JP5622390B2 - 癌治療用対ｅｐｈａ２アンタゴニスト抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、新規ネズミ抗Ｅｐｈモノクローナル抗体又はその断片、及びそのヒト化又は表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）バージョンを提供する。より具体的には、本発明は、ＥｐｈＡ受容体ファミリーと相互作用し、拮抗物質として作用する、新規モノクローナル抗体又はその断片、及びそのヒト化又は表面再構成バージョンに関する。より詳細には、本発明は、ＥｐｈＡ２受容体の細胞機能を阻害する抗ＥｐｈＡ２受容体抗体に関する。更により詳細には、本発明は、腫よう細胞の増殖及び生存に拮抗し、作動活性を欠く、抗ＥｐｈＡ２受容体抗体に関する。
本発明は、さらに、細胞結合剤と細胞毒性薬とを含む細胞傷害性抱合体、抱合体を含む治療用組成物、細胞増殖阻害及び疾患治療に抱合体を使用する方法、並びに細胞傷害性抱合体を含むキットも対象とする。特に、細胞結合剤は、受容体のＥｐｈＡファミリーを認識し、かつそれに結合する、モノクローナル抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片、及びそのヒト化又は表面再構成バージョンである。
受容体チロシンキナーゼは、正常な生理反応中の細胞増殖及び分化、並びに癌化及び腫よう進行において、多様な役割を果たす。Ｅｐｈ受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の独特のファミリーであり、ゲノム中最大であり、９種類の膜結合性エフリンリガンドと相互作用する少なくとも１６種類の受容体からなる（Ｐａｓｑｕａｌｅ， Ｅ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６：４６２−４７５）。Ｅｐｈ受容体は、配列相同性及び結合親和性に基づいて、２つのグループ、すなわちクラスＡとＢに更に分類することができる（Ｐａｓｑｕａｌｅ， Ｅ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６：４６２−４７５）。クラスＡ Ｅｐｈ受容体は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に結合した膜タンパク質の一グループであるエフリンＡファミリーの複数のリガンドと相互作用し、クラスＢ Ｅｐｈ受容体は、膜貫通タンパク質の一ファミリーであるエフリンＢリガンドに結合する。Ｅｐｈ受容体とそのリガンドが結合すると、受容体クラスター形成、キナーゼ活性の活性化、及びそれに続くチロシン残基上の細胞質ドメインのリン酸基転移を誘発し、幾つかのシグナル伝達タンパク質に対するドッキング部位が生成する（Ｋｕｌｌａｎｄｅｒ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ， Ｒ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ３：４７５−４８６、Ｎｏｒｅｎ， Ｎ．Ｋ． ａｎｄ Ｐａｓｑｕａｌｅ， Ｅ．Ｂ．， ２００４， Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌ．， １６：６５５−６６６）。
癌は、異常なシグナル伝達に起因する非制御の増殖を特徴とする疾患である。癌の最も危険な形態は、浸潤による隣接組織中への直接の増殖によって、又は転移による遠位部位への移植によって、拡散する能力を有する悪性細胞である。転移細胞は、原発腫ようから分離し、血流又はリンパ系を介して遠位部位に転位置し、遠位の異質な微小環境にコロニーを形成する能力を獲得した。
Ｅｐｈ分子も癌などの病態においてある役割を果たすことが現在明らかである。特に、ＥｐｈＡ２受容体の過剰発現は、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、食道癌、腎細胞癌、頚部癌及び黒色腫において報告された。ＥｐｈＡ２は、悪性細胞における細胞増殖及び生存の陽性制御因子であることが示唆された（Ｌａｎｄｅｎ， Ｃ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｅｘｐｅｒｔ． Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｔａｒｇｅｔｓ， ９（６）：１１７９−１１８７）。ＥｐｈＡ２の過剰発現は単独で、乳腺上皮細胞を悪性形質に転換するのに十分であり（Ｚｅｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６１：２３０１−２３０６）、遠位部位への自然転移を増加させるので（Ｌａｎｄｅｎ， Ｃ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｅｘｐｅｒｔ． Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｔａｒｇｅｔｓ， ９（６）：１１７９−１１８７）、転移におけるＥｐｈＡ２の役割も記述された。また、ＥｐｈＡ２が腫よう血管新生にも関与することを示唆する証拠が増えつつある（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９：６０４３−６０５２、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００２， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １：２−１１、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｅｏｐｌａｓｉａ， ５（５）：４４５−４５６、Ｄｏｂｒｚａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６４：９１０−９１９）。
ＥｐｈＡ２のリン酸化は、その存在量と関連づけられることが判明した。チロシンリン酸化されたＥｐｈＡ２は、急速に内部に取り入れられ、分解する運命にあるのに対して、非リン酸化ＥｐｈＡ２は、代謝回転が遅く、したがって細胞表面に蓄積する。この種のモデルは、癌における高頻度のＥｐｈＡ２過剰発現の一因になり得ると現在考えられている（Ｌａｎｄｅｎ， Ｃ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｅｘｐｅｒｔ． Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｔａｒｇｅｔｓ， ９（６）：１１７９−１１８７）。しかし、最近のデータは、腫よう進行において、ＥｐｈＡ２キナーゼ依存性及び非依存性機能のための役割を示しているように見えるので、実際にはより複雑であり得る（Ｆａｎｇ Ｗ．Ｂ．， ２００５， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２４：７８５９−７８６８）。
ＥｐｈＡ２チロシンリン酸化及び内部移行を促進し、最終的に腫よう細胞増殖を阻害するアゴニスト抗体が開発された（Ｄｏｄｇｅ−Ｚａｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ．， １０：６２９−６３８、国際公開第０１／１２１７２号、同０３／０９４８５９号、同２００４／０１４２９２号、同２００４／１０１７６４号、同２００６／０２３４０３号、同２００６／０４７６３７号、同２００７／０３０６４２号）。これらの抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインに対するものである。これらのアゴニスト抗体は、ＥｐｈＡ２受容体リン酸化及び下流シグナルを阻害するのではなく、刺激するので、これらの抗体は、ＥｐｈＡ２キナーゼ活性を利用する腫ようには有効でない可能性がある。一方、抗体を含めた拮抗薬の使用が提案されたが（国際公開第２００４／０９２３４３号）、実際のアンタゴニスト抗体はその中では開示されていない。さらに、かかる抗体は、細胞増殖を阻害するのではなく、刺激すると提案された。国際公開第２００６／０８４２２６号は、ＥｐｈＡ２キナーゼ活性を増加も減少もさせないが、腫よう細胞増殖を妨害する能力のある抗体を開示している。しかし、これらの抗体が、受容体に結合したエフリンＡ１を妨げ、エフリンＡ１によって誘導されるＥｐｈＡ２リン酸化を阻害することは、その中には示されていない。それどころか、これらの抗体は、全く異なる機序によって、例えば、エフリンＡ１の結合に続く受容体クラスター形成を防止することによって、腫よう細胞増殖に影響を及ぼし得る。したがって、当業者は、これらの抗体が拮抗物質であるとは結論づけず、そうではなく、その作用機序が不明であると結論づけた。
したがって、ＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインに結合し、リガンドのエフリンＡ１によるその活性化を阻害し、ＥｐｈＡ２キナーゼ依存性腫よう細胞増殖を阻害する、新しいアンタゴニスト抗ＥｐｈＡ２抗体が必要とされる。かかるアンタゴニスト抗体は、癌治療に有用なはずである。
国際公開第０１／１２１７２号 国際公開第０３／０９４８５９号 国際公開第２００４／０１４２９２号 国際公開第２００４／１０１７６４号 国際公開第２００６／０２３４０３号 国際公開第２００６／０４７６３７号 国際公開第２００７／０３０６４２号 国際公開第２００４／０９２３４３号 国際公開第２００６／０８４２２６号
Ｐａｓｑｕａｌｅ， Ｅ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６：４６２−４７５ Ｋｕｌｌａｎｄｅｒ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ， Ｒ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ３：４７５−４８６、 Ｎｏｒｅｎ， Ｎ．Ｋ． ａｎｄ Ｐａｓｑｕａｌｅ， Ｅ．Ｂ．， ２００４， Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌ．， １６：６５５−６６６ Ｌａｎｄｅｎ， Ｃ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｅｘｐｅｒｔ． Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｔａｒｇｅｔｓ， ９（６）：１１７９−１１８７ Ｚｅｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６１：２３０１−２３０６ Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９：６０４３−６０５２、 Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００２， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １：２−１１、 Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｅｏｐｌａｓｉａ， ５（５）：４４５−４５６、 Ｄｏｂｒｚａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６４：９１０−９１９ Ｆａｎｇ Ｗ．Ｂ．， ２００５， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２４：７８５９−７８６８ Ｄｏｄｇｅ−Ｚａｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ．， １０：６２９−６３８
したがって、本発明の一目的は、ＥｐｈＡ２などのクラスＡ Ｅｐｈ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合し、受容体に拮抗することによって受容体の細胞活性を阻害する薬剤を提供することである。したがって、本発明は、ＥｐｈＡ２受容体、好ましくはヒトＥｐｈＡ２受容体を認識し、該受容体の拮抗物質として機能する、抗体又はその断片を含む。
ＥｐｈＡ２受容体は、腫ようの発生及び増殖においてある役割を果たし、転移にも関与する。一部の実施形態においては、本発明の抗体は、癌細胞の増殖を阻害する能力がある。一部の別の実施形態においては、本発明の抗体は、転移性癌細胞の遊走を防止する能力がある。好ましい実施形態においては、癌細胞は、乳癌、結腸癌、子宮体癌、卵巣癌、骨肉腫、子宮頚癌、前立腺癌、肺癌、滑膜腫 すい癌、肉腫、神経こう腫、頭頚部癌、胃癌、肝臓癌及び他の癌腫からなる群から選択される癌の細胞である。別の一実施形態においては、本発明の抗体は、血管新生を阻害する能力がある。
従来技術に開示した抗ＥｐｈＡ２抗体は、大部分が作動物質であるのに対して（例えば、国際公開第０３／０９４８５９号、同２００４／０１４２９２号、同２００４／１０１７６４号、同２００６／０２３４０３号、同２００６／０４７６３７号、同２００７／０３０６４２号）、本発明は、受容体に対して、最小限の作動活性しか持たない、又は優先的に、作動活性を欠く、該受容体を認識する抗体を包含する。好ましい一実施形態においては、本発明の抗体は、ＥｐｈＡ２チロシンリン酸化を刺激しない。
本発明の抗体は、ＥｐｈＡ２受容体に対するリガンド、好ましくはエフリンＡ１の結合を阻害する能力を有する。一部の実施形態においては、本発明の抗体は、ＥｐｈＡ２チロシンリン酸化を阻害する能力を有する。別の一実施形態においては、ＥｐｈＡ２チロシンリン酸化は、エフリンＡ１の存在下でも、本発明の抗体によって阻害される。一部の実施形態においては、本発明の抗体は、ＥｐｈＡ２媒介性シグナル伝達を遮断することができる。特に、本発明の抗体は、ＡｋｔのＥｐｈＡ２依存性リン酸化を阻害する能力を有する。
本発明は、０．３×１０−９Ｍ以下のＫＤでＥｐｈＡ２受容体に結合する抗体も提供する。
本発明の抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片などのエピトープ結合性断片も本発明の範囲に含まれる。モノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体が好ましい。より好ましい一実施形態においては、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２から選択されるネズミ抗体を提供する。これらのネズミ抗体は、軽鎖と重鎖可変領域の両方のアミノ酸配列、軽鎖及び重鎖可変領域の遺伝子のｃＤＮＡ配列、そのＣＤＲ（相補性決定領域）の同定、その表面アミノ酸の同定、並びに組換え体におけるその発現手段に関して本明細書において十分特徴づけられている。ネズミ抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１並びにＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約下で、それぞれ２００６年６月１６日及び２００７年５月３日に、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡに、それぞれ受託番号ＰＴＡ−７６６０、ＰＴＡ−７６６１、ＰＴＡ−７６６２、ＰＴＡ−８４０７及びＰＴＡ−８４０８で寄託された。
本発明は、抗体の可変領域枠組みの表面露出残基又は該抗体のエピトープ結合性断片が、公知のヒト抗体表面により近似するように、軽鎖と重鎖の両方において置換された、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２から選択されるネズミ抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体、並びに３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体の表面再構成又はヒト化バージョンを含む。本発明のヒト化抗体及び該抗体のエピトープ結合性断片は、それらが投与されるヒト対象において、ネズミバージョンよりも、免疫原性が低い（又は完全に非免疫原性である）点で性質が改善されている。したがって、本発明のヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体並びに該抗体のエピトープ結合性断片の種々のバージョンは、ＥｐｈＡ２受容体を特異的に認識するが、ヒトに対して免疫原性ではない。
本発明の３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体のヒト化バージョンは、軽鎖と重鎖可変領域の両方のそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖及び重鎖可変領域の遺伝子のＤＮＡ配列、相補性決定領域（ＣＤＲ）の同定、その可変領域枠組み表面アミノ酸残基の同定、並びに組換え体におけるその発現手段の開示に関して本明細書において十分特徴づけられている。
本発明は、（１）ＥｐｈＡ２受容体などのＥｐｈＡ受容体を認識し、それに結合する細胞結合剤と、（２）細胞毒性薬とを含む細胞傷害性抱合体間の抱合体の使用も企図する。細胞傷害性抱合体においては、細胞結合剤は、ＥｐｈＡ受容体（例えば、ＥｐｈＡ２受容体）に対して高親和性を有し、細胞毒性薬は、ＥｐｈＡ受容体を発現する細胞に対して高度の細胞傷害性を有するので、本発明の細胞傷害性抱合体は、有効な殺剤（ｋｉｌｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を形成する。
好ましい一実施形態においては、細胞結合剤は、抗ＥｐｈＡ２抗体（例えば、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２）又は該抗体のエピトープ結合性断片であり、より好ましくはヒト化抗ＥｐｈＡ２抗体（例えば、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２）又は該抗体のエピトープ結合性断片であり、細胞毒性薬は、直接的に、又は開裂性若しくは非開裂性リンカーを介して、抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片に共有結合する。より好ましい実施形態においては、細胞結合剤は、ヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片であり、細胞毒性薬はＴａｘｏｌ、マイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、ＣＣ−１０６５又はＣＣ−１０６５類似体である。
本発明の好ましい実施形態においては、細胞結合剤は、ヒト化抗ＥｐｈＡ２抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２であり、細胞毒性薬は、ＤＭ１、ＤＭ４などのマイタンシン化合物である。
本発明は、ＥｐｈＡ２受容体に結合する能力を保持する抗ＥｐｈＡ２抗体断片の使用も包含する。本発明の別の一態様においては、抗ＥｐｈＡ２抗体の機能的等価物の使用を企図する。
本発明は、ＥｐｈＡ２受容体を発現する細胞の増殖を阻害する方法も含む。好ましい実施形態においては、ＥｐｈＡ２受容体を発現する細胞の増殖を阻害する方法は、生体内で行われ、細胞死をもたらすが、インビトロ及び生体外での適用も含む。
本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体又は抗ＥｐｈＡ２抗体−細胞毒性薬抱合体と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む、治療用組成物も提供する。一部の実施形態においては、治療用組成物は、第２の治療薬を含む。この第２の治療薬は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）又はＨＥＲ２受容体の拮抗物質からなる群から選択することができる。
本発明は、治療用組成物を用いて癌患者を治療する方法を更に含む。一部の実施形態においては、癌は転移性癌である。特に、癌細胞は、乳癌、結腸癌、子宮体癌、卵巣癌、骨肉腫、子宮頚癌、前立腺癌、肺癌、滑膜腫 すい癌、肉腫、神経こう腫、頭頚部癌、胃癌、肝臓癌及び他の癌腫からなる群から選択される癌の細胞である。好ましい実施形態においては、細胞傷害性抱合体は、抗ＥｐｈＡ２抗体及び細胞毒性薬を含む。より好ましい実施形態においては、細胞傷害性抱合体は、ヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体−ＤＭ１抱合体、ヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体−ＤＭ４、ヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体−タキサン抱合体、又はヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体−トマイマイシン誘導体抱合体を含み、薬学的に許容される担体又は賦形剤と一緒に投与される。
本発明の別の一態様においては、抗ＥｐｈＡ２抗体を使用して、生物試料中のＥｐｈＡ２タンパク質を検出する。好ましい一実施形態においては、前記抗体を使用して、腫よう組織中のＥｐｈＡ２レベルを求める。
本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体又は抗ＥｐｈＡ２抗体−細胞毒性薬抱合体と、使用説明書とを含む、キットも含む。好ましい実施形態においては、抗ＥｐｈＡ２抗体は、ヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体であり、細胞毒性薬は、ＤＭ１、ＤＭ４などのマイタンシン化合物、タキサン、レプトマイシン誘導体、又はトマイマイシン誘導体であり、説明書は、癌患者の治療において抱合体を使用するためのものである。キットは、抱合体が凍結乾燥状態又は濃縮体である場合の希釈剤など、薬学的に許容される製剤の調製に必要な成分も含むことができ、製剤の投与に必要な成分も含むことができる。
別段の記載がないかぎり、本明細書に引用するすべての参考文献及び特許を参照により本明細書に組み入れる。
抗ＥｐｈＡ２抗体と、ヒトＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞（３００−１９／ｈｕ−ＥｐｈＡ２細胞）との特異的結合のＦＡＣＳ分析による分析結果を示すグラフである。それぞれ、図１Ａは３７．３Ｄ７抗体のデータであり、図１Ｂは３７．１Ｆ５抗体のデータであり、図１Ｃは５３．２Ｈ１１抗体のデータである。 抗ＥｐｈＡ２抗体と、ヒトＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞（３００−１９／ｈｕ−ＥｐｈＡ２細胞）との特異的結合のＦＡＣＳ分析による分析結果を示すグラフである。それぞれ、図１Ａは３７．３Ｄ７抗体のデータであり、図１Ｂは３７．１Ｆ５抗体のデータであり、図１Ｃは５３．２Ｈ１１抗体のデータである。 抗ＥｐｈＡ２抗体と、ヒトＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞（３００−１９／ｈｕ−ＥｐｈＡ２細胞）との特異的結合のＦＡＣＳ分析による分析結果を示すグラフである。それぞれ、図１Ａは３７．３Ｄ７抗体のデータであり、図１Ｂは３７．１Ｆ５抗体のデータであり、図１Ｃは５３．２Ｈ１１抗体のデータである。 精製３７．３Ｄ７抗体と、ＢｘＰＣ３ヒトすい癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞及びＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞との特異的結合を示すグラフである。ＦＡＣＳ分析のヒストグラムを示す。 ネズミ３００−１９細胞を過剰発現するヒトＥｐｈＡ２（３００−１９／ｈｕ−ＥｐｈＡ２）を用いて樹立された抗体３７．３Ｄ７（図３Ａ）、３７．１Ｆ５（図３Ｂ）及び５３．２Ｈ１１（図３Ｃ）の結合曲線を示すグラフである。 精製３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体と、ＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞との特異的結合を示すグラフである。ＦＡＣＳ分析のヒストグラムを示す。図４Ａは、ネズミＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞（３００−１９／ｍｕ−ＥｐｈＡ２）のデータであり、図４Ｂは、ラットＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞（３００−１９／ｒａｔ−ＥｐｈＡ２）のデータである。 精製３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体と、ＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞との特異的結合を示すグラフである。ＦＡＣＳ分析のヒストグラムを示す。図４Ａは、ネズミＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞（３００−１９／ｍｕ−ＥｐｈＡ２）のデータであり、図４Ｂは、ラットＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞（３００−１９／ｒａｔ−ＥｐｈＡ２）のデータである。 精製３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体と、ＶＥＲＯサル腎上皮細胞との特異的結合を示すグラフである。ＦＡＣＳ分析のヒストグラムを示す。 ＶＥＲＯサル腎上皮細胞を用いて樹立された抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１の結合曲線を示すグラフである。 ３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体によるビオチン化エフリンＡ１と乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の結合阻害を示すグラフである。 乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、３７．３Ｄ７及び３７．１Ｆ５抗体による、エフリンＡ１によって刺激されるＥｐｈＡ２リン酸化の阻害を示す図である。 乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体による、エフリンＡ１によって刺激されるＥｐｈＡ２リン酸化の阻害を示す図である。 すい臓ＣＦＰＡＣ−１細胞における、３７．３Ｄ７及び３７．１Ｆ５抗体による、エフリンＡ１によって刺激されるＡｋｔリン酸化の阻害を示す図である。 乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、エフリンＡ１によるＥｐｈＡ２リン酸化の刺激、及び抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１によるＥｐｈＡ２リン酸化の刺激の欠如を示す図である。 乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、エフリンＡ１によるＥｐｈＡ２リン酸化の刺激、及び抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１によるＥｐｈＡ２リン酸化の刺激の欠如を示す図である。 ３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体による、結腸ＨＴ−２９細胞（９Ａ）、結腸ＬｏＶｏ細胞（９Ｂ）、すい臓ＣＦＰＡＣ−１細胞（９Ｃ）及び黒色腫ＵＡＣＣ−２５７細胞（９Ｄ）の血清によって刺激される増殖及び生存の阻害を示すグラフである。 ３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体による、結腸ＨＴ−２９細胞（９Ａ）、結腸ＬｏＶｏ細胞（９Ｂ）、すい臓ＣＦＰＡＣ−１細胞（９Ｃ）及び黒色腫ＵＡＣＣ−２５７細胞（９Ｄ）の血清によって刺激される増殖及び生存の阻害を示すグラフである。 ３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体による、結腸ＨＴ−２９細胞（９Ａ）、結腸ＬｏＶｏ細胞（９Ｂ）、すい臓ＣＦＰＡＣ−１細胞（９Ｃ）及び黒色腫ＵＡＣＣ−２５７細胞（９Ｄ）の血清によって刺激される増殖及び生存の阻害を示すグラフである。 ３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体による、結腸ＨＴ−２９細胞（９Ａ）、結腸ＬｏＶｏ細胞（９Ｂ）、すい臓ＣＦＰＡＣ−１細胞（９Ｃ）及び黒色腫ＵＡＣＣ−２５７細胞（９Ｄ）の血清によって刺激される増殖及び生存の阻害を示すグラフである。 ３７．３Ｄ７抗体による、すい臓ＢｘＰＣ３細胞の血清によって刺激される増殖の用量依存的阻害を示すグラフである。 ５３．２Ｈ１１抗体による、結腸ＬｏＶｏ細胞の血清によって刺激される増殖の用量依存的阻害を示すグラフである。 ５３．２Ｈ１１抗体による、結腸ＬｏＶｏ細胞のＥＧＦによって刺激される増殖の用量依存的阻害を示すグラフである。 ３７．３Ｄ７抗体とＨＵＶＥＣ細胞の結合曲線を示す図である。 ３７．１Ｆ５抗体とＨＵＶＥＣ細胞の結合曲線を示す図である。 ３７．３Ｄ７抗体による、ＶＥＧＦによって刺激されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖及び生存の阻害を示すグラフである。 ＨＵＶＥＣ細胞において、３７．３Ｄ７抗体による、ＶＥＧＦ誘導性Ａｋｔリン酸化の阻害を示す図である。 マウスにおけるＨＴ−２９結腸癌異種移植片の増殖に対する、３７．３Ｄ７抗体を用いた治療の効果を示すグラフである。効果を抗ＥＧＦＲ抗体及び非結合対照ＩｇＧ１抗体の効果と比較する。 ｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４によるＰＣ３前立腺腫よう細胞の増殖阻害を示すグラフである。 ｈｕ５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４によるＰＣ３前立腺腫よう細胞の増殖阻害を示すグラフである。 マウスにおける、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺腫異種移植片の増殖に対するｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を用いた治療の効果を示すグラフである。 マウスにおける、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺腫異種移植片の増殖に対するｈｕ５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を用いた治療の効果を示すグラフである。
ＥｐｈＡ受容体に特異的に結合し、該受容体に拮抗する能力のある新しい薬剤を本明細書で提供する。特に、本発明者らは、細胞表面のＥｐｈＡ受容体に特異的に結合する新規抗体を発見した。ＥｐｈＡ受容体に特異的に結合する既知の抗体は、ＥｐｈＡ受容体リガンドの非存在下でも、ＥｐｈＡ受容体を活性化させるが、本発明の抗体又は断片は作動活性を優先的に欠く。一方、本発明の抗体又は断片は、そのリガンドの存在下でも、受容体の細胞機能を阻害する独特な能力を有する。この特性は、既知のＥｐｈＡ２結合性抗体では完全に欠如している。また、本発明のアンタゴニスト抗体及び抗体断片は、ヒト腫よう細胞の増殖及び／又は遊走を阻害し、及び／又は血管新生を阻害する。これら３つの性質は、従来技術から考えて全く予期されない（Ｌａｎｄｅｎ， Ｃ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｅｘｐｅｒｔ． Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｔａｒｇｅｔｓ， ９（６）：１１７９−１１８７、国際公開第０１／１２１７２号、同２００４／０１４２９２号、同２００４／０９２３４３号）。
本明細書では「Ｅｐｈ受容体」という用語は、（Ｐａｓｑｕａｌｅ， Ｅ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６， ４６２−４７５に概説された）Ｅｐｈ受容体ファミリーに属するチロシンキナーゼを指す。本明細書では「クラスＡ Ｅｐｈ受容体ファミリー」又は「ＥｐｈＡ受容体」は、（現在は５種類のリガンドを含むエフリンＡサブクラスの）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合リガンドと優先的に相互作用する。具体的ＥｐｈＡ受容体としては、（Ｅｐｈ及びＥｓｋとも称される）ＥｐｈＡ１、（Ｅｃｋ、ｍＥｃｋ、Ｍｙｋ２、Ｓｅｋ２とも称される）ＥｐｈＡ２、（Ｈｅｋ、Ｍｅｋ４、Ｔｙｒｏ４及びＣｅｋ４とも称される）ＥｐｈＡ３、（Ｈｅｋ８、Ｓｅｋ１、Ｔｙｒｏｌ及びＣｅｋ８としても知られる）ＥｐｈＡ４、（Ｈｅｋ７、Ｂｓｋ、Ｅｈｋ１、Ｒｅｋ７及びＣｅｋ７とも称される）ＥｐｈＡ５、（ｍＥｈｋ２及びＥｈｋ２とも称される）ＥｐｈＡ６、（Ｈｅｋ１１、Ｍｄｋ１、Ｅｂｋ、Ｅｈｋ３とも称される）ＥｐｈＡ７、（Ｅｅｋ及びｍＥｅｋとも称される）ＥｐｈＡ８、これらの天然変種などが挙げられる。本明細書の好ましいＥｐｈ受容体は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４３１（ヒトＥｐｈＡ２）、ＮＭ＿０１０１３９（ネズミＥｐｈＡ２）又はＮＸＭ＿３４５５９６（ラットＥｐｈＡ２）におけるようなアミノ配列を含む、「ＥｐｈＡ２受容体」である。本明細書では「Ｅｐｈリガンド」という用語は、Ｅｐｈ受容体に結合し、場合によっては活性化する（例えば、Ｅｐｈ受容体の自己リン酸化を刺激する）タンパク質を指す。本明細書の好ましいＥｐｈリガンドは「エフリンＡ１」である。エフリンＡ１は、ＥｐｈＡ２受容体に結合し、例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＭ＿００４４２８（ヒトエフリンＡ１）におけるようなアミノ配列を含む。
本明細書では「拮抗物質」という用語は、ＥｐｈＡ受容体などの標的分子の生物活性の１つ以上を阻害する能力を有する分子を指す。拮抗物質は、リガンドに対する受容体の結合、及び受容体に対するリガンドの結合を妨害することによって、ＥｐｈＡ２リン酸化を抑制することによって、及び／又はリガンドによって活性化された細胞を無能力にする、又は死滅させることによって、作用し得る。拮抗物質は、受容体−リガンド相互作用を完全に遮断することができ、又はかかる相互作用を実質的に抑制することができる。拮抗物質による介入のかかるポイントはすべて、本発明では等価とみなすものとする。したがって、ＥｐｈＡ受容体、Ｅｐｈリガンド、又はＥｐｈ受容体とＥｐｈリガンドの複合体に結合する拮抗物質（例えば、中和抗体）；ＥｐｈＡ受容体とＥｐｈＡリガンドの相互作用に拮抗する、ＥｐｈＡ受容体又はＥｐｈＡリガンドのアミノ酸配列変異体又は誘導体；免疫グロブリン領域などの異種分子に融合していてもよい、可溶性ＥｐｈＡ受容体又は可溶性ＥｐｈＡリガンド（例えば、イムノアドヘシン）；ＥｐｈＡリガンドに結合したＥｐｈＡ受容体を含む複合体；ＥｐｈＡ受容体又はＥｐｈＡリガンドに結合する合成又は未変性配列ペプチドは、本発明の範囲に含まれる。
本明細書では「作動物質」という用語は、標的分子の生物活性の１つ以上を活性化する能力のある、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、抱合体、大分子、小分子を含めた任意の化合物を指す。ＥｐｈＡ作動物質は、タンパク質のリン酸化を刺激し、それによって該タンパク質の分解を誘発することによって、作用する。
したがって、好ましい一実施形態においては、本発明は、他の特徴の中でも、抗ＥｐｈＡモノクローナル抗体、抗Ｅｐｈヒト化抗体及び抗ＥｐｈＡ抗体断片を提供する。本発明の抗体及び抗体断片の各々は、ＥｐｈＡ２受容体を特異的に認識し、それに結合し、ＥｐｈＡ２受容体拮抗物質として作用するように設計される。さらに、本発明のアンタゴニスト抗体及び抗体断片は、ヒト腫よう細胞の増殖、及び／又は転移性癌細胞の遊走、及び／又は血管新生を阻害することができる独特の性質を有する。
本発明のアンタゴニスト抗体及び抗体断片によって結合される好ましいＥｐｈＡ受容体は、ＥｐｈＡ２受容体である。ヒトＥｐｈＡ２は、好ましいＥｐｈＡ２受容体である。
ＥｐｈＡ２受容体は、リガンドが結合して、種々のアダプター及びシグナル伝達タンパク質と相互作用した後に、細胞質側末端のリン酸化が増加して、異なる下流の細胞シグナル伝達経路の活性化をもたらす、受容体ファミリーに属する（Ｋｕｌｌａｎｄｅｒ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ， Ｒ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ３：４７５−４８６、Ｎｏｒｅｎ， Ｎ．Ｋ． ａｎｄ Ｐａｓｑｕａｌｅ， Ｅ．Ｂ．， ２００４， Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌ．， １６：６５５−６６６）。本明細書では「ＥｐｈＡ２媒介性シグナル伝達」という用語は、ＥｐｈＡ２によるリガンド結合に応じて起こる全細胞事象を指す。従来技術に開示した抗体は、ＥｐｈＡ２受容体を刺激し、特に、ＥｐｈＡ２タンパク質のチロシンリン酸化を増加させるのに対して、本発明の抗体及び抗体断片は、かかる作動性を優先的に欠く。特に、本発明の抗体及び抗体断片は、それ自体でＥｐｈＡ２リン酸化を刺激することができない。
一方、本発明は、第１の実際の拮抗的抗ＥｐｈＡ２抗体を提供する。一実施形態においては、本発明の抗体及び抗体断片は、ＥｐｈＡ受容体に対するリガンドの結合を阻害することができる。好ましい一実施形態においては、ＥｐｈＡ２に対するエフリンＡ１の結合は、本発明によって提供される抗体及びその断片によって防止される。意外なことに、別の一実施形態においては、本発明の抗体及び抗体断片は、エフリンＡ１の存在下でも、ＥｐｈＡ２受容体のチロシンリン酸化を阻害する能力を有する。さらに、前記抗体及びその断片は、ＥｐｈＡ２媒介性シグナル伝達を阻害する能力を有する。特に、ＡｋｔエフリンＡ１依存性リン酸化は、本発明の抗体及び抗体断片によって防止することができる。
抗体
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、具体的には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの任意のアイソタイプの（完全長モノクローナル抗体を含めた）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、及び抗体断片を包含する。特異抗原と反応する抗体は、ファージベクター若しくは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択などの組換え方法によって、又は抗原、若しくは抗原をコードする核酸で動物を免疫することによって、作製することができる。
典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって連結された、２本の同一の重鎖と、２本の同一の軽鎖とを含む。各重鎖及び軽鎖は、定常領域及び可変領域を含む。各可変領域は、抗原のエピトープに結合する主因である「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）又は「超可変領域」と称する３個のセグメントを含む。３個のセグメントは、通常、Ｎ末端から順次番号がつけられ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と称される。可変領域のより高度に保存された部分は、「枠組み領域」と称する。
本明細書では「ＶＨ」又は「ＶＨ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片の重鎖を含めて、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」又は「ＶＬ」という表記は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片の軽鎖を含めて、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
「ポリクローナル抗体」は、１種類以上の他の異なる抗体間で、又は１種類以上の他の異なる抗体の存在下で、生成された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は、異なる抗体を産生する幾つかの他のＢリンパ球の存在下で、Ｂリンパ球から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫動物から直接得られる。
本明細書では「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体である。すなわち、この集団を形成する抗体は、少量存在し得る可能な天然変異体を除いて、本質的に同一である。これらの抗体は、単一のエピトープに対するものであり、したがって極めて特異的である。
「エピトープ」は、抗体が結合する、抗原上の部位である。エピトープは、抗原タンパク質の折りたたみによって近接した、隣接残基又は非隣接残基によって形成され得る。隣接アミノ酸によって形成されるエピトープは、変性溶媒に曝露しても典型的には保持されるが、非隣接アミノ酸によって形成されるエピトープは、該曝露下では典型的には失われる。
本明細書では「ＫＤ」という用語は、特定の抗体／抗原相互作用の解離定数を指す。
本発明は、軽鎖と重鎖の両方のアミノ酸配列、ＣＤＲの同定、表面アミノ酸の同定、及び組換え体におけるその発現手段に関して十分特徴づけられた、ネズミ抗ＥｐｈＡ２抗体、本明細書では、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２から生ずる。抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２軽鎖及び重鎖並びにヒト化バージョンの一次アミノ酸配列及びＤＮＡ配列を本明細書に開示する。
抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２は、それぞれ３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２と命名され、ブダペスト条約下で、それぞれ２００６年６月１６日及び２００７年５月３日に、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡに、それぞれ受託番号ＰＴＡ−７６６０、ＰＴＡ−７６６１ ＰＴＡ−７６６２、ＰＴＡ−８４０７及びＰＴＡ−８４０８で寄託されたハイブリドーマによって産生される。
本発明の範囲は、これらの配列を含む抗体及び断片に限定されない。そうではなく、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、受容体の生物活性に拮抗するが、作動活性を欠く全抗体及び断片は、本発明の範囲内である。すなわち、抗体及び抗体断片は、その足場、ＣＤＲ、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列が、抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２又はヒト化誘導体とは異なり得るが、それでも本発明の範囲内である。
一実施形態においては、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１及び７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１個以上のＣＤＲを含む抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片を提供する。
好ましい一実施形態においては、本発明の抗体は、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖は、配列番号１、２、３、７、８、９、１３、１４、１５、６１、６２、６３、６７、６８及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖は、配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、６４、６５、６６、７０、７１及び７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む。
より好ましい一実施形態においては、本発明の抗体は、配列番号１、２、３、４、５及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個のＣＤＲを含む。更により好ましい一実施形態においては、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号１、２及び３からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖が、配列番号４、５及び６からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む、３７．３Ｄ７抗体を提供する。
別のより好ましい一実施形態においては、本発明の抗体は、配列番号７、８、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個のＣＤＲを含む。更により好ましい一実施形態においては、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号７、８及び９からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖が、配列番号１０、１１及び１２からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む、３７．１Ｆ５抗体を提供する。
別のより好ましい一実施形態においては、本発明の抗体は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個のＣＤＲを含む。更により好ましい一実施形態においては、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号１３、１４及び１５からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖が、配列番号１６、１７及び１８からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む、５３．２Ｈ１１を提供する。
別のより好ましい一実施形態においては、本発明の抗体は、配列番号６１、６２、６３、６４、６５及び６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個のＣＤＲを含む。更により好ましい一実施形態においては、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号６１、６２及び６３からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖が、配列番号６４、６５及び６６からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む、ＥｐｈＡ２−Ｎ１抗体を提供する。
別のより好ましい一実施形態においては、本発明の抗体は、配列番号６７、６８、６９、７０、７１及び７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個のＣＤＲを含む。更により好ましい一実施形態においては、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号６７、６８及び６９からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖が、配列番号７０、７１及び７２からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む、ＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体を提供する。
別の一実施形態においては、本発明の抗体は、配列番号２０、２２、２４、７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨを含む。好ましい一実施形態においては、配列番号２０からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含む３７．３Ｄ７抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号２２からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含む３７．１Ｆ５抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号２４からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含む５３．２Ｈ１１抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号７４からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含むＥｐｈＡ２−Ｎ１抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号７６からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含むＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体を提供する。
別の好ましい一実施形態においては、本発明の抗体は、配列番号２６、２８、３０、７８及び８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬを含む。好ましい一実施形態においては、配列番号２６からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含む３７．３Ｄ７抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号２８からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含む３７．１Ｆ５抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号３０からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含む５３．２Ｈ１１抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号７８からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含むＥｐｈＡ２−Ｎ１抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号８０からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含むＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体を提供する。
ヒト化又は表面再構成３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５；５３．２Ｈ１１；ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体
本明細書では「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体を指す。本明細書では「キメラ抗体」は、定常領域又はその一部が変化し、置換され、又は交換され、その結果、可変領域が、異なる種の定常領域に連結された、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する、抗体である。「キメラ抗体」は、可変領域又はその一部が変化し、置換され、又は交換され、その結果、定常領域が、異なる種の可変領域に連結された、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する、抗体も指す。
ヒト化の目的は、抗体の十分な抗原結合親和性及び特異性を維持しながら、ヒトに導入するための、ネズミ抗体などの異種抗体の免疫原性の低減である。ヒト化抗体、又は他のほ乳動物によって拒絶されないようになされた抗体は、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）、ＣＤＲ移植などの幾つかの技術を用いて作製することができる。本明細書では、表面再構成技術は、分子モデリング、統計解析及び変異誘発の組合せを用いて、抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を変化させて、標的宿主の公知の抗体の表面に似せる。
抗体の表面再構成の戦略及び方法、並びに異なる宿主内の抗体の免疫原性を低減する他の方法は、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第５，６３９，６４１号に開示されている。手短に述べると、好ましい方法においては、（１）抗体重鎖及び軽鎖可変領域のプールの位置アラインメントを生成して、全可変領域のアラインメント位置が少なくとも約９８％同一である１組の重鎖及び軽鎖可変領域枠組み表面露出位置を得、（２）１組の重鎖及び軽鎖可変領域枠組み表面露出アミノ酸残基をげっ歯類抗体（又はその断片）に対して定義し、（３）１組のげっ歯類表面露出アミノ酸残基に最も一致する１組の重鎖及び軽鎖可変領域枠組み表面露出アミノ酸残基を特定し、（４）げっ歯類抗体の相補性決定領域の任意の残基の任意の原子の５Å以内にあるアミノ酸残基を除いて、段階（２）で定義した１組の重鎖及び軽鎖可変領域枠組み表面露出アミノ酸残基を、段階（３）で特定した１組の重鎖及び軽鎖可変領域枠組み表面露出アミノ酸残基で置換し、（５）結合特異性を有するヒト化げっ歯類抗体を作製する。
抗体は、ＣＤＲ移植（欧州特許第０ ２３９ ４００号、国際公開第９１／０９９６７号、米国特許第５，５３０，１０１号及び同５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又は表面再構成（欧州特許第０ ５９２ １０６号、欧州特許第０ ５１９ ５９６号、Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．， １９９１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ Ｇ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４、Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９１：９６９−９７３）及び鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含めて、種々の他の技術によってヒト化することができる。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を含めて、当分野で公知の種々の方法によって作製することができる。（参照によりその全体を本明細書に組み入れる）米国特許第４，４４４，８８７号、同４，７１６，１１１号、同５，５４５，８０６号及び同５，８１４，３１８号、並びに国際公開第９８／４６６４５号、同９８／５０４３３号、同９８／２４８９３号、同９８／１６６５４号、同９６／３４０９６号、同９６／３３７３５号及び同９１／１０７４１号も参照されたい。
本発明は、ＥｐｈＡ２受容体を認識し、拮抗物質として作用する、ヒト化抗体又はその断片を提供する。別の一実施形態においては、ヒト化抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片は、ＥｐｈＡ２受容体を発現する癌細胞の増殖を阻害する追加の能力を有する。更なる一実施形態においては、ヒト化抗体又は該抗体のエピトープ結合性は、ＥｐｈＡ２受容体を発現する転移性癌細胞の遊走を阻害する追加の能力を有する。
かかるヒト化抗体の好ましい実施形態は、ヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５；５３．２Ｈ１１；ＥｐｈＡ２−Ｎ１若しくはＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片である。
より好ましい実施形態においては、抗体又はその断片の表面露出残基が、公知のヒト抗体表面により近似するように、軽鎖と重鎖の両方において置換された、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５；５３．２Ｈ１１；ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体の表面再構成又はヒト化バージョンを提供する。本発明のヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５；５３．２Ｈ１１；ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片は、改善された諸性質を有する。例えば、ヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片は、ＥｐｈＡ２受容体を特異的に認識する。より好ましくは、ヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片は、ＥｐｈＡ２受容体を発現する細胞の増殖を阻害する追加の能力を有する。
３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体のヒト化バージョンは、軽鎖と重鎖可変領域の両方のそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖及び重鎖可変領域の遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、表面アミノ酸の同定、並びに組換え体におけるその発現手段の開示に関しても、本明細書において十分特徴づけられている。しかし、本発明の範囲は、これらの配列を含む抗体及び断片に限定されない。そうではなく、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合する全抗体及び断片が本発明に含まれる。好ましくは、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合する抗体及び断片は、受容体の生物活性に拮抗する。より好ましくは、かかる抗体は、さらに、作動活性を実質的に欠く。したがって、本発明の抗体及びエピトープ結合性抗体断片は、その足場、ＣＤＲ、及び／又は軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列が、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１若しくはＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体又はそのヒト化誘導体とは異なり得るが、それでも本発明の範囲内である。
３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体のＣＤＲは、モデリングによって同定され、その分子構造が予測された。さらに、ＣＤＲは、エピトープ認識に重要ではあるが、本発明の抗体及び断片に必須ではない。したがって、例えば本発明の抗体の親和性成熟によって生じる、改善された諸性質を有する抗体及び断片が提供される。
実験例のセクションに開示するように、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２が由来する可能性がある、マウス軽鎖ＩｇＶＫ及びＪＫ生殖系列遺伝子並びに重鎖ＩｇＶｈ及びＪｈ生殖系列遺伝子が特定された。かかる生殖系列遺伝子配列は、ＣＤＲ中を含めて、抗体中の体細胞変異を特定するのに有用である。
３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の配列、並びにそのＣＤＲの配列は、知られておらず、本願で規定される。かかる情報を用いて、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体のヒト化バージョンを作製することができる。これらのヒト化抗ＥｐｈＡ抗体又はその誘導体を本発明の細胞結合剤として使用することもできる。
したがって、一実施形態においては、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１及び７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１個以上のＣＤＲを含むヒト化抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片を提供する。好ましい一実施形態においては、本発明のヒト化抗体は、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖は、配列番号１、２、３、７、８、９、１３、１４、１５、６１、６２、６３、６７、６８及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖は、配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、６４、６５、６６、７０、７１及び７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む。更に好ましい一実施形態においては、本発明のヒト化抗体は、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖は、配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖は、配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む。別の更に好ましい一実施形態においては、本発明のヒト化抗体は、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖は、配列番号７、８及び９のアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖は、配列番号１０、１１及び１２のアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む。別の更に好ましい一実施形態においては、本発明のヒト化抗体は、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖は、配列番号１３、１４及び１５のアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖は、配列番号１６、１７及び１８のアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む。別のより好ましい一実施形態においては、本発明のヒト化抗体は、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖は、配列番号６１、６２及び６３からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖は、配列番号６４、６５及び６６からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む。別のより好ましい一実施形態においては、本発明のヒト化抗体は、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、該重鎖は、配列番号６７、６８及び６９からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含み、該軽鎖は、配列番号７０、７１及び７２からなるアミノ酸配列を有する３個の連続したＣＤＲを含む。
一実施形態においては、本発明は、配列番号３２、３４、３６、３７、３８、４０、４２、４３及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨを含むヒト化抗体又はその断片を提供する。好ましい一実施形態においては、配列番号３２、３４及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨを含むヒト化３７．１Ｄ７抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号３７及び３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨを含むヒト化３７．１Ｆ５抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号４０、４２、４３及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨを含むヒト化５３．２Ｈ１１抗体を提供する。
別の一実施形態においては、本発明は、配列番号４７、４８、４９、５０及び５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬを含むヒト化抗体又はその断片を提供する。好ましい一実施形態においては、配列番号４７からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含むヒト化３７．１Ｄ７抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号４８、４９及び５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬを含むヒト化３７．１Ｆ５抗体を提供する。別の好ましい一実施形態においては、配列番号５２からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含むヒト化５３．２Ｈ１１抗体を提供する。
本発明のヒト化３７．３Ｄ７抗体及び該抗体のエピトープ結合性断片は、最初のネズミ残基からヒト抗体２８Ｅ４中の対応する枠組み表面残基に変化したネズミ表面枠組み残基を表す、表１Ａ及び１Ｂの灰色の残基によって規定された１個以上の位置において、軽鎖及び／又は重鎖アミノ酸残基中に置換も含み得る。表１Ｂの星印（＊）の付いた残基は、ヒト化３７．３Ｄ７重鎖変種におけるネズミ復帰変異に対応する（配列番号３４及び配列番号３６）。復帰変異のための残基は、ＣＤＲの近位にあり、米国特許第５，６３９，６４１号に記載のように、又は以前のヒト化の試みにおいて抗原結合親和性の低下をもたらした残基の選択と同様に、選択された（Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．；９（１０）：８９５−９０４、米国特許出願公開第２００３／０２３５５８２号及び同２００５／０１１８１８３号）。
同様に、本発明のヒト化３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体並びに該抗体のエピトープ結合性断片は、軽鎖及び／又は重鎖アミノ酸残基中の置換も含むことができる。
ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明の抗ＥｐｈＡ２抗体をコードする核酸を提供する。一実施形態においては、核酸分子は、抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする。好ましい一実施形態においては、単一の核酸は、抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの重鎖をコードし、別の核酸分子は、抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの軽鎖をコードする。
本発明の別の一態様においては、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３７、３８、４０、４２、４３、４５、４７、４８、４９、５０、５２、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７４、７６、７８及び８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましい一実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３９、４１、４４、４６、５１、７３、７５、７７及び７９からなる群から選択される。本発明は、本質的に前記ポリヌクレオチドに限定されず、前記ポリヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を示す全ポリヌクレオチドも含む。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態においては、ベクターは、抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。別の一実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの軽鎖をコードする。本発明は、融合タンパク質、修飾抗体、抗体断片及びそのプローブをコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターも提供する。
本発明の抗ＥｐｈＡ２抗体の重鎖及び／又は軽鎖を発現させるために、前記重鎖及び／又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、遺伝子が転写及び翻訳配列に作用可能に結合するように発現ベクターに挿入する。発現ベクターとしては、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来のエピソーム、並びに当業者が前記重鎖及び／又は軽鎖を確実に発現させるのに好都合であることを知っている他のすべてのベクターなどが挙げられる。当業者は、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを異なるベクター又は同じベクターにクローン化し得ることを理解しているはずである。好ましい一実施形態においては、前記ポリヌクレオチドを同じベクターにクローン化する。
本発明のポリヌクレオチド、及びこれらの分子を含むベクターは、適切なほ乳動物宿主細胞、又は当業者に公知である任意の他のタイプの宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを細胞宿主に導入する任意の公知の方法によることができる。かかる方法は、当業者に周知であり、デキストラン媒介性形質転換、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性形質移入、原形質体融合、電気穿孔法、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、微粒子銃注入、及び核へのＤＮＡの直接微量注入などが挙げられる。
抗体断片
本発明の抗体は、上で考察した完全長抗体とエピトープ結合性断片の両方を含む。本明細書では「抗体断片」は、「エピトープ結合性断片」と一般に称される、完全長抗体によって認識されるエピトープに結合する能力を保持する抗体の任意の部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィドによって連結されたＦｖ（ｄｓＦｖ）、並びにＶＬ又はＶＨ領域を含む断片が挙げられるが、これらだけに限定されない。単鎖抗体を含めて、エピトープ結合性断片は、可変領域を、単独で、又はヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全体若しくは一部と組み合わせて、含み得る。
かかる断片は、一方又は両方のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片を含み得る。好ましくは、抗体断片は、抗体全体の全６個のＣＤＲを含むが、３、４又は５個のＣＤＲなど、かかる領域の全部よりも少ないＣＤＲを含む断片も機能する。また、断片は、以下の免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ及びそのサブクラスの任意の１つのメンバーであり得、又は該メンバーを組み合わせることができる。
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片）、ペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片）などの酵素を用いたタンパク質切断によって、生成させることができる。
「単鎖ＦＶ」（「ｓｃＦｖ」）断片は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１個の断片と連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１個の断片を含むエピトープ結合性断片である。リンカーは、単鎖抗体断片が由来する抗体全体の標的分子結合特異性を維持するように、（ＶＬ）領域と（ＶＨ）領域が結合したときに（ＶＬ）及び（ＶＨ）領域の適切な３次元折りたたみが確実に起こるように選択された短い柔軟なペプチドであり得る。（ＶＬ）又は（ＶＨ）配列のカルボキシ末端は、相補的（ＶＬ）又は（ＶＨ）配列のアミノ酸末端にリンカーを介して共有結合し得る。
本発明の単鎖抗体断片は、本明細書に記載する抗体全体の可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１個を有するアミノ酸配列を含むが、該抗体の定常ドメインの一部又は全部を欠いている。これらの定常ドメインは、抗原結合には不要であるが、抗体全体の構造の主要な部分を構成する。したがって、単鎖抗体断片は、定常ドメインの一部又は全部を含む抗体の使用に付随する問題の一部を克服することができる。例えば、単鎖抗体断片は、生体分子と重鎖定常領域の望ましくない相互作用がない傾向があり、又は他の望ましくない生物活性がない傾向がある。さらに、単鎖抗体断片は、抗体全体よりもかなり小さく、したがって抗体全体よりも大きい毛細血管透過性を有するので、標的抗原結合性部位により効率的に局在し、結合することができる。また、抗体断片は、原核細胞において比較的大規模に産生することができ、したがってその製造が容易である。また、比較的小さいサイズの単鎖抗体断片は、レシピエントにおいて、抗体全体よりも免疫応答を誘発する可能性が低い。
単鎖抗体断片は、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリー、又は当業者に周知の類似技術によって、作製することができる。これらのタンパク質は、例えば、細菌を含めて、真核細胞又は原核細胞において、生成させることができる。本発明のエピトープ結合性断片は、当分野で公知である種々のファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子表面に表示される。特に、かかるファージを利用して、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はネズミ）から発現されるエピトープ結合性ドメインを表示することができる。目的抗原に結合するエピトープ結合性ドメインを発現するファージは、抗原、例えば、固体表面又はビーズに結合した、又は捕捉された、標識抗原を用いて、選択又は特定することができる。これらの方法に用いられるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質に組換え融合されたＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。
本発明のエピトープ結合性断片の作製に使用することができるファージディスプレイ法の例としては、その各々を参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １８２：４１−５０、Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １８４：１７７−１８６、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２４：９５２−９５８、Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｇｅｎｅ １８７：９−１８、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ５７：１９１−２８０、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号、国際公開第９０／０２８０９号、同９１／１０７３７号、同９２／０１０４７号、同９２／１８６１９号、同９３／１１２３６号、同９５／１５９８２号、同９５／２０４０１号、並びに米国特許第５，６９８，４２６号、同５，２２３，４０９号、同５，４０３，４８４号、同５，５８０，７１７号、同５，４２７，９０８号、同５，７５０，７５３号、同５，８２１，０４７号、同５，５７１，６９８号、同５，４２７，９０８号、同５，５１６，６３７号、同５，７８０，２２５号、同５，６５８，７２７号、同５，７３３，７４３号及び同５，９６９，１０８号に開示されたファージディスプレイ法が挙げられる。
ファージ選択後、断片をコードするファージの領域を単離し、それを用いて、例えば以下に詳述するように、組換えＤＮＡ技術を用いて、ほ乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含めて、選択した宿主における発現によって、エピトープ結合性断片を作製することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組換え製造する技術は、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、国際公開第９２／２２３２４号、Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １２（６）：８６４−８６９、Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５， ＡＪＲＩ， ３４：２６−３４、及びＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０：１０４１−１０４３に開示された方法などの当分野で公知の方法を用いて、使用することもできる。単鎖Ｆｖ及び抗体の製造に使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び同５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８、Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９０：７９９５−７９９９、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０：１０３８−１０４０に記載の技術が挙げられる。
機能的等価物
抗ＥｐｈＡ抗体及びヒト化抗ＥｐｈＡ２受容体抗体の機能的等価物も本発明の範囲に含まれる。「機能的等価物」という用語は、相同配列を有する抗体、キメラ抗体、人工抗体及び修飾抗体を含み、例えば、各機能的等価物は、ＥｐｈＡ２受容体に結合する能力によって規定される。当業者は、「抗体断片」と称する分子グループと「機能的等価物」と称するグループは、重複部分があることを理解されたい。機能的等価物を製造する方法は、当業者に公知であり、例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、国際公開第９３／２１３１９号、欧州特許第０２３９４００号、国際公開第８９／０９６２２号、欧州特許第０３３８７４５号及び欧州特許第０３３２４２４号に開示されている。
相同配列を有する抗体は、本発明の抗ＥｐｈＡ抗体及びヒト化抗ＥｐｈＡ抗体のアミノ酸配列と配列相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体である。好ましくは、相同性は、本発明の抗ＥｐｈＡ抗体及びヒト化抗ＥｐｈＡ抗体の可変領域のアミノ酸配列とのものである。本明細書においてアミノ酸配列に適用される「配列相同性」は、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５：２４４４−２４４８のＦＡＳＴＡ探索法によって測定して、別のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％又は９４％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する配列として定義される。
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する抗体である。例えば、ネズミモノクローナル抗体由来の可変領域を有する抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域と対になった。キメラ抗体を製造する方法は当分野で公知である。例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：１２０２、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４：２１４、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １２５：１９１−２０２、米国特許第５，８０７，７１５号、同４，８１６，５６７号及び同４，８１６，３９７号を参照されたい。
キメラ抗体のヒト化体は、例えばマウス抗体の、相補性決定領域を、ヒト枠組みドメインに入れることによって、作製される。例えば、国際公開第９２／２２６５３号を参照されたい。ヒト化キメラ抗体は、好ましくは、対応するヒト抗体領域に実質的又は独占的に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外、及びヒト以外のほ乳動物に実質的又は独占的に由来するＣＤＲ以外の定常領域及び可変領域を有する。
人工抗体としては、各々抗原結合能力を有する、ｓｃＦｖ断片、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及びｍｒｕが挙げられる（Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ， ３４９：２９３−２９９、Ｈｕｄｓｏｎ， Ｐ．Ｊ．， １９９９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １１：５４８−５５７による総説を参照されたい。）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）では、抗体のＶＨ及びＶＬドメインは、柔軟なペプチドによって連結される。典型的には、このリンカーペプチドは、約１５アミノ酸残基長である。リンカーがはるかに小さく、例えば５アミノ酸である場合、二価のｓｃＦｖ２量体である二重特異性抗体が形成される。リンカーが３アミノ酸残基未満に短縮すると、三重特異性抗体及び四重特異性抗体と称する３量体及び４量体構造が形成される。抗体の最小結合単位はＣＤＲであり、典型的には、別個に使用することができる十分な特異的認識及び結合性を有する重鎖のＣＤＲ２である。かかる断片は、分子認識単位又はｍｒｕと称する。幾つかのかかるｍｒｕは、短いリンカーペプチドを用いて連結することができ、したがって単一のｍｒｕよりも結合活性が高い人工結合タンパク質を形成することができる。
本願の機能的等価物は、修飾抗体、例えば、抗体に対する任意のタイプの分子の共有結合によって修飾された抗体も含む。例えば、修飾抗体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンド又は他のタンパク質との結合などによって、修飾された抗体が挙げられる。共有結合は、抗体が抗イディオタイプの反応を起こすのを妨げない。これらの修飾は、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含めて、ただしこれらだけに限定されない、公知技術によって実施することができる。さらに、修飾抗体は、１個以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
機能的等価物は、異なる枠組み内の異なる鎖上の異なるＣＤＲを交換することによって生成させることができる。したがって、例えば、異なるクラスの抗体が、異なる重鎖の置換によって、所与の一組のＣＤＲに対して可能であり、それによって、例えば、ＩｇＧ１−４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１−２、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体タイプ及びアイソタイプが生成し得る。同様に、本発明の範囲内の人工抗体は、完全な合成枠組み内に所与の一組のＣＤＲを埋め込むことによって生成させることができる。
機能的等価物は、当分野で公知の多種多様な方法を用いて、特定の一組のＣＤＲに隣接する可変及び／又は定常領域配列内の変異、欠失及び／又は挿入によって、容易に生成させることができる。
本発明の抗体断片及び機能的等価物は、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体と比較して、ＥｐｈＡに対して検出可能な程度の結合性を有する分子を包含する。検出可能な程度の結合性としては、ＥｐｈＡに対して、ネズミ３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体の少なくとも１０−１００％、好ましくは少なくとも５０％、６０％又は７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の結合能力の範囲のすべての値が挙げられる。
改善された抗体
ＣＤＲは、エピトープ認識及び抗体結合に最も重要である。しかし、ＣＤＲを構成する残基は、その同種のエピトープを認識し、それに結合する抗体の能力に干渉せずに、変化させることができる。例えば、エピトープ認識に影響を及ぼさないが、エピトープに対する抗体の結合親和性を増大させる変化を起こすことができる。
したがって、ＥｐｈＡも特異的に認識し、好ましくは高親和性で、ＥｐｈＡに結合する、ネズミ抗体とヒト化抗体の両方の改善バージョンも本発明の範囲に含まれる。
幾つかの研究によって、結合性、発現レベルなどの抗体の諸性質に対して、一次抗体配列の知識に基づいて、抗体配列の様々な位置に１つ以上のアミノ酸変化を導入する効果が調査された（Ｙａｎｇ， Ｗ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５４：３９２−４０３、Ｒａｄｅｒ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９５：８９１０−８９１５、Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６：５３５−５３９）。
これらの研究においては、オリゴヌクレオチド媒介性部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング、Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）の変異誘発系統などの方法を用いて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３又は枠組み領域における重鎖及び軽鎖遺伝子の配列を変化させることによって、一次抗体の等価物を生成させた（Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６：５３５−５３９、”Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｅｄｓ． Ｋａｙ， Ｂ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ中のＡｄｅｙ， Ｎ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃｈａｐｔｅｒ １６， ｐｐ．２７７−２９１）。一次抗体の配列を変化させるこれらの方法によって、二次抗体の親和性が改善された（Ｇｒａｍ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８９：３５７６−３５８０、Ｂｏｄｅｒ， Ｅ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９７：１０７０１−１０７０５、Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ． ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．， １９９６， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ， ２：１６９−１７９、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５６：７７−８８、Ｓｈｏｒｔ， Ｍ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７：１６３６５−１６３７０、Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６：２７６２２−２７６２８）。
抗体の１個以上のアミノ酸残基を変化させる類似の定方向戦略（ｓｉｍｉｌａｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ）によって、本発明に記載の抗体配列を使用して、ＥｐｈＡに対する改善された親和性を含めて、機能が改善された抗ＥｐｈＡ抗体を開発することができる。
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（２）酸化に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変えるアミノ酸置換、及び（４）かかる類似体の他の物理化学的又は機能的諸性質を付与又は改変するアミノ酸置換である。類似体としては、天然ペプチド配列以外の配列の種々の変異タンパク質を挙げることができる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）が、（好ましくは、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチド部分における）天然配列において行われ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に存在するヘリックスを破壊する傾向にあるべきではなく、親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を乱す傾向にあるべきではない。）。当分野で認識されているポリペプチド二次及び三次構造の例は、その各々を参照により本明細書に組み入れる、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ． Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ． Ｔｏｏｚｅ， ｅｄｓ．， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．（１９９１））及びＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ， ３５４：１０５）に記載されている。
改善された抗体としては、動物免疫化、ハイブリドーマ形成、及び特定の特性を有する抗体の選択の標準技術によって調製された、改善された特性を有する抗体も挙げられる。
本発明は、細胞傷害性抱合体も含む。これらの細胞傷害性抱合体は、２種類の主成分、細胞結合剤及び細胞毒性薬を含む。
本明細書では「細胞結合剤」という用語は、細胞表面のＥｐｈＡ受容体を特異的に認識し、それに結合する薬剤を指す。一実施形態においては、細胞結合剤は、非特異的結合に起因する副作用がほとんどない標的様式で抱合体が作用するように、ＥｐｈＡ受容体を特異的に認識する。
別の一実施形態においては、本発明の細胞結合剤は、さらに、抱合体が標的細胞と、抱合体の細胞毒部分が細胞に作用するのに十分な時間接触するように、及び／又は抱合体が細胞によって内部に取り入れられるのに十分な時間接触するように、ＥｐｈＡ受容体を特異的に認識する。
好ましい一実施形態においては、細胞傷害性抱合体は、細胞結合剤として抗ＥｐｈＡ抗体、より好ましくはネズミ３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２抗ＥｐｈＡモノクローナル抗体を含む。より好ましい一実施形態においては、細胞傷害性抱合体は、ヒト化３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１若しくはＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片を含む。３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体は、ＥｐｈＡ２などのＥｐｈＡ受容体を特異的に認識することができ、細胞毒性薬を癌細胞などの異常細胞又は組織に標的様式で誘導する。
本発明の細胞傷害性抱合体の第２の成分は、細胞毒性薬である。本明細書では「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能若しくは増殖を抑制若しくは遮断する物質、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。
好ましい実施形態においては、細胞毒性薬は、タキソイド、マイタンシノイド（ＤＭ１、ＤＭ４など）、低分子薬物（ｓｍａｌｌ ｄｒｕｇ）、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、プロドラッグ、ＣＣ−１０６５又はＣＣ−１０６５類似体である。好ましい実施形態においては、本発明の細胞結合剤は、直接的に、又は開裂性若しくは非開裂性リンカーを介して、細胞毒性薬に共有結合する。
細胞結合剤、細胞毒性薬及びリンカーを以下により詳細に考察する。
細胞結合剤
治療薬としての本発明の化合物の有効性は、適切な細胞結合剤の慎重な選択に依存する。細胞結合剤は、現在公知である、又は公知になる、任意の種類とすることができ、ペプチド、非ペプチドなどが挙げられる。細胞結合剤は、細胞に特異的又は非特異的に結合し得る任意の化合物であり得る。一般に、これらの細胞結合剤は、抗体（特にモノクローナル抗体）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、ビタミン、（トランスフェリンなどの）栄養素輸送分子、又は任意の他の細胞結合分子若しくは物質であり得る。
使用することができる細胞結合剤のより具体的な例としては、
・ポリクローナル抗体、
・モノクローナル抗体、
・Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどの抗体断片（Ｐａｒｈａｍ， １９８３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３１：２８９５−２９０２、Ｓｐｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９７４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１３：４７０−４７８、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９６０， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ８９：２３０−２４４）
が挙げられる。
好ましくは、ヒト化抗ＥｐｈＡ抗体を本発明の細胞結合剤として使用する。より好ましくは、ヒト化抗ＥｐｈＡ抗体は、ヒト化又は表面再構成３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５；５３．２Ｈ１１；ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体から選択される。
細胞毒性薬
別の一実施形態においては、ヒト化抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片は、マイタンシノイド、トマイマイシン誘導体などの薬物と複合化して、薬物をＥｐｈＡ２受容体に向けることによって抗原発現細胞に対して特定の細胞傷害性を有するプロドラッグを形成することができる。かかる抗体及び毒性の高い低分子薬物（例えば、マイタンシノイド、タキサン、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５類似体）を含む細胞傷害性抱合体は、乳腺腫、卵巣腫ようなどの腫ようの治療薬として使用することができる。
本発明の細胞傷害性抱合体に用いられる細胞毒性薬は、細胞死をもたらす、又は細胞死を誘発する、又は何らかの様式で細胞の生存能を低下させる、任意の化合物であり得る。好ましい細胞毒性薬としては、例えば、以下に規定する、マイタンシノイド及びマイタンシノイド類似体、プロドラッグ、トマイマイシン誘導体、タキソイド、レプトマイシン誘導体、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５類似体が挙げられる。これらの細胞毒性薬は、本明細書に開示する抗体、抗体断片、機能的等価物、改善された抗体及びその類似体と複合化される。
細胞傷害性抱合体は、インビトロ法によって調製することができる。薬物又はプロドラッグを抗体と連結するために、連結基を使用する。適切な連結基は、当分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、感光性基、ペプチダーゼに不安定な基、エステラーゼに不安定な基などが挙げられる。好ましい連結基は、ジスルフィド基及びチオエーテル基である。例えば、抱合体は、ジスルフィド交換反応によって、又は抗体と薬物若しくはプロドラッグとのチオエーテル結合の形成によって、構築することができる。
マイタンシノイド
本発明において細胞傷害性抱合体の形成に使用することができる細胞毒性薬としては、マイタンシノイド及びマイタンシノイド類似体が挙げられる。適切なマイタンシノイドの例としては、マイタンシノール及びマイタンシノール類似体が挙げられる。マイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、ほ乳動物細胞に極めて有毒な薬物である。
適切なマイタンシノール類似体の例としては、改変された芳香環を有する類似体、及び他の位置に改変を有する類似体が挙げられる。かかる適切なマイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号、同４，２５６，７４６号、同４，２９４，７５７号、同４，３０７，０１６号、同４，３１３，９４６号、同４，３１５，９２９号、同４，３３１，５９８号、同４，３６１，６５０号、同４，３６２，６６３号、同４，３６４，８６６号、同４，４５０，２５４号、同４，３２２，３４８号、同４，３７１，５３３号、同６，３３３，４１０号、同５，４７５，０９２号、同５，５８５，４９９号及び同５，８４６，５４５号に開示されている。
改変された芳香環を有する適切なマイタンシノール類似体の具体例としては、
（１）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元によって調製された）Ｃ−１９脱クロロ（ｄｅｃｈｌｏｒｏ）（米国特許第４，２５６，７４６号）、
（２）（ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）若しくはアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いた脱メチル、又はＬＡＨを用いた脱塩素によって調製された）Ｃ−２０ヒドロキシ（又はＣ−２０脱メチル）＋／−Ｃ−１９脱クロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び同４，３０７，０１６号）、及び
（３）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製された）Ｃ−２０脱メトキシ、Ｃ−２０アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）＋／−脱クロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）
が挙げられる。
他の位置の改変を有する適切なマイタンシノール類似体の具体例としては、
（１）（マイタンシノールとＨ２Ｓ又はＰ２Ｓ５の反応によって調製された）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）、
（２）Ｃ−１４アルコキシメチル（脱メトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、
（３）（ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製された）Ｃ−１４ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）、
（４）（ストレプトミセスによるマイタンシノールの転化によって調製された）Ｃ−１５ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）、
（５）（トレウィア ヌジフロラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離された）Ｃ−１５メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び同４，３１５，９２９号）、
（６）（ストレプトミセスによるマイタンシノールの脱メチルによって調製された）Ｃ−１８−Ｎ脱メチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び同４，３２２，３４８号）、及び
（７）（マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製された）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）
が挙げられる。
好ましい一実施形態においては、本発明の細胞傷害性抱合体は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシンと公式に称されるチオール含有マイタンシノイド（ＤＭ１）を細胞毒性薬として利用する。ＤＭ１は、以下の構造式（Ｉ）で表される。
Figure 0005622390
別の好ましい一実施形態においては、本発明の細胞傷害性抱合体は、チオール含有マイタンシノイドＮ２’−デアセチル−Ｎ−２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシンを細胞毒性薬として利用する。ＤＭ４は、以下の構造式（ＩＩ）で表される。
Figure 0005622390
本発明の更なる実施形態においては、硫黄原子を有する炭素原子上のモノ又はジアルキル置換を有するチオール及びジスルフィド含有マイタンシノイドを含めて、他のマイタンシンを使用することができる。これらのマイタンシンとしては、アシル基がヒンダードスルフヒドリル基を有するアシル化アミノ酸側鎖を、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ又はＣ−２０デスメチルに有するマイタンシノイドが挙げられ、チオール官能基を有するアシル基の炭素原子は、１又は２個の置換基を有し（該置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状若しくは分枝アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基である。）、さらに、置換基の１個はＨであり得、アシル基は、カルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有する。
かかる追加のマイタンシンとしては、式（ＩＩＩ）の化合物が挙げられる。
Figure 0005622390
 式中、
Ｙ’は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｒ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺであり、
ここで、
Ｒ１及びＲ２は各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに、Ｒ２はＨであり得、
Ａ、Ｂ、Ｄは、３−１０個の炭素原子を有するシクロアルキル若しくはシクロアルケニル、単純若しくは置換アリール、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは各々独立に０又は１から５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔの少なくとも２個は、いかなる時点においても０ではなく、
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲである（式中、Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基である。）。
式（ＩＩＩ）の好ましい実施形態としては、以下の式（ＩＩＩ）の化合物が挙げられる。
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、ＺがＨである。
Ｒ１及びＲ２がメチルであり、ＺがＨである。
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｚが−ＳＣＨ３である。
Ｒ１及びＲ２がメチルであり、Ｚが−ＳＣＨ３である。
かかる追加のマイタンシンとしては、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）又は（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物も挙げられる。
Figure 0005622390
 式中、
Ｙは（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺであり、
ここで、
Ｒ１及びＲ２は各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに、Ｒ２はＨであり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
ｌ、ｍ及びｎは各々独立に１から５の整数であり、さらに、ｎは０であり得、
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲであり（式中、Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する線状若しくは分枝アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基である。）、
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ又はＣ−２０デスメチルに側鎖を有するマイタンシノイドである。
式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態としては、以下の式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が挙げられる。
Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは各々１であり、ｎは０であり、ＺはＨである。
Ｒ１及びＲ２はメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは１であり、ｎは０であり、ＺはＨである。
Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは各々１であり、ｎは０であり、Ｚは−ＳＣＨ３である。
Ｒ１及びＲ２はメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは１であり、ｎは０であり、Ｚは−ＳＣＨ３である。
好ましくは、細胞毒性薬は、式（ＩＶ−Ｌ）で表される。
かかる追加のマイタンシンとしては、式（Ｖ）の化合物も挙げられる。
Figure 0005622390
 式中、
Ｙは（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺであり、
ここで、
Ｒ１及びＲ２は各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに、Ｒ２はＨであり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
ｌ、ｍ及びｎは各々独立に１から５の整数であり、さらに、ｎは０であり得、
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲである（式中、Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基である。）。
式（Ｖ）の好ましい実施形態としては、以下の式（Ｖ）の化合物が挙げられる。
Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは各々１であり、ｎは０であり、ＺはＨである。
Ｒ１及びＲ２はメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは１であり、ｎは０であり、ＺはＨである。
Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは各々１であり、ｎは０であり、Ｚは−ＳＣＨ３である。
Ｒ１及びＲ２はメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは１であり、ｎは０であり、Ｚは−ＳＣＨ３である。
かかる追加のマイタンシンとしては、さらに、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）又は（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）の化合物も挙げられる。
Figure 0005622390
 式中、
Ｙ２は（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２であり、
ここで、
Ｒ１及びＲ２は各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに、Ｒ２はＨであり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状環式アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
ｌ、ｍ及びｎは各々独立に１から５の整数であり、さらに、ｎは０であり得、
Ｚ２はＳＲ又はＣＯＲであり（Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基である。）、
Ｍａｙはマイタンシノイドである。
かかる追加のマイタンシンとしては、式（ＶＩＩ）の化合物も挙げられる。
Figure 0005622390
 式中、
Ｙ２’は（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｒ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２であり、
ここで、
Ｒ１及びＲ２は各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状分枝若しくはアルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに、Ｒ２はＨであり得、
Ａ、Ｂ及びＤは各々独立に、３から１０個の炭素原子を有するシクロアルキル若しくはシクロアルケニル、単純若しくは置換アリール、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは各々独立に０又は１から５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔの少なくとも２個は、いかなる時点においても０ではなく、
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲである（式中、Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３−１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基である。）。
式（ＶＩＩ）の好ましい実施形態としては、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨである、式（ＶＩＩ）の化合物が挙げられる。
上記マイタンシノイドは、抗ＥｐｈＡ抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１若しくはＥｐｈＡ２−Ｎ２又はその相同体若しくは断片と複合化することができ、抗体は、マイタンシノイドのＣ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ又はＣ−２０デスメチルに存在するアシル化アミノ酸側鎖のアシル基上に存在するチオール又はジスルフィド官能基を用いて、マイタンシノイドと連結され、アシル化アミノ酸側鎖のアシル基は、１又は２個の置換基を有する炭素原子に位置するそのチオール又はジスルフィド官能基を有し（該置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基である。）、さらに、置換基の１個はＨであり得、アシル基は、カルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有する。
本発明の好ましい抱合体は、式（ＶＩＩＩ）のマイタンシノイドと複合化された、抗ＥｐｈＡ抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１若しくはＥｐｈＡ２−Ｎ２又はその相同体若しくは断片を含む抱合体である。
Figure 0005622390
 式中、
Ｙ１’は（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｒ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２Ｓ−であり、
ここで、
Ａ、Ｂ及びＤは各々独立に、３−１０個の炭素原子を有するシクロアルキル若しくはシクロアルケニル、単純若しくは置換アリール、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは各々独立に０又は１から５の整数であり、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔの少なくとも２個は、いかなる時点においても０ではない。
好ましくは、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はＨであり、又はＲ１及びＲ２はメチルである。
本発明の更に好ましい抱合体は、式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）又は（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）のマイタンシノイドと複合化された、抗ＥｐｈＡ抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１若しくはＥｐｈＡ２−Ｎ２又はその相同体若しくは断片を含む抱合体である。
Figure 0005622390
 式中、
Ｙ１は（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２Ｓ−であり、
ここで、
Ｒ１及びＲ２は各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり、さらに、Ｒ２はＨであり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する線状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝若しくは環式アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、
ｌ、ｍ及びｎは各々独立に１から５の整数であり、さらに、ｎは０であり得、
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ又はＣ−２０デスメチルに側鎖を有するマイタンシノールである。
式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）及び（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態としては、
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、又はＲ１及びＲ２がメチルであり、
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、ｎが０であり、
Ｒ１及びＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０である、
式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）及び（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の化合物が挙げられる。
好ましくは、細胞毒性薬は、式（ＩＸ−Ｌ）で表される。
本発明の更に好ましい抱合体は、式（Ｘ）のマイタンシノイドと複合化された、抗ＥｐｈＡ抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１若しくはＥｐｈＡ２−Ｎ２又はその相同体若しくは断片を含む抱合体である。
Figure 0005622390
式中、置換基は、上記式（ＩＸ）に対して定義したとおりである。
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、ｎが０である、上記化合物のいずれも特に好ましい。
Ｒ１及びＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０である、上記化合物のいずれも更に特に好ましい。
また、Ｌ−アミノアシル立体異性体が好ましい。
２００４年５月２０日に出願された係属中の米国特許出願第１０／８４９，１３６号に教示されたマイタンシノイドの各々も、本発明の細胞傷害性抱合体に使用することができる。米国特許出願第１０／８４９，１３６号の開示全体を参照により本明細書に組み入れる。
ジスルフィド含有連結基
マイタンシノイドを、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体などの細胞結合剤に連結するために、マイタンシノイドは、連結部分を含む。連結部分は、十分に活性なマイタンシノイドを遊離することができる化学結合を特別な部位に含む。適切な化学結合は、当分野で周知であり、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、感光性結合、ペプチダーゼに不安定な結合、エステラーゼに不安定な結合などが挙げられる。ジスルフィド結合が好ましい。
連結部分は、反応性化学基も含む。好ましい一実施形態においては、反応性化学基は、ジスルフィド結合連結部分を介してマイタンシノイドと共有結合することができる。
特に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステル及びＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。
反応性化学基を含む連結部分を含む特に好ましいマイタンシノイドは、連結部分がジスルフィド結合を含み、化学反応基がＮ−スクシンイミジル又はＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含む、マイタンシノールのＣ−３エステル、及びその類似体である。
マイタンシノイド上の多数の位置が、連結部分に化学的に結合するための位置として役立ち得る。例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシ基を有するＣ−２０位はすべて有用であると予想される。しかし、Ｃ−３位が好ましく、マイタンシノールのＣ−３位が特に好ましい。
連結部分を有するマイタンシノールのエステルの合成をジスルフィド結合含有連結部分の面から記述するが、当業者は、（上述した）他の化学結合との連結部分を、本発明に使用できることも理解されたい。他のマイタンシノイドも同様である。他の化学結合の具体例としては、酸に不安定な結合、感光性結合、ペプチダーゼに不安定な結合、及びエステラーゼに不安定な結合が挙げられる。本明細書に組み入れる米国特許第５，２０８，０２０号の開示は、かかる結合を有するマイタンシノイドの製造を教示する。
反応基を有するジスルフィド部分を含むマイタンシノイド及びマイタンシノイド誘導体の合成は、その各々を参照により本明細書に組み入れる、米国特許第６、４４１，１６３号及び同６，３３３，４１０号並びに米国特許出願第１０／１６１，６５１号に記載されている。
ＤＭ１などの反応基含有マイタンシノイドは、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１又はＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体などの抗体と反応して、細胞傷害性抱合体を生成する。これらの抱合体は、ＨＰＬＣ又はゲルろ過によって精製することができる。
かかる抗体−マイタンシノイド抱合体を製造する幾つかの優れたスキームは、その各々を参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第６，３３３，４１０号、並びに米国特許出願第０９／８６７，５９８号、同１０／１６１，６５１号及び同１０／０２４，２９０号に記載されている。
一般に、水性緩衝剤中の抗体溶液を、反応基を有するジスルフィド部分を含むモル過剰のマイタンシノイドと一緒に温置することができる。（エタノールアミン、タウリンなどの）過剰のアミンを添加することによって、反応混合物をクエンチすることができる。次いで、マイタンシノイド−抗体抱合体をゲルろ過によって精製することができる。
抗体分子１個当たりの結合マイタンシノイド分子の数は、２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度比を分光光度的に測定することによって求めることができる。平均１−１０マイタンシノイド分子／抗体分子が好ましい。
抗体とマイタンシノイド薬物の抱合体を、種々の望ましくない細胞系の増殖を抑制する能力についてインビトロで評価することができる。例えば、ヒト類表皮癌系統Ａ−４３１、ヒト小細胞肺癌細胞系ＳＷ２、ヒト乳腺腫系統ＳＫＢＲ３、バーキットリンパ腫細胞系Ｎａｍａｌｗａなどの細胞系を、これらの化合物の細胞傷害性の評価に容易に使用することができる。評価すべき細胞を化合物に２４時間曝露し、細胞の生存割合を直接アッセイにおいて公知の方法によって測定することができる。次いで、アッセイ結果からＩＣ５０値を計算することができる。
ＰＥＧ含有連結基
マイタンシノイドは、米国特許出願第１０／０２４，２９０号に記載のように、ＰＥＧ連結基を用いて、細胞結合剤に連結することもできる。これらのＰＥＧ連結基は、水と非水系溶媒の両方に可溶であり、１種類以上の細胞毒性薬を細胞結合剤に連結するのに使用することができる。例示的なＰＥＧ連結基としては、リンカーの両端において、一端のスルフヒドリル又はジスルフィド官能基と、他端の活性エステルとを介して、細胞毒性薬と細胞結合剤に結合するヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーが挙げられる。
ＰＥＧ連結基を用いた細胞傷害性抱合体の合成の一般例として、具体的詳細については、やはり米国特許出願第１０／０２４，２９０号を参照されたい。合成は、反応性ＰＥＧ部分を有する１種類以上の細胞毒性薬と細胞結合剤の反応で始まり、各反応性ＰＥＧ部分の末端活性エステルを、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１、ＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体などの細胞結合剤のアミノ酸残基で置換して、ＰＥＧ連結基を介して細胞結合剤に共有結合した１種類以上の細胞毒性薬を含む細胞傷害性抱合体を得る。
タキサン
本発明による細胞傷害性抱合体に使用される細胞毒性薬は、タキサン又はその誘導体とすることもできる。
タキサンは、細胞傷害性天然物であるパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、及び半合成誘導体であるドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）を含む化合物の１ファミリーであり、２種類の化合物は癌治療に広く用いられる。タキサンは、チューブリンの解重合を阻害し、細胞死をもたらす紡錘体毒である。ドセタキセル及びパクリタキセルは癌治療に有用な薬剤であるが、正常細胞に対する非特異的毒性のために、その抗腫よう活性は限られている。また、パクリタキセル及びドセタキセルのような化合物自体は、細胞結合剤の抱合体に使用するには効力が不十分である。
細胞傷害性抱合体の調製用に好ましいタキサンは、式（ＸＩ）のタキサンである。
Figure 0005622390
本発明の細胞傷害性抱合体に使用することができるタキサンを合成する方法は、タキサンを３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１、ＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体などの細胞結合剤と複合化する方法と一緒に、米国特許第５，４１６，０６４号、同５，４７５，０９２号、同６，３４０，７０１号、同６，３７２，７３８号及び同６，４３６，９３１号、並びに米国特許出願第１０／０２４，２９０号、同１０／１４４，０４２号、同１０／２０７，８１４号、同１０／２１０，１１２号及び同１０／３６９，５６３号に詳述されている。
トマイマイシン誘導体
本発明による細胞傷害性は、トマイマイシン誘導体とすることもできる。トマイマイシン誘導体は、ＤＮＡの副溝中のグアニンのＮ２に共有結合することによって生物学的諸性質を発揮する化合物の公知クラスであるピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。ＰＢＤとしては、アントラマイシン、ネオトラマイシン、ＤＣ−８１などの幾つかの副溝結合剤が挙げられる。
高い細胞傷害性を保持し、細胞結合剤に効果的に結合することができる新規トマイマイシン誘導体は、その内容を参照により本明細書に組み入れる国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００１４２号に記載されている。細胞結合剤−トマイマイシン誘導体複合体は、望ましくない細胞のみに対して標的様式で適用されるトマイマイシン誘導体の十分な細胞傷害作用を可能にし、したがって非標的正常細胞の損傷による副作用を回避することができる。
本発明による細胞毒性薬は、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１、ＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体などの細胞結合剤に連結基を介して結合した１種類以上のトマイマイシン誘導体を含む。連結基は、トマイマイシン誘導体に従来の方法によって共有結合する化学部分の一部である。好ましい一実施形態においては、化学部分は、トマイマイシン誘導体にジスルフィド結合を介して共有結合し得る。
本発明に有用であるトマイマイシン誘導体は、下記式（ＸＩＩ）、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくは鏡像異性体を有する。
Figure 0005622390
 式中、
−−−は、必須でない単結合を表し、
Figure 0005622390
 は、単結合又は二重結合を表し、
ただし、
Figure 0005622390
 が単結合であるときには、ＵとＵ’は、同じでも異なっていても、独立にＨであり、ＷとＷ’は、同じでも異なっていても、ＯＨ、−ＯＲなどのエーテル、−ＯＣＯＲなどのエステル（例えば、酢酸エステル）、−ＯＣＯＯＲなどのカルボナート、−ＯＣＯＮＲＲ’などのカルバマート、Ｎ１０とＣ１１が環（ｃｙｃｌｅ）の一部であるような環式カルバマート、−ＮＲＣＯＮＲＲ’などの尿素、−ＯＣＳＮＨＲなどのチオカルバマート、Ｎ１０とＣ１１が環の一部であるような環式チオカルバマート、−ＳＨ、−ＳＲなどのスルフィド、−ＳＯＲなどのスルホキシド、−ＳＯＯＲなどのスルホン、−ＳＯ３−などのスルホナート、−ＮＲＳＯＯＲなどのスルホンアミド、−ＮＲＲ’などのアミン、Ｎ１０とＣ１１が環の一部であるような、場合によっては環式のアミン、−ＮＲＯＲ’などのヒドロキシルアミン誘導体、−ＮＲＣＯＲなどのアミド、−Ｎ３などのアジド、シアノ、ハロ、トリアルキル又はトリアリールホスホニウム、アミノ酸誘導基からなる群から独立に選択され、好ましくはＷとＷ’は、同じであり、又は異なり、ＯＨ、Ｏｍｅ、Ｏｅｔ、ＮＨＣＯＮＨ２、ＳＭｅであり、
Figure 0005622390
 が二重結合であるときには、Ｕ及びＵ’は存在せず、Ｗ及びＷ’はＨであり、
・Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’は、同じであり、又は異なり、ハロゲン化物、若しくは１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、アリール、Ｈｅｔ、Ｓ（Ｏ）ｑＲで置換されていてもよいアルキルから独立に選択され、又はＲ１とＲ２及びＲ１’とＲ２’は、それぞれ基＝Ｂ及び＝Ｂ’を含む二重結合を一緒に形成する。
好ましくは、Ｒ１とＲ２及びＲ１’とＲ２’は、それぞれ基＝Ｂ及び＝Ｂ’を含む二重結合を一緒に形成する。
・ＢとＢ’は、同じであり、又は異なり、１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、アリール、Ｈｅｔ、Ｓ（Ｏ）ｑＲで置換されていてもよいアルケニルから独立に選択され、又はＢ及びＢ’は酸素原子である。
好ましくは、Ｂ＝Ｂ’。
より好ましくは、Ｂ＝Ｂ’＝＝ＣＨ２又は＝ＣＨ−ＣＨ３。
・Ｘ、Ｘ’は、同じであり、又は異なり、１個以上の−Ｏ−、−ＮＲ−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｑ−から独立に選択される。
好ましくは、Ｘ＝Ｘ’。
より好ましくは、Ｘ＝Ｘ’＝Ｏ。
・Ａ、Ａ’は、同じであり、又は異なり、酸素、窒素又は硫黄原子を含んでいてもよいアルキル又はアルケニルから独立に選択され、各々は１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ、アリール、Ｈｅｔ、アルキル、アルケニルで置換されていてもよい。
好ましくは、Ａ＝Ａ’。
より好ましくは、Ａ＝Ａ’＝線状非置換アルキル。
・Ｙ、Ｙ’は、同じであり、又は異なり、Ｈ、ＯＲから独立に選択され、
好ましくは、Ｙ＝Ｙ’。
より好ましくは、Ｙ＝Ｙ’＝Ｏアルキル、より好ましくはＯメチル。
・Ｔは、−ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｑ−、又は４から１０員のアリール、シクロアルキル、複素環式若しくはヘテロアリールであり、各々は１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、Ｒ、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ及び／又はリンカーで置換されていてもよく、又は１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ及び／又はリンカーで置換されていてもよい分枝アルキル、又は１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ及び／又はリンカーで置換された線状アルキルである。
好ましくは、Ｔは、４から１０員のアリール又はヘテロアリールであり、より好ましくは、１個以上のリンカーで置換されていてもよいフェニル又はピリジルである。
前記リンカーは、連結基を含む。適切な連結基は、当分野で周知であり、チオール、スルフィド、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、感光性基、ペプチダーゼに不安定な基、エステラーゼに不安定な基などが挙げられる。ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。
連結基がチオール、スルフィド（又はいわゆるチオエーテル−Ｓ−）又はジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）を含有する基であるとき、チオール、スルフィド又はジスルフィド基を有する側鎖は、線状又は分枝、芳香族又は複素環式であり得る。当業者は、適切な側鎖を容易に特定することができる。
好ましくは、前記リンカーは、次式のものである。
−Ｇ−Ｄ−（Ｚ）ｐ−Ｓ−Ｚ’
式中、
Ｇは、単結合又は二重結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ−であり、
Ｄは、単結合又は−Ｅ−、−Ｅ−ＮＲ−、−Ｅ−ＮＲ−Ｆ−、−Ｅ−Ｏ−、−Ｅ−Ｏ−Ｆ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＯ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＯ−Ｆ−、−Ｅ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｅ−、−Ｅ−ＣＯ−Ｆ、−Ｅ−Ｓ−、−Ｅ−Ｓ−Ｆ−、−Ｅ−ＮＲ−Ｃ−Ｓ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＳ−Ｆ−であり、
ここで、ＥとＦは、同じであり、又は異なり、線状又は分枝−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−アルキル−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉシクロアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ複素環式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉシクロアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ複素環式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−シクロアルキル−アルキル−、−アルキル−シクロアルキル−、−複素環式−アルキル−、−アルキル−複素環式−、−アルキル−アリール−、−アリール−アルキル−、−アルキル−ヘテロアリール−、−ヘテロアリール−アルキル−から独立に選択され、
ここで、ｉとｊは、同じでも異なっていても、整数であり、０、１から２０００から独立に選択され、
Ｚは線状又は分枝−アルキル−であり、
ｐは０又は１であり、
Ｚ’は、Ｈであり、ＣＯＲ、Ｒ２０又はＳＲ２０などのチオール保護基であり、Ｒ２０はＨ、メチル、アルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又は複素環式であり、ただし、Ｚ’がＨであるときには、前記化合物は、ＰＢＤ部分のうちの１個のイミン結合−ＮＨ＝上のチオール基−ＳＨの付加に起因する分子内環化によって形成される対応する化合物と平衡にある。
・ｎ、ｎ’は、同じでも異なっていても０又は１である。
・ｑは０、１又は２である。
・Ｒ、Ｒ’は、同じであり、又は異なり、Ｈ、アルキル、アリールから独立に選択され、各々はＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、Ｒ、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ、アリール、Ｈｅｔで置換されていてもよい。
幾何及び立体異性体を有する一般式（ＸＩＩ）の化合物も本発明の一部である。
式（ＸＩＩ）のトマイマイシン誘導体のＮ−１０、Ｃ−１１二重結合は、水、アルコール、チオール、第一級又は第二級アミン、尿素及び他の求核剤の存在下で、対応するイミン付加体に可逆的に容易に転化可能であることが知られている。このプロセスは可逆的であり、脱水剤の存在下で、非プロトン性有機溶媒中で、減圧下で、又は高温で、対応するトマイマイシン誘導体を容易に再生することができる（Ｚ． Ｔｏｚｕｋａ， １９８３， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， ３６：２７６）。
したがって、一般式（ＸＩＩＩ）のトマイマイシン誘導体の可逆的誘導体も、本発明に使用することができる。
Figure 0005622390
 式中、Ａ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ｔ、Ａ’、Ｘ’、Ｙ’、ｎ’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’は式（ＸＩＩ）と同様に定義され、Ｗ、Ｗ’は、同じであり、又は異なり、ＯＨ、−ＯＲなどのエーテル、−ＯＣＯＲ、−ＣＯＯＲなどのエステル（例えば、酢酸エステル）、−ＯＣＯＯＲなどのカルボナート、−ＯＣＯＮＲＲ’などのカルバマート、Ｎ１０とＣ１１が環の一部であるような環式カルバマート、−ＮＲＣＯＮＲＲ’などの尿素、−ＯＣＳＮＨＲなどのチオカルバマート、Ｎ１０とＣ１１が環の一部であるような環式チオカルバマート、−ＳＨ、−ＳＲなどのスルフィド、−ＳＯＲなどのスルホキシド、−ＳＯＯＲなどのスルホン、−ＳＯ３−などのスルホナート、−ＮＲＳＯＯＲなどのスルホンアミド、−ＮＲＲ’などのアミン、Ｎ１０とＣ１１が環の一部であるような、場合によっては環式のアミン、−ＮＲＯＲ’などのヒドロキシルアミン誘導体、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲＲ’などのアミド、−Ｎ３などのアジド、シアノ、ハロ、トリアルキル又はトリアリールホスホニウム、アミノ酸誘導基からなる群から選択される。好ましくは、ＷとＷ’は、同じであり、又は異なり、ＯＨ、Ｏｍｅ、Ｏｅｔ、ＮＨＣＯＮＨ２、ＳＭｅである。
したがって、式（ＸＩＩＩ）の化合物は、溶媒が水であるときには水を含む、溶媒和化合物とみなすことができる。これらの溶媒和化合物は特に有用であり得る。
好ましい一実施形態においては、本発明のトマイマイシン誘導体は、以下からなる群から選択される。
・８，８’−［１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［５−メトキシ−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［１，５−ペンタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［１，４−ブタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［３−メチル−１，５−ペンタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［２，６−ピリジンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［４−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピルオキシ）−２，６−ピリジンジイルビス−（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［５−（３−アミノプロピルオキシ）−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［５−（Ｎ−メチル−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）−１，３−ベンゼンジイルビス−（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−｛５−［３−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）プロピルオキシ］−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）｝−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［５−アセチルチオメチル−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−メチレン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・ビス−｛２−［（Ｓ）−２−メチレン−７−メトキシ−５−オキソ−１，３，，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−８−イルオキシ］−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
・８，８’−［３−（２−アセチルチオエチル）−１，５−ペンタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−メチレン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［５−（Ｎ−４−メルカプト−４，４−ジメチルブタノイル）アミノ−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［５−（Ｎ−４−メチルジチオ−４，４−ジメチルブタノイル）−アミノ−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［５−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−メルカプト−２，２−ジメチルエチル）アミノ−１，３−ベンゼンジイル（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［５−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−メチルジチオ−２，２−ジメチルエチル）アミノ−１，３−ベンゼンジイル（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（４−（２−（４−メルカプト−４−メチル）−ペンタンアミド−エトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（１−（２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（４−（３−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド−プロポキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（４−（４−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド−ブトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（４−（３−［４−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイル）−ピペラジン−１−イル］−プロピル）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（１−（３−［４−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイル）−ピペラジン−１−イル］−プロピル）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（４−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（１−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（１−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（４−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（１−（２−［メチル−（２−メチル−２−メチルジスルファニル−プロピル）−アミノ］−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（４−（３−［メチル−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイル）−アミノ］−プロピル）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
・８，８’−［（４−（３−［メチル−（２−メチル−２−メチルジスルファニル−プロピル）−アミノ］−プロピル）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（１−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
並びに対応するメルカプト誘導体、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくは鏡像異性体。
好ましい化合物は、次式の化合物である。
Figure 0005622390
 式中、Ｘ、Ｘ’、Ａ、Ａ’、Ｙ、Ｙ’、Ｔ、ｎ、ｎ’は、上と同様に定義される。
式（ＸＩＩ）の化合物は、当業者に周知である幾つかの方法で調製することができる。式（ＸＩＩ）の化合物は、例えば、下記方法の適用若しくは手直し、又は当業者が認識するそれに対する変形によって、合成することができる。適切な改変及び置換は、科学文献から当業者に容易に理解でき、周知であり、又は容易に得ることができる。特に、かかる方法は、Ｒ．Ｃ． Ｌａｒｏｃｋ， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９９に見いだすことができる。
本発明に使用することができるトマイマイシン誘導体を合成する方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００１４２号に記載されている。本発明の化合物は、種々の合成経路によって調製することができる。試薬及び出発材料は、市販されており、又は当業者によって、周知の技術によって容易に合成される（例えば、国際公開第００／１２５０８号、同００／１２５０７号、同２００５／０４０１７０号、同２００５／０８５２６０号、ＦＲ１５１６７４３、Ｍ． Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ４２：３７９３−３８０６参照）。
本発明の抱合体分子は、任意の技術を用いて形成することができる。本発明のトマイマイシン誘導体は、酸に不安定なリンカー、又は感光性リンカーによって、抗体又は他の細胞結合剤に連結することができる。トマイマイシン誘導体は、適切な配列を有するペプチドと縮合させ、続いて細胞結合剤に連結して、ペプチダーゼに不安定なリンカーを生成させることができる。抱合体は、第一級ヒドロキシル基を含むように調製することができ、スクシニル化し、細胞結合剤に連結して、細胞内エステラーゼによって切断されて遊離誘導体を遊離し得る抱合体を生成させることができる。好ましくは、トマイマイシン誘導体を、遊離又は保護チオール基を含むように合成し、次いで１個以上のジスルフィド又はチオール含有誘導体をジスルフィド結合又はチオエーテル結合によって細胞結合剤に各々共有結合させる。
多数の複合化方法が米国特許第５，４１６，０６４号及び同５，４７５，０９２号に教示されている。トマイマイシン誘導体は、遊離アミノ基を生成するように改変することができ、次いで酸に不安定なリンカー、又は感光性リンカーを介して、抗体又は他の細胞結合剤に連結することができる。遊離アミノ又はカルボキシル基を有するトマイマイシン誘導体は、ペプチドと縮合させ、続いて細胞結合剤に連結して、ペプチダーゼに不安定なリンカーを生成させることができる。リンカー上に遊離ヒドロキシル基を有するトマイマイシン誘導体は、スクシニル化し、細胞結合剤に連結して、細胞内エステラーゼによって切断されて遊離薬物を遊離し得る抱合体を生成させることができる。最も好ましくは、トマイマイシン誘導体を処理して、遊離又は保護チオール基を生成させ、次いでジスルフィド又はチオールを含有するトマイマイシン２量体をジスルフィド結合を介して細胞結合剤に連結する。
好ましくは、モノクローナル抗体−又は細胞結合剤−トマイマイシン誘導体抱合体は、ジスルフィド結合を介して連結され、上述したように、トマイマイシン誘導体を送達する能力のある抱合体である。かかる細胞結合抱合体は、スクシンイミジルピリジル−ジチオプロピオナート（ＳＰＤＰ）を用いたモノクローナル抗体の修飾などの公知の方法によって調製される（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １７３：７２３−７３７）。次いで、生成したチオピリジル基を、チオール含有トマイマイシン誘導体で処理して置換して、ジスルフィドによって連結された抱合体を生成させる。或いは、アリールジチオ−トマイマイシン誘導体の場合には、細胞結合抱合体は、抗体分子に前もって導入されたスルフヒドリル基で、トマイマイシン誘導体のアリール−チオールを直接置換することによって、形成される。ジスルフィド架橋によって連結された１から１０種類のトマイマイシン誘導体薬物を含有する抱合体は、いずれかの方法によって容易に調製される。
より具体的には、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む、ｐＨ７．５の、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝剤中２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のジチオ−ニトロピリジル修飾抗体の溶液を、チオール含有トマイマイシン誘導体（１．３モル当量／ジチオピリジル基）で処理する。修飾抗体からのチオ−ニトロピリジンの放出は、３２５ｎｍで分光光度的にモニターされ、約１６時間で終了する。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５又はＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラムを用いたゲルろ過によって、抗体−トマイマイシン誘導体抱合体を精製し、未反応薬物及び他の低分子量材料を取り除く。抗体分子１個当たりの結合トマイマイシン誘導体部分の数は、２３０ｎｍと２７５ｎｍの吸光度比を測定することによって求めることができる。平均１−１０個のトマイマイシン誘導体分子／抗体分子を、この方法によってジスルフィド結合を介して連結することができる。
抗原発現細胞に対する結合親和性についての複合化の効果は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９３：８６１８−８６２３によって以前に記述された方法を用いて求めることができる。細胞系に対するトマイマイシン誘導体及びその抗体抱合体の細胞傷害性は、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３５：３６４８−３６５１に記載のように、細胞増殖曲線を後方に外挿することによって、測定することができる。接着細胞系に対するこれらの化合物の細胞傷害性は、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １０２：１３１２−１３１９に記載のように、クローン原性アッセイによって求めることができる。
レプトマイシン誘導体
本発明による細胞傷害性は、レプトマイシン誘導体とすることもできる。本発明による「レプトマイシン誘導体」は、Ｋａｌｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００２， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ８：９８１−１００３）に定義されたレプトマイシンファミリーのメンバーを指し、レプトマイシンＡ、レプトマイシンＢなどのレプトマイシン、カリスタチン、ラトジャドンＡ、ラトジャドンＢなどのラトジャドン、アングイノマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどのアングイノマイシン、カズサマイシン、レプトルスタチン、レプトフラニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどのレプトフラニンなどが挙げられる。レプトマイシンＡ及びＢの誘導体が好ましい。
より具体的には、本発明の誘導体は、式（Ｉ）の誘導体、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくは鏡像異性体である。
Figure 0005622390
 式中、
Ｒａ及びＲａ’はＨ又は−Ａｌｋであり、好ましくはＲａは−Ａｌｋであり、好ましくはメチルであり、Ｒａ’はＨであり、
Ｒ１７は、ＯＲ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ペルフルオロアルキルで置換されていてもよいアルキルであり、好ましくは、Ｒ１７はアルキル、より好ましくはメチル又はエチルであり、
Ｒ９は、ＯＲ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ペルフルオロアルキルで置換されていてもよいアルキルであり、好ましくは、Ｒ９はアルキル、より好ましくはメチルであり、
Ｘは−Ｏ−又は−ＮＲ−であり、好ましくはＸは−ＮＲ−であり、
Ｙは−Ｕ−、−ＮＲ−Ｕ−、−Ｏ−Ｕ−、−ＮＲ−ＣＯ−Ｕ−、−Ｕ−ＮＲ−ＣＯ−、−Ｕ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｕ−であり、
好ましくは、Ｘが−Ｏ−であるときには、Ｙは−Ｕ−、−ＮＲ−Ｕ−、−Ｕ−ＮＲ−ＣＯ−であり、
ここで、Ｕは、線状又は分枝−Ａｌｋ−、−Ａｌｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ａｌｋ−、−Ａｌｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ａｌｋ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−、−シクロアルキル−、−複素環式−、−シクロアルキル−Ａｌｋ−、−Ａｌｋ−シクロアルキル−、−複素環式−Ａｌｋ−、−Ａｌｋ−複素環式−から選択され、
ｍは、１から２０００から選択される整数であり、
好ましくは、Ｕは線状又は分枝−Ａｌｋ−であり、
Ｚは−Ａｌｋ−であり、
ｎは０又は１であり、好ましくはｎは０であり、
Ｔは、Ｈであり、Ａｃ、Ｒ１、ＳＲ１などのチオール保護基であり、Ｒ１は、Ｈ、メチル、Ａｌｋ、シクロアルキル、置換されていてもよいアリール、若しくは複素環式であり、又はＴは
Figure 0005622390
 を表し、ここで、
Ｒａ、Ｒａ’、Ｒ１７、Ｒ９、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎは、上と同様に定義され、
好ましくは、ＴはＨ又はＳＲ１であり、Ｒ１はＡｌｋ、より好ましくはメチルであり、
Ｒ、Ｒ’は、同じでも異なっていても、Ｈ又はアルキルであり、
Ａｌｋは、線状又は分枝アルキルであり、好ましくは、Ａｌｋは（−（ＣＨ２−ｑ（ＣＨ３）ｑ）ｐ−であり（式中、ｐは１から１０の整数であり、ｑは０から２の整数である。）、好ましくは、Ａｌｋは−（ＣＨ２）−又は−Ｃ（ＣＨ３）２−である。
好ましい化合物は、以下から選択することができる。
・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メチルスルファニル−エチル）−アミド
・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸］のビス−［（２−メルカプトエチル）−アミド
・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メルカプト−エチル）−アミド
・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メチルジスルファニル−エチル）−アミド
・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メチル−２−メチルジスルファニル−プロピル）−アミド
・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メルカプト−２−メチル−プロピル）−アミド
又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくは鏡像異性体。
誘導体を細胞結合剤に連結するために、誘導体は、ジスルフィド結合、スルフィド（又は本明細書ではチオエーテルと称する。）結合、酸に不安定な基、感光性基、ペプチダーゼに不安定な基、エステラーゼに不安定な基などの結合を介して、誘導体が細胞結合剤に結合することができる部分（連結基）を含まなければならない。誘導体は、例えば、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、酸に不安定な基、感光性基、ペプチダーゼに不安定な基、又はエステラーゼに不安定な基を介して、レプトマイシン誘導体を細胞結合剤に連結するのに必要な部分を含むように調製される。水溶液への溶解性を更に高めるために、連結基は、ポリエチレングリコールスペーサーを含むことができる。好ましくは、スルフィド又はジスルフィド結合を用いる。というのは、標的細胞の還元環境によって、スルフィド又はジスルフィドが切断され、細胞傷害性がそれに付随して増加した誘導体が放出されるからである。
本発明の化合物は、種々の合成経路によって調製することができる。試薬及び出発材料は、市販されており、又は当業者によって、周知の技術によって容易に合成される。本発明の細胞傷害性抱合体に使用することができるレプトマイシン誘導体を合成する方法は、該レプトマイシン誘導体を抗体などの細胞結合剤と複合化する方法と一緒に、その内容を参照により本明細書に組み入れる欧州特許出願公開第０６２９０９４８．６号に詳述されている。
ＣＣ−１０６５類似体
本発明による細胞傷害性抱合体に使用される細胞毒性薬は、ＣＣ−１０６５又はその誘導体とすることもできる。
ＣＣ−１０６５は、ストレプトミセス ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離される強力な抗腫よう抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、インビトロで、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンクリスチンなどの一般に使用される抗癌薬の約１０００倍強力である（Ｂ．Ｋ． Ｂｈｕｙａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４２， ３５３２−３５３７）。ＣＣ−１０６５及びその類似体は、米国特許第６，３７２，７３８号、同６，３４０，７０１号、同５，８４６，５４５号及び同５，５８５，４９９号に開示されている。
ＣＣ−１０６５の細胞傷害作用強度は、そのアルキル化活性及びそのＤＮＡ結合又はＤＮＡ挿入活性と相関する。これら２つの活性は、分子の別々の部分に存在する。すなわち、アルキル化活性は、シクロプロパピロロインドール（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｐｙｒｒｏｌｏｉｎｄｏｌｅ）（ＣＰＩ）サブユニットに含まれ、ＤＮＡ結合活性は、２個のピロロインドールサブユニットに存在する。
ＣＣ−１０６５は、細胞毒性薬としてある種の魅力的な特徴を有するが、治療用には制限がある。ＣＣ−１０６５をマウスに投与すると、遅延肝毒性を引き起こし、１回の静注投与量１２．５μｇ／ｋｇ後５０日目に死（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）をもたらした（Ｖ．Ｌ． Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， ＸＸＩＸ：３１９−３３４）。これは、遅延毒性を起こさない類似体の開発努力に拍車をかけ、ＣＣ−１０６５を基にしたより単純な類似体の合成が記述された（Ｍ．Ａ． Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３１：５９０−６０３）。
別の一連の類似体においては、ＣＰＩ部分がシクロプロパベンゾインドール（ＣＢＩ）部分で置換された（Ｄ．Ｌ． Ｂｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ５５：５８２３−５８３３、Ｄ．Ｌ． Ｂｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， ＢｉｏＯｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １：１１５−１２０）。これらの化合物は、マウスにおいて遅延毒性を起こさずに、親薬物の高いインビトロ効力を維持する。ＣＣ−１０６５同様、これらの化合物は、ＤＮＡの副溝に共有結合様式で結合して細胞死を起こすアルキル化剤である。しかし、最も有望な類似体アドゼレシン及びカルゼレシンの臨床評価は、失望する結果となった（Ｂ．Ｆ． Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ， １３：３２１−３２６、Ｉ． Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２：１７１７−１７２３）。これらの薬物は、その高い全身毒性のために、治療効果が不十分である。
ＣＣ−１０６５類似体の治療効力は、腫よう部位への標的送達によって生体内での分布を変えて、非標的組織への毒性を低下させ、したがって全身毒性を低下させることによって、大きく改善することができる。この目標を達成するために、ＣＣ−１０６５の類似体及び誘導体と、腫よう細胞を特異的に標的にする細胞結合剤との抱合体が記述された（米国特許第５，４７５，０９２号、同５，５８５，４９９号、同５，８４６，５４５号）。これらの抱合体は、典型的には、インビトロでの高い標的特異的細胞傷害性、及びマウスにおけるヒト腫よう異種移植モデルにおける例外的な抗腫よう活性を示す（Ｒ．Ｖ．Ｊ． Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５：４０７９−４０８４）。
最近、水性媒体への高い溶解性を有するＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグが記述された（欧州特許出願第０６２９０３７９．４号）。これらのプロドラッグでは、酸性水溶液中に貯蔵すると薬物を安定にし、非保護類似体よりも高い水溶性を薬物に付与する官能基で、分子のアルキル化部分のフェノール基が保護される。保護基は、生体内で生理学的ｐＨで容易に開裂して、対応する活性薬物を与える。欧州特許出願第０６２９０３７９．４号に記載のプロドラッグでは、フェノール置換基は、生理学的ｐＨにおいて電荷を有するスルホン酸含有フェニルカルバマートとして保護され、したがって高い水溶性を有する。水溶性を更に高めるために、任意選択のポリエチレングリコールスペーサーを、インドリルサブユニットとジスルフィド基などの開裂可能な結合との間のリンカーに導入することができる。このスペーサーの導入は、薬物の効力を変えない。
本発明の細胞傷害性抱合体に使用することができるＣＣ−１０６５類似体を合成する方法は、該類似体を抗体などの細胞結合剤と複合化する方法と一緒に、欧州特許出願第０６２９０３７９．４号（その内容を参照により本明細書に組み入れる。）、米国特許第５，４７５，０９２号、同５，８４６，５４５号、同５，５８５，４９９号、同６，５３４，６６０号及び同６，５８６，６１８号、並びに米国特許出願第１０／１１６，０５３号及び同１０／２６５，４５２号に詳述されている。
他の薬物
メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、カリキアマイシン、ツブリシン及びツブリシン類似体、デュオカルマイシン及びデュオカルマイシン類似体、ドラスタチン及びドラスタチン類似体などの薬物も、本発明の抱合体の調製に適切である。薬物分子は、血清アルブミンなどの中間担体分子を介して、抗体分子と連結することもできる。例えば米国特許第６，６３０，５７９号に記載の、ドキソルビシン（Ｄｏｘａｒｕｂｉｃｉｎ）及びダウノルビシン（Ｄａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）化合物も、有用な細胞毒性薬であり得る。
治療用組成物
本発明は、本発明の化合物の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む、ほ乳動物における過剰増殖障害（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の治療用組成物にも関する。一実施形態においては、前記薬剤組成物は、（これらだけに限定されないが）以下を含めた癌治療用である：ぼうこう、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、すい臓、胃、頚部、甲状腺及び皮膚の癌腫を含めた癌腫；へん平上皮癌を含めた；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含めた、リンパ球系列の造血器腫よう；急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含めた、ミエロイド系列の造血器腫よう；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含めた、間充織起源の腫よう；黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫及び神経こう腫を含めた、他の腫よう；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経こう腫及びシュワン腫を含めた、中枢及び末梢神経系の腫よう；線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒａｍａ）及び骨肉腫を含めた、間充織起源の腫よう；黒色腫、色素性乾皮症、角化きょく細胞腫、精上皮腫、甲状腺ろ胞癌及び奇形癌腫を含めた、他の腫よう、並びにＥｐｈＡが主に発現される未確定の他の癌。好ましい一実施形態においては、本発明の薬剤組成物は、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、すい臓、卵巣、頚部及びリンパ器官、骨肉腫、滑膜腫、肉腫、頭頚部、神経こう腫、胃、肝臓の癌、又はＥｐｈＡが発現される他の癌腫の治療に使用される。特に、癌は転移性癌である。別の一実施形態においては、前記薬剤組成物は、他の障害（例えば、自己免疫疾患（全身性ループス、リウマチ様関節炎、多発性硬化症など）、移植片拒絶（腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、骨髄移植拒絶など）、移植片対宿主病、ウイルス感染（ｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなど）及び寄生虫感染（ジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫病など）、当業者によって確定された他の障害など）に関係する。
本発明は、
・本発明の抗体、抗体断片又は抗体抱合体の有効量と、
・不活性でも、生理活性でもよい、薬学的に許容される担体と
を含む、薬剤組成物を提供する。
本明細書では「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する、任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤などを含む。適切な担体、希釈剤及び／又は賦形剤の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどの１つ以上、及びこれらの組合せが挙げられる。糖、多価アルコール、塩化ナトリウムなどの等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）を組成物中に含むことが好ましい場合が多い。特に、適切な担体の関連例としては、（１）約１ｍｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミンを含む、又は含まない、ダルベッコリン酸緩衝食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、及び（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられ、トリプタミンなどの抗酸化剤、及びＴｗｅｅｎ ２０などの安定剤も含有することができる。
本明細書の組成物は、治療する特定の障害に必要であれば、更なる治療薬を含むこともできる。好ましくは、本発明の抗体、抗体断片又は抗体抱合体、及び補充の活性化合物は、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する。好ましい一実施形態においては、更なる治療薬は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）又はＨＥＲ２受容体の拮抗物質である。
本発明の組成物は、種々の形態であり得る。これらは、例えば、液体、半固体及び固体剤形を含むが、好ましい形態は、意図する投与方法及び治療用途に応じて決まる。典型的な好ましい組成物は、注射液又は注入液の形態である。好ましい投与方法は、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）である。好ましい一実施形態においては、本発明の組成物をボーラスとして、又はある期間にわたって連続注入によって、静脈内投与する。別の好ましい一実施形態においては、本発明の組成物は、筋肉内、皮下、関節内、滑液嚢内、腫よう内、腫よう周囲、病巣内又は病変周囲の経路によって注射されて、局所的及び全身的治療効果を発揮する。
非経口投与用無菌組成物は、必要な量の本発明の抗体、抗体断片又は抗体抱合体を適切な溶媒に混合し、続いて精密ろ過して滅菌することによって、調製することができる。溶媒又はビヒクルとして、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、及びこれらの組合せを使用することができる。糖、多価アルコール、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが好ましい場合が多い。これらの組成物は、佐剤、特に湿潤剤、等張化剤、乳化剤、懸濁剤及び安定剤も含み得る。非経口投与用無菌組成物は、使用時に滅菌水又は任意の他の注射用無菌媒体に溶解させることができる無菌固体組成物の形態で調製することもできる。
本発明の抗体、抗体断片又は抗体抱合体は、経口的に投与することもできる。経口投与用固体組成物として、錠剤、丸剤、散剤（ゼラチンカプセル剤、サシェ剤）又は顆粒剤を使用することができる。これらの組成物においては、本発明による活性成分をデンプン、セルロース、スクロース、ラクトース、シリカなどの１種類以上の不活性希釈剤とアルゴン気流下で混合する。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、１種類以上の潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）、着色剤、コーティング（糖衣錠）又はゆう薬も含み得る。
経口投与用液体組成物として、水、エタノール、グリセリン、植物油、パラフィン油などの不活性希釈剤を含む、薬学的に許容される溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ及びエリキシル剤を使用することができる。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、湿潤剤、甘味剤、濃化剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ）、香味剤又は安定化剤を含み得る。
用量は、所望の効果、治療期間、及び使用する投与経路に応じて決まり、一般に、成体に対して経口的に５ｍｇから１０００ｍｇ／日であり、活性物質１ｍｇから２５０ｍｇの単位用量である。一般に、医師は、年齢、体重、及び治療対象に特異的な任意の他の因子に応じて、適切な投与量を決定する。
治療上の使用方法
別の一実施形態においては、本発明は、前記ＥｐｈＡ２受容体に拮抗する抗体をそれを必要とする患者に投与することによって、ＥｐｈＡ２受容体活性を阻害する方法を提供する。本発明の抗体、抗体断片又は細胞傷害性抱合体のタイプのいずれでも治療に使用することができる。したがって、本発明は、医薬品としてのアンタゴニスト抗ＥｐｈＡ２抗体、その断片、又はその細胞傷害性抱合体の使用を含む。
好ましい一実施形態においては、本発明の抗体、抗体断片又は細胞傷害性抱合体を、ほ乳動物における過剰増殖障害の治療に使用する。より好ましい一実施形態においては、本発明の抗体、抗体断片又は細胞傷害性抱合体を含む、上に開示した薬剤組成物の１つを、ほ乳動物における過剰増殖障害の治療に使用する。一実施形態においては、障害は癌である。特に、癌は転移性癌である。本発明の抗体、抗体断片及び細胞傷害性抱合体は、前記癌腫ようの血管新生の処置に使用することもできる。
したがって、本発明の薬剤組成物は、（これらだけに限定されないが）以下を含めた種々の癌の治療又は予防に有用である：ぼうこう、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、すい臓、胃、頚部、甲状腺及び皮膚の癌腫を含めた癌腫；へん平上皮癌を含めた；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含めた、リンパ球系列の造血器腫よう；急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含めた、ミエロイド系列の造血器腫よう；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含めた、間充織起源の腫よう；黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫及び神経こう腫を含めた、他の腫よう；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経こう腫及びシュワン腫を含めた、中枢及び末梢神経系の腫よう；線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含めた、間充織起源の腫よう；黒色腫、色素性乾皮症、角化きょく細胞腫、精上皮腫、甲状腺ろ胞癌及び奇形癌腫を含めた、他の腫よう、並びにＥｐｈＡが主に発現される未確定の他の癌。好ましい一実施形態においては、癌は、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、すい臓、子宮、卵巣、頚部及びリンパ器官、骨肉腫、滑膜腫、肉腫、頭頚部、神経こう腫、胃、肝臓の癌、又はＥｐｈＡが発現される他の癌腫である。別の一実施形態においては、前記薬剤組成物は、他の障害（例えば、自己免疫疾患（全身性ループス、リウマチ様関節炎、多発性硬化症など）、移植片拒絶（腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、骨髄移植拒絶など）、移植片対宿主病、ウイルス感染（ｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなど）及び寄生虫感染（ジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫病など）、当業者によって確定された他の障害など）に関係する。
同様に、本発明は、本発明の抗体、抗体断片若しくは抗体抱合体の有効量に、又は抗体、抗体断片、若しくは細胞傷害性抱合体を単独で若しくは他の細胞傷害薬若しくは治療薬と組み合わせて含む治療薬の有効量に、標的細胞、又は標的細胞を含む組織を接触させることを含む、選択した細胞集団の増殖を阻害する方法を提供する。
選択した細胞集団の増殖を阻害する方法は、インビトロ、生体内又は生体外で実施することができる。本明細書では「増殖を阻害すること」とは、短時間でも長時間でも、細胞の増殖を遅らせること、細胞の生存率を低下させること、細胞死を起こすこと、細胞を溶解すること、及び細胞死を誘導することを意味する。
インビトロでの使用の例としては、患部細胞又は悪性細胞を死滅させるための、同じ患者に移植する前の自家骨髄治療、コンピテントなＴ細胞を死滅させ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための、その移植前の骨髄治療、標的抗原を発現しない望ましい変種を除いた全細胞を死滅させるための、又は望ましくない抗原を発現する変種を死滅させるための、細胞培養治療が挙げられる。
非臨床のインビトロでの使用条件は、当業者によって容易に決定される。
臨床の生体外での使用の例は、癌治療若しくは自己免疫疾患治療において自家移植前に腫よう細胞若しくはリンパ球を骨髄から除去すること、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するために移植前にＴ細胞及び他のリンパ球を自家若しくは同種の骨髄若しくは組織から除去することである。治療は、以下のように実施することができる。骨髄を、患者又は他の個体から収集し、次いで本発明の細胞毒性薬を添加した血清含有培地中で温置する。濃縮は、約３０分間から約４８時間で、約３７℃で、約１０μＭから１ｐＭの範囲である。正確な濃縮条件及び温置時間、すなわち、用量は、当業者によって容易に決定される。温置後、骨髄細胞を血清含有培地で洗浄し、公知の方法に従ってｉ．ｖ．注入によって患者に戻す。患者が、髄の収集時期と処理した細胞の再注入との間に、切除を伴う化学療法過程、全身照射などの他の治療を受ける状況では、処理した髄細胞を、標準医用装置を用いて液体窒素中に凍結保存する。
生体内での臨床使用の場合、本発明の抗体、エピトープ結合性抗体断片又は細胞傷害性抱合体を、無菌性及び内毒素レベルについて試験する溶液として供給する。細胞傷害性抱合体投与の適切な手順の例は、以下のとおりである。抱合体を各週ｉ．ｖ．ボーラスとして４週間毎週投与する。ヒト血清アルブミン５から１０ｍｌを添加することができる等張食塩溶液５０から１００ｍｌのボーラス量を投与する。投与量は、ｉ．ｖ．投与１回当たり１０μｇから１００ｍｇ（１００ｎｇから１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲）である。より好ましくは、投与量は、５０μｇから３０ｍｇの範囲である。最も好ましくは、投与量は、１ｍｇから２０ｍｇの範囲である。治療４週間後、患者は、週単位で治療を受け続けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、投与量、時間などに関する具体的臨床手順は、臨床状況が許せば、当業者が決定することができる。
診断
本発明の抗体又は抗体断片を用いて、生物試料中のＥｐｈＡ２をインビトロ又は生体内で検出することもできる。一実施形態においては、本発明の抗ＥｐｈＡ２を用いて、組織中、又は組織由来の細胞中のＥｐｈＡ２レベルを求める。好ましい一実施形態においては、組織は患部組織である。方法の好ましい一実施形態においては、組織は腫よう又はその生検である。方法の好ましい一実施形態においては、まず、組織又はその生検を患者から切り出し、次いで、組織又は生検中のＥｐｈＡ２レベルを、本発明の抗体又は抗体断片を用いた免疫測定法において求めることができる。組織又はその生検は、凍結又は固定することができる。同じ方法を用いて、チロシンリン酸化レベル、細胞表面レベル、細胞局在など、ＥｐｈＡ２タンパク質の他の諸性質を求めることができる。
上記方法を用いて、癌を有することが既知である、又は疑われる対象において、測定されたＥｐｈＡ２レベルを正常な基準対象又は標準のそれと比較して、癌を診断することができる。次いで、前記方法を用いて、腫ようがＥｐｈＡ２を発現するかどうかを判定することができる。それによって、腫ようが、本発明の抗体、抗体断片又は抗体抱合体を用いた治療に十分反応することを示唆することができる。好ましくは、腫ようは、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、すい臓、子宮、卵巣、頚部及びリンパ器官、骨肉腫、滑膜腫、肉腫、神経こう腫、胃、肝臓、頭頚部の癌、又はＥｐｈＡ２が発現される他の癌腫、及びＥｐｈＡ２が主に発現される未確定の他の癌である。
本発明は、さらに、研究又は診断用途用に更に標識されたモノクローナル抗体、ヒト化抗体及び該抗体のエピトープ結合性断片も規定する。好ましい実施形態においては、標識は、放射性標識、蛍光団、発色団、造影剤又は金属イオンである。
前記標識された抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片を癌の疑いがある対象に投与し、対象の体内標識分布を測定又はモニターする診断方法も提供する。
キット
本発明は、例えば、上記細胞傷害性抱合体と、特定の細胞タイプを死滅させるための細胞傷害性抱合体の使用説明書とを含む、キットも含む。説明書は、細胞傷害性抱合体をインビトロ、生体内又は生体外で使用するための指示を含み得る。
典型的には、キットは、細胞傷害性抱合体を含む区画を有する。細胞傷害性抱合体は、凍結乾燥形態、液体形態、又はキットに含まれるように変更可能な他の形態とすることができる。キットは、キット中の説明書に記載された方法の実施に必要な追加の要素、凍結乾燥散剤を戻すためのかかる滅菌溶液、患者に投与する前に細胞傷害性抱合体と組み合わせるための追加の薬剤、及び抱合体を患者に投与するのを助ける道具を含むこともできる。
実施例
抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体ハイブリドーマの生成
４匹のＢＡＬＢ／ｃ ＶＡＦマウスを、ヒトＥｐｈＡ２を移入した３００−１９細胞（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のプレＢ細胞系）で免疫した。抗原を過剰発現する、安定に形質移入された細胞を、３００−１９細胞に完全長ヒトＥｐｈＡ２ ｃＤＮＡを移入して生成させ、フローサイトメトリーによって高発現クローンを選択した。細胞表面でヒトＥｐｈＡ２受容体を高度に発現するクローンであるクローン４−６を、マウスの免疫化、及びハイブリドーマの抗体スクリーニングのための免疫原として選択した。ＥｐｈＡ２移入細胞を、最終濃度１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む選択培地中に維持し、市販抗体を用いてＥｐｈＡ２発現を定期的に試験した。
マウス１匹当たりリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００μＬ中の約５×１０６個のＥｐｈＡ２移入３００−１９細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ， Ｉｎｃ．において用いられた標準免疫化手順によって、２−３週間ごとに注射を実施した。細胞融合の３日前に、同じ用量の抗原でもう１回マウスの腹腔内に追加免疫し、動物使用手順の標準プロトコルに従ってひ臓細胞を調製するために、細胞融合当日に屠殺した。
ひ臓を、免疫したマウスから滅菌外科的（ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ｓｕｒｇｉｃａｌ）条件下で収集し、２枚の無菌つや消し顕微鏡スライド間ですりつぶして、ＲＰＭＩ−１６４０培地中の単細胞懸濁液を得た。ひ細胞をペレットにし、細胞融合前にＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄した。ポリエチレングリコール１５００を融合因子（ｆｕｓｏｇｅｎ）（Ｒｏｃｈｅ ７８３ ６４１）として用いて、ひ臓細胞をネズミ骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞と混合し、融合させた（Ｋｅａｒｎｅｙ， Ｊ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９７９． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２３：１５４８−１５５０）。細胞融合及び遠心分離後、細胞を、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）補助剤（Ｓｉｇｍａ Ｈ−０２６２）を含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（２００ｍＬ）に懸濁させ、１０枚の９６ウェル平底プレートに蒔いた（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ ３５９６、細胞懸濁液２００μＬ／ウェル）。３７℃、５％ＣＯ２で５日間温置後、培養上清１００μＬをプレートの各ウェルから除去し、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）補助剤（Ｓｉｇｍａ Ｈ−０１３７）を含む等体積の完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で置換した。ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニング用に十分大きなコロニーに増殖するまで、（３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気中の）温置を続けた。
融合後１０日目に、ハイブリドーマ細胞がウェル中で半分コンフルエントまで増殖し、上清がオレンジ色に変化したときに、免疫測定法による抗体スクリーニング用にハイブリドーマ上清を融合プレートから採取した。予備スクリーニングのために、ハイブリドーマ上清をＥｐｈＡ２移入細胞と親３００−１９細胞についてフローサイトメトリーによって試験した。細胞をハイブリドーマ上清５０μＬで染色し、続いてフルオレセイン−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抱合体と一緒に温置し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＦＡＣＳＡｒｒａｙ装置を用いたフローサイトメトリーによって分析した。ＥｐｈＡ２移入細胞に対して陽性であるが３００−１９細胞に対しては陰性と分析されたハイブリドーマクローンを選択し、拡大し、貯蔵のために凍結させ、又は限界希釈によってサブクローニングしてモノクローナル集団を得た。ハイブリドーマ細胞によって分泌された特異抗体を、市販アイソタイピング試薬（Ｒｏｃｈｅ １４９３０２７）を用いて、アイソタイプ化した。
フローサイトメトリーのデータに基づいて、ヒトＥｐｈＡ２移入細胞と特異的に反応するが、親３００−１９細胞とは反応しない、２９種類のハイブリドーマクローンを特定し、ヒトＥｐｈＡ２抗原によるマウスの免疫化から選択した。
抗ＥｐｈＡ２抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２の結合特性分析
精製抗ＥｐｈＡ２抗体３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１の各々の特異的結合を、ヒトＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞、及びＥｐｈＡ２を発現しない細胞を用いて、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって実証した（図１Ａ、Ｂ及びＣ）。冷ＦＡＣＳ緩衝剤（ダルベッコＭＥＭ培地中１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）１００μｌ中の３７．３Ｄ７抗体、３７．１Ｆ５抗体又は５３．２Ｈ１１抗体（６０ｎＭ）の温置を、ＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞、及びＥｐｈＡ２を発現しない細胞を用いて、氷上の丸底９６ウェルプレート中で実施した。１時間後、細胞を遠心分離によってペレット化し、冷ＦＡＣＳ緩衝剤で洗浄し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−ＦＩＴＣ抱合体（１００μＬ、ＦＡＣＳ緩衝剤中６μｇ／ｍｌ）と一緒に氷上で１時間温置した。次いで、細胞をペレット化し、洗浄し、ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒド溶液２００μＬに再懸濁させた。次いで、細胞試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒリーダー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
ヒトＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞を３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５又は５３．２Ｈ１１抗体と一緒に温置すると強い蛍光シフトが得られた。これに対して、ヒトＥｐｈＡ２を発現しない細胞を３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５又は５３．２Ｈ１１抗体と一緒に温置するとシフトはわずかであった（図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃ）。これは、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体がヒトＥｐｈＡ２に選択的に結合したことを示している。正の対照の抗ＥｐｈＡ２抗体であるＢ２Ｄ６（Ｕｐｓｔａｔｅ）は、ヒトＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞と一緒に温置すると、類似の蛍光シフトを示した（図１Ａ）。強い蛍光シフトは、３７．３Ｄ７及びヒト癌細胞（ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞、ヒトすい癌ＢｘＰＣ３細胞など）を用いたＦＡＣＳアッセイによっても観察された。これは、３７．３Ｄ７抗体がヒト腫よう細胞表面のヒトＥｐｈＡ２に結合することを示している（図２）。３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体をヒト腫よう細胞系と一緒に用いても、類似のデータが得られた。
３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体と細胞表面のヒトＥｐｈＡ２との結合の見かけの解離定数（ＫＤ）を、幾つかの濃度の抗体とヒトＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞及びヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との結合のＦＡＣＳアッセイによって求めた（図３）。１サイト（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ）結合に対する非線形回帰によってＫＤ値を推定した。結合曲線から、３７．３Ｄ７抗体に対して０．３ｎＭ、３７．１Ｆ５抗体に対して０．０７ｎＭ、及び５３．２Ｈ１１抗体に対して０．１４ｎＭの見かけのＫＤ値を得た（図３Ａ、３Ｃ及び３Ｅ）。
同じ実験手順を用いて、０．１８ｎＭ及び０．０５ｎＭの見かけのｋＤ値をそれぞれＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２に対して求めた。
ネズミＥｐｈＡ２又はラットＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞を３７．３Ｄ７抗体又は５３．２Ｈ１１抗体と一緒に温置すると強い蛍光シフトが得られた。これに対して、ネズミＥｐｈＡ２又はラットＥｐｈＡ２を発現しない細胞を３７．３Ｄ７抗体又は５３．２Ｈ１１抗体と一緒に温置するとシフトはわずかであった（図４）。これは、３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体が、ネズミＥｐｈＡ２及びラットＥｐｈＡ２にも結合することを示している。強い蛍光シフトは、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５又は５３．２Ｈ１１抗体をサル（サバンナモンキー（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ））上皮性ＶＥＲＯ細胞と一緒に用いたＦＡＣＳアッセイによっても観察された（図５Ａ）。これは、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１が、サルＥｐｈＡ２にも結合することを示している。１サイト結合に対する非線形回帰によって見かけのＫＤ値を推定した。ＦＡＣＳアッセイによる結合曲線から、サル細胞上の３７．３Ｄ７に対して０．１５ｎＭ、３７．１Ｆ５に対して０．０５ｎＭ、及び５３．２Ｈ１１に対して０．０７ｎＭのＫＤ値を得た（図５Ｂ、５Ｄ及び５Ｆ）。
３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体による、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するエフリンＡ１の結合阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞へのエフリンＡ１の結合は、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体によって阻害された（図６）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を５μｇ／ｍＬ ３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５若しくは５３．２Ｈ１１抗体と一緒に、又は３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体なしで２時間温置し、続いて１００ｎｇ／ｍＬビオチン化エフリンＡ１と一緒に４℃で３０分間温置した。次いで、細胞を無血清培地で２回洗浄して、結合していないビオチン−エフリンＡ１を除去し、次いで１％ＮＰ−４０及びプロテアーゼ阻害剤を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．４に溶解させた。Ｉｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢ ＥＬＩＳＡプレートをマウスモノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体（Ｄ７、Ｕｐｓｔａｔｅ）で被覆し、それを用いて、ＥｐｈＡ２及び結合したビオチン−エフリンＡ１を溶解物から捕捉した。被覆抗体とＥｐｈＡ２の細胞質Ｃ末端ドメインとの結合は、ビオチン−エフリンＡ１とＥｐｈＡ２の細胞外ドメインとの結合に干渉しなかった。ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体と一緒に温置し、再度洗浄し、次いでＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて現像した。５μｇ／ｍＬ ３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５又は５３．２Ｈ１抗体による、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するエフリンＡ１結合の阻害は、本質的に定量的であった。シグナルは、ビオチン−エフリンＡ１を欠く対照を用いて得られたＥＬＩＳＡバックグラウンドシグナルのそれとほぼ同じであった（図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃ）。
ＥｐｈＡ２−Ｎ１とＥｐｈａ２−Ｎ２の両方は、３７．３Ｄ７と同じ程度に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するヒトエフリンＡ１の結合を阻害する能力を有した。
３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体によるＥｐｈＡ２媒介性細胞シグナル伝達の阻害
３７．３Ｄ７又は３７．１Ｆ５抗体を用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の治療は、ＥｐｈＡ２受容体自己リン酸化の阻害（図７Ａ）、及びＡｋｔなどのその下流のエフェクターのリン酸化の阻害（図７Ｂ）によって示されるように、細胞内ＥｐｈＡ２受容体シグナル伝達を完全に阻害した。３７．３Ｄ７抗体又は５３．２Ｈ１１抗体を用いたすい癌ＣＦＰＡＣ−１細胞の治療は、ＥｐｈＡ２受容体自己リン酸化の阻害（図７Ｃ）によって示されるように、細胞内ＥｐｈＡ２受容体シグナル伝達を完全に阻害した。
図７Ａ及び７Ｃにおいては、乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞又はすい臓ＣＦＰＡＣ−１細胞を、血清を含む（各細胞系に対してＡＴＣＣから示唆される）通常の培地中で３日間増殖させ、次いで無血清培地中で１２−１４時間培養した。血清不足の細胞を１５μｇ／ｍＬ ３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５又は５３．２Ｈ１１抗体又は対照ＩｇＧ１で２時間処理し、続いて１μｇ／ｍＬエフリンＡ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）を用いて３７℃で１０分間刺激した。次いで、細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む氷冷溶解緩衝剤に溶解させた（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．４、１％ＮＰ−４０、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μＭロイペプチン、５μＭペプスタチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍＭベンズアミジン及び５μｇ／ｍＬアプロチニン）。タンパク質Ａ／Ｇビーズに結合した抗ＥｐｈＡ２抗体Ｄ７（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いて溶解物を免疫沈降させた。免疫沈降したＥｐｈＡ２をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、ホスホチロシン特異的モノクローナル抗体４Ｇ１０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウエスタンブロットした。各免疫沈降試料中のＥｐｈＡ２タンパク質レベルを評価するために、抗ＥｐｈＡ２抗体Ｄ７（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いて同じ膜を再ブロットした。対照抗体の使用は、エフリンＡ１によって刺激される、ＥｐｈＡ２受容体の自己リン酸化を阻害しなかった（図７Ｃ）。これに対し、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５又は５３．２Ｈ１１抗体で処理すると、エフリンＡ１によって刺激される、ＥｐｈＡ２受容体の自己リン酸化が完全に阻害された（図７Ａ及び７Ｃ）。Ａｋｔなどの下流のエフェクターのエフリンＡ１によって刺激される活性化も、溶解物及びウサギポリクローナル抗ホスホＳｅｒ４７３ Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のウエスタンブロット（図７Ｂ）によって示されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、３７．３Ｄ７又は３７．１Ｆ５抗体によって阻害された。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥｐｈＡ２自己リン酸化に対するエフリンＡ１の刺激効果とは対照的に、３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体自体は、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥｐｈＡ２自己リン酸化を刺激しなかった（図８Ａ及び８Ｂ）。３７．１Ｆ５抗体に対しても、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いて類似のデータを得た。図８では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、血清を含む通常の培地中で３日間増殖させ、次いで無血清培地中で１２−１４時間培養した。血清不足の細胞を１μｇ／ｍＬエフリンＡ１−Ｆｃ又は１５μｇ／ｍＬ ３７．３Ｄ７若しくは５３．２Ｈ１１抗体で１０分間処理した。抗ＥｐｈＡ２抗体Ｄ７（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いて、細胞溶解物を免疫沈降に供した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離後、ブロットを抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗ＥｐｈＡ２抗体Ｄ７（Ｕｐｓｔａｔｅ）でプローブした。ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、ＥｐｈＡ２−Ｎ１とＥｐｈＡ２−Ｎ２の両方を用いて、類似の結果を得た。どちらの抗体もＥｐｈＡ２自己リン酸化を単独で刺激するのに対して、その各々は、ＥｐｈＡ２受容体のエフリンＡ１依存性リン酸化を防止する。
したがって、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５、５３．２Ｈ１１、ＥｐｈＡ２−Ｎ１及びＥｐｈＡ２−Ｎ２抗体は、エフリンＡ１によって刺激されるＥｐｈＡ２細胞内シグナル伝達を阻害する有効性において、公知のすべての抗ＥｐｈＡ２抗体の中でも独特である。
３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体による、ヒト腫よう細胞の血清によって刺激される増殖及び生存の阻害
幾つかのヒト腫よう細胞系を、３７．３Ｄ７又は５３．２Ｈ１１抗体の存在下での血清に対する増殖及び生存応答について、無血清条件下で試験した。約３０００細胞／ウェルを、９６ウェルプレートにおいて血清を含む（各細胞系に対してＡＴＣＣから示唆される）通常の培地中に蒔き、翌日、培地を無血清培地で置換した。無血清培地中で１日増殖させた後、細胞を１５μｇ／ｍＬ ３７．３Ｄ７抗体若しくは５３．２Ｈ１１抗体又は対照ＩｇＧ１と一緒に温置し、続いて血清を添加して、１％又は１．５％血清の最終濃度にした。次いで、細胞を更に３日間増殖させた。次いで、ＭＴＴ［臭化３−（４，５）−ジメチルチアゾル−２−イル−２，３−ジフェニルテトラゾリウム、ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬ溶液２５μＬ］の溶液を添加し、細胞を恒温器に２−３時間戻した。次いで、培地を除去し、ＤＭＳＯ １００μＬで置換し、混合し、プレートの吸光度を５４５ｎｍにおいて測定した。幾つかのヒト腫よう細胞系は、血清を添加すると増殖及び生存応答を示し、３７．３Ｄ７又は５３．２Ｈ１１抗体によってかなり阻害された。例として、結腸腫よう細胞系ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、すい臓腫よう細胞系ＣＦＰＡＣ−２、ＢｘＰＣ３、及び黒色腫ＵＡＣＣ−２５７を用いた結果を示す。
３７．３Ｄ７抗体は、ヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞の血清によって刺激される増殖及び生存を強力に阻害した（図９Ａ）。別の実験においては、３７．３Ｄ７抗体は、ＢｘＰＣ３ヒトすい癌細胞の血清によって刺激される増殖及び生存を用量依存的に強力に阻害し、ＩＣ５０値は４ｎＭであった（図１０Ａ）。また、３７．３Ｄ７又は５３．２Ｈ１１抗体は、ＬｏＶｏヒト結腸癌細胞（図９Ｂ）、ＣＦＰＡＣ−１ヒトすい癌細胞（図９Ｃ）及びＵＡＣＣ−２５７黒色腫癌細胞（図９Ｄ）の血清によって刺激される増殖及び生存を強力に阻害し、５３．２Ｈ１１抗体は、ＬｏＶｏ細胞の血清又はＥＧＦによって刺激される増殖及び生存を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０値は２ｎＭであった（図１０Ｂ及び１０Ｃ）。図１０では、０％血清処理試料のＯＤ５４５値を１００％阻害に設定し、１．５％血清又は１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦで処理した試料を用いて０％阻害を設定した。既報の抗ＥｐｈＡ２抗体は、ヒト腫よう細胞の足場依存性（単層）増殖に対して抑制活性を持たない。したがって、３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１抗体は、ヒト腫よう細胞の足場依存性増殖（単層増殖）を阻害する能力において独特である。
３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体による、ヒトさい静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ媒介性細胞シグナル伝達並びにＶＥＧＦによって刺激される増殖及び生存の阻害
ＨＵＶＥＣ細胞を３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５又は５３．２Ｈ１１抗体と一緒に温置すると、ＦＡＣＳ分析によって強い蛍光シフトが得られた。これは、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体が、ＨＵＶＥＣ細胞上で発現されるＥｐｈＡ２受容体に結合することを示している。３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体と細胞表面のＥｐｈＡ２との結合の見かけの解離定数（ＫＤ）を、幾つかの濃度で実施したＦＡＣＳ結合アッセイによって確立された図１１に示す結合曲線から求めた。３７．３Ｄ７抗体のＫＤ＝０．３ｎＭの値を１サイト結合の非線形回帰によって推定した（図１１）。この値は、ヒト癌細胞に対する３７．３Ｄ７抗体の結合のＫＤ値と類似している。３７．１Ｆ５抗体に対するＫＤ＝０．０１ｎＭの値、及び５３．２Ｈ１１抗体に対するＫＤ＝０．０６ｎＭの値も同様に得られた。これは、３７．３Ｄ７、３７．１Ｆ５及び５３．２Ｈ１１抗体が、ＥｐｈＡ２受容体を介して、ＨＵＶＥＣ細胞に特異的に結合することを示している。
３７．３Ｄ７抗体は、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣの増殖及び生存を強力に阻害した。活性は、抗ＶＥＧＦ阻止抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の活性と類似している、又はＡｖａｓｔｉｎの活性よりも高い（図１２）。アゴニスト抗ＥｐｈＡ２抗体は、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣの増殖及び生存を阻害しなかった（図１２）。図１２では、ＨＵＶＥＣ細胞を、血清及び内皮細胞（ＥＣ）補助剤（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を含むＥＢＭ−２培地中で３日間増殖させた。ＶＥＧＦを欠く無血清培地＋ＥＣ増殖補助剤中で細胞を１２−１４時間培養した。血清欠乏後、示した抗体（１００μｇ／ｍＬ）と一緒に、又は抗体なしで、５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ＋０．４％血清で細胞を刺激した。ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ細胞の増殖及び生存に対する抗体の効果を、抗体及びＶＥＧＦの添加から３日後に、実施例５に記載のＭＴＴアッセイによって判定した。ＶＥＧＦ媒介性増殖及び生存の抗体による阻害率を図１２に示す。ビヒクルで処理した試料のＯＤ５４５値を０％阻害に設定し、ＶＥＧＦを欠く試料を用いて１００％阻害を設定した。
３７．３Ｄ７抗体によるＨＵＶＥＣ細胞の処理によって細胞内ＥｐｈＡ２受容体シグナル伝達が阻害されることは、Ａｋｔなどのその下流のエフェクターのリン酸化の阻害を測定することによって示された。
阻害は、抗ＶＥＧＦ阻止抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の阻害と類似している（図１３）。アゴニスト抗ＥｐｈＡ２抗体は、ＨＵＶＥＣ細胞においてＶＥＧＦ誘導性Ａｋｔリン酸化を阻害しなかった。図１３では、ＶＥＧＦを欠く無血清培地＋ＥＣ補助剤中でＨＵＶＥＣ細胞を１２−１４時間欠乏状態にした。細胞を抗体（２０μｇ／ｍＬ）で１時間処理した後、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加した。ＶＥＧＦ添加後、細胞を１５分間溶解させ、示した抗体を用いて免疫ブロットをプローブした。
マウスにおけるヒト結腸癌ＨＴ−２９異種移植片の増殖の３７．３Ｄ７抗体による抑制（図１４）
ＳＣＩＤマウスにおいて、２×１０６個のＨＴ−２９細胞を皮下注射することによって、ヒト結腸癌ＨＴ−２９異種移植片を樹立した。マウスが、触診可能な（５０ｍｍ３）ＨＴ−２９異種移植腫ようを示したときに、３７．３Ｄ７抗体又は対照抗体（ＩｇＧ１）（１ｍｇ／マウス、ｉ．ｖ．、２回／週）で、又はＰＢＳ単独（１００μＬ／マウス、ｉ．ｖ．、２回／週）で、マウスを処置した。腫ようの増殖は、対照抗体処置又はＰＢＳ単独に比較して、３７．３Ｄ７抗体処置によってかなり遅延された。マウス体重の測定に基づいて、３７．３Ｄ７抗体の毒性は認められなかった。
抗ＥｐｈＡ２抗体ｈｕ５３．２Ｈ１１による初期乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１転移の阻害
抗ＥｐｈＡ２抗体ｈｕ５３２Ｈ１１の抗腫よう活性を、雌性ＳＣＩＤマウスにおいて皮下に移植された初期乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫ように対して、１用量レベルで評価した。表面軸方向（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ａｘｉａｌ）及び鼠径リンパ節におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫よう浸潤に対するこの抗体の効果も検討した。そのために、腫よう移植後１、５、８、１２、１５、１９、２２及び２６日目に、ｈｕ５３２Ｈ１１を４０ｍｇ／ｋｇ／ａｄｍでｉｖ経路によって投与した。対照群は、未処置のままであった。
ｈｕ５３２Ｈ１１の抗腫よう活性の評価では、動物を毎日計量し、腫ようをカリパスで毎週２−３回測定した。腫よう重量を、質量（ｍｇ）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２の式によって計算した。抗腫よう活性を３つの判定基準に従って評価した：１）未処置対照の腫よう重量中央値で除算された処置群の腫よう重量中央値（ｍｇ）として定義されたＴ／Ｃを含めて、２）腫よう増殖遅延（Ｔ−Ｃ）の決定（Ｔは、投与群腫ようが７５０ｍｇになるのに必要な日数の時間中央値として定義され、Ｃは、対照群腫ようが同じサイズになる時間中央値である。）、及び３）腫よう細胞死滅（ｃｅｌｌ ｋｉｌｌ）は、ｌｏｇ１０細胞死滅（総計）＝［Ｔ−Ｃ値（日数）］／（Ｔｄ×３．３２）として定義される。Ｔ−Ｃは上で定義され、Ｔｄは、対照腫ようの腫よう体積倍加日数であり、指数増殖（１００−１，０００ｍｇの範囲）における対照群腫ようの対数線形増殖プロットからの最適直線から推定される。
並行試験（ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｔｕｄｙ）において、前述したように動物を処置し、腫よう移植後２８日目にすべてのマウスを屠殺し、えきか及び鼠径リンパ節を収集した（対照群における腫ようサイズ中央値＝１５５８ｍｇ）。リンパ節におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫よう細胞を免疫染色によって特異的に特定するために、ヒトＫｉ６７抗体を使用した。リンパ節における転移の表面積を、Ｓ＝ヒトＫｉ６７表面積×１００／リンパ節表面積として計算した（２つの断面の平均）。
・原発腫ように対する効力：
ｈｕ５３２Ｈ１１は、４０ｍｇ／ｋｇ／ａｄｍ（全用量３２０ｍｇ／ｋｇ）において耐容性が良好であり、２７日目に＋８．９％の体重変化であった。この用量は、腫ようが療法中に消失（ｅｓｃａｐｅ）しても、原発腫ようの腫よう増殖を遅延させた（Ｔ／Ｃ＝２７％及び１．０ ｌｏｇ細胞死滅総計）。
・抗転移活性：
ｈｕ５３２Ｈ１１は、えきかと鼠径の両方のリンパ節において、転移表面を減少させた（＞５０％）。
結論として、乳房腫ようＭＤＡ−ＭＢ−２３１を有するマウスにおいては、ｈｕ５３２Ｈ１１は、腫よう発生初期に処置した原発腫ようの増殖を遅延させ（Ｔ／Ｃ＝２７％及び１．０ ｌｏｇ細胞死滅総計）、えきかと鼠径の両方のリンパ節において、転移表面を減少させる（＞５０％）。
別の試験においては、ヒト結腸ＨＴ２９肝臓「転移」モデルにおいて、抗ＥｐｈＡ２抗体の活性を評価することができる。ネズミ抗ＥｐｈＡ２抗体５３．２Ｈ１１を、ＳＣＩＤ雌性マウスにおけるＨＴ２９細胞のひ臓内移植後４日目から毎週２回ｉｖ投与する（処置及び対照の、腫ようがない動物（ＮＴＢＡ）に対してｎ＝２０マウス／群）。原発腫よう部位（ひ臓）又は転移部位（肝臓）における腫よう量を評価するために、５０日目に、すなわち１３回目の抗ＥｐｈＡ２投与後３日目に、マウスを解剖し、ひ臓及び肝臓を計量する。転移数も評価する。当業者に公知の統計学的ツールを用いてデータを解析する。
・４０ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊ（総用量５２０ｍｇ／ｋｇ）の抗ＥｐｈＡ２処置は耐容性が良好である。
・原発腫よう重量（ひ臓）：ひ臓重量の有意差がＮＴＢＡと対照移植マウスの間で認められ、後者の方が大である。対照移植マウスと抗ＥｐｈＡ２処置マウスの１匹とのひ臓重量の有意差はない。
・転移重量（肝臓）：対照移植マウスの肝臓重量は、ＮＴＢＡの肝臓重量よりも有意に大きく、一方、抗ＥｐｈＡ２処置マウスは対照移植マウスよりも有意に小さい。
・肝臓転移数：対照移植マウスと抗ＥｐｈＡ２処置マウスで統計学的な差は認められない。
結論として、ヒト結腸腺癌ＨＴ−２９のひ臓内移植は、転移性腫よう量のために、肝臓重量を有意に増加させる。抗ＥｐｈＡ２処置は、肝臓上で数えられる転移数に影響を及ぼさずに、移植マウスの肝臓重量の減少によって観察されるように、転移性腫よう量を有意に減少させることができる。
３７．１Ｆ５抗体の軽鎖及び重鎖のクローン化及び配列決定
３７．１Ｆ５抗体を産生するハイブリドーマ細胞からのＲＮＡ調製
全ＲＮＡの調製物は、３７．１Ｆ５抗体を産生する５×１０６個のハイブリドーマ細胞から、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニプレップキットを用いて得られた。手短に述べると、５×１０６個の細胞をペレットにし、（１％β−メルカプトエタノールを含む）ＲＬＴ緩衝剤３５０μＬに再懸濁させた。懸濁液を、２１．５ゲージ針及びシリンジに約１０−２０回又はもはや粘ちゅうでなくなるまで通過させてホモジナイズした。エタノール（７０％エタノール水溶液３５０μＬ）をホモジネートに添加し、十分混合した。溶液をスピンカラムに移し、２ｍＬ収集管中に置き、＞８０００×ｇで１５秒間回転させた。カラムをＲＰＥ緩衝剤５００μＬで２回洗浄し、次いで新しい管に移し、ＲＮａｓｅを含まない水３０μＬで溶出させ、１分間回転。第２の１分間溶出回転のために、溶出物（３０μＬ）をカラム上に戻した。溶出物の一定分量３０μＬを水で希釈し、それを用いて、ＲＮＡを定量するために２６０ｎｍでＵＶ吸収を測定した。
逆転写酵素（ＲＴ）反応によるｃＤＮＡ調製
可変領域３７．１Ｆ５抗体ｃＤＮＡを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩキットを用いて全ＲＮＡから作製した。Ｑｉａｎｅａｓｙミニプレップからの全ＲＮＡ最高５μｇを利用して、キット手順に厳密に従った。手短に述べると、ＲＮＡ、無作為プライマー１μＬ及びｄＮＴＰ混合物１μＬを、ＲＮａｓｅを含まない無菌蒸留水で１２μＬまで増量し、６５℃で５分間温置した。次いで、混合物を氷上に少なくとも１分間置いた。次いで、５×反応緩衝剤４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ ２μＬ及びＲＮａｓｅＯＵＴ １μＬを添加し、混合物をＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラー中で２５℃で２分間温置した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ酵素１μＬを添加できるようにサーマルサイクラーを一時停止し、次いで２５℃で更に１０分間再スタートし、５５℃に５０分間移した。反応物を７０℃に１５分間加熱して不活性化した。ＲＮａｓｅ Ｈ １μＬを添加し、３７℃で２０分間温置して、ＲＮＡを除去した。
縮重ＰＣＲ反応
ハイブリドーマ細胞由来のｃＤＮＡ上の第１ラウンドの縮重ＰＣＲ反応の手順は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．；２３３（１−２）：１６７−７７）及びＣｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１４８（４）：１１４９−５４）に記載の方法に基づいた。このラウンドのプライマー（表２）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩプラスミドへのクローン化を容易にする制限酵素切断部位を含む。
ＰＣＲ反応成分（表３）を氷上で薄肉ＰＣＲ管中で混合し、次いで９４℃で予熱され一時停止されたＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーに移した。以下のように、Ｗａｎｇ等（２０００；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．；２３３（１−２）：１６７−７７）由来のプログラムを用いて、反応を実施した。
名称：Ｗａｎｇ４５
１）９４℃ ３：００分
２）９４℃ ０：１５秒
３）４５℃ １：００分
４）７２℃ ２：００分
５）２に戻る ２９回
６）７２℃ ６：００分
７）常時４℃
８）終了
次いで、ＰＣＲ反応混合物を１％低融点（ｌｏｗ ｍｅｌｔ）アガロースゲル上で泳動させ、３００から４００ｂｐバンドを切り出し、Ｚｙｍｏ ＤＮＡミニカラムを用いて精製し、配列決定のためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに送った。それぞれの５’及び３’ＰＣＲプライマーを配列決定プライマーとして用いて、両方向から３７．１Ｆ５可変領域ｃＤＮＡを作製した。
５’末端配列のクローン化
３７．１Ｆ５可変領域の軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡ配列のクローン化に用いる縮重プライマーは５’末端配列を変化させるので、全配列の解読には更なる配列決定の努力が必要であった。上記方法から得られた予備的ｃＤＮＡ配列を用いて、３７．１Ｆ５配列が由来するネズミ生殖系列配列をＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）で検索した。新しいＰＣＲ反応が、ＰＣＲプライマーによって変化しない完全可変領域ｃＤＮＡを生成することができるように、ＰＣＲプライマーをネズミ抗体のリーダー配列にアニールするように設計した（表４）。ＰＣＲ反応、バンド精製及び配列決定を、上述したように実施した。ｍｕ３７．１Ｆ５の軽鎖及び重鎖が由来する可能性がある生殖系列配列は、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＭＵＳＩＧＫＶＲ３及びＡＦ３０３８３９で利用可能である。
配列確認のためのペプチド分析
可変領域のｃＤＮＡ配列情報を生殖系列定常領域配列と組み合わせて、完全長抗体ｃＤＮＡ配列を得た。次いで、重鎖及び軽鎖の分子量を計算し、ネズミ３７．１Ｆ５抗体のＬＣ／ＭＳ分析によって得られた分子量と比較した。
表５は、３７．１Ｆ５ ＬＣ及びＨＣのｃＤＮＡ配列から計算された質量を、ＬＣ／ＭＳによる測定値と一緒に示す。分子量測定値は、３７．１Ｆ５軽鎖と重鎖の両方のｃＤＮＡ配列と矛盾しない。
３７．３Ｄ７及び５３．２Ｈ１１の軽鎖及び重鎖のクローン化には本質的に同じ方法を用いた。３７．３Ｄ７の軽鎖及び重鎖が由来する可能性がある生殖系列配列のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号は、それぞれＭＭＵ２３１２１７及びＡＦ３０３８６８である。５３．２Ｈ１１の場合、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号は、それぞれＭＭＵ２３１１９６及びＡＦ３０３８３３であり、ＥｐｈＡ２−Ｎ１の場合、それぞれＫ０２１６１及びＪ００４８８であり、ＥｐｈＡ２−Ｎ２の場合、それぞれＡＪ２３１２２２及びＪ００４８８である。
ヒト化３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４及びヒト化５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４による、ＥｐｈＡ２を発現する腫よう細胞の増殖の阻害
ヒト化３７．３Ｄ７及びヒト化５３．２Ｈ１１抗体を、ＳＰＤＢ（４−［２−ピリジルジチオ］ブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｈｙｄｒｏｘｓｕｃｃｉｎｉｍｄｅ）エステル）リンカーを用いて、Ｌ−ＤＭ４ Ｎ２’デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシンと複合化した。手短に述べると、ｈｕ５３．２Ｈ１１及びｈｕ３７．３Ｄ７の場合でそれぞれ５．５又は６．５倍モル過剰のＳＰＤＢで８ｍｇ／ｍＬで抗体を修飾した。ＥｔＯＨ（５％ｖ／ｖ）を含む緩衝剤Ａ（５０ｍＭ ＫＰｉ／５０ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５、９５％ｖ／ｖ）中で室温で９０分間反応を実施した。次いで、緩衝剤Ａを用いたＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５脱塩カラムによって修飾抗体を精製した。次に、ＳＰＤＢリンカーを用いて修飾抗体を１．７倍モル過剰のＤＭ４と反応させた。反応を、２．５ｍｇ／ｍＬ抗体において、緩衝剤Ａ（９７％ｖ／ｖ）及びＤＭＡ（ジメチルアセトアミド、３％ｖ／ｖ）中で室温で２０時間実施した。１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭグリシン、５％スクロース、ｐＨ５．５を含むＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５脱塩カラムによって抱合体を精製した。薬物と抗体の比は、ｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４では４．０、ｈｕ５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４では３．１であった。
ＥｐｈＡ２を発現する腫よう細胞の増殖に対するｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４及びｈｕ５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の効果を、インビトロ細胞増殖ＷＳＴ−８（（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩）アッセイ（カタログ＃ ＣＫ０４−１１、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ）を用いてまず試験した。幾つかのヒト腫よう細胞系を試験した。種々の濃度のｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４又はｈｕ５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の存在下で、約２０００細胞／ウェルを９６ウェルプレート中の１０％血清を含む（各細胞系に対してＡＴＣＣから示唆される）通常の培地に蒔いた。次いで、細胞を５日間増殖させた。次いで、ＷＳＴ−８溶液［２０μＬ溶液］を添加し、細胞を恒温器に２−３時間戻した。プレートの吸光度を４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで測定した。２つの対照群を実験に用いた。０％生存は、培地のみの対照である。１００％生存は細胞のみの対照である。データ解析のために、Ａ６５０ｎｍ（基準波長）値を対応するＡ４５０ｎｍ値からまず減算した。次いで、バックグラウンド対照（培地のみ）のＡ４５０ｎｍ値の減算によって、各試料のＡ４５０ｎｍ値を正規化した。細胞のみの対照から得られた正規化Ａ４５０値で除算された試料の正規化Ａ４５０値によって生存比を計算した（１００％生存−０％生存）。Ｌｏｇ［Ａｂ−ＤＭ４］値をｘ軸にプロットし、生存比をｙ軸にプロットした。
Ｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４及びｈｕ５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、ＰＣ３前立腺腫よう細胞、ＭＤＡ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺腫細胞、ＷＭ−１１５黒色腫細胞、Ａ３７５黒色腫細胞及びＬｏＶｏ結腸腫よう細胞を含めて、ＥｐｈＡ２を発現するヒト腫よう細胞の増殖を有意に阻害した。例として、ＰＣ３前立腺腫よう細胞を用いた結果を示す。ｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４又はｈｕ５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、０．０２ｎＭの類似ＩＣ５０値で、ＰＣ３細胞の増殖を用量依存的に強力に阻害した（図１５Ａ＆１５Ｂ）。抱合体の効力は、ＥｐｈＡ２発現レベルと相関した。５０倍を超える濃度のｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４又はｈｕ５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４が、ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞の増殖を阻害するのに必要であった（ＩＣ５０値：それぞれ１．３ｎＭ及び＞５ｎＭ、図１５Ａ＆１５Ｂ）。ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞は、細胞表面で（ＦＡＣＳによって測定して）ほとんど検出不可能なレベルのＥｐｈＡ２を発現した（データ示さず。）（図１５Ａ＆１５Ｂ）。したがって、インビトロ増殖阻害アッセイの結果によって、ＥｐｈＡ２を発現する腫よう細胞系の増殖を特異的に阻害するアンタゴニスト抗ＥｐｈＡ２抗体抱合体の能力が実証された。
ＥｐｈＡ２を発現する腫よう異種移植片の増殖に対するｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４及びｈｕ５３．２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の効果を試験した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺腫異種移植モデルを用いた試験を一例として示す。５週齢の雌性ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスにおいて、１×１０７個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の皮下注射によって、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を樹立した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫ようが樹立された後（平均サイズ８３ｍｍ３）、ｈｕ３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４又はＰＢＳの単回ｉ．ｖ注射によってマウスを処置した。抗体の用量は、１５ｍｇ／ｋｇマウス体重、７．５ｍｇ／ｋｇマウス体重及び３．２５ｍｇ／ｋｇマウス体重であった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫ようの増殖は、３．２５ｍｇ／ｋｇ ｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４以外の試験濃度のすべてにおいて、ｈｕ３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４又はｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４抗体抱合体によって完全に阻害され、ＰＢＳ対照に比べて腫よう細胞増殖が著しく遅延される（図１６Ａ＆１６Ｂ）。各群（６マウス／群）の腫よう体積中央値を図１６Ａ＆Ｂに示す。要約すると、ｈｕ３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４とｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４のどちらも、ＥｐｈＡ２を発現する腫ように対して生体内で強力な増殖抑制活性を有する。体重測定に基づいて、両方の抗体抱合体の毒性は認められなかった。
表
表１Ａ：
ｍｕ３７．３Ｄ７軽鎖枠組み表面残基、及びヒト２８Ｅ４抗体における同じＫａｂａｔ位置の対応する残基。ｈｕ３７．３Ｄ７抗体において異なる、したがって変化した残基は、灰色の枠内にある。
Figure 0005622390
表１Ｂ：
ｍｕ３７．３Ｄ７重鎖枠組み表面残基、及びヒト２８Ｅ４抗体における同じＫａｂａｔ位置の対応する残基。ｈｕ３７．３Ｄ７抗体において異なる、したがって変化した残基は、灰色の枠内にある。星印（＊）の付いた残基は、１種類以上のｈｕ３７．３Ｄ７変種においてｍｕ３７．３Ｄ７残基に復帰変異した。
Figure 0005622390
表２：
縮重ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、Ｃｏ ｅｔ ａｌ． １９９２に基づくＨｉｎｄＫＬ（配列番号５８）を除いて、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００のプライマーに基づく。混合塩基を以下のように定義する。Ｈ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝ｇ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋ｇ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ。
Figure 0005622390
表３：
３７．１Ｆ５可変領域ｃＤＮＡ配列のクローン化のための軽鎖及び重鎖ＰＣＲ反応混合物
Figure 0005622390
表４：
３７．１Ｆ５の第２ラウンドのＰＣＲ反応に用いた５’末端ネズミリーダー配列プライマー。３’末端プライマーは、それぞれの定常領域配列にプライム（ｐｒｉｍｅ）するので、第１ラウンドの反応に用いたプライマーと同一である。
Figure 0005622390
表５：
ネズミ３７．１Ｆ５抗体軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡから計算された分子量、及びＬＣ／ＭＳによって測定された分子量
Figure 0005622390

Claims (54)

  1. 少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号１、２及び３で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号４、５及び６で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、ならびに前記受容体の拮抗物質である、抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  2. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号２６からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  3. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号２０からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の１個以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  4. 少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号７、８及び９で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号１０、１１及び１２で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、ならびに前記受容体の拮抗物質である、抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  5. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号２８からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項４に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  6. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号２２からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の１個以上を含むことを特徴とする、請求項４に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  7. 少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号１３、１４及び１５で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号１６、１７及び１８で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、ならびに前記受容体の拮抗物質である、抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  8. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号３０からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項７に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  9. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号２４からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の１個以上を含むことを特徴とする、請求項７に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  10. 少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号６１、６２及び６３で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号６４、６５及び６６で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、ならびに前記受容体の拮抗物質である、抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  11. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号７８からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  12. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号７４からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の１個以上を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  13. 少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号６７、６８及び６９で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号７０、７１及び７２で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、ならびに前記受容体の拮抗物質である、抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  14. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号８０からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  15. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号７６からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の１個以上を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  16. 前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、ネズミ抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受託番号ＰＴＡ−７６６０で寄託されている３７．３Ｄ７と命名されたハイブリドーマ、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に受託番号ＰＴＡ−７６６１で寄託されている３７．１Ｆ５と命名されたハイブリドーマ、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に受託番号ＰＴＡ−７６６２で寄託されている５３．２Ｈ１１と命名されたハイブリドーマ、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に受託番号ＰＴＡ−８４０７で寄託されているＥｐｈＡ２−Ｎ１と命名されたハイブリドーマ、又はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に受託番号ＰＴＡ−８４０８で寄託されているＥｐｈＡ２−Ｎ２と命名されたハイブリドーマによって産生されることを特徴とする、請求項１から１５のいずれかに記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  17. 請求項１から１６のいずれかに記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片と同じエピトープに結合する、ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  18. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号１、２及び３で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号４、５及び６で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１７に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  19. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号４７で表される配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１８に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  20. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号３２、３４及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の１個以上を含むことを特徴とする、請求項１８に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  21. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号７、８及び９で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号１０、１１及び１２で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１７に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  22. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号４８、４９及び５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項２１に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  23. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号３７及び３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の１個以上を含むことを特徴とする、請求項２１に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  24. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号１３、１４及び１５で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号１６、１７及び１８で表されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１７に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  25. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項２４に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  26. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号４０、４２、４３及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の１個以上を含むことを特徴とする、請求項２４に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  27. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号６１、６２及び６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号６４、６５及び６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１７に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  28. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、少なくとも１個の重鎖及び少なくとも１個の軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号６７、６８及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号７０、７１及び７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１７に記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  29. 前記ヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片が、配列番号３２及び４７、配列番号３４及び４７、配列番号３６及び４７、配列番号３７及び４８、配列番号３７及び４９、配列番号３７及び５０、配列番号３８及び４８、配列番号３８及び４９、配列番号３８及び５０、配列番号４０及び５２、配列番号４２及び５２、配列番号４３及び５２、配列番号４５及び５２からなる群から選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１７から２８のいずれかに記載のヒト化若しくは表面再構成抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片。
  30. 細胞毒性薬に連結された、請求項１から２９のいずれかに記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片を含む、抱合体。
  31. 前記細胞毒性薬が、マイタンシノイド、低分子薬物、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、プロドラッグ、タキソイド、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５類似体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３０の抱合体。
  32. 前記細胞毒性薬が、式
    Figure 0005622390
     のマイタンシンＤＭ１であることを特徴とする、請求項３０の抱合体。
  33. 前記細胞毒性薬が、式
    Figure 0005622390
     のマイタンシンＤＭ４であることを特徴とする、請求項３０の抱合体。
  34. 前記細胞毒性薬が、
    ・８，８’−［１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［５−メトキシ−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［１，５−ペンタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［１，４−ブタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［３−メチル−１，５−ペンタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［２，６−ピリジンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［４−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピルオキシ）−２，６−ピリジンジイルビス−（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［５−（３−アミノプロピルオキシ）−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［５−（Ｎ−メチル−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）−１，３−ベンゼンジイルビス−（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−｛５−［３−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）プロピルオキシ］−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）｝−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［５−アセチルチオメチル−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−メチレン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・ビス−｛２−［（Ｓ）−２−メチレン−７−メトキシ−５−オキソ−１，３，，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−８−イルオキシ］−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
    ・８，８’−［３−（２−アセチルチオエチル）−１，５−ペンタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−メチレン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［５−（Ｎ−４−メルカプト−４，４−ジメチルブタノイル）アミノ−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［５−（Ｎ−４−メチルジチオ−４，４−ジメチルブタノイル）−アミノ−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［５−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−メルカプト−２，２−ジメチルエチル）アミノ−１，３−ベンゼンジイル（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［５−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−メチルジチオ−２，２−ジメチルエチル）アミノ−１，３−ベンゼンジイル（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（４−（２−（４−メルカプト−４−メチル）−ペンタンアミド−エトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（１−（２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（４−（３−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド−プロポキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（４−（４−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド−ブトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（４−（３−［４−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイル）−ピペラジン−１−イル］−プロピル）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（１−（３−［４−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイル）−ピペラジン−１−イル］−プロピル）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（４−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（１−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（１−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（４−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（１−（２−［メチル−（２−メチル−２−メチルジスルファニル−プロピル）−アミノ］−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（４−（３−［メチル−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイル）−アミノ］−プロピル）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ・８，８’−［（４−（３−［メチル−（２−メチル−２−メチルジスルファニル−プロピル）−アミノ］−プロピル）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    ８，８’−［（１−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エタ−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
    からなる群から選択されるトマイマイシン誘導体であることを特徴とする、請求項３０の抱合体。
  35. 細胞毒性薬が、
    ・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸（２−メチルスルファニル−エチル）−アミドの（２−メチルスルファニル−エチル）−アミド
    ・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸］のビス−［（２−メルカプトエチル）−アミド
    ・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メルカプト−エチル）−アミド
    ・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メチルジスルファニル−エチル）−アミド
    ・（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メチル−２−メチルジスルファニル−プロピル）−アミド
    （２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メルカプト−２−メチル−プロピル）−アミド
    からなる群から選択されるレプトマイシン誘導体であることを特徴とする、請求項３０の抱合体。
  36. 請求項１から２９のいずれかに記載の抗体若しくは該抗体のエピトープ結合性断片、又は請求項３０から３５のいずれかに記載の抱合体、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、薬剤組成物。
  37. 医薬品として使用するための、請求項１から２９のいずれかに記載の抗体若しくは該抗体のエピトープ結合性断片、又は請求項３０から３５のいずれかに記載の抱合体。
  38. ＥｐｈＡ２キナーゼ活性を利用する癌を治療するための医薬品を製造するための、請求項１から２９のいずれかに記載の抗体若しくは該抗体のエピトープ結合性断片、又は請求項３０から３５のいずれかに記載の抱合体の使用。
  39. 前記癌が転移性癌であることを特徴とする、請求項３８の使用。
  40. 前記抗体若しくは該抗体のエピトープ結合性断片、又は前記抱合体が、腫よう血管新生を阻害することを特徴とする、請求項３８又は３９の使用。
  41. 前記癌が、乳癌、結腸癌、子宮体癌、卵巣癌、骨肉腫、子宮頚癌、腎癌、前立腺癌、肺癌、滑膜腫 すい癌、肉腫、神経こう腫、頭頚部癌、胃癌、肝臓癌及び他の癌腫からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３８から４０のいずれかの使用。
  42. 同じ又は異なる組成物の製造における更なる治療薬の使用を更に含む、請求項３８から４１のいずれかに記載の使用。
  43. 更なる治療薬が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）又はＨＥＲ２受容体の拮抗物質であることを特徴とする、請求項４２に記載の使用。
  44. ＥｐｈＡ２受容体をアッセイする方法であって、
    ａ）癌を有することが知られている対象又は癌を有する疑いのある対象から得られた細胞を、請求項１〜２９の何れか１項に記載の抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片と接触させること、
    ｂ）前記細胞に対する前記抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片の結合を測定すること、及び
    ｃ）（ｂ）における発現を正常な基準対象又は標準の発現と比較すること
    を含み、（ｂ）における発現と正常な基準対象又は標準の発現は、請求項１〜２９の何れか１項に記載の抗体若しくは該抗体のエピトープ又は請求項３０〜３５の何れか１項に記載の抱合体による治療の反応性を示唆する、方法。
  45. 前記癌が、乳癌、結腸癌、子宮体癌、卵巣癌、骨肉腫、子宮頚癌、腎癌、前立腺癌、肺癌、滑膜腫 すい癌、肉腫、神経こう腫、頭頚部癌、胃癌、肝臓癌及び他の癌腫からなる群から選択される癌の細胞である、請求項４４の方法。
  46. 前記細胞が、前記患者からの凍結組織、固定組織又は細胞であることを特徴とする、請求項４５の方法。
  47. 配列番号２０及び２６、配列番号２２及び２８、配列番号２４及び３０、配列番号７４及び７８、配列番号７６及び８０、配列番号３２及び４７、配列番号３４及び４７、配列番号３６及び４７、配列番号３７及び４８、配列番号３７及び４９、配列番号３７及び５０、配列番号３８及び４８、配列番号３８及び４９、配列番号３８及び５０、配列番号４０及び５２、配列番号４２及び５２、配列番号４３及び５２、並びに配列番号４５及び５２からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  48. 重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、
    （ｉ）前記重鎖は、それぞれＣＤＲ１、２及び３である配列番号６１、６２、６３を含み、前記軽鎖は、それぞれＣＤＲ１、２及び３である配列番号６４、６５及び６６を含む、又は、
    （ｉｉ）前記重鎖は、それぞれＣＤＲ１、２及び３である配列番号６７、６８、６９を含み、前記軽鎖は、それぞれＣＤＲ１、２及び３である配列番号７０、７１及び７２を含む、ポリヌクレオチド。
  49. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１９及び２５、配列番号２１及び２７、配列番号２３及び２９、配列番号７３及び７７、配列番号７５及び７９、配列番号３１及び４６、配列番号３３及び４６、配列番号３５及び４６、配列番号３９及び５１、配列番号４１及び５１、並びに配列番号４４及び５１からなる群から選択されるポリヌクレオチドに少なくとも９５％相同性を有し、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、ならびに前記受容体の拮抗物質である、抗体又は該抗体のエピトープ結合性断片をコードする配列を有することを特徴とする、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
  50. 請求項４７〜４９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
  51. 請求項５０のベクターを含む、宿主細胞。
  52. アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に受託番号ＰＴＡ−７６６０で寄託されている３７．３Ｄ７と命名されたハイブリドーマ細胞系、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に受託番号ＰＴＡ−７６６１で寄託されている３７．１Ｆ５と命名されたハイブリドーマ細胞系、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に受託番号ＰＴＡ−７６６２で寄託されている５３．２Ｈ１１と命名されたハイブリドーマ細胞系、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に受託番号ＰＴＡ−８４０７で寄託されているＥｐｈＡ２−Ｎ１と命名されたハイブリドーマ細胞系、又はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に受託番号ＰＴＡ−８４０８で寄託されているＥｐｈＡ２−Ｎ２と命名されたハイブリドーマ細胞系からなる群から選択されることを特徴とする、ハイブリドーマ細胞系。
  53. 細胞毒性薬に結合した、表面再構成抗体又はヒト化抗体を含む抱合体であって、前記表面再構成抗体又はヒト化抗体は、配列番号５２に少なくとも９５％の配列相同性を有する軽鎖可変領域と、配列番号４０、４２、４３及び４５からなる群から選択される配列に少なくとも９５％の配列相同性を有する重鎖可変領域とを含み、前記抗体はＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、ならびに前記受容体の拮抗物質である、抱合体。
  54. 細胞毒性薬に結合した、表面再構成抗体又はヒト化抗体を含む抱合体であって、前記表面再構成抗体又はヒト化抗体は、配列番号５２に少なくとも９８％の配列相同性を有する軽鎖可変領域と、配列番号４０、４２、４３及び４５からなる群から選択される配列に少なくとも９８％の配列相同性を有する重鎖可変領域とを含み、前記抗体はＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、ならびに前記受容体の拮抗物質である、抱合体。
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