CN109152799A - 胰腺干细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及干细胞及其在治疗和/或预防胰腺疾病或障碍中的治疗用途。本文提供了包含c‑kit阳性胰腺干细胞的组合物以及制备和使用用于治疗和/或预防胰腺疾病或障碍的c‑kit阳性胰腺干细胞的方法。

Description

胰腺干细胞及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月9日提交的美国临时申请号62/305,736和2017年2月10日提交的美国临时申请号62/457,710在35 U.S.C.119(e)下的优先权的权益，其每一个的内容通过引用以其全文并入本文。
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将与此一起以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其全文结合在此：计算机可读格式拷贝的序列表(文件名：AALS_005_02WO_ST25.txt，记录日期：2017年3月5日，文件大小：约3千字节)。
技术领域
本公开文本涉及干细胞及其在治疗和/或预防胰腺疾病或障碍中的治疗用途。本文提供了包含c-kit阳性胰腺干细胞的组合物以及制备和使用用于治疗和/或预防胰腺疾病或障碍的c-kit阳性胰腺干细胞的方法。
发明背景
胰腺既是内分泌腺也是外分泌腺。在其作为内分泌腺的功能中，它产生几种重要的激素，包括胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。胰岛素和胰高血糖素分别从β细胞和α细胞分泌，以调节碳水化合物、蛋白质和脂质代谢。外分泌胰腺包括导管和腺泡细胞，它们合成和分泌有助于食物消化的消化酶。与胰腺相关的疾病和障碍包括糖尿病、胰腺炎、胰腺外分泌功能不全和囊性纤维化。
1型糖尿病是一种当胰腺由于自身免疫应答而产生很少胰岛素或不产生胰岛素时发生的慢性医学病症。免疫系统破坏了胰腺中产生胰岛素的β细胞。1型糖尿病通常开始于幼年期或青年期，但可以在任何年龄发生。在美国、加拿大和欧洲，1型糖尿病占所有糖尿病病例的5％至10％。发生糖尿病的人有一种或多种使他们易感该疾病的基因。环境因素，如在生命早期对某些病毒和食物的暴露，可能会引发自身免疫应答。患有1型糖尿病的人患心血管疾病的风险增加，这可能导致心脏病发作、胸痛、卒中、和甚至死亡。
1型糖尿病需要定期监测血糖、调整生活方式和使用胰岛素治疗。一般来说，向患有1型糖尿病的人推荐强化胰岛素疗法，以保持血糖在严格控制中。强化胰岛素疗法的缺点包括：每天多次胰岛素注射或使用胰岛素泵；需要频繁检查血糖；需要协调日常活动；低血糖发作的风险增加；初始体重增加；和成本。胰岛素作用的有效性还取决于注射的胰岛素剂量、注射技术、注射部位、皮下血流量、来自打开瓶子的胰岛素效力、以及每个个体特有的因素。
2型糖尿病是一种会破坏身体使用葡萄糖的方式的慢性医学病症。在这种障碍中，胰腺不能制造足够的胰岛素，身体对正常或甚至高水平的胰岛素、或两者变得有抗性。这导致高血糖水平，如果不治疗这会导致问题。在美国、加拿大和欧洲，所有患有糖尿病的人中约90％患有2型糖尿病。2型糖尿病被认为是由遗传和环境因素共同引起的。许多患有2型糖尿病的人的家庭成员患有2型糖尿病或与糖尿病相关的其他医学问题，如高胆固醇水平、高血压或肥胖。在某些种族群体中发生2型糖尿病的可能性更大，如西班牙裔、非洲裔和亚裔血统的人。
2型糖尿病的治疗包括改变生活方式、自我护理措施以及定期给予胰岛素和其他药物。这些治疗可以使血糖水平保持接近正常水平，并使发生并发症的风险最小化。
胰腺炎是胰腺的炎症，并且当消化酶开始消化胰腺本身时发生。胰腺炎可以是急性的或慢性的。任一种形式都很严重，并且可能导致并发症。急性胰腺炎突然发生，并且通常在接收治疗后几天消失。它通常由胆结石引起。常见症状是上腹部剧烈疼痛、恶心和呕吐。治疗通常是住院几天以静脉内注射(IV)液体、抗生素和缓解疼痛的药物。慢性胰腺炎不会治愈或改善。随着时间的推移会变得更糟，并导致永久损伤。最常见的原因是大量饮酒。其他原因包括囊性纤维化和其他遗传性障碍、血液中高水平的钙或脂肪、一些药物和自身免疫病症。症状包括恶心、呕吐、体重减轻和油性粪便。治疗还可以是住院几天以IV液体、缓解疼痛的药物和营养支持。慢性胰腺炎是诸如胰腺癌、糖尿病和胰腺外分泌功能不全等其他障碍的风险因素。
胰腺外分泌功能不全(EPI)是由于缺乏由胰腺制造的消化酶而不能正确消化食物。EPI发现于患有囊性纤维化和舒-戴综合征(Shwachman-Diamond syndrome)的人类。它是由制造消化酶的胰腺细胞逐渐丧失引起的。慢性胰腺炎是人类EPI的最常见原因。消化酶的损失导致营养的消化不良和吸收不良。
在患有囊性纤维化的个体中，在囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的突变导致在许多器官(包括胰腺)中的上皮流体输送的调节异常。所产生的纤维化和胰腺炎症可能引起营养不良和糖尿病。
某些类型的胰腺癌涉及异常发挥功能的细胞。例如，胰腺的腺泡细胞癌可能导致过度产生消化酶，引起诸如皮疹和关节疼痛等症状。作为另一个例子，功能类型的神经内分泌肿瘤大量分泌激素如胰岛素、胃泌素和胰高血糖素到血流中，这可能导致严重的症状如低血糖。外科手术是外分泌类型癌症的唯一治疗方法，但手术可能会损伤胰腺的正常部位。
因此，存在将从允许胰腺内的细胞修复、重建和/或再生的疗法受益的各种胰腺疾病和障碍。然而，从胰腺中鉴定、表征和分离胰腺干细胞仍然是难以捉摸的，并且关于是否存在这种干细胞还存在争议。因此，本领域中存在对鉴定胰腺干细胞的标志物的需求，该胰腺干细胞的标志物可以用于分离可以用于胰腺疾病或障碍的疗法中的此类干细胞。
发明概述
本发明的实施方案涉及干细胞以及制备和使用该干细胞的方法。
本发明的实施方案是基于在胰腺组织中具有干细胞典型特征的c-kit阳性细胞群体的发现。在该发现之前，还没有识别或分离来自胰腺组织的具有所有干细胞特征的一种细胞类型。干细胞的基本特性是在体外和体内自我更新、克隆形成和多能性。c-kit阳性胰腺细胞通常是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素和/或淀粉酶。
本发明的实施方案提供了替换被胰腺疾病或障碍例如但不限于1型糖尿病、2型糖尿病、胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液(hemosuccus pancreaticus)、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌损伤的胰腺细胞的问题的解决方案。在一些方面，该问题通过以下方式来解决：在有需要的受试者中向有缺陷和/或受损的胰腺组织给予胰腺干细胞以便促进胰腺组织修复和/或再生以及治疗或预防胰腺疾病或障碍，例如但不限于，1型糖尿病、2型糖尿病、胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌。在一个实施方案中，通过将细胞植入患者体内来给予胰腺干细胞。
因此，在一个方面，本发明提供了治疗或预防有需要的受试者中的胰腺疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者给予分离的胰腺干细胞，其中该胰腺干细胞是从胰腺组织样本中分离的并且是c-kit阳性的。在一个实施方案中，胰腺组织样本从受试者获得。在一个实施方案中，胰腺干细胞产生胰腺的β细胞。在另一个实施方案中，胰腺干细胞的特征在于它们分化成内分泌细胞和/或外分泌细胞的能力。在进一步的实施方案中，分离的胰腺干细胞是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
在一个实施方案中，通过本文描述的方法或组合物治疗的胰腺疾病或障碍是1型糖尿病。在另一个实施方案中，胰腺疾病或障碍是2型糖尿病。在另一个实施方案中，胰腺疾病或障碍是胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌。
在一个实施方案中，将所述分离的胰腺干细胞在给予至受试者之前在培养物中扩增。在一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞在给予至受试者之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在另一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞在给予至受试者之前暴露于干细胞因子(SCF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、和/或肝细胞生长因子(HGF)。
在一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞通过血管、胰腺导管给予至受试者或直接给予至组织。在另一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞通过注射或通过导管系统或通过肝脏中注射给予至受试者。
在另一个方面，本发明提供包含治疗有效量的分离的胰腺干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于修复和/或再生胰腺的受损组织，其中所述分离的胰腺干细胞是c-kit阳性的。在一些实施方案中，胰腺干细胞是从胰腺组织分离的。在另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是自体的。
在一个实施方案中，分离的胰腺干细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。在进一步的实施方案中，内分泌细胞是α细胞或β细胞。在又另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
在一个实施方案中，组合物包含约106个分离的胰腺干细胞。在另一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞在体外进行培养和扩增。在另一个实施方案中，组合物进一步包含一种或多种细胞因子和/或生长因子。在进一步的实施方案中，组合物进一步包含干细胞因子(SCF)、IGF-1和/或HGF。
在一个实施方案中，组合物被配制用于导管介导的注射或直接注射。
在另一个方面，本发明提供了一种从胰腺分离常驻胰腺干细胞的方法，该方法包括：(a)在培养物中培养来自所述胰腺的组织样本，从而形成组织外植体；(b)选择来自培养外植体的呈c-kit阳性的细胞，和(c)分离所述c-kit阳性细胞，其中所述分离的c-kit阳性细胞是常驻胰腺干细胞。
在一个实施方案中，所述分离的c-kit阳性细胞表达外分泌细胞和/或内分泌细胞的一种或多种标志物。在另一个实施方案中，一种或多种标志物包括胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
在从胰腺分离常驻胰腺干细胞的方法的一个实施方案中，分离的c-kit阳性细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。在进一步的实施方案中，内分泌细胞是α细胞或β细胞。
在一个实施方案中，从胰腺分离常驻胰腺干细胞的方法进一步包括在培养物中扩增所述分离的c-kit阳性细胞。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于干细胞因子(SCF)、IGF-1和/或HGF。
在另一个方面，本发明提供了一种修复和/或再生有需要的受试者中胰腺的受损组织的方法，该方法包括：从胰腺中提取胰腺干细胞；培养和扩增所述胰腺干细胞，所述胰腺干细胞是c-kit阳性干细胞；并且将一个剂量的所述提取和扩增的胰腺干细胞给予至受试者的受损组织区域，该剂量可有效修复和/或再生胰腺的受损组织。
在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞表达外分泌细胞和/或内分泌细胞的一种或多种标志物。在另一个实施方案中，一种或多种标志物包括胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。在进一步的实施方案中，内分泌细胞是α细胞或β细胞。
在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，在培养物中将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损组织之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损组织之前暴露于干细胞因子(SCF)、IGF-1和/或HGF。
在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞通过导管介导的注射或直接注射给予。
在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，胰腺组织来自人类。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，胰腺组织是成体胰腺组织。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，c-kit阳性细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，胰腺干细胞是自体的。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，胰腺干细胞是同种异体的。
附图简述
图1显示了在外科手术时获得的代表性人类胰腺样品。
图2A显示了针对c-kit(绿色)和胰岛素(红色)染色的胰腺细胞的代表性免疫组织化学(IHC)图像。细胞核用DAPI染色。
图2B显示了针对c-kit(绿色)和C-肽(红色)染色的胰腺细胞的代表性IHC图像。细胞核用DAPI染色。
图2C显示了针对c-kit(绿色)和胰高血糖素(红色)染色的胰腺细胞的代表性IHC图像。细胞核用DAPI染色。类胰蛋白酶染色显示为白色并且是肥大细胞的标志物。
图2D-图2F显示了图2C中的加框区域的放大图。图2D显示了针对c-kit(绿色)染色的细胞。图2E显示了针对胰高血糖素(红色)染色的相同细胞。图2F显示了c-kit和胰高血糖素染色信号的合并。
图3A-图3C显示了针对c-kit(绿色)和上皮标志物CK19(红色)染色的与胰腺导管和外分泌胰腺相关的细胞的代表性IHC图像。图3B和图3C显示了图3A中的加框区域的放大图。图3B-图3C显示了共表达c-kit和上皮标志物CK19的一些外分泌细胞。图3B-图3C中的箭头指示c-kit阳性细胞。细胞核用DAPI染色。类胰蛋白酶染色显示为白色并且是肥大细胞的标志物。
图4显示了针对c-kit(绿色)和细胞命运决定子α-衔接蛋白(红色)染色的c-kit阳性细胞的代表性IHC图像。细胞核用DAPI染色。
图5显示了针对c-kit(绿色)染色的来自c-kit阳性细胞克隆的子细胞的代表性IHC图像。细胞核用DAPI染色。
图6A-图6C显示了针对c-kit(绿色，图6A-图6C)、C-肽(红色，图6A)、胰高血糖素(红色，图6B)和淀粉酶(红色，图6C)染色的未分化(‘对照’)或分化(‘Dexa’)c-kit阳性细胞的代表性IHC图像。
图6D显示了通过高灵敏度ELISA测定法测量的在含有葡萄糖的培养基中生长的hPSC合成人类胰岛素。GSIS：葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
图7显示了人类胰腺的样品。将在外科手术中丢弃的胰腺样本用于c-kit阳性细胞的组织学和分离。
图8A-图8E：c-kit阳性细胞存在于人类胰腺中。图8A：存在三个c-kit阳性细胞(绿色，箭头)；胰岛通过C-肽(红色)染色。细胞核被DAPI(蓝色)染色。在下面的插图中以更高的放大率示出了单独的荧光通道。图8B：一个c-kit阳性细胞(绿色，箭头)存在于被胰岛素(红色)染色的胰岛内。c-kit阳性细胞对胰岛素呈阳性。插图：单独的荧光通道。图8C：左图和右图显示了两个相距6μm的焦平面，其示出了由胰高血糖素(红色)的外周定位限定的胰岛内的两个不同的c-kit阳性细胞(箭头)。全部两个c-kit阳性细胞均表达胰高血糖素。插图：单独的荧光通道。对c-kit和类胰蛋白酶(箭头尖)呈阳性的一个肥大细胞存在于该视场内。图8D：被细胞角蛋白-19(右上图；CK19，红色)染色的胰腺导管上皮内的c-kit阳性细胞(左上图；绿色)。箭头指示4个c-kit阳性、CK19阴性和类胰蛋白酶阴性(左下图；白色)细胞。对c-kit和类胰蛋白酶(箭头尖)呈阳性的四个肥大细胞靠近胰腺导管。插图：单独的荧光通道。虚线定义了对类胰蛋白酶和CK19呈阴性的c-kit阳性细胞。右下图：合并。图8E：人类胰腺中c-kit阳性细胞和肥大细胞的比例(n＝6)。显示了单独数据(蓝色条)连同它们的平均值±SD(红色条)。
图9：人类胰腺中存在c-kit阳性细胞。三个c-kit阳性细胞在外分泌腺泡细胞(淀粉酶，红色)附近。两个对c-kit和类胰蛋白酶(白色)呈阳性，代表肥大细胞(箭头尖)。第三个c-kit阳性细胞对类胰蛋白酶和淀粉酶呈阴性(箭头)。插图：单独的荧光通道；淀粉酶与c-kit阳性细胞相邻，但不是c-kit阳性细胞的一部分。
图10A-图10F：推定的hPSC对称和不对称分裂并形成多细胞克隆。图10A：胰腺细胞中c-kit表达的散点图(右图)；在象限Q2中，细胞对c-kit受体的两个不同表位呈阳性。还显示了两种c-kit抗体的同种型对照(左图)。图10B：定量数据单独显示(蓝色条)并显示为平均值±SD(红色条)(n＝16)。图10C：FACS分选的c-kit阳性细胞(绿色)的培养物以低放大率和更高的放大率示出。细胞核被DAPI(蓝色)染色。大多数细胞表达c-kit。图10D：三个分裂的c-kit阳性细胞(绿色)具有在细胞分裂晚后期/末期的染色体(左上图)。这些有丝分裂细胞中的两个(箭头)对称分裂；α-衔接蛋白(红色)分布在两个子细胞中(右上图)。另一个c-kit阳性细胞(箭头尖)靠近有丝分裂结束并且不对称分裂；α-衔接蛋白仅限于两个子细胞中的一个。左下图，合并。数据显示为平均值±SD(n＝5)。*相对于不对称细胞分裂p<0.05。图10E：通过相位差显微镜显示两个单细胞衍生的克隆。图10F：通过共聚焦显微镜示出的被c-kit(绿色)和DAPI(蓝色)染色的三个单细胞衍生的克隆。
图11A-图11D：胰腺c-kit阳性细胞的生长和特征。图11A：将FACS分选的c-kit阳性和c-kit阴性细胞铺板，固定在多聚甲醛中并用与用于分选的抗体不同的第三种c-kit抗体染色；左图显示c-kit阳性部分，且右图显示c-kit阴性部分。图11B：将FACS分选的c-kit阳性细胞单独地接种在96孔板的单个孔中。克隆通过亚甲蓝染色并包括在红色圆圈中。图11C：有关克隆效率的数据单独显示(蓝色条)并显示为平均值±SD(红色条)(n＝14)。图11D：克隆的c-kit阳性细胞不表达造血细胞谱系的表面标志物：从FACS分选的c-kit阳性细胞获得的扩增细胞的散点图；显示了CD34、CD45、CD90和CD105的表达。
图12A-图12G：hPSC表达胰腺祖细胞的标志物并定型于内分泌和外分泌细胞表型。图12A：克隆的c-kit阳性hPSC(n＝4)中的基因转录物。图12B-图12D：热图示出了分化诱导剂地塞米松对克隆的hPSC中的Wnt/β-连环蛋白(图12B)、TGF-β/BMP(图12C)和Notch(图12D)途径的影响(n＝3)。图12E-图12G：hPSC的定型(n＝4)。在每种情况下，上面三个图示出了未分化细胞中的c-kit(绿色)的表达。暴露于地塞米松后，胰岛素原C-肽(图12E：红色)、胰高血糖素(图12F：红色)和淀粉酶(图12G：红色)的表达在下面三个图的每一个中都很清楚。细胞核被DAPI(蓝色)染色。向培养基中添加葡萄糖导致通过高灵敏度ELISA测定法测量的人类胰岛素的合成(图12E)。GSIS，葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
图13A-图13G：将hPSC植入小鼠胰腺内并获得内分泌和外分泌细胞命运。图13A：PKH26标记的hPSC(红色，箭头)存在于小鼠胰腺内；外分泌腺泡细胞被淀粉酶(白色)染色。PKH26标记的hPSC在插图中以更高的放大率示出。细胞核被DAPI(蓝色)染色。图13B：小鼠胰腺中的GFP阳性hPSC簇(绿色)。图13C：在受损小鼠胰腺的区域中PKH26标记的hPSC簇(红色，箭头)。这些hPSC对C-肽(绿色)和淀粉酶(白色)呈阴性。这些小的hPSC群体在插图中以更高的放大率显示。图13D：正方形限定了在完整的小鼠胰腺中的GFP阳性hPSC(淀粉酶，白色)。如在插图中以更高的放大率所示，这些hPSC显示了胰岛素(红色)的细胞内定位。图13E和图13F：广泛损伤的胰腺组织被GFP阳性(图13E)和PKH26阳性(图13F)hPSC的大簇部分替换。大多数hPSC表达胰岛素(图13E，红色)或C-肽(图13F，绿色)。包括在小正方形中的区域在大正方形中以更高的放大率示出，以使GFP和胰岛素(图13E)以及PKH26和C-肽(图13F)在分化的β细胞中的共定位更加清楚。图13G：完整的小鼠胰腺具有表达淀粉酶(白色)的单个PKH26标记的hPSC(红色，正方形)。PKH26(红色)、C-肽(绿色)和淀粉酶(白色)的单独荧光通道在插图中以更高的放大率示出。
图14A-图14B：hPSC归巢于完整和受损的小鼠胰腺。图14A：在组织内存在一小簇PKH26标记的hPSC(红色，箭头)。这些hPSC对C-肽和淀粉酶呈阴性。PKH26(红色)、C-肽(绿色)和淀粉酶(白色)的单独荧光通道在插图中以更高的放大率显示。图14B：许多PKH26标记的hPSC存在于小鼠胰腺的损伤区域内。PKH26标记的hPSC(红色)显示了C-肽的细胞内定位(绿色；红色和绿色＝黄色)。在正方形中包括的区域在插图中以更高的放大率示出，其中PKH26(红色)、C-肽(绿色)和淀粉酶(白色)的单独荧光通道在插图中以更高的放大率显示。细胞核被DAPI(蓝色)染色。
图15：分化的hPSC表达胰岛素。由正方形限定的两个GFP标记的hPSC(绿色)对胰岛素(红色)呈阳性。GFP(绿色)、胰岛素(红色)和淀粉酶(白色)的单独荧光通道在插图中以更高的放大率显示。
图16A-图16C：Kit+/MCMx R-GFP小鼠和Kit+/MCMx mT/mG小鼠：胰腺细胞是c-kit阳性细胞的后代。图16A：在Kit+/MCMx R-GFP小鼠中，外分泌腺泡细胞对GFP(绿色)呈阳性。对GFP和胰岛素呈阳性的β细胞(红色)存在于胰岛(白色和黄色箭头尖)内。两个插图(右图)示出了左图中所示的胰岛中的黄色箭头尖所指向的细胞簇和单个细胞的GFP和胰岛素的单独荧光通道。图16B：白色箭头指示7个对GFP和胰岛素呈阳性的β细胞，并且黄色箭头尖指示2个仅对GFP呈阳性的细胞。在正方形1和2中包括的细胞在插图中以更高的放大率示出，这些插图单独显示GFP和胰岛素的荧光通道。插图1：一个β细胞对GFP和胰岛素呈阳性(白色虚线)。插图2：一个β细胞对GFP和胰岛素呈阳性(白色虚线)，而另一个对GFP呈阳性但对胰岛素呈阴性(黄色虚线)。图16C：Kit+/MCMx mT/mG小鼠：在胰岛的外周处，对胰岛素(红色)和GFP(绿色)呈阳性的两个β细胞由正方形限定并在插图中以更高的放大率显示，在这些插图中GFP、胰岛素和淀粉酶的荧光通道单独示出。一个细胞(前三个竖直插图)对GFP呈阳性，并对胰岛素和淀粉酶呈阴性。另一个细胞(后三个竖直插图)对GFP和胰岛素呈阳性，并对淀粉酶呈阴性。被淀粉酶(白色)标记并对GFP呈阳性的一些外分泌腺泡细胞存在于该视场中。
图17：GFP在Kit+/MCMx mT/mG小鼠的胰腺中表达。GFP(绿色)被定位于被淀粉酶(白色)标记的外分泌腺泡细胞的质膜中。
图18A-图18B：KitCreERT2/+x IRG小鼠：胰腺细胞是c-kit阳性细胞的后代。图18A：外分泌腺泡细胞(淀粉酶，白色)对GFP(绿色)呈阳性的小鼠胰腺的切片。存在五个胰岛(胰岛素，红色)并将其在图18B中详细显示。图18B：在上图中，胰岛内存在几个GFP阳性细胞，并且选择了26个用于说明。在26个GFP阳性细胞中，21个由白色箭头尖指示，并且5个由黄色箭头指示。在中心和下图中所示的插图中以更高的放大率记录这些细胞。出于说明的目的，增加了绿色通道的强度；红色通道的强度没有改变。与由白色箭头尖指示的21个细胞(上图)对应的白色虚线，限定了对GFP(中图)和胰岛素(下图)呈阳性的β细胞。与由黄色箭头(上图)指示的5个细胞对应的黄色虚线，限定了对GFP呈阳性(中图)和对胰岛素呈阴性(下图)的细胞。
图19A-图19D：KitCreERT2/+x IRG小鼠：胰腺细胞是c-kit阳性细胞的后代。图19A：新鲜分离的胰腺。上面三个图记录了天然GFP荧光(左，绿色)、天然DsRed荧光(中，红色)及其组合(右，绿色和红色)。下面三个图不显示天然GFP荧光(左)。仅存在天然DsRed荧光(中图和右图)。图19B：显示被天然GFP标记的新鲜分离的胰腺细胞的部分、以及被天然GFP标记的固定胰腺细胞的部分的点图。数据是平均值±SD。图19C：其中首先针对天然GFP并然后针对胰岛素、C-肽和胰高血糖素对胰腺细胞进行门控的点图。表达天然GFP的胰岛素、C-肽和胰高血糖素阳性细胞的百分比显示为平均值±SD。左图：用于设定门控策略的阴性对照。图19D：其中首先针对胰岛素、C-肽和胰高血糖素对细胞进行门控并然后将表达天然GFP的胰岛素阳性、C-肽阳性和胰高血糖素阳性细胞的百分比显示为平均值±SD的点图。左图：用于设定门控策略的阴性对照。
图20A-图20B：Kit+/MCMx R-GFP小鼠。图20A：非他莫昔芬治疗的转基因小鼠中的白色腹部斑点。图20B：年龄匹配的对照野生型小鼠中的睾丸(上图)。在没有进行他莫昔芬治疗的情况下，在8个月大(左下图)和18个月大(右下图)的转基因小鼠中睾丸萎缩是清楚的。
具体实施方式
本发明的实施方案是基于在胰腺组织中具有干细胞典型特征的c-kit阳性细胞群体的发现。干细胞的基本特性是在体外和体内自我更新(即，制造更多干细胞)、克隆形成和多能性的能力。在这一发现之前，还没有识别或分离来自胰腺组织的展现所有三个干细胞特征的一种细胞类型。
如众所周知，干细胞凭借其特性产生身体的所有细胞和组织。因此，干细胞可以用于修复或加速受损和/或有缺陷的胰腺的修复。如果可以获得足够量的胰腺干细胞(PSC)，则通过在胰腺中构建新组织可以将该量的PSC用于修复受损和/或有缺陷的胰腺。在有缺陷和/或受损的胰腺中，可能存在很少的PSC或没有PSC。由于PSC自我更新，植入的PSC可以定殖并栖居于(colonize and populate)有缺陷和/或受损胰腺中的壁龛(niche)。通过克隆和多能，植入的PSC还可以分裂和分化以产生所有新的胰腺细胞和组织。因此，分离的PSC群体或包含分离的PSC群体的组合物可以用于治疗或预防受试者的胰腺疾病或障碍。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了来自胰腺组织的样品的分离细胞群体，其中分离的细胞群体含有c-kit阳性PSC。可以大量富集和扩增这种c-kit阳性PSC群体。
在一个实施方案中，本文提供了包含治疗有效量的分离和扩增的胰腺干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于修复和/或再生受损的胰腺组织，其中所述分离的胰腺干细胞是c-kit阳性的。在另一个实施方案中，胰腺干细胞是成体(例如，非胚胎和/或非胎儿)胰腺干细胞。在另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。在一些实施方案中，胰腺干细胞是从胰腺组织分离的。在另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是人类细胞。在另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是自体的。
在一些实施方案中，分离的胰腺干细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。在一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。在进一步的实施方案中，内分泌细胞是α细胞或β细胞。在又另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
在一个实施方案中，组合物包含约106个分离的胰腺干细胞。在另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞在体外进行培养和扩增。在另一个实施方案中，组合物进一步包含一种或多种细胞因子和/或生长因子。在进一步的实施方案中，组合物进一步包含干细胞因子(SCF)、IGF-1和/或HGF。
在一个实施方案中，组合物被配制用于导管介导的注射或直接注射。
在一个实施方案中，本文提供了用于在生产用于治疗和/或预防受试者中的胰腺疾病或障碍的药物中使用的组合物，该组合物包含来自胰腺组织样品的分离的c-kit阳性PSC的富集群体。在该组合物的另一个实施方案中，该组合物进一步包含药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了从胰腺中分离常驻胰腺干细胞的方法，该方法包括：(a)在培养物中培养来自所述胰腺的组织样本，从而形成组织外植体；(b)选择来自培养外植体的呈c-kit阳性的细胞，和(c)分离所述c-kit阳性细胞，其中所述分离的c-kit阳性细胞是常驻胰腺干细胞。
在一个实施方案中，所述分离的c-kit阳性细胞表达外分泌细胞和/或内分泌细胞的一种或多种标志物。在另一个实施方案中，一种或多种标志物是胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
在从胰腺分离常驻胰腺干细胞的方法的一些实施方案中，分离的c-kit阳性细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。在一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。在进一步的实施方案中，内分泌细胞是α细胞或β细胞。
在一个实施方案中，从胰腺分离常驻胰腺干细胞的方法进一步包括在培养物中扩增所述分离的c-kit阳性细胞。在另一个实施方案中，所述分离的c-kit阳性细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于干细胞因子(SCF)、IGF-1和/或HGF。
在一个实施方案中，本发明提供了获得基本上对c-kit阳性PSC富集的分离细胞的群体的方法，该方法包括冷冻保存从受试者获得的胰腺组织样本；在以后解冻冷冻保存的样本；从胰腺组织的样本中选择一个或多个c-kit阳性细胞；在培养基中增殖所选择的c-kit阳性细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了增殖基本上对c-kit阳性PSC富集的分离细胞的群体的方法，该方法包括从胰腺组织样品中选择一种或多种c-kit阳性细胞；将一种或多种c-kit阳性选择细胞引入培养基中；并在培养基中增殖所选择的c-kit阳性细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了例如在修复、再生和/或治疗胰腺疾病或障碍如1型糖尿病、2型糖尿病、胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌中使用这种基本上对c-kit阳性PSC富集的分离细胞的群体或使用包含分离的c-kit阳性PSC的富集群体的药物组合物的方法。不希望受理论束缚，诸位发明人认为在胰腺组织中鉴定的c-kit阳性细胞可以代表胰腺中特化细胞的来源，该特化细胞例如分泌胰高血糖素的α细胞、分泌胰岛素的β细胞、释放生长抑素的δ细胞、产生生长激素释放肽(ghrelin)的ε细胞、分泌胰多肽的PP细胞、外分泌腺泡细胞、外分泌中心腺泡细胞和/或外分泌导管细胞。因此，在一个实施方案中，可以将已经在体外扩增的分离的c-kit阳性PSC的群体移植或植入受累及/受损的胰腺中。然后，c-kit阳性PSC在胰腺中驻留，生长并分化成通常在胰腺中发现的各种类型的组织，并恢复和/或重建外分泌细胞和内分泌细胞。目标是替换由于受累及的胰腺中的疾病而损伤的至少一些胰腺组织。替换的胰腺组织充当补充受累及的受试者中的现有或剩余的胰腺组织，使得总体上有足够的组织用于胰腺的充分消化和/或内分泌功能以改善、治疗和/或预防该受试者中的胰腺疾病或障碍。
在一个实施方案中，可以将分化的c-kit阳性PSC移植到严重组合免疫缺陷(SCID)/非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的腹部脂肪垫中以确定PSC是否可以分化成产生胰岛素的β细胞，从而改善、治疗和/或预防小鼠的糖尿病。
没有文献证明成体胰腺中真正的多能组织特异性成体干细胞的存在，以及这些PSC治疗或预防患者的胰腺疾病或障碍的用途。本发明的优点是用于治疗或预防胰腺疾病或障碍的PSC可以是自体细胞，这将大大提高治疗或预防的成功率。例如，在活组织检查期间，通过外科手术取出患者胰腺的一部分。少至一立方厘米就足够了。处理该组织片以从取样的胰腺组织释放单个细胞。使用干细胞标志物c-kit作为干细胞身份的指示，选择c-kit阳性细胞。然后将c-kit阳性PSC在体外扩增以获得治疗或预防所需的足够数量的细胞。当存在足够的细胞时，收获细胞并将其注射回同一患者或相对于PSC供体遗传匹配的患者中。在每个过渡步骤，例如，在选择与扩增之间或在扩增与植入之间，可以任选地将PSC冷冻保存。在一个实施方案中，患者回收已经在体外选择和扩增的患者自身的PSC。在另一个实施方案中，患者获得从遗传匹配的供体来源的PSC。在一些实施方案中，该方法还可以扩展至任何具有胰腺的哺乳动物，例如猫、狗、马、猴等。
因此，本发明提供了治疗或预防有需要的受试者中的胰腺疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者给予分离的胰腺干细胞，其中该胰腺干细胞是从胰腺组织样本中分离的并且是c-kit阳性的。在一个实施方案中，胰腺组织样本从受试者获得。在一个实施方案中，胰腺干细胞产生胰腺的β细胞。在另一个实施方案中，胰腺干细胞的特征在于它们分化成内分泌细胞和/或外分泌细胞的能力。在进一步的实施方案中，分离的胰腺干细胞是未分化的或表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
在一个实施方案中，胰腺疾病或障碍是1型糖尿病。在另一个实施方案中，胰腺疾病或障碍是2型糖尿病。在进一步的实施方案中，胰腺疾病或障碍是胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌。
在一些实施方案中，将所述分离的胰腺干细胞在给予至受试者之前在培养物中扩增。在一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞在给予至受试者之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在另一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞在给予至受试者之前暴露于干细胞因子(SCF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、和/或肝细胞生长因子(HGF)。
在一些实施方案中，将分离的胰腺干细胞通过血管、胰腺导管给予至受试者或直接给予至胰腺组织。在另一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞通过注射或通过导管系统或通过肝脏中注射给予至受试者。
在一些实施方案中，可以在包封设备中将分离的胰腺干细胞植入患者内(参见，例如US 9,132,226和US 8,425,928，其每一个的内容通过引用以其全文并入本文)。在一个实施方案中，患者患有糖尿病，并且在包封设备中植入的PSC在患者内产生胰岛素。
在一个实施方案中，本文提供了用于治疗和/或预防有需要的受试者中的胰腺疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者给予包含本文所述的c-kit阳性PSC的群体的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗和/或预防有需要的受试者中的胰腺疾病或障碍的方法，该方法包括从受试者获得胰腺组织样品；从胰腺组织样品中提取c-kit阳性PSC群体；在体外扩增所选择的c-kit阳性PSC以增加此类PSC的数量；并且向该受试者给予扩增的c-kit阳性PSC群体以修复、重建和/或再生受试者胰腺中的外分泌和/或内分泌细胞和组织。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防有需要的受试者中的胰腺疾病或障碍的方法，该方法包括从第一受试者中获得胰腺组织；从胰腺组织样品中提取c-kit阳性PSC群体；扩增c-kit阳性PSC的群体；并且向第二受试者给予c-kit阳性PSC群体以使c-kit PSC在胰腺中驻留并修复、重建和/或再生第二受试者胰腺中的外分泌和/或内分泌细胞和组织。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种修复和/或再生在有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法，该方法包括：从胰腺中提取胰腺干细胞；培养和扩增所述胰腺干细胞，所述胰腺干细胞是c-kit阳性干细胞；并且将一个剂量的所述提取和扩增的胰腺干细胞给予至受试者的受损组织区域，该剂量可有效修复和/或再生胰腺的受损组织。
在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞表达外分泌细胞和/或内分泌细胞的一种或多种标志物。在另一个实施方案中，一种或多种标志物是胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一些实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。在一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。在进一步的实施方案中，内分泌细胞是α细胞或β细胞。
在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，在培养物中将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损组织之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损组织之前暴露于干细胞因子(SCF)、IGF-1和/或HGF。
在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞通过导管介导的注射或直接注射给予。
在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，主要由分离细胞的群体组成的c-kit阳性PSC具有自我更新能力、克隆形成能力和多能性。这意味着每个分离的c-kit阳性细胞可以分裂以产生更多的c-kit阳性细胞，从而在培养物中形成菌落。当在某些条件下刺激时，每个c-kit阳性细胞可以变成定型的(即，选择特定细胞谱系以分化成)并进一步分化成特定谱系的细胞，例如α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、PP细胞、腺泡细胞、中心腺泡细胞或导管细胞。在规范和分化时，这些细胞及其后代将表达所确定谱系特有的特定细胞标志物。此外，定型的细胞及其后代将失去c-kit的表达。
在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，胰腺组织来自人类。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，人类是成年人。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，在选择c-kit阳性细胞之前将胰腺组织冷冻保存。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，使用针对c-kit的抗体进行c-kit阳性PSC的选择。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，针对c-kit的抗体是单克隆抗体。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，针对c-kit的单克隆抗体是针对人类c-kit的抗原表位的小鼠单克隆IgG。
在任何所述方法的一个实施方案中，针对c-kit的抗体是荧光染料缀合的。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，针对c-kit的抗体与磁性粒子缀合。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，c-kit阳性细胞的选择是通过流式细胞术。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，选择是通过荧光激活细胞分选或高梯度磁性选择。
在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，进一步将c-kit阳性PSC进行离体扩增。在所述方法的所有方面的一个实施方案中，进一步将c-kit阳性PSC在体外进行扩增。在某些方面，目标是具有足够大量的c-kit阳性PSC用于植入以确保将植入的PSC成功植入到受损胰腺的壁龛中。基本上，必须有足够的细胞在受损的胰腺中生长和繁殖，以提供修复和/或替换胰腺受损部分所必需的所有细胞。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，在扩增或增殖步骤后c-kit阳性PSC在数量上是至少两倍。在所述方法的所有方面的一些实施方案中，期望在扩增或增殖时c-kit阳性细胞的数量在增殖期结束时增加至少5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍或更多。培养物中细胞的数量可以通过本领域中已知的任何方法确定，例如通过使用库尔特(coulter)计数器确定。这些方法对本领域技术人员而言是熟知的。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，将所选择的c-kit阳性PSC冷冻保存用于扩增前的储存。
在所述方法的所有方面的另一个实施方案中，出于储存目的，将扩增的PSC冷冻保存。在需要时，将冷冻的细胞解冻并然后用于给予至或植入对其有需要的受试者中。
在所述方法的所有方面的一个实施方案中，该方法进一步包括将分离的c-kit阳性PSC群体冷冻保存。
对于最近被诊断患有胰腺疾病或障碍的人，如果获得了受试者胰腺的活组织检查样品用于诊断，则可以根据这里描述的方法制备c-kit阳性PSC的群体，并且然后可以将PSC冷冻保存供将来在疾病进展到晚期使得该人需要胰腺干细胞疗法的情况下使用。
类似地，处于发生胰腺疾病或障碍风险的人可以得益于早期从人自身胰腺组织中制备c-kit PSC群体并将PSC冷冻保存。例如，具有糖尿病遗传倾向或具有患糖尿病的直系亲属的人将受益。与不具有糖尿病家族史的人相比，在患有糖尿病的人的一级亲属(姐妹、兄弟、儿子、女儿)中发生2型糖尿病的终身风险高5至10倍。处于发生胰腺疾病或障碍的风险的其他人包括但不限于：携带囊性纤维化基因或被诊断患有囊性纤维化的人；以及被诊断患有胰腺炎、胰腺外分泌功能不全、胰性血液、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌的个体。
在治疗方法的所有方面的一些实施方案中，治疗(treating和treatment)包括“恢复对其有需要的受试者中的受损胰腺的结构和功能完整性”。
在所述方法的所有方面的其他实施方案中，治疗包括修复受损或功能不充分的人类胰腺。在另一个实施方案中，治疗(treating和treatment)包括修复、重建和/或再生受损胰腺中的外分泌和/或内分泌细胞和组织。
恢复或修复不需要达到健康人的胰腺的100％。只要受试者的症状有所改善，恢复或修复就得以实现。熟练的医生将能够在治疗之前和之后评估症状的严重性，并且基于比较确定是否存在改善。通常，受试者将能够说出症状是否存在改善。一些症状的例子包括但不限于：尿频、口渴增加、饥饿增加、视力模糊、体重减轻、嗜睡、过度换气(对于糖尿病)；腹部疼痛、恶心、呕吐(糖尿病、胰腺炎)。
在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，预防(preventing和prevention)包括减慢由于疾病(例如从囊性纤维化、胰腺炎或糖尿病)引起的胰腺的功能能力和完整性降低。
在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，c-kit阳性PSC群体修复、重建或产生胰腺中的外分泌和/或内分泌细胞和组织。
在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，治疗和/或预防胰腺疾病或障碍的方法进一步包括在给予基本上富集c-kit阳性PSC的细胞群体之前选择患有胰腺疾病或障碍的受试者，例如患有囊性纤维化、胰腺炎或糖尿病的受试者。
在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，治疗和/或预防胰腺疾病或障碍的方法进一步包括在给予细胞之前选择对恢复受损胰腺的结构和功能完整性有需要的受试者，例如患有囊性纤维化、胰腺炎或糖尿病的受试者。
在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，治疗和/或预防胰腺疾病或障碍的方法进一步包括选择对治疗、预防或者修复或重建或产生胰腺中的外分泌和/或内分泌细胞和组织有需要的受试者，例如患有囊性纤维化、胰腺炎或糖尿病的受试者。
例如，所选择的受试者是那些对传统治疗完全没有反应或具有不良反应的受试者和/或已经用尽了本领域目前已知的针对特定形式或类型的胰腺疾病或障碍的所有治疗选择的受试者。
在用于治疗或预防胰腺疾病或障碍的治疗方法的所有方面的一个实施方案中，给予是通过注射、通过导管系统或其组合。
在用于治疗或预防胰腺疾病或障碍的治疗方法的所有方面的一个实施方案中，向受试者给予是通过血管、胰腺导管、直接给予至组织、或其组合。
在用于治疗或预防胰腺疾病或障碍的治疗方法的所有方面的一个实施方案中，给予至受试者是在包封设备中植入患者内。
在用于治疗或预防胰腺疾病或障碍的治疗方法的所有方面的一个实施方案中，c-kit阳性PSC是自体细胞。
在用于治疗或预防胰腺疾病或障碍的治疗方法的所有方面的一个实施方案中，c-kit阳性PSC是从一个或多个供体获得的同种异体细胞。
在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，该方法进一步包括给予至少一种治疗剂以及c-kit阳性PSC，例如用于治疗囊性纤维化、胰腺炎或糖尿病的那些。
在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，该至少一种治疗剂增强PSC群体的归巢、植入或存活。
在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选人类。在另一个实施方案中，受试者是成年的人类。在一个实施方案中，c-kit阳性PSC群体是c-kit阳性人类PSC群体。
胰腺发育
胰腺由源自于内胚层的内分泌区室和外分泌区室构成。内分泌区室具有组织成胰岛的激素分泌细胞，而外分泌区室具有腺泡、导管和中心腺泡细胞。
内分泌区室中存在五种不同的激素分泌细胞类型：分泌胰高血糖素的α细胞；分泌胰岛素的β细胞；释放生长抑素的δ细胞；产生生长激素释放肽(ghrelin)的ε细胞；和分泌胰多肽的PP细胞。该激素负责调节营养代谢和葡萄糖稳态。内分泌细胞聚集形成朗格汉斯(Langerhans)胰岛，其与血管、神经元和中胚层起源的基质组分混合。内分泌细胞和血管细胞的密切关联调节激素释放，从而在体内建立微调的葡萄糖稳态。
腺泡细胞合成并分泌消化酶，该消化酶被浓缩成富含碳酸氢盐的液体，该液体经过复杂的导管网络以注入十二指肠。末端或夹层导管由扁平的扁平状上皮细胞作衬里。与腺泡交界的末端端部导管细胞被称为中心腺泡细胞。夹层导管合并以形成小叶内导管(由骰子形上皮细胞作衬里)，并且这些小叶内导管转而又合并以形成小叶间导管，它们最后合并以形成主导管(由简单的柱状上皮细胞作衬里)。主导管穿过胰腺到达十二指肠，从而递送负载消化酶的流体。
胰腺的内分泌和外分泌区室出现自一个共同的祖细胞群体。胰腺发育涉及早期阶段期间的Hedgehog信号传导、Notch信号传导和其他来自间充质的线索之间的相互作用。此外，已经从对胰腺发育至关重要的遗传学研究中鉴定出许多转录因子：Pdx1是所有胰腺谱系的规范所必需的；Pdx1、Ngn3、NeuroD(也称为BETA2)、Pax4、Mafa、Mafb、Nkx6-1、Nkx2-2、Neurod、Mnx1、Foxa1、Foxa2和Arx与内分泌谱系定型有关；外分泌谱系规范或分化受到内分泌原转录因子的缺乏和由邻近的胰腺间充质(包括Wnt信号传导、层粘连蛋白-1和可溶性卵泡抑素)提供的允许信号的存在两者的影响。与腺泡细胞相关的转录因子包括但不限于Ptf1a、Gata4、Mist1和Nr5a2。与导管细胞相关的转录因子包括但不限于Hnf6、Hnf1b、Sox9和Foxa2。此外，FGF-1、FGF-7、TGF-β1、激活素和EGFR的水平在决定内分泌分化与外分泌分化之间的平衡方面是重要的。
发育期间的腺泡细胞分化显现受到bHLH(基本螺旋-环-螺旋)转录因子Ptf1a(也称为p48)的调节。虽然在多能祖细胞中在胰腺发育早期就检测到Ptf1a表达，但是Ptf1a表达受限于分化和成熟的腺泡细胞。在小鼠中敲除Ptf1a导致外分泌胰腺的缺失和胰岛细胞移位到脾脏，其中内分泌区室驻留在一些低等脊椎动物中。Mist1是另一种bHLH转录因子，该转录因子在第二次变迁的近似时间中变得重要，并且缺乏Mist1的小鼠表现出有缺陷的腺泡细胞组织。
胰腺干细胞(PSC)
干细胞是保留通过有丝分裂细胞分裂更新其自身种类的能力的细胞，并且它们的子细胞可以分化成各种各样的特化细胞类型。两种广泛类型的哺乳动物干细胞是：在囊胚中发现的胚胎干(ES)细胞，以及在成体组织中发现的成体干细胞。在正在发育的胚胎中，ES可以分化成所有的特化胚胎组织。在成体生物体中，成体干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充特化细胞，但也维持再生器官(如血液、皮肤或肠组织)的正常更新。多能干细胞可以分化成从三个胚层中的任何一个起源的细胞。
在一些实施方案中，如本文所使用的术语“干细胞”是指能够增殖并且产生更多祖细胞的未分化细胞，该祖细胞具有生产大量母细胞的能力，该母细胞转而又可以产生分化或可分化的子细胞(称为前体细胞)。子细胞自身可以被诱导增殖并产生后代，该后代随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时还保留一种或多种具有亲本发育潜力的细胞。
在一些实施方案中，术语“干细胞”还是指在特定情况下具有分化成更特化或分化的表型的能力或潜力的祖细胞的子集，并且在某些情况下还保留增殖而基本上不分化的能力。
本文描述的PSC是与ES相对的躯体干细胞。在优选的实施方案中，所描述的PSC是成体干细胞。
在一个实施方案中，如本文所使用的，术语“c-kit阳性胰腺干细胞”或“c-kit阳性PSC”涵盖干细胞、祖细胞和前体细胞，其全部都是c-kit阳性的。
在一个实施方案中，如本文所使用的，术语“c-kit阳性胰腺干细胞”或“c-kit阳性PSC”涵盖表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶的c-kit阳性细胞。
细胞分化是典型地通过许多细胞分裂发生的复杂过程。分化细胞可以起源于多能细胞等，该多能细胞本身起源于多能细胞。尽管这些多能细胞中的每一种都可以被认为是干细胞，但是每种多能细胞可以产生的细胞类型的范围可以显著变化。一些分化的细胞还具有产生更大发育潜力的细胞的能力。这种能力可以是天然的或可以在用各种因素处理后人工诱导。在许多生物学例子中，干细胞是“多能的”，因为它们可以产生超过一种不同细胞类型的后代，并且如本文件中使用的那样这是必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分，并且如在本文件中使用的这是必不可少的。理论上，自我更新可以通过两种主要机制中的任何一种发生。干细胞可以不对称分裂，其中一个子细胞保留干细胞状态且另一个子细胞表达一些不同的其他特定功能和表型。可选地，群体中的一些干细胞可以对称分裂成两个干细胞，从而在群体中整体维持一些干细胞，而群体中的其他细胞仅产生分化的后代。
在一个实施方案中，基本上富集c-kit阳性细胞的分离细胞群体主要包含PSC。因此，在一个实施方案中，基本上富集c-kit阳性细胞的分离细胞群体被称为分离的c-kit阳性PSC群体。这意味着c-kit阳性PSC群体可以包括一些c-kit阳性祖细胞和/或c-kit前体细胞。
如本文所使用的，在一些实施方案中，术语“分离的和基本上富集c-kit阳性PSC的群体”或“分离的c-kit阳性PSC群体”涵盖异质或同质的PSC群体和/或胰腺祖细胞和/或胰腺前体细胞。PSC是多能的并且产生许多谱系的细胞类型。相反，胰腺祖细胞和胰腺前体细胞是谱系决定细胞。例如，如果胰腺祖细胞被确定为β细胞谱系，即将来会产生β细胞，则该胰腺祖细胞将不会转变并产生作为外分泌胰腺细胞的腺泡细胞。在一些实施方案中，胰腺祖细胞和胰腺前体细胞被确定为α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、PP细胞、腺泡细胞、中心腺泡细胞或导管细胞。
包含至少两种不同细胞类型的分离的c-kit阳性PSC群体在本文中被称为“异质群体”。本文还考虑在移植前离体分离和扩增胰腺干细胞或胰腺祖细胞。仅包含一种细胞类型(例如，β细胞)的分离的c-kit阳性PSC群体在本文中被称为“同质细胞群体”。
在该例子中，人类胰腺组织中的这种细胞群体表达c-kit(也称为KIT或CD117)，其是结合细胞因子干细胞因子(SCF)的细胞因子受体。SCF向细胞发出信号以进行分裂和生长。一般来说，c-kit在干细胞以及祖细胞和前体细胞类型的表面上表达，所述祖细胞和前体细胞类型是干细胞通过有丝分裂的后代。因此，c-kit是干细胞标志物。通过对人类胰腺组织中的c-kit进行免疫染色，诸位发明人发现了这种c-kit阳性细胞(图2A-2F，图3A-3C)。在此发现之前，尚未报道成体胰腺中干细胞存在的证据。这些c-kit阳性细胞主要是未分化的并且表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
诸位发明人显示这些c-kit阳性PSC具有克隆形成特性。当将这些细胞分离并以非常低的细胞密度铺板(即在体外铺板单细胞)时，多细胞克隆从这些单细胞中生长出来(图5)，从而证明了干细胞的克隆形成特性。
此外，由最初分离的c-kit阳性PSC产生的多细胞克隆在菌落子细胞的细胞命运方面是多能的。诸位发明人显示暴露于分化培养基的克隆c-kit阳性细胞获得了内分泌和外分泌谱系的标志物(图6A-图6C)。
最后，这些c-kit阳性PSC可以自我更新。诸位发明人显示c-kit阳性PSC不对称分裂，从而产生了子代干细胞和子代定型细胞。另外，c-kit阳性细胞可以对称分裂。基于细胞命运决定子α-衔接蛋白的非均匀或均匀分布来定义分裂形式(图4)。
在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，分离的c-kit阳性PSC群体包含具有长期和短期再生能力的细胞，以及定型的多能、寡能和单能祖细胞。
因此，如本文所使用的，术语“PSC”是指具有多谱系胰腺分化潜能和持续自我更新活性的细胞。“自我更新”是指细胞分裂并产生至少一个具有亲本细胞的相同(例如，自我更新)特征的子细胞的能力。第二个子细胞可以定型于特定的分化途径。例如，自我更新的PSC分裂并形成一个子干细胞和另一个定型于分化成胰腺的外分泌和/或内分泌细胞的子细胞。定型祖细胞典型地丧失自我更新能力，并且在细胞分裂时产生两个显示更分化(即受限)表型的子细胞。
因此，如本文所述的方法中使用的“PCS”涵盖所有多能细胞，其能够分化成几种胰腺细胞类型，包括但不限于α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、PP细胞、腺泡细胞、中心腺泡细胞或导管细胞。
如本文使用的术语“胰腺祖细胞”是指定型于特定的胰腺细胞谱系且通常不自我更新，并且可以例如通过细胞表面标志物或细胞内蛋白质鉴定的PSC的子集。例如，胰岛素或C-肽表明定型于β细胞谱系；或胰高血糖素表明定型于α细胞谱系。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，针对使用这些另外的细胞表面标志物中的一种或多种来选择PSC。
PSC的存在可以通过本领域已知的任何方法确定，或通过使用本领域技术人员已知的测定或在实施例中描述的那些测定法通过检测细胞表面标志物在表型上进行确定。
PSC的分离
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，PSC起源于或分离自以下来源的胰腺组织样品：新死亡的受试者、来自活体受试者的组织活组织检查或胰腺干细胞系。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，PSC离体起源于其他细胞，如诱导的多能干细胞(iPS细胞)或成体多能细胞。
在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何方法或根据本文所述的方法(例如，从活体受试者细针抽吸小的胰腺组织样品)来分离PSC。
可以通过本领域已知的任何方法从胰腺组织样品中分离PSC。从组织样品中解离单独细胞的方法是本领域已知的，例如，在美国专利7,547,674和美国专利申请U.S.2006/0239983、2009/0148421、和2009/0180998中。这些参考文献通过引用以其全文并入本文。
在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，分离的PSC群体通过以下方法分离。对于来自不同来源的胰腺组织，本领域技术人员将能够根据需要对该方法进行微小调整。用胶原酶酶促消化一小块胰腺组织(最小尺寸为至少1立方厘米)以获得单个细胞。重新悬浮小的完整细胞，并且用细胞过滤器去除细胞聚集体。该细胞过滤器步骤是任选的。然后将细胞与小鼠c-kit抗体一起孵育。分离c-kit阳性细胞并将其用包被有抗小鼠IgG的免疫磁性珠粒收集。
在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，然后通过以下方法培养获得的分离的c-kit阳性细胞。本领域技术人员将能够根据需要对该方法进行微小调整。将培养法用于使c-kit阳性PSC生长并扩增c-kit阳性PSC的数量。在标准组织培养条件下，将分离的c-kit阳性细胞铺板在含有F12培养基(GIBCO,格兰岛(Grand Island),纽约州(NY))的补充有5％-10％FBS(GIBCO)和胰岛素-硒-转铁蛋白混合物(西格玛(SIGMA),圣路易斯(St.Louis),密苏里州(MO))的改良F12K培养基中。在达到汇合后，将细胞传代到几个其他板上以使用处理细胞的标准组织培养方案扩增培养物。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在用于本文所述的方法之前，使用本领域技术人员可接受的任何方法离体扩增来自本文所述的胰腺组织的PSC。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将扩增的c-kit阳性PSC进一步分选、分级、处理以去除任何不需要的细胞，或以其他方式操作以使用本领域技术人员可接受的制备用于移植的细胞的任何程序来处理患者。不需要的细胞的例子是恶性肿瘤细胞。
在胰腺组织样品中典型地存在非常少量的PSC，例如，每约40,000个细胞中可能仅存在一个或两个c-kit阳性细胞。因此，通常需要扩增所选择的c-kit阳性PSC以增加本文所述的治疗用途所必需的细胞的数量。在本文所述的治疗用途中移植的更多数量的PSC增加其中使用的疗法的成功率。将PSC用于修复、重建和产生受试者胰腺中的一些受损组织和细胞。因此，更多的PSC被移植意味着更多的细胞可用于修复、重建和产生新的胰腺细胞和胰腺组织。在一些实施方案中，移植疗法的成功可以通过本领域已知的任何方法和本文所述的那些方法测量，如本领域技术人员已知的受试者血糖水平和总体健康状况的改善。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将包含PSC的胰腺组织样品从受试者分离并然后例如通过细胞分选(例如，FACS)进一步加工以获得基本上富集c-kit阳性PSC的群体。在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，基本上富集c-kit阳性PSC的群体是指扩增的PSC的体外或离体培养物。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，来自各种来源的胰腺组织样品是冷冻样品，如在c-kit阳性PSC的提取或选择之前冷冻的或冷冻保存的。胰腺组织样品获自本文所述的受试者或其他来源，并然后用冷冻保护剂进行冷冻保存。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，来自胰腺组织样品的分离的c-kit PSC群体在使用前用冷冻保护剂进行冷冻保存。在所述组合物和方法的所有方面的又另一个实施方案中，已经在体外培养物中扩增的分离的c-kit PSC群体在使用前用冷冻保护剂进行冷冻保存。用冷冻保护剂将组织和细胞冷冻保存的方法在本领域是熟知的。用于解冻冷冻保存的组织或细胞以供使用的另外的方法在本领域也是熟知的。
如本文所使用的，术语“分离”和“获得或制备的方法”是指一种过程，凭借该过程从受试者或从其最初被发现的胰腺组织样品中去除细胞或细胞群体(例如PSC群体)。如本文所使用的，术语“分离的群体”是指已经从生物样品中去除和分离的细胞群体，或在这种样品中发现的混合或异质细胞群体。这种混合群体包括例如从胰腺组织样品中获得的PSC群体。在一些实施方案中，如与从其分离或富集细胞的异质群体相比，分离的群体是基本上纯的细胞群体。在一些实施方案中，分离的群体是分离的c-kit阳性PSC群体。在这方面和本文所述的所有方面的的其他实施方案中，分离的群体包含基本上富集的c-kit阳性PSC群体。在一些实施方案中，将分离的细胞或细胞群体(如c-kit阳性PSC群体)进一步在体外或离体培养(例如，在生长因子或细胞因子的存在下)，以进一步扩增分离的细胞群体或基本上c-kit富集的细胞群体中的细胞的数量。在一个实施方案中，将c-kit阳性PSC群体用SCF、IGF-1和/或HGF进一步在体外或离体培养。可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行这样的培养。在一些实施方案中，将通过本文所公开的方法获得的分离的或基本上富集的c-kit阳性PSC群体随后给予至第二个受试者，或者重新引入最初从其分离细胞群体的受试者中(例如，同种异体移植与自体给予)。
关于特定细胞群体，术语“基本上富集的”是指细胞群体相对于构成总细胞群体的细胞是至少约50％、75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％纯的。换句话说，关于分离用于在本文所公开的方法中使用的c-kit阳性PSC群体，术语“基本上富集的”或“基本上纯化的”是指c-kit阳性PSC群体含有少于约30％、25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％或少于1％的不是PSC的细胞，如本文通过术语所限定的。这些方面的一些实施方案进一步涵盖扩增基本上纯的或富集的PSC群体的方法，其中所扩增的c-kit阳性PSC群体也是基本上纯的或富集的c-kit阳性PSC群体。
关于细胞群体中的特定标志物存在，术语“基本上阴性”是指细胞群体相对于构成总细胞群体的细胞有不超过约10％、不超过约8％、不超过约6％、不超过约4％、不超过约2％、不超过约1％对该标志物呈阳性。
术语“富集”(enriching)或“富集的”(enriched)在本文中可互换使用，并且意指一种类型的细胞(如用于在本文所述的方法中使用的PSC)的产率(分数)比该类型的细胞在起始生物样品、培养物或制品中的分数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％。最优选地获得用于在本文所述的方法中使用的c-kit阳性PSC群体是至少50％富集的c-kit阳性PSC。
在一些实施方案中，将对PSC特异的标志物用于分离或富集这些细胞。如本文所使用的，“标志物”描述了细胞的特征和/或表型。可以将标志物用于选择包含感兴趣的特征的细胞。标志物将随特定细胞而变化。标志物是特别针对一种细胞类型的无论形态学、功能性或生物化学(酶学)的特征、或由该细胞类型表达的分子。优选地，此类标志物是蛋白质，并且更优选地，拥有本领域可获得的抗体或其他结合分子的表位。然而，标志物可以由在细胞中发现的任何分子组成，包括但不限于蛋白质(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇。形态学特征或性状的例子包括但不限于形状、尺寸、外观(例如，光滑、半透明)和细胞核与细胞质的比。功能性特征或性状的例子包括但不限于粘附于特定底物的能力、结合或排除特定染料的能力、在特定条件下迁移的能力、以及沿着特定谱系分化的能力。可以通过本领域技术人员可用的任何方法检测标志物。
因此，如本文所使用的，“细胞表面标志物”是指在细胞表面上表达的任何分子。细胞表面表达通常需要分子拥有跨膜结构域。通常在细胞表面上未发现的一些分子可以通过重组技术进行工程化以在细胞表面上表达。许多天然存在的细胞表面标志物被称为“CD”或“分化簇”分子。细胞表面标志物通常提供抗体可与其结合的抗原决定簇。与本文所述的方法特别相关的细胞表面标志物是CD117或c-kit。根据组合物和方法的有用的PSC优选地表达c-kit，或者换句话说，它们是c-kit阳性的。
对于任何细胞表面标志物或其他细胞内标志物，细胞可以被指定为“阳性”或“阴性”，并且这两种名称都可用于本文所述方法的实践。如果细胞在其细胞表面或细胞内以足以使用本领域技术人员已知的方法检测的量表达细胞表面标志物，则该细胞被认为对于该标志物是“阳性的”，该方法例如是使细胞与特异性地结合该标志物的抗体接触，并随后对这种接触细胞进行流式细胞术分析以确定抗体是否与该细胞结合。应当理解，虽然细胞可以表达细胞表面标志物的信使RNA，但是为了被认为针对本文所述的方法是阳性的，细胞必须在其表面上表达该标志物。类似地，如果细胞不以足以使用本领域技术人员已知的方法检测的量表达细胞表面标志物，则该细胞被认为对于该标志物是“阴性的”，该方法例如是使细胞与特异性地结合该标志物的抗体接触，并随后对这种接触细胞进行流式细胞术分析以确定抗体是否与该细胞结合。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，对c-kit阳性PSC进行阴性选择，并且该选择使用对细胞表面标志物特异的药剂。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，细胞表面标志物是谱系特异性标志物，如外分泌细胞谱系或内分泌细胞谱系。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在阴性选择(其中使用对谱系标志物特异的药剂)的上下文中，所有的药剂都可以包含相同的标记或标签(如荧光标签)，并因此可以排除或去除对该标记或标签呈阳性的所有细胞，从而留下谱系标志物阴性的PSC、胰腺祖细胞和/或胰腺前体细胞用于在本文所述的方法中使用。这是阴性选择，选择那些不与对谱系标志物特异的药剂接触的细胞。
因此，如本文所定义的，“对细胞表面标志物或其他细胞内标志物特异的药剂”是指可以选择性地与该细胞表面标志物或其他细胞内标志物反应或结合，但是对另一种细胞表面标志物、其他细胞内标志物或抗原具有很少或没有可检测反应性的药剂。例如，对c-kit特异的药剂不会鉴定或结合CD49e。因此，对细胞表面标志物或其他细胞内标志物特异的药剂识别标志物的独特结构特征。在一些实施方案中，对标志物特异的药剂结合该标志物，但不导致由该标志物介导的下游信号传导事件的起始，例如，非活化的抗体。对细胞表面分子特异的药剂包括但不限于抗体或其抗原结合片段、天然或重组配体、小分子、核酸序列和核酸类似物、细胞内抗体、适配子和其他蛋白质或肽。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，用于分离PSC的对细胞表面标志物特异的优选药剂是特异性地结合细胞表面标志物的抗体药剂，并且可以包括多克隆和单克隆抗体、以及其抗原结合衍生物或片段。所熟知的抗原结合片段包括，例如，单结构域抗体(dAb；其基本上由单个VL或VH抗体结构域组成)、Fv片段(包括单链Fv片段(scFv))、Fab片段和F(ab')2片段。用于构建此类抗体分子的方法在本领域是熟知的。因此，如本文所使用的，术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或是指具有Fc(可结晶的片段)区的单克隆或多克隆抗原结合片段或者Fc区的FcRn结合片段。抗原结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。“抗原结合片段”尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双抗体和含有免疫球蛋白的至少一部分的多肽，该至少一部分足以赋予与多肽结合的特异性抗原。术语Fab、Fc、pFc'、F(ab')2和Fv与本领域技术人员已知的标准免疫学含义结合使用，例如，在Klein,“Immunology”(John Wiley,New York,N.Y.,1982)；Clark,W.R.(1986),“TheExperimental Foundations of Modern Immunology”(Wiley&Sons,Inc.,New York)中；以及Roitt,I.(1991)“Essential Immunology”,第7版,(Blackwell ScientificPublications,Oxford)中。此类抗体或抗原结合片段可从供应商如R&D Systems、BDBiosciences、e-Biosciences和Miltenyi商购获得，或者可以通过本领域技术人员已知的方法针对这些细胞表面标志物或其他细胞内标志物产生。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将对细胞表面分子或其他细胞内标志物特异的药剂(如抗体或抗原结合片段)标记上标签，以促进胰腺干细胞的分离。如本文所使用的，术语“标记”或“标签”是指能够产生指示靶标的存在(如生物样品中特定细胞表面标志物的存在)的可检测信号的组合物。合适的标记包括荧光分子、放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、化学发光部分、磁性粒子、生物发光部分等。因此，标记是对分离和富集PSC、胰腺祖细胞和胰腺前体细胞的方法所必需的可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。
如本文所使用的，术语“标记抗体”或“标签抗体”包括通过可检测手段标记的抗体，并且包括但不限于荧光、酶促、放射性和化学发光地标记的抗体。抗体还可以用可检测标签(如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、或HIS)标记，该可检测标签可以使用对该标签特异的抗体(例如抗c-Myc抗体)检测。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域是已知的并且可以被使用。用于标记用于在本发明的方法中使用的抗体的荧光标记或标签的非限制性例子包括羟基香豆素、琥珀酰亚胺酯、氨基香豆素、琥珀酰亚胺酯、甲氧基香豆素、级联蓝(Cascade Blue)、酰肼、太平洋蓝(Pacific Blue)、马来酰亚胺、太平洋橙(PacificOrange)、荧光黄、NBD、NBD-X、R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy5缀合物(Cychrome，R670，三色，量子红)、PE-Cy7缀合物、Red 613、PE-德克萨斯红(PE-Texas Red)、PerCP、多甲藻素叶绿素蛋白、TruRed(PerCP-Cy5.5缀合物)、FluorX、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、BODIPY-FL、TRITC、X-罗丹明(XRITC)、丽丝胺(Lissamine)罗丹明B、德克萨斯红(Texas Red)、别藻蓝蛋白(APC)、APC-Cy7缀合物、ALEXA350、ALEXA405、ALEXA430、ALEXA488、ALEXA500、ALEXA514、ALEXA532、ALEXA546、ALEXA555、ALEXA568、ALEXA594、ALEXA610、ALEXA633、ALEXA647、ALEXA660、ALEXA680、ALEXA700、ALEXA750、ALEXA790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5或Cy7。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，技术人员可获得多种分离基本上纯的或富集的c-kit阳性PSC群体的方法，该方法包括免疫选择技术，如使用流式细胞术方法的高通量细胞分选，用标记于磁性珠粒、可生物降解珠粒、不可生物降解珠粒的抗体、和平移到包括培养皿等表面的抗体的亲和方法，以及此类方法的组合。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，可以使用基于珠粒的分选机制(如磁性珠粒)进行PSC群体的分离和富集。在此类方法中，使消化的胰腺组织样品与包被有针对一种或多种特定细胞表面抗原(如c-kit)的抗体的磁性珠粒接触。这导致样品中表达相应抗原的细胞附着到磁性珠粒上。在允许c-kit阳性细胞结合珠粒一段时间后，将细胞和珠粒的混合物暴露于强磁场，如具有磁铁的柱或架子。附着于珠粒的细胞(表达细胞表面标志物)停留在柱或样品管上，而其他细胞(不表达细胞表面标志物)流过或保留在溶液中。使用该方法，细胞可以相对于特定细胞表面标志物阳性地分离或阴性地分离、或使用其组合分离。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将磁性激活细胞分选(MACS)策略用于PSC的分离和预选择。在一些实施方案中，在人类血浆或人类血清白蛋白(HSA)(如2％HSA)的存在下分离PSC。
在所述组合物和方法的所有方面的一些优选实施方案中，使用针对细胞表面标志物c-kit的阳性选择分离或富集PSC。
如本文所定义的，“阳性选择”是指导致表达特定细胞表面标志物或细胞内蛋白质的细胞分离或富集的技术，而“阴性选择”是指导致不表达特定细胞表面标志物或细胞内蛋白质的细胞分离或富集的技术。可以通过本领域已知的任何方法进行阴性选择。例如，通过去除确实表达感兴趣的标志物的细胞来实施典型的阴性选择。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，由本领域技术人员使用本领域已知的标准技术，如商业珠粒缀合试剂盒，可以用抗体包被珠粒。在一些实施方案中，进行阴性选择步骤以去除表达一种或多种谱系标志物的细胞，随后进行荧光激活细胞分选以阳性选择表达一种或多种特定细胞表面标志物的PSC。
许多不同的细胞表面标志物在特定分化的细胞谱系上具有特异性表达，并且不被分离用于本文所述的方法中的c-kit阳性PSC表达。因此，当对这些谱系细胞标志物特异的药剂与c-kit阳性PSC接触时，细胞将是“阴性的”。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将单独的或与基于磁性珠粒的方法组合的流式细胞术方法用于分离或富集c-kit阳性PSC。如本文所定义的，“流式细胞术”是指通过将微观粒子(如细胞和DNA)悬浮在流体流中并使它们通过电子检测装置来对该微观粒子进行计数和检查的技术。流式细胞术允许每秒同时多参数分析多达数千个粒子的物理和/或化学参数，如荧光参数。现代流式细胞术仪器通常具有多个激光器和荧光检测器。增加激光器和检测器的数量允许通过多种抗体进行标记，并且可以通过其表型标志物更精确地鉴定目标群体。某些流式细胞术仪器可以拍摄单独细胞的数字图像，从而允许对细胞表面内或表面上的荧光信号位置进行分析。
流式细胞术技术的常见变体是基于其性质对粒子进行物理分选，以便使用“荧光激活细胞分选”来纯化感兴趣的群体。如本文所定义的，“荧光激活细胞分选”或“基于流式细胞术的分选”方法是指根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，用于将来自单个生物样品的细胞异质混合物每次一个细胞地分选到一个或多个容器中，并提供来自各个细胞的荧光信号的快速、客观和定量记录以及特别感兴趣的细胞的物理分离的流式细胞术方法。因此，在那些实施方案中，当对细胞表面标志物特异的药剂是用可以通过流式细胞仪检测的标签标记的抗体时，荧光激活细胞分选(FACS)可以用于本文所述的方法中并与该方法一起使用以分离和富集PSC群体。
PSC的扩增
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，分离的和基本上富集的c-kit阳性PSC群体在其用于本文所述的治疗方法之前进一步扩增以增加数量。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，通过使用本文所述的方法和技术分离或富集的c-kit阳性PSC在培养物中扩增，即，在给予至有需要的受试者之前使用本领域技术人员已知的方法在受试者体外使细胞数量增加。
在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，根据以下方法将获得的分离的c-kit阳性PSC在培养物中扩增。本领域技术人员将能够根据需要对该方法进行微小调整。在标准组织培养条件(例如，95％空气、5％CO2、37℃)下，将分离的c-kit阳性细胞铺板在含有F12培养基(GIBCO,格兰岛,纽约州)的补充有5％-10％FBS(GIBCO)和胰岛素-硒-转铁蛋白混合物(西格玛公司,圣路易斯,密苏里州)的改良F12K培养基中。在达到汇合后，将来自一个汇合板的细胞传代到几个其他板上以使用处理细胞的标准组织培养方案扩增培养物。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，此类扩增方法可以包括，例如，在导致PSC扩增的条件下，在补充有细胞因子和/或生长因子(如干细胞因子、IGF-1和/或HGF)的无血清培养基中培养c-kit阳性PSC。通过基质金属蛋白酶-2的表达和激活，HGF正向地影响细胞迁移。该酶家族破坏细胞外基质中的屏障，从而促进干细胞运动、归巢和组织恢复。类似地，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是促有丝分裂的、抗凋亡的并且是神经干细胞增殖和分化所必需的。以可比较的方式，IGF-1通过增加干细胞数量和保护其活力来影响干细胞。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，可以进一步将c-kit阳性PSC与因子一起和/或在旨在诱导PSC分化为外分泌和/或内分泌细胞的条件下，如使用补充有地塞米松和/或生长因子和细胞因子的组合的无血清培养基进行培养。
在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，通过调整不超过约0.5％的纳米技术或纳米工程方法来扩增c-kit阳性PSC，如在Lu J等人,“A Novel Technology forHematopoietic Stem Cell Expansion using Combination of Nanofiber and GrowthFactors.”Recent Pat Nanotechnol.2010 4(2):125-35中所综述的。例如，在一些实施方案中，可以进行干细胞微环境的纳米工程。如本文所使用的，分泌因子、干细胞-相邻细胞相互作用、细胞外基质(ECM)和机械性质共同组成“干细胞微环境”。干细胞微环境纳米工程可以包括使用微/纳米图案表面、纳米粒子控制释放生长因子和生化制品、纳米纤维模拟细胞外基质(ECM)、纳米级合成阵列生物材料、自组装肽系统模拟干细胞信号簇、纳米线、激光制造的纳米槽、和纳米相薄膜扩增PSC。
在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，对c-kit阳性PSC进行遗传操作，例如用外源核酸进行转染。纳米工程可以用于PSC中的转染和遗传操作，如纳米粒子用于体内基因递送、纳米针用于基因递送至PSC、自组装肽系统用于PSC转染、纳米线用于基因递送至PSC、和微/纳米流体设备用于PSC电穿孔。
在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，可以使用生物反应器来扩增分离或富集用于所述方法中的c-kit阳性PSC。
当在PSC扩增的上下文中使用时，术语“增加的”(increased)、“增加”(increase)或“扩增”(expand)通常意指PSC的数量增加了统计学上显著的量；为了避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”、“扩增”或“扩增的”(expanded)意指如与参考水平相比，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至多并包括100％的增加，或者如与对照或参考水平相比，至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、至少约9倍、或至少约10倍增加、或10倍或更多倍的任何增加。本文使用对照/参考样品或水平来描述从相同生物来源获得的细胞群体，该细胞群体例如尚未使用本文所述的方法扩增，例如，处于扩增培养的开始或添加到扩增培养物中的细胞的初始数量。胰腺组织样品和/或胰腺干细胞的储存
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在使用之前，即在提取、分离或选择其中的c-kit阳性PSC之前储存胰腺组织样品。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在提取或选择其中的c-kit阳性PSC之前储存经消化的胰腺组织样品。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，储存分离的c-kit阳性PSC。在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，在储存之前首先分离和/或扩增c-kit阳性PSC。在一个实施方案中，储存是通过冷冻保存。当需要用于本文所述的治疗方法时，将PSC解冻。
在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将胰腺组织样品或分离的c-kit阳性PSC(扩增的或其他)在其用于本文所述的方法之前冷冻。冷冻样品可以在一种或多种不同的冷冻保护剂的存在下进行，以使冻融过程期间的细胞损伤最小化。例如，可以使用二甲亚砜(DMSO)、海藻糖或蔗糖。
PSC在再生医学中的给予和用途
本文所述的某些实施方案是基于人类胰腺组织中躯体干细胞的发现。在一些情况下，这些人类胰腺干细胞(hPSC)可以修复糖尿病小鼠中受损的胰腺组织。在例如Hua等人,PLoS One,2014年7月10日；9(7):e102198中描述了糖尿病小鼠模型的例子和将干细胞植入这种小鼠中的方法。当将hPSC置于具有受损胰腺的小鼠中时，可以发生给予的hPSC的长期植入，并且这些hPSC可以分化成β细胞，例如，其可以导致随后的β细胞再生和修复。该实验可以指示分离的c-kit阳性PSC是否可以用于例如人类患者中的胰腺组织再生和糖尿病的治疗。如在Kroon等人,Nature Biotechnology,2008年4月；26(4):443-52中所述，还可以测试PSC在小鼠中产生葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞并保护小鼠免受链脲佐菌素诱导的糖尿病的能力。因此，本文提供了用于治疗和/或预防有需要的受试者中的胰腺疾病或障碍的方法。如本文所使用的，术语“胰腺疾病或障碍”、“胰腺疾病”、“胰腺病症”和“胰腺障碍”可互换使用。这些方法中的一些涉及通过注射、通过导管系统或其组合向受试者给予治疗有效量的分离的c-kit阳性PSC。在这些方法的一些方面，将治疗有效量的分离的c-kit阳性PSC通过血管、胰腺导管给予、直接给予至组织、或其组合。在其他方面，在包封设备中将治疗有效量的分离的c-kit阳性PSC植入患者内(参见，例如US 9,132,226和US 8,425,928，其每一个的内容通过引用以其全文并入本文)。这些方法特别针对对于具有胰腺疾病或障碍或处于胰腺疾病或障碍风险的人类受试者(例如患有胰腺炎或糖尿病的受试者)的治疗性和预防性治疗。可以将本文所述的分离的或富集的c-kit阳性PSC给予至所选的受试者，该受试者具有任何胰腺疾病或障碍或倾向于发生胰腺疾病或障碍，该给予可以通过导致受试者的有效治疗的任何适当的途径。在本文所述的治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在给予细胞之前首先选择患有胰腺疾病或障碍的受试者。
术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如，可以从其获得用于在本文所述的方法中使用的细胞的人类(即，供体受试者)和/或使用如本文所述的细胞对其提供治疗(包括预防性治疗)的人类(即受体受试者)。为了治疗对特定动物如人类受试者特异的那些病症或失调状态，术语受试者是指该特定动物。如本文可互换使用的“非人类动物”和“非人类哺乳动物”包括哺乳动物，如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人类灵长类动物。术语“受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受试者是哺乳动物，如人类，或其他哺乳动物，如驯养的哺乳动物，例如狗、猫、马等，或食品生产哺乳动物，例如牛、绵羊、猪等。
因此，在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，受试者是受体受试者，即，对其给予分离的c-kit阳性PSC的受试者，或供体受试者，即从其获得包含c-kit阳性PSC的胰腺组织样品的受试者。受体或供体受试者可以是任何年龄。在一些实施方案中，受试者是“幼年受试者”，在本文中定义为小于10岁的受试者。在其他实施方案中，受试者是“婴儿受试者”，在本文中定义为小于2岁的受试者。在一些实施方案中，受试者是“新生儿受试者”，在本文中定义为小于28日龄的受试者。在一个实施方案中，受试者是人类成体。
在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，被给予的分离的c-kit阳性PSC群体包含从一个或多个供体获得的同种异体PSC。如本文所使用的，“同种异体的”是指从相同物种的一个或多个不同供体获得的PSC或包含PSC的胰腺组织样品，其中在一个或多个基因座处的基因不相同。例如，向受试者给予的分离的c-kit阳性PSC群体可以获自如下胰腺组织，该胰腺组织获自一个或多个不相关的供体受试者或获自一个或多个异卵同胞或其他来源。在一些实施方案中，使用同系的分离的c-kit阳性PSC群体，如从遗传上相同的动物或从同卵双胞胎获得的那些。在这方面的其他实施方案中，分离的c-kit阳性PSC是自体PSC。如本文所使用的，“自体”是指从受试者获得或分离并且给予至同一受试者的PSC或包含c-kit阳性PSC的胰腺组织样品，即供体和受体是相同的。
胰腺疾病或障碍是在胰腺中发生的或导致胰腺不能恰当工作的任何疾病或障碍。胰腺疾病或障碍可以包括但不限于1型糖尿病、2型糖尿病、胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌。
本文所述的方法可以用于治疗、改善症状，预防和/或减缓许多胰腺疾病或其症状的进展，例如导致胰腺结构的病理性损伤的那些。术语“胰腺疾病或障碍”、“胰腺疾病”、“胰腺病症”和“胰腺障碍”在本文中可互换使用，并且是指与胰腺(包括内分泌细胞(α、β、δ、ε、PP)和外分泌细胞(腺泡、中心腺泡、导管))的结构或功能有关的任何病症和/或障碍。此类胰腺疾病包括但不限于1型糖尿病、2型糖尿病、胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌。
在这些病症中的一些中，其中炎症在病症的病理学中起作用，与c-kit PSC一起使用的治疗剂可以通过减少来自炎症的损伤来改善或减缓病症的进展。在其他情况下，与c-kit PSC一起使用的治疗剂可以起到限制病原体复制或病原体相关的胰腺组织损伤的作用。
如本文所使用的，在将本发明的细胞(例如，c-kit阳性PSC)通过如下方法或途径置于受试者中的上下文中，术语“给予”、“引入”、“移植”和“植入”可互换使用，该方法或途径导致所引入的细胞至少部分定位于所希望的部位(如损伤或修复部位)，使得产生所希望的效果。细胞例如c-kit阳性PSC或其分化后代(例如，β样细胞)可以直接植入胰腺，或者可选地通过任何适当的途径给予，该途径导致递送至受试者中的所希望位置，在该位置处至少一部分的植入细胞或细胞的组分保持存活。在给予至受试者后细胞活力的时间可以短至几小时，例如二十四小时、至几天、至长达几年，即长期植入。例如，在本文所述的治疗方法的所有方面的一些实施方案中，通过直接注射将有效量的分离或富集的分离的c-kit阳性PSC群体直接给予至患有糖尿病的个体的胰腺。在本文所述的治疗方法的所有方面的其他实施方案中，分离和富集的c-kit阳性PSC群体经由间接全身给予途径如导管介导的途径进行给予。
本发明的一个实施方案包括使用基于导管的方法来递送注射剂。导管的使用排除了更具侵入性的递送方法，如外科手术打开身体以进入胰腺。如本领域技术人员所知，通过更微创的手术将允许最佳的恢复时间，如这里所概述的，该手术包括导管方法。当预防性地提供时，可以在胰腺疾病或障碍的任何症状前面将分离和富集的c-kit阳性PSC给予至受试者。因此，分离或富集的c-kit阳性PSC群体的预防性给予用来预防胰腺疾病或障碍，或如本文所公开的胰腺疾病或障碍的进一步进展。
当治疗性地提供时，在胰腺疾病或障碍的症状或迹象发作时(或之后)，例如在糖尿病发作时，提供分离和富集的c-kit阳性PSC。
如本文所使用的，术语“治疗”(treat、treatment、treating)或“改善”(amelioration)是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、减少、抑制或减缓与疾病或障碍相关的病症的进展或严重性。术语“治疗”(treating)包括减少或减轻与胰腺疾病相关的病症、疾病或障碍(例如但不限于胰腺炎)的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物降低，则治疗通常是“有效的”，如本文对该术语所定义的。可选地，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括停止或至少减缓在没有治疗的情况下预期的症状的进展或恶化。有益或希望的临床结果包括但不限于一种或多种症状减轻、疾病的程度减小、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和、和无论是可检测的还是不可检测的缓解(无论是部分还是全部)。在一些实施方案中，“治疗”(treatment和treating)还可以意指如果受试者未接受治疗，则与预期存活相比受试者的存活延长。
如本文所使用的，术语“预防”是指预防性(prophylactic或preventative)措施，其中目的是预防或延迟疾病或障碍的发作，或延迟与疾病或障碍相关的症状的发作。在一些实施方案中，“预防”是指减缓病症的进展或严重性或与胰腺疾病或障碍相关的胰腺功能的恶化。
在另一个实施方案中，胰腺疾病或障碍的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的解除(包括姑息治疗)。例如，无论多么轻微，血糖水平、腹部疼痛、恶心和/或呕吐的任何降低都将被认为是减轻的症状。在本文所述的方面的一些实施方案中，与对照或未治疗的受试者相比，在给予分离和富集的PSC群体后，疾病或障碍的症状或测量参数减轻了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。
测量的或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物，例如升高或降低水平的临床或生物学标志物，以及与疾病或障碍的症状或标志物的临床上接受的规模相关的参数。然而，应当理解，如本文所公开的组合物的总用量将由主治医生在合理的医学判断范围内决定。所需的确切的量将取决于诸如所治疗的胰腺疾病或障碍的类型、损伤程度、目标是治疗还是预防还是两者、受试者的年龄，可用的细胞的量等因素而变化。因此，本领域技术人员意识到治疗可以改善疾病状况，但可能不完全治愈该疾病。
在所述治疗方法的所有方面的一个实施方案中，如本文所使用的术语“有效量”是指减轻胰腺疾病或障碍的至少一种或多种症状所需的分离或富集的c-kit阳性PSC群体的量，并且涉及足以提供所希望的效果(例如治疗患有糖尿病的受试者)的药理成分的量。因此，术语“治疗有效量”是指使用如本文所公开的治疗方法在给予至典型的受试者(如患有糖尿病或处于糖尿病的风险的受试者)时足以产生特定效果的分离和富集的c-kit阳性PSC的量。
在所述方法的所有方面的另一个实施方案中，如本文所使用的有效量还将包括足以预防或延迟疾病的症状发展、改变疾病症状的过程(例如但不限减缓疾病症状的进展)、或甚至逆转疾病症状的量。特定效果所需的c-kit阳性细胞的有效量将随每个个体而变化，并且还将随所处理的胰腺疾病或障碍的类型而变化。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当的“有效量”。
在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在根据本文所述的方法给予细胞之前，首先将受试者诊断为患有影响胰腺组织的疾病或障碍。在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在给予细胞之前，首先将受试者诊断为处于发生胰腺疾病或障碍的风险，例如，个体具有糖尿病的遗传倾向或具有患有糖尿病的近亲属。
为了在本文所述的治疗方法的所有方面中使用，有效量的分离的c-kit阳性PSC包含每次给予至少102、至少5X 102、至少103、至少5X 103、至少104、至少5X 104、至少105、至少2X 105、至少3X 105、至少4X 105、至少5X 105、至少6X 105、至少7X 105、至少8X 105、至少9X105、或至少1X 106个c-kit阳性PSC或其倍数。在一些实施方案中，向受试者进行分离的c-kit阳性PSC的多于一次的给予。分离的c-kit阳性PSC的多次给予可以在一段时间内发生。c-kit阳性PSC可以从一个或多个供体中分离或富集，或者可以从自体来源获得。
用于在本文所述的方法中使用的PSC和其他药剂的示例性给予模式包括但不限于注射、输注、吸入(包括鼻内)、摄入和直肠给予。“注射”包括但不限于静脉内、动脉内、导管内、直接注射到组织心室内、心脏内、经气管注射和输注。如本文所使用的短语“肠胃外给予”(parenteral administration和administered parenterally)是指除肠内和局部给予以外的给予模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、心室内、心脏内、经气管注射和输注。在一些实施方案中，c-kit阳性PSC可以通过静脉内、动脉内、导管内或直接注射到组织中、或通过注射到肝脏中来给予。
在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，将有效量的分离的c-kit阳性PSC通过注射给予至受试者。在其他实施方案中，将有效量的分离的c-kit阳性PSC通过导管介导的系统给予至受试者。在其他实施方案中，将有效量的分离的c-kit阳性PSC通过血管、胰腺导管、直接给予至组织或其组合给予至受试者。在另外的实施方案中，在包封设备中将有效量的分离的c-kit阳性PSC植入患者体内(参见，例如US 9,132,226和US 8,425,928，其每一个的内容通过引用以其全文并入本文)。
在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，通过全身给予(如静脉内给予)将有效量的分离和富集的c-kit阳性PSC给予至受试者。
如本文所使用的，短语“全身给予”、“全身地给予”、“外周给予”和“外周地给予”是指除直接给予以外将PSC群体给予到胰腺中，使得其代替进入受试者的循环系统。
在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在受试者中使用一种或多种给予途径以实现不同的效果。例如，通过直接注射和导管介导的途径两者向受试者给予分离或富集的c-kit阳性PSC群体，用于治疗或修复外分泌和/或内分泌组织。在此类实施方案中，分离或富集的c-kit阳性PSC的不同有效量可以用于每种给予途径。
在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，该方法进一步包括给予一种或多种治疗剂，如药物或分子，该治疗剂可以增强或加强通过给予分离或富集的c-kit阳性PSC介导的作用，如增强PSC的归巢或植入、增加外分泌和/或内分泌细胞的修复、或增加外分泌和/或内分泌细胞的生长和再生。治疗剂可以是蛋白质(如抗体或抗原结合片段)、肽、多核苷酸、适配子、病毒、小分子、化学化合物、细胞、药物等。
如本文所定义的，“血管再生”是指在损伤或创伤(如本文所述，包括但不限于胰腺疾病)后从头形成新血管或替换受损血管(例如毛细血管)。“血管生成”是可互换地用于描述这种现象的术语。
在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，该方法进一步包括给予c-kit阳性PSC连同本领域已知的生长、分化和血管生成剂或因子，以刺激胰腺组织中的细胞生长、分化和血管生成。在一些实施方案中，这些因子中的任何一种可以在给予本文所述的组合物之前或之后递送。还可以发生这些因子中的任何一种的多个后续递送以诱导和/或增强植入、分化和/或血管生成。合适的生长因子包括但不限于转化生长因子-β(TGFβ)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促血管新生蛋白因子(angiopoietin)、表皮生长因子(EGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。其他例子描述于Dijke等人,“Growth Factors for WoundHealing”,Bio/Technology,7:793-798(1989)；Mulder GD,Haberer PA,Jeter KF,编辑Clinicians'Pocket Guide to Chronic Wound Repair.第4版Springhouse,PA:Springhouse Corporation；1998:85；Ziegler T.R.,Pierce,G.F.,和Herndon,D.N.,1997,International Symposium on Growth Factors and Wound Healing:Basic Science&Potential Clinical Applications(Boston,1995,Serono Symposia USA),出版社:Springer Verlag中，并且这些文献通过引用以其全文特此并入。
在一个实施方案中，组合物可以包括一种或多种生物活性剂以诱导受损胰腺组织的愈合或再生，如从周围组织募集血管形成细胞以为新生血管提供连接点。合适的生物活性剂包括但不限于药学活性化合物、激素、生长因子、酶、DNA、RNA、siRNA、病毒、蛋白质、脂质、聚合物、透明质酸、促炎性分子、抗体、抗生素、抗炎剂、反义核苷酸和转化核酸或其组合。其他生物活性剂可以促进细胞生长和细胞分化的有丝分裂增加。
本领域已知许多生长因子和分化因子用来刺激干细胞和祖细胞的细胞生长和分化。合适的生长因子和细胞因子包括能够刺激、维持和/或动员祖细胞的任何细胞因子或生长因子。它们包括但不限于干细胞因子(SCF)、粒细胞-菌落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、基质细胞衍生因子-1、青灰因子、血管内皮生长因子(VEGF)、TGFβ、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促血管新生蛋白因子(Ang)、表皮生长因子(EGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素像生长因子(IGF-1)、白细胞介素(IL)-3、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11和IL-13、菌落刺激因子、促血小板生成素、促红细胞生成素、fit3-配体和肿瘤坏死因子α。其他例子描述于Dijke等人,"Growth Factors for Wound Healing",Bio/Technology,7:793-798(1989)；Mulder GD,Haberer PA,Jeter KF,编辑Clinicians'Pocket Guide to Chronic Wound Repair.第4版Springhouse,PA:Springhouse Corporation；1998:85；Ziegler T.R.,Pierce,G.F.,和Herndon,D.N.,1997,International Symposium on Growth Factors and WoundHealing:Basic Science&Potential Clinical Applications(Boston,1995,SeronoSymposia USA),出版社:Springer Verlag中。
在所述治疗方法的所有方面的一个实施方案中，所描述的组合物是在合适的生理学载体溶液如盐水中的PSC悬浮液。悬浮液可以含有另外的生物活性剂，该生物活性剂包括但不限于药学活性化合物、激素、生长因子、酶、DNA、RNA、siRNA、病毒、蛋白质、脂质、聚合物、透明质酸、促炎性分子、抗体、抗生素、抗炎剂、反义核苷酸和转化核酸或其组合。
在所述治疗方法的所有方面的某些实施方案中，生物活性剂是“促血管生成因子”，其是指直接或间接促进胰腺中的新血管形成的因子。促血管生成因子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、E-钙粘素、VEGF、血管生成素(angiogenin)、促血管新生蛋白因子-1、成纤维细胞生长因子(酸性(aFGF)和碱性(bFGF))、纤维蛋白原、纤连蛋白、乙酰肝素酶、肝细胞生长因子(HGF)、促血管新生蛋白因子、低氧可诱导因子-1(HIF-1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、IGF、BP-3、血小板衍生的生长因子(PDGF)、VEGF-A、VEGF-C、色素上皮衍生的因子(PEDF)、血管通透性因子(VPF)、玻连蛋白(vitronection)、瘦素、三叶肽(TFF)、CYR61(CCN1)、NOV(CCN3)、瘦素、中期因子、胎盘生长因子、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生的生长因子-BB(PDGF-BB)、多效生长因子(PTN)、颗粒蛋白前体、多育曲菌素、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、c-Myc、粒细胞菌落刺激因子(G-CSF)、基质衍生因子1(SDF-1)、散射因子(SF)、骨桥蛋白、干细胞因子(SCF)、基质金属蛋白酶(MMP)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、多效生长因子、多育曲菌素、卵泡抑素、胎盘生长因子(PIGF)、中期因子、血小板衍生的生长因子-BB(PDGF)、和曲动蛋白(fractalkine)、以及作为血管生成和增加血管分布的诱导物的炎性细胞因子和趋化因子、例如白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-8(IL-8)、CCL2(MCP-1)、白细胞介素-8(IL-8)和CCL5(RANTES)。
本文所述的组合物中的一种或多种治疗剂的合适剂量可以包括约0.1ng/ml至约500ng/ml、约10ng/ml至约500ng/ml、约20ng/ml至约500ng/ml、约30ng/ml至约500ng/ml、约50ng/ml至约500ng/ml、或约80ng/ml至约500ng/ml的浓度。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂的合适剂量为约10ng/ml、约25ng/ml、约45ng/ml、约60ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约425ng/ml、约450ng/ml、约475ng/ml、或约500ng/ml。在其他实施方案中，一种或多种治疗剂的合适剂量为约0.6μg/ml、约0.7μg/ml、约0.8μg/ml、约0.9μg/ml、约1.0μg/ml、约1.5μg/ml、或约2.0μg/ml。
在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，该方法进一步包括给予一种或多种表面活性剂作为治疗剂，或者可以与一种或多种表面活性剂疗法组合使用。如本文所使用的，表面活性剂是指任何表面活性试剂，包括但不限于润湿剂、表面张力抑制剂、洗涤剂、分散剂和乳化剂。特别优选的是来自肺泡表面上的单分子层的那些，包括但不限于脂蛋白、卵磷脂、磷脂酰甘油(PG)、二棕榈酰-磷脂酰胆碱(DPPG)、脱辅基蛋白A、脱辅基蛋白B、脱辅基蛋白C、脱辅基蛋白D、棕榈酰油酰、磷脂酰甘油棕榈酸和鞘磷脂。示例性表面活性剂包括但不限于表面活性剂蛋白A、表面活性剂蛋白B、表面活性剂蛋白C、表面活性剂蛋白D、及其混合物和组合。可商购的表面活性剂包括但不限于KL-4、牛脂质提取物表面活性剂(BLES)、HL-10、 /ALEC、和
在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，一种或多种其他标准治疗剂的给予可以与给予富集的c-kit阳性PSC组合以治疗胰腺疾病或障碍(例如糖尿病或胰腺炎)，包括使用抗胆碱能药物、β-2-肾上腺素能受体激动剂(如福莫特罗或沙美特罗)、皮质类固醇、抗生素、抗氧化剂、抗高血压剂、一氧化氮、咖啡因、地塞米松和IL-10或其他细胞因子。在一些实施方案中，将所包括的标准治疗剂用于治疗胰腺疾病的症状。
例如，在本文所述的方法中使用c-kit阳性PSC来治疗、改善或减缓诸如囊性纤维化(CF)等病症的进展可以任选地与其他合适的治疗或治疗剂组合。对于CF，这包括但不限于口服或气溶胶皮质类固醇治疗、布洛芬治疗、DNA酶或IL-10治疗、饮食控制(例如维生素E补充)、针对病原体的疫苗接种(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、胸部物理疗法(例如胸腔引流或叩诊)、或其任何组合。
在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，标准治疗剂是已经详细描述的那些，参见例如，Harrison's Principles of Internal Medicine,增刊第15版,2001,E.Braunwald等人,编辑,McGraw-Hill,New York,N.Y.,ISBN0-07-007272-8,尤其是在第1456-1526页的第252-265章；Physicians Desk Reference增刊第54版,2000,第303-3251页,ISBN 1-56363-330-2,Medical Economics Co.,Inc.,Montvale,N.J.。使用本文所述的治疗方案可以实现任何胰腺疾病或障碍的治疗。对于慢性病症，可以使用间歇给药来减少治疗频率。间歇给药方案如本文所述。
对于本文所述的方法的临床用途，本文所述的分离或富集的富集的c-kit阳性PSC群体可以与导致在受试者中有效治疗的任何药学上可接受的化合物、材料、载体或组合物一起给予。因此，用于在本文所述的方法中使用的药物配制品可以含有分离或富集的c-kit阳性PSC群体与一种或多种药学上可接受的成分的组合。
术语“载体”是指与治疗剂一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内给予药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果希望，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释配制品等形式。组合物可以被配制成栓剂，使用传统的粘合剂和载体如甘油三酸酯。口服配制品可以包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的例子描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Gennaro编(Mack Publishing Co.,1990)。配制品应该符合给予模式。
在一个实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更特别地在人体内使用。具体地，它是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物组织接触使用而没有过多的毒性、刺激性、过敏反应、或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所使用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质(例如干细胞培养基)、包封材料、制造辅助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、钙或锌、或硬脂酸)或溶剂包封材料，其涉及维持分离或富集的PSC群体的活性、将该分离或富集的PSC群体从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的另一部分。
在与配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)磷酸盐缓冲溶液；(3)无热原质水；(4)等渗盐水；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(17)粉末黄蓍胶；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，如乙醇；(25)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；和(26)药物配制品中使用的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于配制品中。术语如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。
定义
除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。这里收集了在本文中、在说明书、实施例和权利要求书中使用的某些术语。
如本文所使用的，在体内(in vivo)(“活体内”(within the living)的拉丁语)是指使用整个活的生物体(如人类受试者)的那些方法。如本文所使用的，“离体”(ex vivo)(拉丁语：活体外(out of the living))是指在受试者的体外进行的那些方法，并且是指其中从活的受试者中取出器官、细胞或组织用于手术的那些程序，例如，从获自供体受试者的胰腺组织中分离c-kit阳性PSC，并然后将分离的c-kit阳性PSC样品给予至受体受试者。如本文所使用的，“在体外”(in vitro)是指在受试者外部进行的那些方法，如体外细胞培养实验。例如，在根据本文所述的方法使用或给予之前，可以在体外培养分离的c-kit阳性PSC以扩增或增加c-kit阳性PSC的数量，或者以将PSC直接分化成特定谱系或细胞类型，例如β细胞。
如本文所使用的术语“多能的”是指细胞具有在不同的条件下定型成一种或多种特定细胞类型谱系并分化成超过一种分化细胞类型的定型谱系，并且优选地分化成所有三个生殖细胞层特有的细胞类型的能力。多能细胞的特征主要在于，使用例如裸鼠畸胎瘤形成测定法，它们能够分化成超过一种细胞类型，优选地分化成所有三个生殖层。胚胎干(ES)细胞标志物的表达也证明了多能性，但是多能性的优选测试是证明分化成三个生殖层中每一层的细胞的能力。应该注意的是，简单地培养此类细胞本身并不使它们具有多能性。相对于通常仅具有在培养物中进行有限数目的分裂的能力的原代细胞亲本，重新编程的多能细胞(例如，iPS细胞，如本文对该术语所定义的)也具有延长传代而不丧失生长潜力的能力的特征。
本文所使用的术语“祖细胞”是指相对于其可以通过分化产生的细胞，具有更加原始的细胞表型的细胞(即，是处于沿发育途径或进展的较早期步骤，而不是完全分化或最终分化的细胞)。通常，祖细胞还具有显著的或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生多种不同的分化细胞类型或产生单一分化细胞类型，这取决于发育途径和取决于这些细胞发育和分化所处的环境。祖细胞产生特定确定谱系的前体细胞，例如，某些胰腺祖细胞分裂以产生内分泌细胞谱系前体细胞。这些前体细胞分裂并产生最终分化成例如β细胞的许多细胞。
本文使用的术语“前体”细胞是指具有比最终分化细胞更加原始但是比沿其相同发育途径的干细胞或祖细胞较不原始的细胞表型的细胞。“前体”细胞典型地是“祖”细胞的子代细胞，该子代细胞是“干细胞”的一些子细胞。典型的不对称细胞分裂中的子细胞之一承担干细胞的作用。
术语“胚胎干细胞”用于指胚胎囊胚的内细胞团的多能干细胞(参见美国专利号5843780、6200806)。此类细胞可以类似地获自从体细胞核移植起源的囊胚的内细胞团(参见，例如，美国专利号5945577、5994619、6235970)。胚胎干细胞的区别特征定义了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞拥有胚胎干细胞的一种或多种独特特征使得该细胞可以与其他细胞区分开，则该细胞具有胚胎干细胞的表型。示例性胚胎干细胞区别特征包括但不限于基因表达谱、增殖能力、分化能力、核型、对特定培养条件的响应性等。
术语“成体干细胞”用于指从非胚胎组织(包括幼体和成体组织)起源的任何多能干细胞。在一些实施方案中，成体干细胞可以是非胎儿起源的。
在细胞个体发育的上下文中，形容词“分化的”(differentiated或differentiating)是相对术语，意指“分化的细胞”是比与其进行比较的细胞在发育途径中进一步向下发展的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制的前体细胞(如胰腺干细胞)，其转而又可以分化成途径进一步往下的其他类型的前体细胞(如外分泌或内分泌前体)，并然后分化成在某种组织类型中起特征性作用的终末期分化细胞，并且可能保留或可能不保留进一步增殖的能力。
术语“分化的细胞”意指在其天然形式下不是多能的任何原代细胞，如如本文对该术语所定义的。以另一种方式表述，术语“分化的细胞”是指在细胞分化过程中从较不特化的细胞类型的细胞(例如，干细胞，如胰腺干细胞)衍生的更加特化的细胞类型的细胞。不希望受理论限制，在正常个体发育过程中的多能干细胞可以首先分化为内分泌或外分泌细胞。胰腺干细胞的进一步分化导致各种胰腺细胞类型的形成，包括α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、PP细胞、腺泡细胞、中心腺泡细胞或导管细胞。
如本文所使用的，术语“体细胞”是指形成生物体的身体的任何细胞，与生殖细胞相反。在哺乳动物中，生殖细胞(也称为“配子”)是精子和卵子，它们在受精过程中融合以产生一种称为受精卵的细胞，整个哺乳动物胚胎从该受精卵发育。哺乳动物体内的每种其他细胞类型-除了精子和卵子以外，从其制造它们的细胞(配子体)和未分化的干细胞-是一种体细胞：内脏、皮肤、骨骼、血液和结缔组织全部都是由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎体细胞”，其意指不存在于胚胎中或不是从胚胎获得的体细胞并且不起因于这种细胞在体外的增殖。在一些实施方案中，体细胞是“成体体细胞”，其意指存在于除胚胎或胎儿以外的生物体中或从除胚胎或胎儿以外的生物体获得的细胞或者起因于这种细胞在体外的增殖。
如本文所使用的，术语“成体细胞”是指胚胎发育后在整个身体中发现的细胞。
术语“表型”是指在一组特定的环境条件和因子下定义细胞或生物体的一种或许多种总生物学特征，而不管实际的基因型。例如，细胞中细胞表面标志物的表达。
如本文提及的术语“细胞培养基”(cell culture medium)(本文也称为“培养基”(culture medium)或“培养基”(medium))是用于培养细胞的含有维持细胞活力和支持增殖的营养物的培养基。细胞培养基可以包含以适当的组合的任何以下物质：一种或多种盐、一种或多种缓冲液、氨基酸、葡萄糖或一种或多种其他糖、抗生素、血清或血清替代物和其他组分如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。
术语“更新”或“自我更新”或“增殖”在本文中可互换使用，用于指干细胞通过在长时期和/或好几个月到几年内分裂成相同的非特化细胞类型来更新它们自己的能力。
在一些情况下，“增殖”是指通过将单个细胞重复分裂成两个相同的子细胞来扩增细胞。
本文使用的术语“谱系”描述具有共同祖先的细胞或具有共同发育命运的细胞。
如本文所使用的术语“分离的细胞”是指已经从最初发现其的生物体中除去的细胞或这种细胞的后代。任选地，细胞已经在体外培养，例如，在其他细胞的存在下。任选地，后来将细胞引入第二个生物体中或重新引入其被分离的生物体(或其被传下来的细胞)中。
如本文所使用的，关于分离的细胞群体，术语“分离的群体”是指已经从混合或异质细胞群体中去除和分离的细胞群体。在一些实施方案中，如与从其分离或富集细胞的异质群体相比，分离的群体是基本上纯的细胞群体。
术语“组织”是指一起执行某些特殊功能的一组或一层特化的细胞。术语“组织特异的”是指来自特定组织的细胞来源。
术语“减少了”(decrease)、“降低了”(reduced)、“降低”(reduction)、“减少”(decrease)或“抑制”全部在本文中通常用于意指减少了统计学上显著的量。然而，为了避免疑问，“降低了”(reduced)、“降低”(reduction)或“减少”(decrease)或“抑制”(inhibit)典型地意指如与参考水平相比减少了至少约5％-10％，例如减少了至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％减少(即，如与参考样品相比缺少的水平)，或如与参考水平相比在10％-90％之间的任何减少。在治疗或预防的上下文中，参考水平是在没有给予c-kit阳性PSC群体的情况下受试者的症状水平。
术语“增加了”(increased)、“增加”(increase)或“增强”(enhance)全部在本文中通常用于意指增加了统计学显著的量；为了避免任何疑问，术语“增加了”、“增加”或“增强”意指如与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％增加或更多，或如与参考水平相比在10％-90％之间的任何增加，或如与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加、或在2倍与10倍之间的任何增加或更多。在c-kit阳性PSC体外扩增的上下文中，参考水平是从胰腺组织样品中分离的c-kit阳性PSC的初始数量。
术语“以最低水平表达”是指如通过qRT-PCR、FACS、免疫沉淀反应、蛋白质印迹、ELISA、微阵列、Nanostring、质谱或本领域已知的其他分子定量技术测量的，内分泌或外分泌标志物如胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶在分离的c-kit阳性胰腺干细胞中的有限表达。内分泌和/或外分泌标志物的最低表达水平典型地意指，相对于c-kit表达，每种标志物以对该标志物不超过约10％、不超过约8％、不超过约6％、不超过约4％、不超过约2％、不超过约1％呈阳性或更少进行表达，如通过本领域技术人员已知的分子测定法确定的。
术语“统计学上显著的”或“显著的”是指统计学显著性，并且通常意指比标志物的正常浓度低两个标准偏差(2SD)或更低。该术语是指存在差异的统计证据。它被定义为当零假设实际为真时作出拒绝该零假设的决定的概率。通常使用p值作出该决定。
如本文所使用的，术语“包含”(comprising或comprises)用于指对本发明必不可少的组合物、方法及其相应的一种或多种组分，但存在未指定的要素(无论是否必不可少)的可能性。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其相应的一种或多种组分，其不包括在该实施方案的描述中未列举的任何要素。
除非另外说明，否则在此使用的所有技术和科学术语具有如本公开文本所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学中常见术语的定义可以在以下文献中找到：Benjamin Lewin,Genes IX,由Jones&Bartlett Publishing出版,2007(ISBN-13:9780763740634)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
除非另有说明，否则使用例如在以下文献中的本领域技术人员已知的标准程序执行本发明：Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1982)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版),Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1989)；Davis等人,Basic Methods in MolecularBiology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986)；Current Protocolsin Molecular Biology(CPMB)(Fred M.Ausubel等人编辑,John Wiley and Sons,Inc.),Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan等人编辑John Wiley andSons,Inc.),Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等人编辑,John Wiley and Sons,Inc.),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique由R.Ian Freshney著,出版社：Wiley-Liss；第5版(2005)以及Animal Cell CultureMethods(Methods in Cell Biology,第57卷,Jennie P.Mather和David Barnes编辑,Academic Press,第1版,1998)，它们全部通过引用以其全文并入本文。
应该理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并因此可以变化。本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
除了在操作实施例中以外或者在另外指明的情况下，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应该理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。
出于说明和公开的目的，所鉴定的所有专利和出版物均明确地通过引用并入本文，例如，此类出版物中描述的方法论可能与本发明结合使用。提供这些出版物仅仅是因为它们的公开在本申请的提交日期之前。在这方面的任何内容都不应被解释为承认诸位发明人无权凭借在先发明或出于任何其他原因而先于这种公开。关于日期的所有陈述或关于这些文件内容的表述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
通过以下实施例进一步阐明本发明，其不应解释为限制。贯穿本申请引用的所有参考文献的内容以及附图均通过引用并入本文。
本领域技术人员将认识或能够使用不超过常规实验确定，本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物、不同的培养基和补充物可以用于培养扩增分离的细胞。本领域技术人员将能够进行测试以评价培养基和补充剂的选择。此类等同物旨在被以下权利要求书涵盖。
在本文和整个说明书中引用的参考文献通过引用并入本文。
实施例
诸位发明人已经使用干细胞抗原c-kit作为鉴定和表征胰腺原发细胞的标志物。使用c-kit表位帮助揭示自我更新、可形成克隆和多能的胰腺干细胞(PSC)的库。这些PSC能够再生为表达内分泌胰腺标志物如胰岛素、C-肽和胰高血糖素的细胞，并且还能够再生为表达外分泌胰腺标志物如CK19和淀粉酶的细胞。
材料和方法
hPSC
通过外科手术获得29个人类胰腺组织样品。代表性样品显示于图1中。为了分离人类胰腺干细胞(hPSC)，采用本发明人实验室为收集和扩增其他器官(包括心脏和肺)中的c-kit阳性干细胞类别而开发的方案将片段酶促解离。将组织片段在含有胶原酶的溶液中酶促解离，以获得单细胞悬浮液。将细胞用针对c-kit的磁性免疫珠粒(Miltenyi公司)分选，并且在分选后，通过免疫细胞化学定义细胞表型。然后在补充有5％-10％FBS(Gibco)和胰岛素-硒-转铁蛋白混合物(西格玛公司)的F12培养基(Gibco)中培养推定的hPSC。对于免疫细胞化学，当可能时，用荧光染料(Molecular Probes)直接标记第一抗体以避免交叉反应。通过共聚焦显微镜分析免疫标记。
克隆测定和可形成克隆的细胞分化
分选人类c-kit阳性细胞，并且在显微镜控制下，将单独的c-kit阳性细胞分别接种在96孔板的单个孔中。排除含有超过一个细胞的孔。另外，将c-kit阳性细胞以有限的稀释度(大约100-150个细胞)接种在直径为10cm的皮氏培养皿中。通过含有10％FBS、10-8M地塞米松的MEM诱导克隆形成细胞的分化。通过免疫细胞化学定义细胞表型。
hPSC分裂
通过用α-衔接蛋白抗体免疫标记有丝分裂细胞来确定hPSC的对称和不对称分裂。通过用DAPI染色来鉴定有丝分裂染色体。
定量RT-PCR
用TRIzol从克隆的hPSC提取总RNA用于检测c-kit的转录物、胰腺内分泌细胞分化的标志物(Pdx1、Nkx6.1、Ins、Ngn3)、胰腺外分泌细胞分化的标志物(Amy2A)和胰腺祖细胞标志物(Sox9)。从在37℃下与寡聚(dT)15引物一起孵育2小时的2μg总RNA生成cDNA。使用每个反应的1/20的cDNA在7300实时PCR系统(Real Time PCR Systems)(AppliedBiosystems)上进行RT-PCR。循环条件如下：95℃持续10分钟，随后35个循环的扩增(95℃变性持续15秒，和60℃组合退火/延伸持续1分钟)。使用Vector NTI软件(INVITROGENTM)设计人特异性引物。将定量值针对人类管家基因β2微球蛋白确定的输入来归一化。将人类胰腺总RNA(Applied Biosystems)和从小鼠胰腺中提取的RNA分别用作阳性对照和阴性对照。
PCR产物在2％琼脂糖/1x TBE凝胶上运行，并且获得了具有预期分子大小的DNA条带。用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)提取DNA，将其在30μl的10mM Tris缓冲液(pH 8.5)中洗脱，并在与用于实时RT-PCR相同的正向和反向引物的存在下通过PlatinumBlue PCR Supermix进行扩增。PCR反应在Eppendorf Mastercycler中进行。循环条件如下：94℃持续2分钟，随后20个循环的扩增(94℃变性持续15秒，60℃退火持续30秒，72℃延伸持续15秒)，最后在72℃孵育2分钟。在使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化后，对样品进行测序。通过采用BLAST搜索确认转录物的人类起源。
克隆hPSC的mRNA谱分析
通过采用Nanostring测定获得克隆hPSC的mRNA谱分析。该技术使用颜色编码的分子探针和单分子成像使得能够对靶RNA分子进行数字量化。Nanostring系统拥有高水平的特异性和灵敏度，因此可以测量每个细胞一个转录物拷贝。通过管家基因的表达将通过Nanostring分析产生的原始数据归一化，并且将样品间基因的差异表达显示为热图。用TRIzol从克隆的hPSC提取总RNA。检查了一组195个干细胞相关的人类基因。在未处理的克隆hPSC和暴露于分化诱导物地塞米松(Dexa)的克隆hPSC中测量基因表达。在每个克隆中，将基因表达显示为相对于暴露于地塞米松的对应克隆细胞的百分比差异，并表示为热图。红色对应于在用Dexa处理的细胞中比在未处理的细胞中更高的基因表达水平。蓝色对应于在用Dexa处理的细胞中比在未处理的细胞中更低的基因表达水平。
链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠、移植和测量
在该研究中将使用严重组合免疫缺陷(SCID)/非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。用这些小鼠进行研究的方法可以改编自例如Hua等人,PLoS One,2014年7月10日；9(7):e102198。在具有受控的湿度、光照和温度的动物设施中，将小鼠保持在无特定病原体的条件下。设施内的空气将通过被设计为用于排除细菌和病毒的HEPA过滤系统。动物将被随意喂食以获取标准辐射饮食。
为了诱导实验性糖尿病，每天向小鼠腹膜内注射STZ。在STZ注射后4天，每天通过葡萄糖计使用尾静脉血开始测量血糖水平。在STZ注射前和在STZ给予后1-5天将确定小鼠的平均血糖，以确定定义糖尿病小鼠的平均血糖水平。然后每天将用长效胰岛素注射糖尿病小鼠直至移植。未成功诱导的糖尿病小鼠将被排除在研究之外。将在每天或每周监测小鼠的体重和血糖水平。
将c-kit阳性hPSC移植到腹部脂肪垫中，通过胰腺导管输注和/或直接注射到SCID/NOD小鼠的胰腺实质中。每只小鼠将接受约106个c-kit阳性hPSC。在移植后早期(2-4天)和晚期(1-4个月)将器官固定在10％福尔马林溶液中，以分别确定hPSC植入和组织再生。每周在移植前和移植后测量平均血糖水平。通过测量血清人类胰岛素水平评估细胞存活和功能。
实施例1
鉴定外分泌和内分泌胰腺组织中的c-kit阳性细胞
对样品进行组织学分析以确定胰腺组织中是否存在c-kit阳性细胞。使用针对c-kit的抗体和针对胰岛素、C-肽和胰高血糖素的抗体通过免疫组织化学分析细胞，该胰岛素、C-肽和胰高血糖素是产生胰岛素和C-肽(β细胞)或胰高血糖素(α细胞)的内分泌细胞的标志物。表达c-kit受体的细胞发现于胰腺的内分泌(胰岛)和外分泌部分。在所有情况下，进行类胰蛋白酶染色以从分析中排除肥大细胞。重要的是，鉴定了显示c-kit和谱系标志物的细胞，表明c-kit阳性细胞可能代表胰腺中特化细胞的来源。图2A显示了共表达c-kit和胰岛素的胰岛内的一些细胞。图2B显示了共表达c-kit和C-肽的胰岛内的一些细胞。图2C显示了共表达c-kit和胰高血糖素的胰岛内的一些细胞。图2C中的加框区域的放大图显示在图2D-图2F中。放大图显示了表达c-kit(图2D)、胰高血糖素(图2E)的细胞以及通过两个信号的合并得到的c-kit和胰高血糖素的共表达(图2F)。
在导管的上皮衬里内以及它们在外分泌胰腺中的邻近区域中鉴定出c-kit阳性细胞(图3A-图3C)。有时，c-kit阳性细胞表达上皮标志物CK19和酶淀粉酶。图3A中的加框区域的放大图显示在图3B-图3C中。图3B-图3C显示了共表达c-kit和上皮标志物CK19的一些外分泌细胞。图3B-图3C中的箭头指示c-kit阳性细胞。
实施例2
C-kit阳性细胞是自我更新的、可形成克隆的和多能的
将胰腺样本酶促解离以分离并培养c-kit阳性细胞，发现该c-kit阳性细胞具有干细胞的三种特性：自我更新、克隆形成和多能性。
c-kit阳性细胞不对称分裂，从而产生了子代干细胞和子代定型细胞。另外，c-kit阳性细胞可以对称分裂。基于细胞命运决定子α-衔接蛋白的非均匀或均匀分布来定义分裂形式(图4)。
单独沉积在96孔板的单个孔中的c-kit阳性细胞产生了由子细胞构成的克隆，该子细胞保留了c-kit的表达(图5)。
暴露于分化培养基的克隆的c-kit阳性细胞(图6A-图6C中的“Dexa”)获得了内分泌和外分泌谱系的标志物。分化的c-kit阳性细胞表达β细胞标志物C-肽(图6A)、内分泌α细胞标志物胰高血糖素(图6B)和外分泌细胞标志物淀粉酶(图6C)。另外，hPSC在用葡萄糖刺激后在体外分泌胰岛素(图6D)。
实施例3
体内研究糖尿病SCID/NOD小鼠中的hPSC
将进行体内研究，其中将人类胰腺干细胞(PSC)递送至糖尿病SCID/NOD小鼠的胰腺。目的是确定PSC是否可以分化成产生胰岛素的β细胞。这将导致血糖水平降低和糖尿病的改善。
实施例4
人类胰腺含有产生胰岛素的干细胞的区室
β细胞的新生允许内分泌胰腺能够满足妊娠、肥胖或部分胰腺切除术后对胰岛素分泌的日益增长的需求。普遍的观点是高度专业化的β细胞重新进入细胞周期并自我复制，从而恢复β细胞团并使血糖水平正常化。相反，识别部分调节β细胞生长的人类胰腺干细胞(hPSC)是难以捉摸的。本公开文本显示人类胰腺拥有c-kit阳性-hPSC库，其是自我更新的、可形成克隆的和多能的、是组织特异性成体干细胞的关键标识符。hPSC在体外和体内定型成内分泌β细胞和α-细胞以及外分泌腺泡细胞，从而产生对应的激素和酶。在两种小鼠模型中的命运映射方案已经证实了这些观察结果，表明了胰腺生物学的新范例。了解β细胞形成的机制可能提供了机会来加强这种自然发生的过程，为人类糖尿病的管理提供了新的策略。
在出生后生物体成熟后，几个器官继续拥有调节生理细胞周转并且有助于损伤后组织修复的干细胞区室。内分泌胰腺从一种短暂的神经发生素(neurogenin)-3(Ngn3)阳性祖细胞发展而来，该祖细胞显然在出生后不久就丧失了(Soyer等人,2010)。然而，β细胞的新生是允许内分泌胰腺满足妊娠和肥胖或部分胰腺切除术后对胰岛素分泌的增加的需求的关键过程(Menge等人,2012)。因此，基本问题涉及分泌胰岛素的细胞的起源。普遍的观点是，高度特化的、最终分化的β细胞可以重新进入细胞周期并自我复制，从而恢复β细胞团并使血糖水平正常化(Dirice等人,2014；Dor等人,2004；Mezza和Kulkarni,2014)。
最终分化细胞可以重新进入细胞周期并分裂的假设本身是一种生物学矛盾。此外，自我复制是β细胞生长的机制的观点来源于使用由胰岛素启动子驱动的报告基因的谱系追踪研究(Dor等人,2004)，其具有固有的局限性。该方法的主要偏见是假设胰岛素的存在局限于功能性β细胞。激素可以在祖细胞前体细胞和扩增细胞中同等表达，通过未定型的胰岛素阴性胰腺干细胞(PSC)的激活和进行性谱系规范产生。已经在发育异质的细胞群体(包括成年小鼠和胎儿人类胰腺中的Ngn3阳性和Pdx1阳性祖细胞前体细胞)中检测到胰岛素(Jiang和Morahan,2012)，表明更原始的细胞可以控制β细胞生长和分化。然而，对调节β细胞周转和再生的单能或多能常驻人类PSC(hPSC)的识别是难以捉摸的。
本公开文本显示成年人类胰腺含有c-kit阳性细胞库，其是在体外自我更新的、可形成克隆的和多能的。重要的是，通过定型c-kit阳性细胞产生的β细胞响应于葡萄糖刺激而合成人类胰岛素。此外，小鼠中的谱系追踪研究支持胰腺的内分泌和外分泌组分在体内起源于c-kit阳性细胞的复制和分化的观点。总之，这些发现表明哺乳动物胰腺受调节器官稳态的常驻干细胞的区室调节。
人类胰腺含有c-kit阳性细胞
先前已将c-kit表位用于鉴定和表征造血、心脏和肺干细胞(Beltrami等人,2003；Ellison等人,2013；Leri等人,2015；Liu等人,2015；Orlic等人,1993)，提高了这种受体酪氨酸激酶可能在其他类别的组织特异性成体干细胞中表达的可能性。诸位发明人测试了c-kit的存在是否会揭示hPSC库，其类似于其他器官中的干细胞，是自我更新的、可形成克隆的和多能的。在该研究中包括在外科手术中丢弃的正常出现的人类胰腺的29个样品(图7)。c-kit受体在肥大细胞的质膜中高度表达(Esposito等人,2002)，因此利用类胰蛋白酶的缺失和存在来分别区分推定的hPSC和肥大细胞。
在组织学上，在所有检查的病例中鉴定出c-kit阳性类胰蛋白酶阴性推定的hPSC。它们位于朗格汉斯胰岛内或在外分泌腺泡细胞附近(图8A-图8C和图9)；它们还被发现于小胰腺导管的上皮衬里内(图8D)。c-kit阳性类胰蛋白酶阴性细胞不表达C-肽(图8A)、淀粉酶(图9)和细胞角蛋白-19(图8D)，或者被胰岛素(图8B)和胰高血糖素(图8C)共标记。
进行定量分析以评估组织内c-kit阳性类胰蛋白酶阴性和c-kit阳性类胰蛋白酶阳性细胞的数量(n＝6)。在缺乏优先的解剖学定位的整个实质中鉴定出肥大细胞。然而，在胰腺导管上皮内未检测到肥大细胞。平均有631个c-kit阳性细胞/106个胰腺细胞；c-kit阳性类胰蛋白酶阴性推定的hPSC以26/106个胰腺细胞的频率存在，或每38,500个胰腺细胞存在1个。c-kit阳性类胰蛋白酶阳性肥大细胞包含大部分的c-kit阳性细胞，605/106个胰腺细胞(图8E)。推定的hPSC构成c-kit阳性细胞库的4％，而肥大细胞占该细胞区室的96％。因此，胰腺含有罕见的c-kit阳性推定的hPSC群体，其是未定型的或共表达指示谱系规格的蛋白质。
c-kit阳性细胞是自我更新的和可形成克隆的
组织样品用于c-kit阳性细胞的分离和体外增殖(n＝16)。在酶促消化和扩增未分级的细胞区室后，用识别c-kit受体的不同表位的两种单克隆抗体对细胞进行FACS分选。仅收集与两种抗体都反应的细胞以最小化非特异性结合(图10A)。从这些制品中获得平均0.4％的c-kit阳性细胞(图10B)。另外，将FACS分选的c-kit阳性和c-kit阴性部分的样品铺板并出于特异性用第三种c-kit-抗体进行染色(图11A)。
随后，将FACS分选的c-kit阳性细胞铺板以便进一步扩增(图10C)和记录细胞分裂的模式(n＝5)。将内吞蛋白α-衔接蛋白的双极定位用于阐明对称细胞分裂，而将α-衔接蛋白的单极分布用于记录不对称细胞分裂(Williams等人,2011)。在定量上，对称细胞分裂占优势(图10D)。
在P2-P4，将来自29个组织样品中的14个的c-kit阳性细胞进行FACS分选并单独接种在96孔板的单个孔中(图11B)。经3周的时间，获得多细胞克隆并确定克隆效率(图10E、图10F和图11C)。另外，扩增的c-kit阳性细胞对于造血细胞谱系CD34和CD45以及间充质基质细胞CD90的表位是阴性的。在大多数细胞中检测到CD105(图11D)。因此，人类胰腺拥有c-kit阳性细胞库，其是自我更新的和可形成克隆的，并且对称和不对称地分裂，是组织特异性成体干细胞的所有关键标识符。
单独hPSC的分子标签是异质的
为了确定克隆的hPSC是否拥有与已建立的胰腺祖细胞的未分化和多能状态一致的转录谱，采用qRT-PCR和NanoString技术。通过qRT-PCR测试从单独c-kit阳性细胞起源的单独克隆(n＝4)。另外，用地塞米松(10-8M)处理克隆的hPSC 7天以促进分化。
克隆的hPSC表达c-kit连同Pdx1、Sox9和Ngn3(图12A)，其是祖细胞命运的主要决定子(Arda等人,2013；Jennings等人,2015)。所有胰腺细胞均起源于Pdx1胚胎祖细胞(Murtaugh和Melton,2003)，其产生外分泌腺泡和导管细胞、以及朗格汉斯胰岛的4种内分泌细胞类型(Gu等人,2002)。转录因子Sox9在胚胎胰腺中鉴定有丝分裂活性的Pdx1阳性多能祖细胞的子集(Gradwohl等人,2000；Seymour,2014)。使用地塞米松，c-kit和Sox9mRNA显著下降；然而，Ngn3和Pdx1的表达没有变化(图12A)。因此，c-kit鉴定了可以包含其他类别的先前识别的胰腺祖细胞的hPSC区室。
通过采用Nanostring方案获得了克隆hPSC的mRNA谱分析(Manoranjan等人,2013)。该技术使用颜色编码的分子条形码和单分子成像使得能够对靶RNA分子进行数字量化。Nanostring系统拥有高水平的特异性和灵敏度，因此可以测量每个细胞一个转录物拷贝。基于管家基因的表达将通过Nanostring分析产生的原始数据归一化，并且将样品间基因的差异表达显示为热图。
在单细胞衍生的hPSC克隆(n＝3)中检查了一组195个干细胞相关的人类基因。在未处理的克隆细胞中和在暴露于分化诱导物地塞米松7天时间的克隆细胞中测量基因表达。在每个克隆中，将基因表达显示为相对于未用地塞米松处理的对应克隆细胞的百分比差异，并表示为热图。红色对应于在地塞米松的存在下培养的细胞中比在未处理的细胞中更高的基因表达水平。蓝色对应于在暴露于地塞米松的细胞中比在未处理的细胞中更低的基因表达水平。
三组克隆细胞显示出对三种信号传导途径的不同程度的激活或抑制：Wnt/β-连环蛋白途径、TGF-β/BMP途径和Notch途径，其对于干细胞维持和谱系确定是重要的。Wnt/β-连环蛋白途径是器官的内分泌区室和外分泌区室两者发育所必需的(Arda等人,2013)。在三组克隆细胞中差异调节Wnt/β-连环蛋白途径的基因(图12B)，表明暴露于地塞米松的克隆细胞之间存在一定程度的分子异质性。
TGF-β/BMP途径涉及β细胞形成，并且TGF-β的抑制促进β细胞的复制，然而，这可能是生理学功能障碍的(Brown和Schneyer,2010)。以类似于对Wnt/β-连环蛋白途径观察到的方式，在三个样品中TGF-β/BMP信号传导轴的基因转录物未同等调节(图12C)，进一步表明起源于单独hPSC复制的细胞簇对地塞米松的反应不同。
相反，在三组克隆细胞中类似地调节Notch途径的组分(图12D)。Notch激活维持胚胎胰腺祖细胞的未分化状态，从而抑制内分泌和外分泌细胞规格(Shih等人,2012)。Notch的下调和Hes1对Ngn3的抑制功能的消除是β细胞分化所必需的(Qu等人,2013)。Delta样配体1、Jagged2配体、Notch1受体、Notch2受体、Notch3受体和Notch4受体、转录因子RBPjk、锌指蛋白GLI2和GLI3、转录共激活因子MAML2和MAML3、以及细胞命运决定子Numb在3组克隆的hPSC中被地塞米松下调，这表明它们获得了β细胞谱系。
总的来说，Notch衰减可能有利于克隆的hPSC向内分泌细胞表型的分化，但是在基线和在地塞米松之后基因表达的克隆间变异强调了它们在单细胞水平上的功能异质性；这种现象对于所有类型的成体干细胞都是常见的(Goodell等人,2015)。
分化的hPSC表达C-肽、胰高血糖素、淀粉酶并合成人类胰岛素
上面讨论的分子测定定义了克隆的c-kit阳性hPSC在基线和在暴露于地塞米松后的mRNA谱。随后，该分析与对特异性细胞质蛋白的检测相补充，以增强这种新颖类别的组织特异性成体干细胞的多能性。将FACS分选的c-kit阳性hPSC(n＝4)扩增并然后在含有地塞米松的分化培养基中培养；一周后通过免疫标记和共聚焦显微镜检查细胞。
在所有病例中，c-kit在未分化的对照细胞中的表达明显。在地塞米松的存在下，胰岛素原C-肽的上调(图12E)很清楚；基于向培养基中添加葡萄糖，葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)方案导致通过高灵敏度ELISA测定法检测到的人类胰岛素的合成。此外，c-kit阳性hPSC获得了α细胞表型并显示在细胞质胰高血糖素内，或获得了显示淀粉酶的外分泌腺泡细胞的特性(图12F和图12G)。然而，地塞米松方案与c-kit表达的完全丧失不相关。因此，hPSC具有分化成特化胰腺细胞的能力，与其多能性一致。
hPSC植入和在免疫缺陷小鼠的胰腺中分化
为了测试单细胞衍生的克隆hPSC是否具有定殖胰腺的能力，在免疫受损的小鼠中使用冷冻损伤作为简化形式的损伤。此后不久，将PKH26阳性或GFP阳性细胞注射到死亡组织附近(n＝6)。1-8天后检查细胞处理的器官的组织切片。选择该时间间隔是因为在其他系统中，干细胞归巢在约24小时内发生并且谱系规格在几天内是清楚的(Quesenberry等人,2005；Rota等人,2007)。在保存的完整组织中检测到几个单独的标记的hPSC和小的标记的hPSC群体(图13A、图13B和图14A)，同时在损伤区域内鉴定出较大的标记的hPSC库(图13C)，这表明hPSC能够迁移并归巢到胰腺的非病理部分和病理部分。
通过注射细胞的命运获得来记录所给予的hPSC在受体小鼠器官内的整合和潜在功能。单个的植入hPSC、小的和大的植入hPSC簇获得了β细胞表型并表达胰岛素或C-肽(图13D-图13F和图14B)。另外，对C-肽或胰岛素呈阳性的单独β细胞散布在整个组织中(图15)。还观察到形成淀粉酶的外分泌腺泡细胞的产生(图13G)。在所检查的所有6只动物中，保留其原始未分化状态的克隆的hPSC分布在器官的多个部位(未显示)。因此，在体外增殖的hPSC保留其可塑性并且可以在体内归巢于胰腺的保存部分和损伤部分，这一发现与未来在人类的1型和2型糖尿病中实现干细胞疗法高度相关。
c-kit阳性胰腺细胞的命运映射记录它们的多能性
对多能hPSC的识别与以下一般解释相反：特化胰腺细胞起源于先前存在的有丝分裂后细胞的自我复制，其去分化、重新进入细胞周期并分裂(Dor等人,2004)。先前已经提出了常驻干细胞区室调节成体器官的内分泌和外分泌细胞的稳态的可能性(Jiang和Morahan,2012；Xu等人,2008)。
虽然已经提出了表明对c-kit呈阳性的导管细胞和分化的胰岛细胞在实验性胰腺病理学中的潜在作用的信息，但是这些研究中没有一个显示这些定型细胞的干细胞特性(Feng等人,2015)。大鼠中胰腺导管的结扎与导管细胞和胰岛细胞中c-kit的上调相关，表明它们参与细胞新生(Peters等人,2005)。在链脲佐菌素诱导的糖尿病后(Tiemann等人,2007)和在大鼠胰腺炎模型中(Gong等人,2012)进行了类似的观察。基于上述数据和大鼠中的这些发现，人类胰腺中的结果已经与小鼠中的谱系追踪研究相补充。该方案代表了一种有可能揭示祖细胞与其后代之间的关系的强大的工具(Kretzschmar和Watt,2012)。
首先在转基因小鼠模型中确定胰腺细胞的起源，其中将他莫昔芬诱导的mer-Cre-mer蛋白靶向Kit基因座(van Berlo等人,2014)。将这些小鼠与R-GFP报告系杂交以使在他莫昔芬给予时表达c-kit的任何细胞不可逆地标记上GFP，即Kit+/MCMx R-GFP小鼠。c-kit阳性细胞的后代可以通过荧光标签的存在来识别，该荧光标签在随着细胞分化丧失c-kit表达之后持续存在于细胞质中。
通过这种遗传策略，已经发现在他莫昔芬治疗6-8个月(n＝5)后，外分泌腺泡细胞对GFP呈强阳性(图16A)。此外，在朗格汉斯胰岛内一致地发现GFP标记的β细胞(图16A和图16B)。然后引入第二报告小鼠mT/mG(Muzumdar等人,2007)。在这种双色Cre报告小鼠中，膜靶向的tdTomato(mT)在Cre介导的重组之前表达；只有在终止密码子切除之后，膜限制性绿色荧光蛋白(mG)才变得清楚。将这些mT/mG小鼠与Kit+/MCM动物杂交以产生Kit+/MCMx mT/mG小鼠。每天腹膜内注射他莫昔芬持续5天，并且在10天后处死(n＝6)。引入该方案是为了补充Kit+/MCMx R-GFP小鼠中对他莫昔芬的显著更长时间的暴露。胰腺区域被GFP标记；GFP是清楚的并且限于淀粉酶阳性的外分泌细胞和胰岛素阳性的内分泌β细胞的表面(图16C和图17)。
在严格调节的基因座如c-kit基因中插入复合构建体可以影响Cre重组酶的表达。在Kit+/MCMx R-GFP小鼠中的mer-Cre-mer构建体非常接近这些调节性内含子序列之一(Cairns等人,2003；Nadal-Ginard等人,2014)，并且这可能会影响Cre重组酶。由于这种潜在的限制，测试了第二个命运映射模型KitCreERT2/+小鼠(Goss等人,2016；Hatzistergos等人,2015)，其中靶向了c-kit启动子的不同区域。将Cre-ERT2构建体插入c-kit的第一个外显子中而不影响邻近的内含子区域(Goss等人,2016；Hatzistergos等人,2015)。将这些小鼠与双色IRG报告系杂交，使得在不存在Cre介导的重组的情况下，天然红色荧光蛋白(DsRed)在所有器官中表达。随着他莫昔芬给予和Cre介导的重组，c-kit阳性细胞及其后代不可逆地标记上GFP。在他莫昔芬处理2-3个月(n＝4)后，大的小鼠胰腺区域对GFP、淀粉酶和胰岛素呈阳性(图18A和图18B)，表明这些特化细胞起源于c-kit阳性细胞。因此，转基因小鼠中的这些结果证实了人类数据，强化了c-kit阳性hPSC是多能的并且可以在生理上调节器官稳态的观点。
天然GFP与谱系特异性胰腺细胞蛋白共表达
需要记录不同的细胞内蛋白质来鉴定不同的胰腺细胞类型并识别特化的内分泌和外分泌细胞是否起源于c-kit阳性细胞。该信息可以在解剖器官、酶消化组织、以及用特异性抗体固定和免疫标记分离的细胞后获得。将KitCreERT2/+x IRG小鼠每隔一周暴露于他莫昔芬，持续6周的时间，并且新鲜分离的胰腺显示多个组织区域被天然的GFP荧光标记(图19A)。最初，进行实验以确定天然GFP的存在是否受细胞固定和透化作用的影响。无论是未经处理的还是固定的和透化的，在对天然的GFP呈阳性的胰腺细胞库中都没有发现差异。在两种情况下，近8％-9％的胰腺细胞表达报告基因(图19B)。
基于该结果，考虑了三种细胞内蛋白质，即胰岛素(n＝5)、C-肽(n＝2)和胰高血糖素(n＝2)。在分离的胰腺细胞的整个区室内，表达天然的GFP的胰岛素阳性细胞、C-肽阳性细胞和胰高血糖素阳性细胞的百分比分别包含6％、20％和14％(图19C)。表达GFP的非内分泌细胞的显著分数可能主要反映合成淀粉酶的大的外分泌细胞库。随后，测量了在这三种细胞类别中的每一种内被天然的GFP标记的胰岛素阳性细胞、C-肽阳性细胞和胰高血糖素阳性细胞的频率。对胰岛素、C-肽和胰高血糖素呈双阳性的细胞的分数分别是16％、23％和24％(图19D)。因此，对人类胰腺中的c-kit阳性细胞在体外是自我更新的、可形成克隆的和多能的并且小鼠c-kit阳性细胞在体内分化成β细胞、α-细胞和外分泌腺泡细胞的认识增强了哺乳动物胰腺受一类常驻干细胞调节的观念。
本公开文本预期具有重大临床意义的胰腺生物学范例的转变。这里通过c-kit受体的表达鉴定的hPSC涉及β-细胞的生长和胰岛素的合成、α-细胞的生长和胰高血糖素的产生、以及腺泡细胞的生长和淀粉酶的形成。结合命运映射策略进行了一系列的体外和体内测定，以提供有力的证据支持作为真正的组织特异性成体干细胞的c-kit阳性细胞的识别和功能作用。因此，人类胰腺受常驻干细胞区室调节，该常驻干细胞区室将其定义为类似于骨髓、皮肤、肠、肺和心脏的自我更新器官。
多年来，已经进行努力来了解导致β细胞更新的生物学过程。已经提出自我复制作为负责在生理学和病理学上扩增β-细胞区室的过程(Dor等人,2004)。在这方面，在从3至12个月龄的小鼠中已经报道了β细胞数量的六倍增加(Dor等人,2004)。然而，在成年人类胰腺中β细胞的产生明显非常有限(Perl等人,2010)，并且自我复制是否实际发生是可商榷的；很难想象具有明确定义的功能的高度特化的细胞如何能够复制DNA并进行分裂。该过程将涉及获得祖细胞样表型的有丝分裂后β细胞的去分化，重新进入细胞周期并增殖(Dor和Glaser,2013；Weinberg等人,2007)。不幸的是，没有形态标准能够定义体内细胞的去分化(Leri等人,2015)，向这种新β细胞的潜在来源发起挑战。类似地，对于获得合成和分泌胰岛素的能力的预先存在的外分泌细胞的转分化或重新编程是有争议的(Gomez等人,2015；Lemper等人,2015)。本公开文本中表征的hPSC为理解肥胖、妊娠和在部分胰腺切除术后β细胞的生长适应提供了有效的生物学基础。
为了证明或反驳干细胞控制成人胰腺中β细胞形成，需要对单个创始细胞进行克隆测定；干细胞是特征在于自我更新和分化的双重能力的单独细胞实体(Hsu和Fuchs,2012；Leri和Anversa,2016)。基于细胞群体的研究不足以在克隆性、自我更新和多能性方面定义干细胞行为。这种限制在谱系追踪研究中是清楚的，其中特异性启动子驱动的报告基因被先验地选择，引入了人工区室化因子(Leri和Anversa,2016)；例如，胰岛素启动子的使用将仅靶向注定要变成β细胞的细胞类别(Dor等人,2004；Xiao等人,2013)，该细胞类别在未分化的谱系阴性干细胞的远侧。此外，胰岛素阳性细胞群体是高度异质的，包括最终分化的细胞和具有祖细胞/前体的中间未成熟表型的细胞。为了避免这些混杂变量，干细胞抗原c-kit的启动子被靶向这里使用的转基因小鼠中(Hatzistergos等人,2015；van Berlo等人,2014)。
在最初开发用于确定c-kit受体在心脏、肠和肥大细胞中的作用的这两只转基因小鼠中观察到胰腺的外分泌和内分泌区室中GFP标记的不同强度和分布(Hatzistergos等人,2015；Heger等人,2014；Klein等人,2013；van Berlo等人,2014)。然而，在内分泌和外分泌腺泡细胞中的GFP信号在Kit+/MCMx R-GFP小鼠中比在KitCreERT2/+x IRG小鼠中更强且更弥散。此外，在KitCreERT2/+x IRG小鼠中，GFP标记在外分泌腺泡细胞中比在内分泌细胞中更清楚。报告蛋白表达的这种变异性可能不容易被解释。
用于产生这些遗传模型的敲入构建体(Hatzistergos等人,2015；van Berlo等人,2014)导致c-kit等位基因之一缺失。PSC中c-kit表达的减少可能对组织的外分泌组分比对组织的内分泌组分具有更多影响，导致比腺泡细胞较不强烈标记的GFP阳性β细胞。在心脏中已经观察到类似现象，其中已发现GFP在内皮细胞中比在心肌细胞中更突出(van Berlo等人,2014)，或在心肌细胞中比在血管细胞中更多(Hatzistergos等人,2015)。在敲入小鼠中c-kit基因座的破坏促进了与在c-kit突变小鼠中观察到的相似的表型改变(Geissler等人,1988)。事实上，所有小鼠都显示具有白色的腹部斑点，并且严重的睾丸萎缩(图20A-图20B)，两者均指示由于在c-kit基因座处的Cre敲入引起的c-kit功能的改变(Hatzistergos等人,2015；Nadal-Ginard等人,2014)。c-kit在胰腺的稳态控制中的关键作用与一些c-kit突变小鼠中存在的异常一致，在该c-kit突变小鼠中受体酪氨酸激酶活性的部分丧失伴有胰岛素分泌缺陷、β细胞团减少、衰减的β细胞增殖和糖尿病表型的表现(Krishnamurthy等人,2007)。
hPSC在成体器官中的分子标识(molecular identity)模拟胚胎胰腺祖细胞在其向功能性内分泌和外分泌细胞过渡期间的分子标识。胚胎祖细胞的基因调节网络涉及转录因子的顺序激活和抑制，典型地发现于具有越来越受限的发育选择的前体细胞中。已发现c-kit的表达与鉴定多能祖细胞的两种转录因子Pdx1和Sox9相关(Seymour,2014)。此外，内分泌和外分泌命运决定子Pdx1、Sox9和Ngn3对于在c-kit阳性hPSC中表达做好了准备，提供了有利于其可塑性和多能性的重要证据。
通过qRT-PCR和NanoString定义的克隆c-kit阳性hPSC的转录谱与对胰腺特化细胞典型的蛋白质表达的评价相补充。在分化的hPSC中检测C-肽、胰岛素、胰高血糖素和淀粉酶提供了相当有力的证据证明c-kit识别调节胰腺细胞的更新并且可能促成损伤后的组织修复的常驻原始细胞区室。
最近重新讨论了具有β细胞特性的细胞不享有功能同一性的旧概念(Dorrell等人,2016)。已经在人类胰岛中发现了四种具有不同基因表达谱和对葡萄糖响应的抗原性不同的β细胞亚群(Bonner-Weir和Aguayo-Mazzucato,2016；Dorrell等人,2016)。每个细胞亚群对整个β细胞区室的贡献在健康的人类胰岛中保持不变，但随着糖尿病的发生而高度变化，导致对葡萄糖刺激不太敏感的β细胞比例增加(Dorrell等人,2016)。对β细胞动力学的体内分析揭示，受限制的β细胞库在妊娠期间活跃增殖，导致成熟的β细胞团增加(Bader等人,2016)。功能上不同的β细胞是否对应于独立的细胞谱系或构成相互依赖的实体仍然有待定义(Bonner-Weir和Aguayo-Mazzucato,2016)。增殖和有丝分裂后β细胞的共存表明，胰腺可能是一个分层结构的系统(Smukler等人,2011)，其中分化的干细胞逐渐获得定型状态并经历成熟以扩增分裂细胞，其最后实现最终分化和生长停滞。
人类中1型糖尿病的不利进化与β细胞的进行性丧失相关，而适度的残留胰岛素分泌提供了临床益处，包括改善的血糖控制和系统性并发症的减少(Oram等人,2014；Sherr等人,2014)。重要的是，在具有50年或更长的1型糖尿病病史的大的患者群组中已经记录了持续的胰岛素产生和分泌(Keenan等人,2010)。已经从最初参加Joslin Medalist研究的9名糖尿病受试者中在死后收集的所有胰腺样品中在组织学上鉴定了完整的非凋亡β细胞(Keenan等人,2010)。尽管糖尿病具有长期的负面影响，但是仍保持一些β细胞功能，这表明在疾病进化期间，hPSC库可能参与补充β细胞。
在2型糖尿病中发现了在β细胞恶化与外周血管病变、神经病变、肾病和心肌病的严重性之间的类似相关性(Boudina和Abel,2007；Wajchenberg,2007；Yagihashi等人,2016)。C-肽循环水平的降低与血管缺损程度成正比，伴随内皮依赖性血管舒张丧失(Hadi和Suwaidi,2007)。相反，更有效的胰岛素分泌趋向于保持代谢控制并减弱慢性并发症(Saisho,2014)。这些临床发现强调了恢复2型糖尿病的β细胞团和功能的相关性。
总之，人类胰腺拥有一个常驻干细胞区室，该常驻干细胞在体外和(同样重要的)在体内分化成合成胰岛素的β细胞。尽管存在1型和2型糖尿病，但是完整的hPSC库可以在器官内持续存在，并且可以收集活组织检查样品用于干细胞分离和扩增。体外增殖的hPSC可以被递送回患者，并且如这里实验所证明的，可以植入并获得β细胞表型，从而重构干细胞区室和β细胞团；干细胞疗法可以纠正糖尿病状态并干扰其系统性后果。
人类胰腺样品
在该研究中包括29个在外科手术中丢弃的正常出现组织的样本。样品被分成两部分。将一部分固定在10％福尔马林中并包埋在石蜡中以获得厚度为4-6μm的切片，用于免疫标记和共聚焦显微镜检查。将新鲜组织的另一部分在PBS中洗涤并切碎成小块用于随后的消化。在一些情况下，将一部分样品冷冻。
人类胰腺的免疫标记和共聚焦显微镜检查
将来自胰腺样品的组织切片用兔多克隆抗人c-kit(1:100；Dako)和小鼠单克隆抗人类胰蛋白酶(1:100；Abcam)或山羊多克隆抗人类胰蛋白酶(1:100；R&D)在4℃下标记过夜，以将推定的人胰腺干细胞(hPSC)与肥大细胞区分开(Sanada等人,2014)。细胞核被DAPI(西格玛公司)染色。在6个随机选择的样品(n＝6)中定量测量c-kit阳性细胞的数量、以及c-kit阳性类胰蛋白酶阴性推定的hPSC和c-kit阳性类胰蛋白酶阳性肥大细胞的数量(Anversa和Olivetti,2002；Sanada等人,2014)。通过在组织切片中评估与三种细胞类别中的每一种相关的细胞核的数量、连同存在于其他胰腺细胞群体中的细胞核的数量来收集这些参数。通过用小鼠单克隆抗人C-肽(1:100；Abcam)、小鼠单克隆或豚鼠多克隆抗人胰岛素(1:100；Abcam)、小鼠单克隆抗人胰高血糖素(1:100；Abcam)、小鼠单克隆或兔单克隆抗人淀粉酶(1:100；Santa Cruz或Cell Signaling)和小鼠单克隆抗人细胞角蛋白-19(1:100；Dako)共标记来确定推定的hPSC的谱系定型。在所有情况下，孵育时间在37℃下为1小时。采用携带荧光蛋白的第二抗体。用Olympus FV1000共聚焦激光扫描显微镜收集图像。在图像采集期间，所有参数的设置保持恒定。
在体外分离和扩增胰腺细胞
在37℃下在含有25μg/ml释放酶TL(Roche)和0.02％DNA酶I(西格玛公司)的哈氏F12培养基(Ham’s F12medium)(Lonza)中酶促解离组织片段。然后将分离的未分级的细胞在含有胎牛血清(FBS)的培养基中洗涤，并随后铺板在层粘连蛋白包被的培养皿(Invitrogen)上。在补充有10％FBS(HyClone)、5mU/ml重组人类促红细胞生成素(西格玛公司)、10ng/ml重组人类成纤维细胞生长因子-碱性(FGF-B)(Peprotech)、1％青霉素-链霉素(西格玛公司)和0.2mM L-谷胱甘肽(西格玛公司)的哈氏F12培养基中培养细胞(Beltrami等人,2003；Bearzi等人,2007)。每2-3天更换一次生长培养基。在约80％汇合时，将细胞使用蕲蛇酶(Acutase)(Innovative Cell Technologies)解离并传代。将该方案应用于16个样品(n＝16)。
人类胰腺细胞的流式细胞术和分选
将扩增的胰腺细胞进行免疫标记并针对c-kit进行分选。为了增强该过程的特异性并避免非特异性结合，使用了识别c-kit受体(CD117)的两个不同表位的两种抗体：APC缀合的小鼠抗人CD117(1:100；BD-Biosciences)和PE缀合的小鼠抗人CD117(1:100；MiltenyiBiotec)。使用针对两种抗体的APC缀合的和PE缀合的小鼠IgG同种型对照(1:100)(Liu等人,2015)。标记反应在4℃下进行。增加用DAPI染色以从分析中排除死亡细胞。仅对两个c-kit表位都呈阳性的细胞进行分选(BD FACSAria II；BD-Biosciences)，铺板并在1-3天后进行研究。对于分选和铺板细胞的免疫标记，使用了第三种c-kit抗体(1:100；Dako)。
对称和不对称细胞分裂
针对c-kit(参见上文)和α-衔接蛋白，通过标记分选和铺板的细胞来确定细胞分裂的形式(n＝5)。对于α-衔接蛋白，使用小鼠单克隆抗人(1:100；Santa Cruz)(Ferreira-Martins等人,2012)；反应在37℃下进行1小时。细胞核被DAPI染色。α-衔接蛋白的均匀和非均匀定位与c-kit一起评价，以分别区分对称和不对称干细胞分裂。
克隆测定
将来自14名患者的FACS分选的c-kit阳性细胞单独接种在96孔板的单个孔中(n＝14)。经2-3周的时间，获得多细胞克隆(Bearzi等人,2007；Beltrami等人,2003；Liu等人,2015)。通过用相位差显微镜鉴定细胞簇的存在并随后固定和用溶解在乙醇中的5％亚甲蓝(西格玛公司)染色来测量克隆效率。将克隆细胞扩增并用于分子测定，包括qRT-PCR和Nanostring方法。
定量RT-PCR
用TRIzol从克隆的hPSC制品(n＝4)提取总RNA，用于检测c-kit、Pdx1、Sox9、Ngn3和Nkx6.1的转录物。从在37℃下与寡聚(dT)15引物一起孵育2小时的1μg总RNA生成cDNA，并然后以1:10稀释。使用每个反应的1/200的cDNA在StepOnePlus实时PCR系统(Real TimePCR Systems)(Applied Biosystems)上进行RT-PCR。循环条件如下：95℃持续10分钟，随后35个循环的扩增(95℃变性持续15秒，和60℃组合退火/延伸持续1分钟)。将人类特异性引物(参见下文)从NIH引物数据库qPrimerDepot下载或用Vector NTI软件(Invitrogen)设计。将定量值针对管家基因β2微球蛋白确定的输入归一化。PCR产物在2％琼脂糖/1x TBE凝胶上运行，并且获得了具有预期分子大小的DNA条带。
Nanostring方案
在hPSC克隆中评价了一组194个干细胞相关基因的表达(n＝3)。分析在不存在或存在10-8M地塞米松(西格玛公司)的情况下培养一周时间的细胞。所有与mRNA定量相关的程序(包括样品制备、杂交、检测和扫描)均按照NanoString Technologies推荐的进行(Geiss等人,2008；Talhouk等人,2016；Veldman-Jones等人,2015)。
简言之，根据制造商的说明，使用Trizol方法(Invitrogen)从hPSC中提取总RNA。使用Nanodrop 1000仪器(赛默飞世尔科学公司(ThermoFisher Scientific))测量RNA浓度。在NanoString Technologies设计和合成在nCounter干细胞代码集(Stem CellCodeset)中包含的每个基因的探针组。出于归一化目的，将内部参考基因和三个管家基因(ACTB、GAPDH和LDHA)包括在代码集中。该代码集包含3'生物素化的捕获探针、标记有荧光条形码的5'报告探针和针对194个转录物中的每一个的两序列特异性探针。将探针在65℃下与100ng总RNA杂交16小时，其后除去过量的捕获探针和报告探针，并将转录物特异性三元复合物固定在链霉亲和素包被的筒上。
使用nCounter数字分析仪进行数据收集，以计数单独的荧光条形码并定量每个样品中存在的靶RNA分子。使用针对阳性对照探针获得的计数对每个实验内的每个基因的原始NanoString计数进行技术归一化。随后，使用在组中包括的三个管家基因进行生物学归一化。将归一化数据进行log2变换。具有比平均背景±2标准偏差低的所有mRNA被认为低于检测极限。将配对t检验用于鉴定在未处理的克隆hPSC和对应的地塞米松处理的克隆hPSC中的差异表达基因。将结果表示为相对于未处理的克隆hPSC的百分比差异，并表示为热图。
c-kit阳性细胞的分化
将来自不同制品的c-kit阳性细胞用10-8M地塞米松(西格玛公司)处理一周，以诱导谱系定型(n＝4)。然后用4％多聚甲醛固定细胞，在10％驴血清中封闭，并且针对c-kit和C-肽、淀粉酶或胰高血糖素共染色。实施以下实验条件：浓度为1:100的兔多克隆抗人c-kit(Dako)，在4℃下过夜；浓度为1:100的小鼠单克隆抗人C-肽(Abcam)，在37℃下持续1小时；浓度为1:100的小鼠单克隆抗人胰高血糖素(Abcam)，在37℃下持续1小时；和浓度为1:100的小鼠单克隆抗人淀粉酶(Santa Cruz)，在37℃下持续1小时。通过共聚焦显微镜确定c-kit和谱系标志物的表达。
葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)
用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤在单独孔中培养的克隆c-kit阳性hPSC，并然后在含有0.1％BSA和2.8-3.3mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液(KRB)中在37℃下饥饿1小时。对于葡萄糖刺激，将细胞转移至补充有0.1％BSA和16.7mM葡萄糖的新鲜KRB中在37℃下持续1小时。然后将细胞用PBS洗涤并用500μl酸-乙醇处理。从孔中刮下细胞，将其收集在Eppendorf管中并超声处理1分钟。将细胞在4℃下保持过夜以完成裂解过程。将裂解物在4℃下以7000rpm离心10分钟，并通过高灵敏度人类胰岛素特异性ELISA测定法分析上清液。将沉淀物用SpeedVac(Thermo Scientifics)进一步浓缩并重悬以收集DNA。通过Nanodrop测量DNA浓度。将胰岛素值针对DNA含量进行归一化(Dirice等人,2014)。
胰腺损伤
按照国家研究委员会(National Research Council)生命科学委员会(Commission on Life Sciences)实验动物研究资源研究所(Institute of LaboratoryAnimal Research Resources)描述的实验动物护理和使用指南(Guide for the Care andUse of Laboratory Animals)使动物接受了人道护理。在异氟醚(1.5％)麻醉下，打开NOD-Scid小鼠(n＝6)的腹部并使用在液氮中预先冷却的不锈钢探针在胰腺中诱导体积为约2-3mm3的冷冻损伤。通过受累及组织的苍白颜色鉴定损伤区域。此后不久，在与受损实质相邻的区域中给予用携带GFP的慢病毒感染(Hosoda等人,2009)或用PKH26染料标记(Liu等人,2015)的克隆hPSC的3-4次注射。注射的克隆hPSC最多为200,000个。通过过剂量的异氟醚使动物安乐死并在1-8天后解剖心脏。将胰腺用10％磷酸盐缓冲的福尔马林固定并包埋在石蜡中。
谱系追踪
研究了两种不同的c-kit敲入小鼠系：Kit+/MCM和KitCreERT2/+小鼠(Hatzistergos等人,2015；Goss等人,2016；van Berlo等人,2014)。将Kit+/MCM小鼠繁殖成LoxP位点依赖性Rosa26-CAG-loxP-STOP-loxP-eGFP(R-GFP)报告小鼠，以使在他莫昔芬给予时表达c-kit的任何细胞不可逆地标记上GFP(van Berlo等人,2014)。
用200-400mg/kg他莫昔芬喂养Kit+/MCMx R-GFP小鼠6-8个月的时间(n＝5)。将野生型小鼠和未暴露于他莫昔芬的小鼠用作对照(n＝2)。另外，引入第二种报告小鼠mT/mG(Muzumdar等人,2007)。在这种双荧光Cre报告小鼠中，膜靶向的串联二聚体番茄色(mT)在Cre介导的重组之前表达，而膜靶向的绿色荧光蛋白(mG)在终止密码子切除后表达，即Kit+/MCMx mT/mG。Kit+/MCMx mT/mG小鼠(n＝6)；每天给这些小鼠腹膜内注射他莫昔芬(2mg/kg体重)持续5天，并在10天后将这些小鼠处死。
为了证实用Kit+/MCM小鼠获得的结果，我们研究了另一种其中靶向c-kit启动子的不同区域的c-kit敲入小鼠，即KitCreERT2小鼠系。将KitCreERT2/+小鼠与双色IRG报告系杂交(De Gasperis等人,2008；Goss等人,2016；Hatzistergos等人,2015)，使得在不存在Cre介导的重组的情况下，天然红色荧光蛋白(DsRed)在所有器官中表达。将KitCreERT2/+x IRG小鼠用他莫昔芬(400mg/kg)处理2-3个月(n＝3)。将Kit+/MCMx R-GFP、Kit+/MCMx mT/mG、和KitCreERT2/+x IRG小鼠用于组织学和免疫标记以及共聚焦显微镜检查。为了通过流式细胞术分析胰腺细胞(Liu等人,2015；Sanada等人,2014)，在细胞分离和表征之前，每隔一周给KitCreERT2/+x IRG小鼠喂食他莫昔芬(200mg/kg)持续6周的时间；对于胰岛素n＝5，并且对于C-肽和胰高血糖素n＝2。
小鼠胰腺的免疫标记和共聚焦显微镜检查
在去石蜡化和再水化之后，用10％正常驴血清(Jackson Immuno Research)在PBS中封闭组织切片30分钟，并与山羊多克隆抗GFP(1:40；Molecular Probes)在4℃下孵育过夜或在37℃下孵育2小时。将在PBS中以1:100稀释的小鼠单克隆抗胰岛素(Abcam)或豚鼠抗胰岛素(Abcam)、和兔单克隆抗淀粉酶(Cell Signaling)分别用于标记β细胞和腺泡细胞。用PBS洗涤之后，将组织切片在37℃下暴露于在PBS中以1:100稀释的FITC-或TRITC-缀合的第二抗体(Jackson Immuno Research)持续1小时。为了避免石蜡包埋的福尔马林固定的组织切片的自发荧光，将载玻片用1％苏丹黑(Sudan Black)在70％乙醇中处理30分钟。用Vectashield坚硬封固剂(Vector Labs)固定切片。用Olympus FV1000和Nikon C2plus共聚焦激光扫描显微镜获得图像。在图像采集期间，所有参数的设置保持恒定。
小鼠胰腺细胞的流式细胞术
拍摄新鲜解剖的胰腺，并且如上文针对人类样品所述将组织酶促解离以获得胰腺细胞。最初，确定表达天然GFP荧光的活的未固定的胰腺细胞的百分比，连同免疫标记的固定的GFP阳性细胞的分数(FITC-缀合的兔多克隆抗-GFP；1:100)。在后一种情况下，将细胞在PBS中洗涤并在室温下用含有2％甲醛的固定缓冲液(eBioscience)固定30分钟。然后用透化缓冲液(eBioscience)使细胞透化并用驴血清封闭。为了表征β细胞和α细胞，将细胞悬浮液与大鼠IgG2b抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体(BD Bioscience)在室温下预孵育15分钟，之后用特异性抗体或同种型匹配的对照抗体染色。将细胞与第一抗体在室温下孵育30分钟：兔多克隆抗GFP(1:100；Invitrogen)、豚鼠多克隆抗胰岛素(1:200；Abcam)、小鼠单克隆抗C-肽(1:200；Abcam)和小鼠单克隆抗胰高血糖素(1:200；Abcam)。将染色的细胞用PBS洗涤，暴露于与Alexa Fluor 488(GFP)或与Alexa Fluor 647(谱系标志物)缀合的第二抗体，并使用BD FACS Canto II进行分析。收集至少10,000个事件，并且使用FlowJo软件分析数据(Liu等人,2015；Sanada等人,2014)。
统计分析
将数据显示为平均值±SD。通过学生t检验评价统计学差异；p<0.05被认为是显著的(McDonald,2014)。
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序列表
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Anversa, Piero
<120> 胰腺干细胞及其用途
<130> AALS-005_02WO
<150> US 62/305,736
<151> 2016-03-09
<150> US 62/457,710
<151> 2017-02-10
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增c-kit的正向引物
<400> 1
gcacctgctg aaatgtatga cataat 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增c-kit的反向引物
<400> 2
ctgcagtttg ctaagttgga gtaaat 26
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增Pdx1的正向引物
<400> 3
cagtgggcag gcggc 15
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增Pdx1的反向引物
<400> 4
cggccgtgag atgtacttgt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增Sox9的正向引物
<400> 5
gctctggaga cttctgaacg a 21
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增Sox9的反向引物
<400> 6
tggcctcctc tgcctcc 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增Ngn3的正向引物
<400> 7
ttttctcctt tggggctggg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增Ngn3的反向引物
<400> 8
aggcgtcatc ctttctaccg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增Nkx6.1的正向引物
<400> 9
agggctcgtt tggcctattc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增Nkx6.1的反向引物
<400> 10
cgtcgtcctc ttcctcgttc 20
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增B2M的正向引物
<400> 11
caaggactgg tctttctatc tcttg 25
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于扩增B2M的反向引物
<400> 12
attcatccaa tccaaatgcg 20

Claims (52)

1.一种治疗或预防有需要的受试者中的胰腺疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者给予分离的胰腺干细胞，其中该胰腺干细胞是从胰腺组织样本中分离的并且是c-kit阳性的。
2.权利要求1的方法，其中该胰腺干细胞是成体胰腺干细胞。
3.权利要求1的方法，其中该胰腺干细胞产生胰腺的β细胞。
4.权利要求1的方法，其中该胰腺干细胞的特征在于它们分化成内分泌细胞和/或外分泌细胞的能力。
5.权利要求1的方法，其中该胰腺疾病或障碍是1型糖尿病。
6.权利要求1的方法，其中该胰腺疾病或障碍是2型糖尿病。
7.权利要求1的方法，其中将所述分离的胰腺干细胞在给予至该受试者之前在培养物中扩增。
8.权利要求1的方法，其中将该分离的胰腺干细胞在给予至该受试者之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。
9.权利要求1的方法，其中将该分离的胰腺干细胞在给予至该受试者之前暴露于干细胞因子(SCF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、和/或肝细胞生长因子(HGF)。
10.权利要求1的方法，其中该胰腺组织样本是从该受试者获得的。
11.权利要求1的方法，其中将该分离的胰腺干细胞通过血管、胰腺导管给予至该受试者或直接给予至该组织。
12.权利要求1的方法，其中将该分离的胰腺干细胞通过注射或通过导管系统给予至该受试者。
13.权利要求1的方法，其中该分离的胰腺干细胞是未分化的或表达最低水平的胰岛素和/或C-肽。
14.一种包含治疗有效量的分离的胰腺干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于修复和/或再生胰腺的受损组织，其中所述分离的胰腺干细胞是c-kit阳性的。
15.权利要求14的药物组合物，其中该胰腺干细胞是成体胰腺干细胞。
16.权利要求14的药物组合物，其中该分离的胰腺干细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。
17.权利要求14的药物组合物，其中该胰腺干细胞是从胰腺组织中分离的。
18.权利要求14的药物组合物，其中该分离的胰腺干细胞是人类细胞。
19.权利要求14的药物组合物，其中该分离的胰腺干细胞是自体的。
20.权利要求14的药物组合物，其中该分离的胰腺干细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。
21.权利要求20的药物组合物，其中该一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。
22.权利要求20的药物组合物，其中该一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。
23.权利要求22的药物组合物，其中该内分泌细胞是α细胞或β细胞。
24.权利要求14的药物组合物，其中该分离的胰腺干细胞是未分化的或表达最低水平的胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
25.权利要求14的药物组合物，其中该组合物包含约106个分离的胰腺干细胞。
26.权利要求14的药物组合物，其中将该分离的胰腺干细胞在体外培养和扩增。
27.权利要求14的药物组合物，其进一步包含一种或多种细胞因子和/或生长因子。
28.权利要求14的药物组合物，其进一步包含干细胞因子(SCF)、IGF-1和/或HGF。
29.权利要求14的药物组合物，其中该组合物被配制成用于导管介导的注射或直接注射。
30.一种从胰腺中分离常驻胰腺干细胞的方法，该方法包括：
(a)在培养物中培养来自所述胰腺的组织样本，从而形成组织外植体；
(b)从该培养的外植体中选择呈c-kit阳性的细胞，并且
(c)分离所述c-kit阳性细胞，其中所述分离的c-kit阳性细胞是常驻胰腺干细胞。
31.权利要求30的方法，其中所述分离的c-kit阳性细胞表达外分泌细胞和/或内分泌细胞的一种或多种标志物。
32.权利要求30的方法，其中该一种或多种标志物包括胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
33.权利要求30的方法，其中所述分离的c-kit阳性细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。
34.权利要求33的方法，其中该一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。
35.权利要求33的方法，其中该一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。
36.权利要求35的方法，其中该内分泌细胞是α细胞或β细胞。
37.权利要求30的方法，其进一步包括在培养物中扩增所述分离的c-kit阳性细胞。
38.权利要求30的方法，其中所述分离的c-kit阳性细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。
39.权利要求30的方法，其进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。
40.权利要求30的方法，其进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于干细胞因子(SCF)、IGF-1和/或HGF。
41.一种修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法，该方法包括：从胰腺中提取胰腺干细胞；培养和扩增所述胰腺干细胞，所述胰腺干细胞是c-kit阳性干细胞；并且将一个剂量的所述提取和扩增的胰腺干细胞给予至该受试者中的受损组织区域，该剂量可有效修复和/或再生该胰腺的该受损组织。
42.权利要求41的方法，其中该提取和扩增的c-kit阳性干细胞表达外分泌细胞和/或内分泌细胞的一种或多种标志物。
43.权利要求42的方法，其中该一种或多种标志物包括胰岛素、C-肽、胰高血糖素、CK19和/或淀粉酶。
44.权利要求41的方法，其中该提取和扩增的c-kit阳性干细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。
45.权利要求44的方法，其中该一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。
46.权利要求44的方法，其中该一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。
47.权利要求46的方法，其中该内分泌细胞是α细胞或β细胞。
48.权利要求41的方法，其中将该提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至该受损组织之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。
49.权利要求41的方法，其中将该提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至该受损组织之前暴露于干细胞因子(SCF)、IGF-1和/或HGF。
50.权利要求41的方法，其中将该提取和扩增的c-kit阳性干细胞通过导管介导的注射或直接注射给予。
51.权利要求41的方法，其中该胰腺干细胞是自体的。
52.权利要求41的方法，其中该胰腺干细胞是同种异体的。
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