变化。

（3）病理组织免疫荧光检测：冰冻切片经4%丙酮室温固定1 min，PBS漂洗；0.3%Triton透膜10 min，PBS漂洗；10%正常山羊血清室温封闭1 h。加入（1）小鼠抗大鼠cTnT抗体（1:500）和兔抗大鼠vimentin抗体（1:500）（2）兔抗大鼠VIII抗体（1:200，Abcam）和小鼠抗大鼠vimentin抗体（1:100，中杉金桥），4℃孵育过夜；PBS漂洗3次，每次5 min；分别滴加（1）Cy3标记的兔抗小鼠抗体（1:500）和FITC标记的山羊抗小鼠抗体（1:500），（2）Cy3标记的山羊抗兔抗体（1:500）和FITC标记的兔抗小鼠抗体（1:500），37 ℃孵育40 min；PBS漂洗3次，每次5 min；

5 mg/L DAPI室温孵育3 min，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察摄像。空白对照为PBS代替一抗工作液，其余步骤相同。

统计分析

所有数据用SPSS 17.0软件进行处理。各数据以（ ±S）表示，多个样本均数的比较用单因素方差分析，各组之间两两比较用LSD方法进行比较分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

2.1 CFs细胞株常见标记的免疫组化表达鉴定

将购买细胞株分别行vimentin、DDR2和FSP1细胞免疫组化染色，结果显示形态各异的CFs细胞株对这三种成纤维细胞标记物均呈阳性染色（图1）。如图1A中所示，构成细胞骨架的中间纤维蛋白——波形蛋白(vimentin)，棕黄色颗粒分布于胞质中，其他部位无非特异性染色，与体外分离培养的成纤维细胞表达类似；而作为膜受体的DDR2蛋白，主要分布于胞膜及胞质近膜处，但也有少部分呈现胞核分布（图1B），在购买CFs细胞株中，约有97.5%细胞呈DDR2阳性表达；FSP1则在胞质中呈均匀分布，在胞核和胞膜中染色较淡（图1C）。成纤维细胞标记vimentin、DDR2和FSP1鉴定细胞株，结果表明购买细胞株符合实验要求，可用于后续实验。

细胞株CD90⁺表达检测和流式分选CD90⁺细胞群

CFs细胞株经CD90⁺免疫荧光染色，发现部分CFs可以强阳性表达CD90⁺如图2所示，且主要表达在细胞膜上。为筛选出CD90⁺亚群，将CFs行细胞扩大培养后，细胞计数并调整细胞浓度至1×10⁶个/mL，使用PE-标记CD90⁺（1:500稀释度）、PE-标记阴性对照（1:500稀释度），并设立不加抗体的空白对照，流式细胞仪检测分选，结果显示CD90⁺比率为34.9%如图3所示。

分选后CD90⁺CFs的检测与心肌诱导

（1）CD90⁺ CFs分选后免疫荧光检测：CD90⁺细胞群分选后，行扩大培养，培养1 d，细胞逐渐伸出突起，培养3 d细胞增殖迅速，光镜下可见有丝分裂相增多，细胞进入对数生长期。为检测扩增后CD90⁺细胞群表达CD90⁺的稳定性，培养6 d，行CD90⁺细胞免疫荧光检测。结果表明在细胞体外扩增培养中，CD90⁺在CFs中表达稳定如图4A-C所示。

（2）CD90⁺细胞群心肌化诱导：CD90⁺扩增后，行5-aza心肌化诱导，诱导24 h，细胞增殖缓慢。诱导28 d，行cTnT细胞免疫荧光检测CD90⁺细胞群心肌化诱导效果，结果表明，在诱导28 d时，细胞数量变化不大，细胞形态多为三角形和椭圆形，偶见星形细胞。cTnT表达阳性的细胞为三角形和椭圆形，并呈强阳性表达如图5所示。经统计，CD90⁺细胞群cTnT阳性细胞比例为61.17+9.75%，而未分选的CFs阳性细胞比例为53.44+16.80%，说明CD90⁺阳性细胞群更有利于向心肌细胞分化。

将扩增后的CD90⁺CFs、用DAPI标记细胞核后供移植入急性心肌梗死区域备用，用于追踪移植细胞在模型动物体内的存活及其向心肌细胞的分化能力。

心肌梗死模型的病理学改变

结扎成年大鼠左冠状动脉前降支，制备急性心肌梗死动物模型，梗死后7 d，动物处死，取材，肉眼可见心脏前壁、左侧壁及心尖上部颜色较浅，略微苍白，无光泽，室壁变薄，且左心室腔扩张。HE染色可见远离梗死区心肌呈粉红色，心肌排列整齐，胞核清晰；而梗死区心肌排列紊乱，心肌纤维发生断裂，胞核形态多样化，部分胞核消失，有大量嗜中性粒细胞浸润，核固缩如图6中左侧图所示。Masson染色可见蓝色条索状胶原纤维的集中分布，梗死区结缔组织的大量增生取代了原来的心肌细胞形成疤痕组织如图6中右侧图所示，表明在病理组织学水平上证实了心肌梗死模型制备成功。

心电图和心功能检测移植细胞前后参数变化

采用高分辨率小动物超声影像系统对急性心肌梗死模型、细胞移植前、细胞移植后7 d和14 d进行心电图和心功能检测，与正常大鼠相比，急性心肌梗死大鼠模型在冠脉结扎后2h心电图表现为ST段弓背抬高，T波振幅增大如图7A，B所示，心电图的特征性改变也证实了急性心肌梗死模型制备成功。在梗死后7 d 和14 d继续监测，ST-T改变已有所缩减。而移植细胞后7 d，ST段明显下移，T波振幅陡降，出现T波倒置如图7C所示。移植细胞后14 d，心电图表现为ST-T逐渐恢复至术前水平如图7D所示。

心电图检测后，对实验组和对照组左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)测量，数据统计分析，与正常组比较，移植前、移植后1周和移植后2周LVEF和LVFS各组均降低，且差异具有极显著意义(P<0.01)；与同期梗死组相比，移植细胞的两组在移植前和移植后一周LVEF和LVFS略微升高，但无统计学差异(P>0.05)，但在移植后两周LVEF和LVFS均显著升高，CFs移植组和CD90⁺ CFs移植组LVEF差异具有极显著差异(P<0.01)，但对于LVFS，CFs移植组具有极显著差异(P<0.01)，CD90⁺ CFs移植组具有显著意义(P<0.05)如图8-9所示。各组在同组内不同时间点进行比较，发现正常对照组在各时期测定心功能参数没有明显变化，无统计学意义，而未移植细胞的梗死组，在7d和14d时，LVEF和LVFS均升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，但14d与7d相比，无统计学意义；CFs移植组中，与移植前相比，移植后7d和14dLVEF和LVFS均升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，且移植后14d较移植后7d也显著提高，差异具有极显著意义(LVEF：60.10+1.25% vs 51.22+2.89%，LVFS：33.85+2.00% vs26.72+2.27%，P<0.01)；在CD90⁺CFs移植组中，与细胞移植前相比，移植后7d和14dLVEF和LVFS均升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，且移植后14d较移植后7d也显著提高，差异具有极显著意义(LVEF：61.40+2.45% vs 56.25+2.93%，LVFS：33.21+0.68% vs 30.26+2.06%，P<0.01)。与CFs移植组相比，CD90⁺CFs移植组在移植后7d和14d，LVEF有所升高，LVFS略微下降，但差异无统计学意义（LVEF：61.40+2.45% vs 60.10+1.25%，LVFS：33.21+0.68% vs33.85+2.00%，P>0.05）。

细胞移植后细胞的存活检测

CD90⁺CFs经心肌化诱导后，DAPI标记细胞核，在急性心肌梗死模型大鼠梗死边缘区域多点微量注射，细胞移植后14 d取材，免疫荧光技术检测移植细胞向心肌细胞和内皮细胞的分化效果。如图10所示，可看到组织切片上存在少量蓝色标记的移植细胞，呈点状散在分布如图10A，E所示，分别用心肌细胞特异性蛋白肌钙蛋白cTnT和成纤维细胞标记vimentin，内皮细胞特异性蛋白VIII因子和vimentin共标，结果显示，经DAPI标记的移植细胞，在体内微环境刺激下部分细胞可以实现cTnT和vimentin的共表达如图10A-D所示，这一部分细胞分散在心肌中，既没有丢失成纤维细胞标记，同时向心肌样细胞转化，但同时也有部分移植细胞仅表达vimentin，说明CD90⁺细胞群中仍然存在异质性细胞群。VIII因子免疫染色可见组织内存在完整的小血管壁如图10F所示，部分DAPI标记的移植细胞也参与血管壁的构成如图10H所示，但该部分细胞已丢失了原来的成纤维细胞标记，vimentin免疫荧光染色表达呈阴性如图10G所示，多数移植细胞散在分布于心肌中，vimentin呈阳性表达，且表达VIII因子如图10H所示。

该结果说明在体外经心肌化诱导的CD90⁺，移植入心肌梗死模型动物后，由于体内微环境的改变，在多种因素影响下，仅有少部分细胞可以向心肌样细胞转化，同时，也参与新生血管的生成。

结论

CD90为一种细胞表面粘附分子，在细胞的粘附、凋亡、增殖和迁移等信号转导中发挥重要作用。有研究证明，体外分离培养肺成纤维细胞中存在CD90⁺和CD90^-亚群，它们在炎症反应和纤维化进程中发挥不同作用。Rege等证实CD90⁺成纤维细胞更易转化为肌成纤维细胞（Myofibroblast，MFB）。心肌球来源（Cardiosphere-derived cells，CDCs）的CD90^-细胞在心肌梗死模型中则具有更大的修复潜能。Ali等证实Thy1⁺、CD45^-、CD31^-、CD11b^-、Ter119^-是心肌成纤维细胞中的主要亚群，但不同亚群对于心脏病理性损伤时的增殖和激活通路却是相同的。

为检测CD90⁺亚群在心肌分化中的作用及其心肌损伤中的修复作用，本发明使用PE-标记CD90，经流式细胞仪检测并分选，CD90⁺ CFs比率为34.9%。将CD90⁺亚群扩大培养，经心肌化诱导，检测到CD90⁺细胞群cTnT阳性细胞较混合群的高（61.17+9.75%vs.53.44+16.80%），表明CD90⁺亚群更有利于向心肌细胞分化。经DAPI标记后细胞行多点注射移植入急性心肌梗死模型的梗死区和梗死边缘区，追踪移植细胞在体内的存活及分析其向心肌细胞和内皮细胞分化能力。结果显示，在体内微环境刺激下部分CD90⁺细胞表达心肌特异性蛋白cTnT，为了证明表达cTnT来源于移植的成纤维细胞，本发明采用了cTnT与vimentin双标记，证实了cTnT阳性细胞与vimentin共表达，提示这些细胞既没有丢失成纤维细胞标记，同时向心肌样细胞转化。但同时也有部分移植细胞仅表达vimentin，说明CD90⁺细胞群中仍然存在异质性细胞群。值得注意的是，移植的CD90⁺细胞部分表达VIII因子，提示CD90⁺成纤维细胞也参与血管壁的形成，这对改善局部血液供应具有重要意义，目前尚未见到类似报道。

经心功能检测，在CD90⁺CFs移植组中，与细胞移植前相比，移植后7d和14d LVEF和LVFS均升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，且移植后14d较移植后7d也显著提高，差异具有极显著意义(LVEF：61.40+2.45% vs. 56.25+2.93%，LVFS：33.21+0.68% vs. 30.26+2.06%，P<0.01)。与混合群移植组相比，CD90⁺CFs移植组在移植后7d和14d，LVEF有所升高，LVFS略微下降，但差异无统计学意义（LVEF：61.40+2.45% vs. 60.10+1.25%，LVFS：33.21+0.68% vs. 33.85+2.00%，P>0.05）。结果说明CD90⁺亚群在心肌损伤中具有一定的作用，但与混合群之间无差异。探究其原因，可能是在心肌损伤后，发生坏死和凋亡的心肌细胞数量较多，而移植的细胞真正在心肌内驻留的较少，且在微环境的刺激下，转化为心肌细胞和内皮细胞的数量有限，或者是这些新生的细胞在体内与原有细胞尚未形成有效连接，未能在真正意义上体现出CD90⁺亚群的心肌分化和损伤修复优势。也可能与细胞移植时间有关。有研究证实，大鼠心肌梗死后1 h心肌内尚无炎症细胞浸润，7d时炎症反应较强，14d时炎症减弱，成纤维细胞增生，大量胶原沉积，28d时疤痕完全形成并出现左室重塑。因此，移植时机对损伤修复疗效影响较大，细胞移植治疗的最佳时机还待于进一步探讨。近期也有研究证实细胞移植治疗心肌梗死，不仅只作用于梗死局部区域，而是对整个心脏的功能恢复起到积极的生物学作用。另外，其他可能的原因是细胞移植后监测时间不够，应增加动物例数，对移植后实验动物心功能检测至4-8周，对CD90⁺阳性群的心肌化疗效评价将更为准确。

总之，本发明研究发现 CD90⁺CFs亚群在体外培养和体内移植中，更有利于向心肌样细胞分化，将为将为全面研究CFs的全能型及其异质性提供理论依据，为CFs向心肌分化优势亚群确立奠定实验基础。

Claims (4)

1.一种分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的方法，其特征在于步骤如下：

（1）复苏并扩大培养大鼠心成纤维细胞株；

（2）用PE-标记CD90抗体分选心成大鼠纤维细胞CD90⁺亚群；

（3）收集分选的大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群，离心弃上清后得细胞沉淀，接种细胞沉淀至培养瓶中，进行扩大培养，完成大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的分选。

2.一种分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群的应用，其特征在于：作为筛选心成纤维细胞优势亚群，调动心成纤维细胞修复心肌的应用。

3.如权利要求2所述的分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群分化的应用，其特征在于操作如下：

（1）向分选的大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群细胞内，加入心肌细胞诱导分化液，诱导25-30天，制得心成纤维细胞CD90⁺悬液；

（2）用DAPI标记大鼠心成纤维细胞CD90⁺悬液中的细胞核，结扎大鼠左冠状动脉前降支制备急性心肌梗死模型；待心电图确认模型制备成功30 min后，把DAPI标记的CD90⁺细胞悬液，多点微量注射到心肌梗死边缘区肌层。

4.如权利要求3所述的分选大鼠心成纤维细胞CD90⁺亚群分化的应用，其特征在于：所述心肌细胞诱导分化液为物质的量浓度13-18 μmoL/L 5-氮杂胞苷溶液。