CN101622276A - 用于治疗癌症的抗epha2的拮抗抗体 - Google Patents

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Abstract

抗体、人源化抗体、表面重建抗体、抗体片段、衍生抗体及其与细胞毒性剂的缀合物，其特异性结合并抑制A类Eph受体，拮抗生长因子对肿瘤细胞生长和存活的影响，其具有最低的激动活性，或者优选没有激动活性。所述抗体及其片段可以用于治疗表达高水平A类Eph受体的肿瘤例如乳癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、滑液癌和胰腺癌，所述衍生抗体可以用于对表达高水平A类Eph受体的肿瘤进行诊断和成像。还提供了包含细胞结合剂和细胞毒性剂的细胞毒性缀合物，包含该细胞毒性缀合物的治疗组合物，使用该缀合物抑制细胞生长和疾病治疗的方法，以及包含细胞毒性缀合物的试剂盒被公开在本发明的所有实施方式中。特别的，所述细胞结合剂是单克隆抗体及其表位结合片段，其识别并结合A类Eph受体。

Description

用于治疗癌症的抗EPHA2的拮抗抗体
发明领域
本发明提供了新型的鼠抗Eph单克隆抗体或其片段，和其人源化或表面重建(resurfaced)变型。更具体的，本发明涉及新型的单克隆抗体或其片段，和其人源化或表面重建变型，其与EphA受体家族相互作用，并作为拮抗剂。更特别的，本发明涉及抗-EphA2受体抗体，其抑制EphA2受体的细胞功能。更特别的，本发明涉及抗-EphA2受体抗体，其拮抗肿瘤细胞的生长和存活，并且其没有激动剂活性。
本发明进一步针对包含细胞结合剂和细胞毒性剂的细胞毒性缀合物，针对包含该缀合物的治疗组合物，针对在抑制细胞生长以及治疗疾病中使用该缀合物的方法，以及针对含有所述细胞毒性缀合物的试剂盒。特别的，该细胞结合剂是单克隆抗体，或其表位结合片段，以及其人源化或表面重建变型，其识别和结合EphA家族受体。
发明背景
受体酪氨酸激酶在正常生理应答过程中的细胞生长和分化，以及致瘤转化和肿瘤发展中发挥了不同的作用。Eph受体是独特的受体酪氨酸激酶(RTK)家族，在基因组中最大，由至少16种受体构成，其与9种膜结合ephrin配体相互作用(Pasquale，E.B.等人，2005，NatureReviews Mol.Cell Biol.，6：462-475)。根据序列同源性和结合亲和力，它们可以被进一步分成两组，A类和B类(Pasquale，E.B.等人，2005，Nature Reviews Mol.Cell Biol.，6：462-475)。A类Eph受体与ephrin-A家族的多种配体，一组糖基化-磷脂酰肌醇(GPI)连接的膜蛋白相互作用，而B类Eph受体结合到ephrin-B配体，膜蛋白家族。Eph受体与它们配体的结合诱导受体集聚(cluster)，激酶活性的激活，以及随后细胞质区酪氨酸残基上的反式-磷酸化(trans-phosphorylation)，形成许多信号传导蛋白的对接位点(docking site)(Kullander，K.and Klein，R.，2002，Nature Reviews Mol.Cell Biol.，3：475-486；Noren，N.K.andPasquale，E.B.，2004，Cell signal.，16：655-666)。
癌症是一种特征在于增殖无法控制的疾病，其由异常的信号传导产生。最危险的癌症形式是恶性细胞，其具有通过经渗入直接生长到邻近组织内或者通过转移植入到远距位点中而扩散的能力。转移细胞获得了从初生肿瘤脱离，经血流或淋巴系统转移到远距位点并在远距和无关微环境形成集落的能力。
目前清楚Eph分子还在疾病状态例如癌症中发挥作用。特别的，EphA2受体的过表达已经在卵巢癌、乳癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、食管癌、肾细胞癌、宫颈癌和黑色素瘤中被报道。暗示EphA2是恶性细胞的细胞生长和存活的正调节剂(Landen，C.N.等人，2005，Expert.Opin.Ther.Targets，9(6)：1179-1187)。也已经描述了EphA2在转移中的作用，因为单独EphA2的过表达足以将乳腺上皮细胞转化成恶性细胞表型(Zelinski等人，2001，Cancer Res.，61：2301-2306)，并且提高自然转移到远距位点(Landen，C.N.等人，2005，Expert.Opin.Ther.Targets，9(6)：1179-1187)。而且，越来越多证据暗示EphA2参与肿瘤血管生成(Ogawa等人，2000，Oncogene，19：6043-6052；Cheng等人2002，Mol.Cancer Res.，1：2-11；Cheng等人，2003，Neoplasia，5(5)：445-456；Dobrzanski等人，2004，Cancer Res.，64：910-919)。
EphA2的磷酸化已经显示与其丰度相关。酪氨酸磷酸化EphA2被快速内化，并且注定要进行降解，然而未磷酸化EphA2证明利用率降低因此在细胞表面集聚。目前认为这种模型可能有助于EphA2在癌症中高频率地过表达(Landen，C.N.等人，2005，Expert.Opin.Ther.Targets，9(6)：1179-1187)。然而，事实可能更复杂，因为最近的数据似乎说明EphA2-依赖性和-不依赖性功能在肿瘤进展中的作用(Fang W.B.，2005，Oncogene，24：7859-7868)。
已经开发了激动抗体(agonist antibody)，其促进EphA2酪氨酸磷酸化和内化，最终导致肿瘤细胞生长的抑制(Dodge-Zantek等人，1999，Cell Growth & Differ.，10：629-638；WO 01/12172，WO 03/094859，WO 2004/014292，WO 2004/101764，WO 2006/023403，WO2006/047637，WO 2007/030642)。这些抗体针对EphA2的胞外区。因为这些激动抗体不抑制而是刺激EphA2受体磷酸化以及下游信号，这些抗体对利用EphA2激酶的活性肿瘤可能无效。另一方面，拮抗剂包括抗体的应用已经被提出(WO 2004/092343)，但其并没有公开实际的拮抗抗体。而且，这些抗体被提出刺激而不是抑制细胞增殖。申请WO2006/084226公开了既不提高也不降低EphA2激活活性但能够阻止肿瘤细胞增殖的抗体。然而，其没有暗示这些抗体阻止ephrinA1结合到受体并抑制ephrinA1-诱导的EphA2磷酸化。而是，它们可以通过完全不同的机理影响细胞增殖，例如通过防止在ephrinA1结合之后受体集聚。因此，本领域技术人员无法得出结论这些抗体是拮抗剂，而且它们的作用机理不清楚。
因此，需要新型的拮抗抗-EphA2抗体，其结合EphA2受体的胞外区，抑制被配体ephrinA1激活，并且抑制EphA2激酶依赖性肿瘤生长。这些拮抗抗体应该能够用于治疗癌症。
发明概述
因此，本发明的目的是提供试剂，其特异性地结合A类Eph受体家族成员例如EphA2，并通过拮抗该抗体抑制受体的细胞活性。因此，本发明包括识别EphA2受体优选人EphA2受体的抗体或其片段，并且发挥所述受体拮抗剂的功能。
EphA2受体在肿瘤的产生和生长中发挥作用，并且已经参与转移。在某些实施方式中，本发明的抗体能够抑制癌细胞的生长。在某些其他实施方式中，本发明的抗体能够防止转移癌细胞的迁移。在优选的实施方式中，癌细胞是选自下列的癌的细胞：乳癌、结肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、滑液癌、胰腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、头颈癌、胃癌、肝癌和其他癌。在另一个实施方式中，本发明的抗体能够抑制血管生成。
然而，现有技术中所公开的抗-EphA2抗体大部分是激动剂(例如WO 03/094859，WO 2004/014292，WO 2004/101764，WO 2006/023403，WO 2006/047637，WO 2007/030642)，本发明包括识别所述受体的抗体，其具有最低的激动活性，或者优选对该受体没有任何激动活性。在优选的实施方式中，本发明的抗体不会刺激EphA2酪氨酸磷酸化。
本发明的抗体能够抑制配体优选ephrinA1结合到EphA2受体。在某些实施方式中，它们能够抑制EphA2酪氨酸磷酸化。在另一个实施方式中，EphA2酪氨酸磷酸化被本发明的抗体抑制，甚至在存在ephrinA1时。在某些实施方式中，本发明的抗体能够阻断EphA2-介导的信号传导，特别的，它们能够抑制EphA2-依赖性Akt磷酸化。
本发明还提供了以0.3×10-9M或更低的KD结合EphA2受体的抗体。
本发明的抗体可以是多克隆或单克隆。表位结合片段例如Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv片段包括在本发明的范围内。优选单克隆抗-EphA2抗体。在更优选的实施方式中，提供了鼠抗体，其选自37.3D7；37.1F5；53.2H11；EphA2-N1；和EphA2-N2，其在本文中被完全鉴定了它们重链和轻链可变区二者的氨基酸序列，轻链和重链可变区基因的cDNA序列，它们的CDR(互补决定区)的鉴定，它们表面氨基酸的鉴定，以及它们以重组形式表达的手段。生产鼠抗-EphA2单克隆抗体37.3D7、37.1F5和53.2H11，以及EphA2-N1和EphA2-N2的杂交瘤已经根据布达佩斯条约分别于2006年6月16日和2007年5月3日被保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA，其保藏号分别为PTA-7660、PTA-7661、PTA-7662、PTA-8407和PTA-8408。
本发明包括鼠抗-EphA2单克隆抗体，其选自37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2，以及37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体的表面重建或人源化变型，其中抗体或或它们表位结合片段的可变区框架表面暴露残基在轻链区和重链区二者中被替换成更加近似已知的人抗体表面。本发明的人源化抗体和其表位结合片段具有改进的性质，即它们在被给药的人类个体中比鼠变型具有较少的免疫原性(或完全非免疫原性)。因此，本发明人源化37.3D7；37.1F5；53.2H11；EphA2-N1；和EphA2-N2抗体的不同变型及其表位结合片段特异性地识别EphA2受体而对人不是免疫原的。
本发明37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体的人源化变型在本文中被完全鉴定了它们各自的轻链和重链可变区二者的氨基酸序列，轻链和重链可变区基因的DNA序列，互补决定区(CDR)的鉴定，它们可变区框架表面氨基酸残基的鉴定，以及公开了它们以重组形式表达的手段。
本发明还涉及细胞毒性缀合物的应用，所述缀合物包括：(1)细胞结合剂，其识别并结合EphA受体例如EphA2受体，和(2)细胞毒性剂。在细胞毒性缀合物中，细胞结合剂对EphA受体(例如EphA2受体)具有高亲和力，细胞毒性剂对表达EphA的细胞具有高水平的细胞毒性，以便本发明的细胞毒性缀合物形成有效的致死剂。
在优选的实施方式中，细胞结合剂是抗-EphA2抗体(例如37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2)或其表位结合片段，更优选为人源化抗-EphA2抗体(例如37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2)或其表位结合片段，其中细胞毒性剂被直接或通过可切割或不可切割连接物共价结合到所述抗体或其表位结合片段。在更优选的实施方式中，细胞结合剂是人源化37.3D7；37.1F5；53.2H11；EphA2-N1；和EphA2-N2抗体或其表位结合片段，细胞毒性剂是紫杉烷类化合物(taxane)、类美登素(maytansinoid)、茅屋霉素(tomaymycin)衍生物、来普霉素(leptomycin)衍生物、CC-1065或CC-1065类似物。
在本发明的优选实施方式中，细胞结合剂是人源化抗-EphA2抗体37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2，细胞毒性剂是美登素(maytansine)化合物例如DM1或DM4。
本发明还包括抗-EphA2抗体片段的应用，其保持结合EphA2受体的能力。在本发明的另一个方面中，设计了抗-EphA2抗体功能等同物的应用。
本发明还包括抑制表达EphA2受体的细胞生长的方法。在优选的实施方式中，用于抑制表达EphA2受体的细胞生长的方法发生在体内，并且导致细胞死亡，尽管还包括了体外和先体外后体内的应用。
本发明还提供了治疗组合物，其包括抗-EphA2抗体或抗-EphA2抗体-细胞毒性剂缀合物以及药物上可以接受的载体或赋形剂。在某些实施方式中，治疗组合物包含第二治疗剂。这种第二治疗剂可以选自包括成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)或HER2受体的拮抗剂的组。
本发明进一步包括使用治疗组合物治疗患有癌症的个体的方法。在某些实施方式中，癌症是转移癌。特别的，癌细胞是选自下列的癌的细胞：乳癌、结肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、滑液癌、胰腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、头颈癌、胃癌、肝癌和其他癌。在优选的实施方式中，细胞毒性缀合物包含抗-EphA2抗体和细胞毒性剂。在更优选的实施方式中，细胞毒性缀合物包含人源化37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体-DM1缀合物，人源化37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体-DM4缀合物，人源化37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体-紫杉烷类化合物缀合物，或人源化37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体-茅屋霉素衍生物缀合物，并且所述缀合物连同药物上可以接受的载体或赋形剂给药。
在本发明的另一个方面中，抗-EphA2抗体被用于检测生物样品中的EphA2蛋白。在优选的实施方式中，所述抗体用于测定肿瘤组织中的EphA2水平。
本发明还包括试剂盒，其包括抗-EphA2抗体或抗-EphA2抗体-细胞毒性剂缀合物，以及其使用说明书。在优选的实施方式中，抗-EphA2抗体是人源化37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体，细胞毒性剂是美登素化合物例如DM1或DM4，紫杉烷类化合物，来普霉素衍生物或茅屋霉素衍生物，以及在治疗患有癌症的个体中使用缀合物的说明书。该试剂盒还包括制备药物上可以接受的制剂所必需的组分，例如如果缀合物是冻干状态或浓缩形式以及用于给药该制剂时的稀释剂。
除非其他方式说明，所引用所有参考文件和专利都通过参照并入本文中。
附图说明
图1显示通过FACS分析进行抗-EphA2抗体与过表达人EphA2的细胞(300-19/hu-EphA2细胞)的特异性结合的分析。分别，图1A显示37.3D7抗体的数据，图1B为37.1F5抗体，图1C为53.2H11抗体。
图2显示纯化的37.3D7抗体与BxPC3人胰腺癌细胞、MDA-MB-231人乳癌细胞以及HT-29人结肠癌细胞的特异性结合。显示了FACS分析的统计图。
图3显示使用过表达人EphA2的鼠300-19细胞(300-19/hu-EphA2)建立的抗体37.3D7(图3A)、37.1F5(图3B)和53.2H11(图3C)的结合曲线。
图4显示纯化的37.3D7和53.2H11抗体与过表达EphA2的细胞的特异性结合。显示了FACS分析的统计图。图4A显示过表达鼠EphA2(300-19/mu-EphA2)的细胞数据，图4B显示过表达大鼠EphA2(300-19/大鼠-EphA2)的细胞的数据。
图5A显示纯化的37.3D7、37.1F5和53.2H11抗体与VERO猴肾上皮细胞的特异性结合。显示了FACS分析的统计图。
图5B显示使用VERO猴肾上皮细胞建立的抗体37.3D7、37.1F5和53.2H11的结合曲线。
图6显示37.3D7、37.1F5和53.2H11抗体抑制生物素化ephrinA1与哺乳动物MDA-MB-231人乳癌细胞的结合。
图7A显示37.3D7和37.1F5抗体在哺乳动物MDA-MB-231细胞中抑制ephrinA1刺激的EphA2-磷酸化。
图7B显示37.3D7和53.2H11抗体在哺乳动物MDA-MB-231细胞中抑制ephrinA1刺激的EphA2-磷酸化。
图7C显示37.3D7和37.1F5抗体在胰腺CFPAC-1细胞中抑制ephrinA1刺激的Akt磷酸化。
图8A和B显示在哺乳动物MDA-MB-231细胞中ephrinA1刺激EphA2磷酸化，以及由于抗体37.3D7、37.1F5和53.2H11而缺少EphA2-磷酸化的刺激。
图9A～9D显示37.3D7和53.2H11抗体抑制直肠HT-29细胞(9A)、直肠LoVo细胞(9B)、胰腺CFPAC-1细胞(9C)和黑色素瘤UACC-257细胞(9D)的血清刺激生长和存活。
图10A显示37.3D7抗体剂量依赖性抑制血清刺激的胰腺BxPC3细胞生长。
图10B显示53.2H11抗体剂量依赖性抑制血清刺激的直肠LoVo细胞生长。
图10C显示53.2H11抗体剂量依赖性抑制EGF-刺激的直肠LoVo细胞的生长。
图11A显示37.3D7抗体与HUVEC细胞的结合曲线。
图11B显示37.1F5抗体与HUVEC细胞的结合曲线。
图12显示37.3D7抗体抑制VEGF-刺激的HUVEC生长和存活。
图13显示7.3D7抗体在HUVEC细胞中抑制VEGF-诱导的Akt磷酸化。
图14显示使用37.3D7抗体处理对小鼠中HT-29结肠癌异种移植物生长的影响。将该影响与抗-EGFR抗体和非结合对照IgG1抗体的影响进行比较。
图15A显示hu37.3D7-SPDB-DM4抑制PC3前列腺肿瘤细胞的生长。
图15B显示hu53.2H11-SPDB-DM4抑制PC3前列腺肿瘤细胞的生长。
图16A显示使用hu37.3D7-SPDB-DM4处理对小鼠中MDA-MB-231乳房肿瘤异种移植物生长的影响。
图16B显示使用hu53.2H11-SPDB-DM4对小鼠中MDA-MB-231乳房肿瘤异种移植物生长的影响。
发明详述
本文提供了新型的活性剂，其能够特异性结合EphA受体并拮抗所述受体。特别的，本发明已经发现了新型的抗体，其特异性结合细胞表面的EphA受体。尽管之前已知的特异性结合EphA受体的抗体，即使在不存在其受体的情况下也能够激活该受体，但本发明的抗体或其片段优选不存在任何激动活性。另一方面，它们具有独特的能力抑制受体的细胞功能甚至存在其配体时，该特征是已知EphA2-结合抗体所完全没有的。而且，本发明的拮抗抗体和抗体片段抑制人肿瘤细胞的生长和/或迁移，和/或血管生成，参考现有技术完全无法预见的三种性能(Landen，C.N.等人，2005，Expert.Opin.Ther.Targets，9(6)：1179-1187；WO 01/12172；WO 2004/014292；WO 2004/092343)。
本文所使用的术语“Eph受体”指酪氨酸激酶，其属于Eph受体家族(在Pasquale，E.B.等人，2005，Nature Reviews Mol.Cell Biol.，6，462-475中综述)。本文所使用的“A类Eph受体家族”或“EphA受体”优选与糖基化磷脂酰肌醇(GPI)-连接的配体(属于ephrin-A亚类，目前包括5种配体)相互作用。具体的EphA受体包括：EphA1(也被称作Eph和Esk)；EphA2(也被称作Eck、mEck、Myk2、Sek2)；EphA3(也被称作Hek，Mek4，Tyro4和Cek4)；EphA4(也被称作Hek8，Sek1，Tyro1和Cek8)；EphA5(也被称作Hek7，Bsk，Ehk1，Rek7和Cek7)；EphA6(也被称作mEhk2和Ehk2)；EphA7(也被称作Hek11、Mdk1、Ebk、Ehk3)；和EphA8(也被称作Eek和mEek)及其天然存在的变体。本文中优选的Eph受体是“EphA2受体”，其包含例如在Genbank保藏号No.NM_004431(人EphA2)、NM_010139(鼠EphA2)或NXM_345596(大鼠EphA2)中的氨基酸序列。本文所使用的术语“Eph配体”指蛋白质，其结合并任选地激活Eph受体(例如刺激Eph受体自磷酸化)。本文中的优选Eph配体是“ephrinA1”，其结合EphA2受体，并包括例如在Genbank保藏号NM_004428(人ephrinA1)中的氨基酸序列。
本文所使用的术语“拮抗剂”指能够抑制靶分子例如EphA受体的一种或者多种生物活性的分子。拮抗剂可以通过干扰受体结合配体(反之亦然)，通过降低EphA2磷酸化和/或通过使已经被配体激活的细胞失去能力或杀死已经被配体激活的细胞发挥作用。拮抗剂可以完全阻断受体-配体相互作用，或者可能实质性降低这些相互作用。为了本发明的目的，所有这些拮抗剂干扰的点需要被等同地考虑。因此，包括在本发明范围内的是拮抗剂(例如中和抗体)，其结合EphA受体，Eph配体或Eph受体和Eph配体复合物；EphA受体或EphA配体的氨基酸序列变体或衍生物，其拮抗EphA受体和EphA配体之间的相互作用；可溶性EphA受体或可溶性EphA配体，其任选融合到异源分子例如免疫球蛋白区(例如免疫粘附分子)；复合物，其包含联合EphA配体的EphA受体；合成或原始序列肽，其结合EphA受体或EphA配体。
本文中所使用的术语“激动剂”指能够激活靶细胞的一种或者多种生物活性的任何化合物，其包括蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段、缀合物、大分子、小分子。EphA激动剂通过刺激蛋白质的磷酸化继而激发所述蛋白质的降解发挥作用。
因此，此外，在优选的实施方式中，本发明提供了抗-EphA单克隆抗体、抗-EphA人源化抗体以及所述抗-EphA抗体的片段。本发明的抗体和抗体片段都被设计成特异性识别和结合EphA2受体，并且作为EphA2受体拮抗剂。而且，本发明的拮抗抗体和抗体片段具有独特的性能能够抑制人肿瘤细胞的生长和/或转移癌细胞的迁移和/或血管生成。
本发明被拮抗抗体和抗体片段结合的优选EphA受体是EphA2受体。人EphA2是优选的EphA2受体。
EphA2受体属于受体家族，其细胞质尾部磷酸化在配体结合之后被提高，以与多种适体(adapter)和信号传导蛋白相互作用，这引起了激活不同的下游细胞信号传导通路(Kullander，K.and Klein，R.，2002，Nature Reviews Mol.Cell Biol.，3：475-486；Noren，N.K.andPasquale，E.B.，2004，Cell signal.，16：655-666)。本文所使用的术语“EphA2-介导的信号传导”指所有的细胞事件，其响应EphA2结合配体而发生。然而，现有技术中所公开的抗体激动EphA2受体，特别的提高EphA2蛋白的酪氨酸磷酸化，本发明的抗体和抗体片段优选不具有任何这类拮抗性能。特别的，它们不能自己刺激EphA2磷酸化。
另一方面，本发明提供了第一实际拮抗抗-EphA2抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体和抗体片段能够抑制配体与EphA受体的结合。在优选的实施方式中，ephrinA1与EphA2的结合被本发明所提供的抗体和其片段所防止。显著地，在另一个实施方式中，本发明的抗体和抗体片段能够抑制EphA2受体的酪氨酸磷酸化，即使存在ephrinA1时。而且所述抗体和其片段能够抑制EphA2-介导的信号传导。特别的，Akt的ephrinA1-依赖性磷酸化能够被本发明的抗体和抗体片段防止。
抗体
术语“抗体”在本文中是以最宽的意义使用的，并且具体地覆盖任何同种型的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，多克隆抗体，多特异性抗体，嵌合抗体和抗体片段。通过重组方法能够产生与特异抗原反应的抗体，例如选择噬菌体或类似载体中的重组抗体库，或者通过使用抗原或编码抗原的核酸对动物进行免疫。
典型的抗体包括通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。每条重链和重链都含有恒定区和可变区。每个可变区都含有被称作“互补决定区(CDR)”或“多变区”的节段，其是结合抗原的表位的主要原因。通常它们被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-末端依次编号。可变区中更高保守的部分被称作“框架区”。
本文所使用的“VH”或“VH”指抗体免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab′或F(ab′)2片段的重链。引用“VL”或“VL”指抗体的免疫球蛋白轻链，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab′或F(ab′)2片段的轻链。
“多克隆抗体”是作为一种或者多种其他不相同的抗体之一，或者在存在一种或者多种其他不相同的抗体时所产生的抗体。通常，多克隆抗体是在存在许多产生不相同抗体的B-淋巴细胞时，从B-淋巴细胞产生的。通常，多克隆抗体是直接从经免疫的动物获得的。
本文所使用的“单克隆抗体”是从一群基本上均一的抗体获得的抗体，即形成该群的抗体除了可能非常少量存在的天然突变外，基本上是相同的。这些抗体针对单一表位，因此是高度特异性的。
“表位”是抗原上抗体结合的位点。其可以是由连续的残基形成，或者由被抗原蛋白质的折叠造成邻近的不连续残基形成。连续氨基酸所形成的表位通常在暴露到变性溶剂时仍被保持，然而不连续氨基酸所形成的表位通常在所述暴露后会丧失。
本文所使用的术语“KD”指特定抗体/抗原相互作用的解离常数。
本发明涉及鼠抗-EphA2抗体，这里为37.3D7；37.1F5；53.2H11；EphA2-N1；以及EphA2-N2，其被完全鉴定了轻链和重链二者的氨基酸序列，CDR的鉴定，表面氨基酸的鉴定，以及它们以重组形式表达的手段。抗体37.3D7；37.1F5；53.2H11；EphA2-N1；和EphA2-N2轻链和重链以及人源化变型的初级氨基酸和DNA序列在本文中被公开。
抗体37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2分别是由被称作37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N的杂交瘤所产生的，所述被称作37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N的杂交瘤分别于2006年6月16日和2007年5月3日被保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA，其保藏号分别为PTA-7660、PTA-7661、PTA-7662、PTA-8407和PTA-8408。
本发明的范围不限于包含这些序列的抗体和片段。而是，所有特异性结合EphA2受体并拮抗受体生物活性但没有激动活性的所有抗体和片段都落入到本发明的范围内。因此，抗体和抗体片段可能与抗体37.3D7；37.1F5；53.2H11；EphA2-N1；和EphA2-N2或人源化衍生物在它们的支架、CDR、轻链和重链的氨基酸序列上有区别，但仍落入本发明的范围内。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体或其表位结合片段，其包含具有选自下列的氨基酸序列的一个或者多个CDR：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71和72。
在优选的实施方式中，本发明的抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：1、2、3、7、8、9、13、14、15、61、62、63、67、68和69的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：4、5、6、10、11、12、16、17、18、64、65、66、70、71和72的氨基酸序列。
在更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了37.3D7抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：1、2和3构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：4、5和6构成的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了37.1F5抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：7、8和9构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：10、11和12构成的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：13、14、15、16、17和18的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了53.2H11抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：13、14和15构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：16、17和18构成的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：61、62、63、64、65和66的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了EphA2-N1抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：61、62和63构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：64、65和66构成的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：67、68、69、70、71和72的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了EphA2-N2抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：67、68和69构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：70、71和72构成的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明的抗体包含VH，其具有选自SEQ IDNO：20、22、24、74和76的氨基酸序列。在一个优选的实施方式中，提供了37.3D7抗体，其包含具有SEQ ID NO：20构成的氨基酸序列的VH。在另一个优选的实施方式中，提供了37.1F5抗体，其包含具有SEQID NO：22构成的氨基酸序列的VH。在另一个优选的实施方式中，提供了53.2H11抗体，其包含具有SEQ ID NO：24构成的氨基酸序列的VH。在另一个优选的实施方式中，提供了EphA2-N1抗体，其包含具有SEQ ID NO：74构成的氨基酸序列的VH。在另一个优选的实施方式中，提供了EphA2-N2抗体，其包含具有SEQ ID NO：76构成的氨基酸序列的VH。
在另一个实施方式中，本发明的抗体包含VL，其具有选自SEQ IDNO：26、28、30、78和80的氨基酸序列。在一个优选的实施方式中，提供了37.3D7抗体，其包含具有SEQ ID NO：26构成的氨基酸序列的VL。在另一个优选的实施方式中，提供了37.1F5抗体，其包含具有SEQID NO：28构成的氨基酸序列的VL。在另一个优选的实施方式中，提供了53.2H11抗体，其包含具有SEQ ID NO：30构成的氨基酸序列的VL。在另一个优选的实施方式中，提供了EphA2-N1抗体，其包含具有SEQ ID NO：78构成的氨基酸序列的VL。在另一个优选的实施方式中，提供了EphA2-N2抗体，其包含具有SEQ ID NO：80构成的氨基酸序列的VL。
人源化或表面重建37.3D7；37.1F5；53.2H11；EphA2-N1；和EphA2-N2抗体
本文所使用的术语“人源化抗体”指嵌合抗体，其含有最少的来自非人免疫球蛋白的序列。本文所使用的“嵌合抗体”是一种抗体，其中其恒定区或其一部分被改变、替换或交换，以便可变区被连接到不同物种或者其他抗体类型或亚类的恒定区。“嵌合抗体”还指一种抗体，其中其可变区或其一部分被改变、替换或交换，以便恒定区被连接到不同物种或者属于其他抗体类型或亚类的可变区。
人源化的目的是降低异种抗体例如鼠抗体，用于引入到人类中时的免疫原性，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。可以使用许多技术例如表面重建和CDR嫁接法生产人源化抗体或适于被其他哺乳动物不排异的抗体。本文所使用的表面重建技术使用利用分子建模、统计分析以及诱变改变抗体可变区的非CDR表面以类似靶宿主的已知抗体表面的组合
用于抗体表面重建的策略和方法，以及用于降低抗体在不同宿主中免疫原性的其他方法被公开在美国专利5,639,641中，通过参照将其全部并入本文。简言之，在优选的方法中，(1)产生一组抗体重链和轻链可变区的位置比对，以提供一组重链和轻链可变区框架表面暴露位置，其中所有可变区的比对位置至少大约98％相同；(2)一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基被限定成啮齿动物抗体(或其片段)；(3)一组重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基，其与所鉴定的啮齿动物表面暴露氨的基酸残基组几乎相同；(4)除了在所述啮齿动物抗体互补决定区任意氨基内的那些氨基酸以外，在步骤(2)中所限定的重链和轻链可变区暴露氨基酸残基组被在步骤(3)中所鉴定的重链和轻链可变区暴露氨基酸残基组所替代；以及(5)产生了具有结合特异性的人源化啮齿动物抗体。
能够利用各种其他的方法将抗体人源化，所述方法包括CDR-嫁接法(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利No.5,530,101；和5,585,089)，镶面法(veneering)或表面重建(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E.A.，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka G.M.等人，1994，Protein Engineering 7(6)：805-814；Roguska M.A.等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：969-973)和链重排(chain shuffling)(美国专利No.5,565,332)。可以通过本领域中各种已知的方法制备人抗体，其包括噬菌体展示法。同样参见美国专利No.4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；以及国际专利申请No.WO 98/46645WO98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741(通过参照将所述参考文献全部并入本文)。
本发明提供了人源化抗体或其片段，其识别EphA2受体并作为拮抗剂。在另一个实施方式中，人源化抗体或其表位结合片段具有额外的能力抑制表达EphA2受体的癌细胞的生长。在进一步的实施方式中，人源化抗体或其表位结合片段具有额外的能力抑制表达EphA2受体的转移癌细胞的迁移。
这类人源化抗体的优选实施方式是人源化37.3D7，37.1F5；53.2H11；EphA2-N1或EphA2-N2抗体或其表位结合片段。
在更优选的实施方式中，提供了表面重建或人源化变型的37.3D7，37.1F5；53.2H11；EphA2-N1和EphA2-N2抗体，其中抗体或其片段的表面暴露残基在轻链和重链二者中都被替换成近似的已知人抗体表面。本发明的人源化37.3D7，37.1F5；53.2H11；EphA2-N1和EphA2-N2抗体或其表位结合片段具有改进的性能。例如，人源化37.3D7，37.1F5；和53.2H11抗体或其表位结合片段特异性识别EphA2受体。更优选，人源化37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体或其表位结合片段具有额外的能力抑制表达EphA2受体的癌细胞的生长。
人源化变型的37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体也在本文中被完全鉴定它们各自轻链和重链可变区二者的氨基酸序列，轻链和重链可变区基因的DNA序列，CDR的鉴定，它们表面氨基酸的鉴定，以及公开了它们以重组形式表达的手段。然而，本发明的范围不限制于包含这些序列的抗体和片段。而是，本发明中包含了特异性结合EphA2受体的所有抗体和片段。优选，特异性结合EphA2受体抗体和片段拮抗受体的生物活性。更优选，这些抗体进一步基本上不存在激动活性。因此，本发明的抗体和表位结合抗体片段可以与7.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体或其人源化衍生物在它们的支架、CDR、轻链和/或重链的氨基酸序列上有区别，但仍落入本发明的范围内。
通过建模鉴定37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体的CDR，并且已经预测了它们的分子结构。同样，尽管CDR对于表位识别是重要的，但它们对于本发明的抗体和片段不是必要的。因此，所提供的抗体和片段具有例如本发明抗体的亲和力成熟所产生的改进性能。
正如在实验实施例部分所公开的，可能产生37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2的小鼠轻链IgVκ和Jκ生殖系基因和重链IgVh和Jh生殖系基因已经被鉴定。这些生殖系基因序列可以用于鉴定抗体中包括CDR中的体细胞突变。
37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体重链和轻链可变区的序列以及它们CDR的序列之前不是已知的，并在本申请中被列出。这些信息可以用于生产人源化变型的37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体。这些人源化抗-EphA抗体或它们的衍生物也可以用作本发明的细胞结合剂。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了人源化抗体或其表位结合片段，其包含具有选自下列的氨基酸序列的一个或多个CDR：SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71和72。在优选的实施方式中，本发明的人源化抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：1、2、3、7、8、9、13、14、15、61、62、63、67、68和69的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：4、5、6、10、11、12、16、17、18、64、65、66、70、71和72的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，本发明的人源化抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：1、2和3表示的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：4、5和6表示的氨基酸序列。在另一个更优选的实施方式中，本发明的人源化抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：7、8和9表示的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：10、11和12表示的氨基酸序列。在另一个更优选的实施方式中，本发明的人源化抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：13、14和15表示的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：16、17和18表示的氨基酸序列。在另一个更优选的实施方式中，本发明的人源化抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：61、62和63构成的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含三个连续的CDR，其具有SEQ IDNO：64、65和66构成的氨基酸序列。在另一个更优选的实施方式中，本发明的人源化抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：67、68和69构成的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：70、71和72构成的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供了人源化抗体或其片段，其包含具有选自SEQ ID NO：32、34、36、37、38、40、42、43和45的氨基酸序列的VH。在优选的实施方式中，提供了人源化37.1D7抗体，其包含具有选自SEQ ID NO：32、34和36的氨基酸序列的VH。在另一个优选的实施方式中，提供了人源化37.1F5抗体，其包含具有选自SEQID NO：37和38的氨基酸序列的VH。在另一个优选的实施方式中，提供了人源化53.2H11抗体，其包含具有选自SEQ ID NO：40、42、43和45的氨基酸序列的VH。
在另一个实施方式中，本发明提供了人源化抗体或其片段，其包含具有选自SEQ ID NO：47、48、49、50和52的氨基酸序列的VL。在优选的实施方式中，提供了人源化37.1D7抗体，其包含具有SEQ IDNO：47所构成氨基酸序列的VL。在另一个优选的实施方式中，提供了人源化37.1F5抗体，其包含具有选自SEQ ID NO：48、49和50的氨基酸序列的VL。在另一个优选的实施方式中，提供了人源化53.2H11抗体，其包含具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的VL。
本发明的人源化37.3D7抗体及其表位结合片段能够还在轻链和/或重链氨基酸残基中在表1A和1B中灰色残基所限定的一个或者多个位点上包含取代，其代表鼠表面框架残基已经被从原始鼠残基变化为人抗体28E4中的相应框架表面残基。表1B中加星号(*)的残基对应人源化37.3D7重链变体中的鼠回复突变(SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：36)。回复突变的残基接近CDR，并且根据在美国专利No.5,639,641中的描述进行选择，或者已经在之前人源化努力中进行的导致抗原结合亲和力的降低的残基选择(Roguska等人，1996，Protein Eng.；9(10)：895-904；美国专利申请公开2003/0235582和2005/0118183)。
类似的，本发明人源化37.1F5；53.2H11；EphA2-N1；和EphA2-N2抗体及其表位结合片段也能够在轻链和/或重链氨基酸残基中包含取代。
多核苷酸、载体和宿主细胞
提供了编码本发明抗-EphA2抗体的核酸。在一个实施方式中，核酸分子编码抗-EphA2免疫球蛋白的重链和/或轻链。在优选的实施方式中，单条核酸编码抗-EphA2免疫球蛋白的重链，另一条核酸分子编码抗-EphA2免疫球蛋白的轻链。
在本发明的另一个方面中，提供了多核苷酸，其编码具有选自SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、37、38、40、42、43、45、47、48、49、50、52、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、74、76、78和80的氨基酸序列的多肽。在优选的实施方式中，本发明的多核苷酸选自SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、39、41、44、46、51、73、75、77和79。本发明不限于所述多核苷酸本身，而且还包括所有显示与所述多核苷酸至少80％同一性的多核苷酸。
本发明提供了含有本发明多核苷酸的载体。在一个实施方式中，该载体含有编码抗-EphA2免疫球蛋白重链的多核苷酸。在另一个实施方式中，所述多核苷酸编码抗-EphA2免疫球蛋白的轻链。本发明还提供了包含编码其融合蛋白、修饰的抗体、抗体片段及探针的多核苷酸分子的载体。
为了表达本发明抗-EphA2抗体的重链和/或轻链，编码所述重链和/或轻链的多核苷酸被插入到表达载体中，以便基因被可操作地连接到转录和翻译序列。表达载体包括质粒、YAC、粘粒(cosmid)、反转录病毒、EBV-衍生游离基因以及本领域技术人员能够知道如何便利确保所述重链和/或轻链表达的所有其他载体。本领域技术人员将意识到编码重链和轻链的多核苷酸能够被克隆到不同的载体中，或者在相同的载体中。在优选的实施方式中，所述多核苷酸被克隆在相同的载体中。
本发明的多核苷酸和包含这些分子的载体能够被用于转化适当的哺乳动物宿主细胞，或者本领域技术人员已知的任何其他类型的宿主细胞。可以通过将多核苷酸引入细胞宿主的任何已知方法进行转化。这些方法是本领域技术人员公知的，并且包括葡聚糖(dextran)-介导的转化、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电转、将多核苷酸封装在脂质体内、基因枪(biolistic)注射以及直接将DNA注射到细胞核中。
抗体片段
本发明的抗体包括上面所讨论的全长抗体以及表位结合片段。本文所使用的“抗体片段”包括保持结合全长抗体所识别表位的能力的任何抗体部分，通常被称作“表位结合片段”抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv(dsFv)和包含VL或VH区的片段。包括单链抗体的表位结合片段可以单独或者联合下列的整体或者一部分的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3区。
这些片段可以含有Fab片段或F(ab′)2片段之一或者二者。优选，抗体片段含有整个抗体的全部六个CDR，尽管含有少于全部这些区域的片段例如3个、4个或5个CDR也具有功能。进一步，这些片段可以是下列免疫球蛋白类型任一种的成员或与其组合：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类。
可以通过蛋白质水解切割产生Fab和F(ab′)2片段，其使用酶诸如木瓜蛋白酶(Fab片段)或胃蛋白酶(F(ab′)2片段)。
“单链FV”(“scFv”)片段是含有连接到至少一个抗体轻链可变区(VL)的至少一个抗体重链可变区(VH)的表位结合片段。连接物可以是所选择的短、柔性肽用于确保(VL)和(VH)区一旦它们被连接时发生适当的三维折叠，以便能够维持单链抗体片段来源的整个抗体的靶分子结合特异性。(VL)或(VH)序列的羧基末端可以通过连接物共价连接到互补(VL)或(VH)序列的氨基酸末端。
本发明的单链抗体片段含有具有本发明所描述的整个抗体的可变区或互补决定区(CDR)至少之一的氨基酸序列，但是缺少这些抗体的某些或者全部恒定区。这些恒定区对于抗原结合不是必要的，但是构成了整个抗体结构的主要部分。因此，单链抗体片段可以克服与使用含有部分或者全部恒定区相关的某些问题。例如，单链抗体片段倾向于不存在生物分子与重链恒定区之间的期望相互作用，或者其他不期望的生物活性。另外，单链抗体片段显著地比整个抗体小，因此可能具有比整个抗体大的毛细管渗透性，这使得单链抗体片段更有效地定位并结合到靶抗原-结合位点。还能够在原核细胞中以相对大规模生产抗体片段，因此促进了它们的生产。此外，单链抗体片段的相对小的尺寸使它们与整个抗体相比不太可能在受体中引发免疫应答。
可以通过分子克隆、抗体噬菌体展示库或本领域技术人员公知的类似技术生产单链抗体片段。可以在真核细胞或原核细胞包括细菌中生产这些蛋白质。也可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法生产本发明的表位结合片段。在噬菌体展示方法中，功能性抗体区被展示在噬菌体颗粒的表面，所述噬菌体颗粒携带编码功能性抗体区的多核苷酸序列。特别的，这些噬菌体可以被用于展示从所有组成部分(repertoire)或组合的抗体库(例如人或鼠)表达的表位结合区。可以利用抗体选择或者鉴定表达与目标抗原结合的表位结合区的噬菌体，例如使用标记的结合或捕获到固体表面或珠的抗原。在这些方法中所使用的噬菌体通常是丝状噬菌体其包括fd和M13或二硫键稳定的Fv抗体区，其被重组融合到噬菌体基因III或基因VIII蛋白质。
可以用于制备本发明的表位结合片段的噬菌体展示方法的例子包括在Brinkman等人，1995，J.Immunol.Methods，182：41-50；Ames等人，1995，J.Immunol.Methods，184：177-186；Kettleborough等人，1994，Eur.J.Immunol.，24：952-958；Persic等人，1997，Gene 187：9-18；Burton等人，1994，Advances in Immunology，57：191-280；PCT申请No.PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO95/20401；和美国专利No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中所公开的，通过参照均将其全部并入本文。
在噬菌体选择后，编码片段的噬菌体的区域能够被分离并用于通过所选择的宿主中表达产生表位结合片段，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，其使用重组DNA技术例如下面详细描述的。例如，用于重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术也可以被采用，其使用本领域中已知的方法例如在PCT公开WO92/22324；Mullinax等人，1992，BioTechniques，12(6)：864-869；Sawai等人，1995，AJRI，34：26-34；和Better等人，1988，Science，240：1041-1043所公开的；通过参照将所述参考文献全部并入本文。可以用于生产单链Fv和抗体的技术的例子包括在美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston等人，1991，Methods in Enzymology 203：46-88；Shu等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：7995-7999；Skerra等人，1988，Science，240：1038-1040中描述的。
功能等同物
本发明的范围中还包括抗-EphA抗体和人源化抗-EphA2受体抗体的功能等同物。术语“功能等同物”包括例如具有同源序列的抗体、嵌合抗体、人工抗体和经修饰的抗体，其中每种功能等同物都被限定为它们具有结合EphA2受体的能力。本领域技术人员能够理解在被称作“抗体片段”的分子组和被称作“功能等同物”的分子组之间存在重叠。生产功能等同物的方法是本领域技术人员已知的，并被公开在例如PCT申请WO 93/21319，欧洲专利No.EP 0239400；PCT申请WO89/09622；欧洲专利No.EP 0338745；以及欧洲专利申请EP 0332424中，分别通过参照将它们全部并入。
具有同源序列的抗体是氨基酸序列与本发明的抗-EphA抗体和人源化抗-EphA抗体氨基酸序列具有序列同源性的那些抗体。优选，同源性是与本发明抗-EphA抗体和人源化抗-EphA抗体的可变区的氨基酸序列。本文用于氨基酸序列的“序列同源性”被定义为与另一条氨基酸序列具有至少大约90％、91％、92％、93％或94％序列同源性的的序列，更优选至少大约95％、96％、97％、98％或99％序列同源性，其是通过例如照Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：2444-2448的FASTA检索方法测定的。
嵌合抗体是抗体的不同部分来自不同动物物种的抗体。例如，一种抗体，其具有与人免疫球蛋白恒定区配对的来自鼠单克隆抗体的可变区。生产嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Morrison，1985，Science，229：1202；Oi等人，1986，BioTechniques，4：214；Gillies等人，1989，J.Immunol.Methods，125：191-202；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816,397，通过参照将其全部并入本文。
人源化形式的嵌合抗体是通过将例如小鼠抗体的互补性决定去构建到人框架区中制备的，例如参见PCT公开No.W092/22653。人源化嵌合抗体优选具有基本上或完全来自相应的人抗体区的除互补决定区(CDR)以外的恒定区和可变区，基本上或完全来自非人类的哺乳动物的CDR。
人工抗体包括scFv片段、二聚抗体、三聚抗体、四聚抗体和mru(参见Winter，G.and Milstein，C，1991，Nature，349：293-299；Hudson，P.J.，1999，Current Opinion in Immunology，11：548-557所综述的)，均具有抗原-结合能力。在单链Fv片段(scFv)中，抗体的VH和VL区被通过柔性肽连接。典型地，该连接肽长度为大约15个氨基酸残基。如果连接物太小，例如5个氨基酸，则形成二聚抗体，其为二价scFv二聚体。如果连接物减少到低于3个氨基酸残基，则形成三聚抗体和四聚抗体。抗体的最小结合单位是CDR，典型地为重链的CDR2，其具有充分的特异性识别和结合，因此其能够独立使用。这种片段被称作分子识别单位或mru。某些这类mru能够与段连接肽连接在一起，因此形成人工结合肽，其具有比单个mru高的亲合力。
本发明的功能等同物还包括经修饰的抗体例如通过将任何类型的分子共价结合到抗体而修饰的抗体。例如，经修饰的抗体包括已经通过例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过抑制保护/阻断基团的衍生物、蛋白质水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接等进行修饰。共价结合防止抗体产生抗-独特型(anti-idiotypic)应答。可以通过已知的技术进行这些修饰，包括但不限于特异性的化学切割、乙酰化、甲酰化、代谢合成衣霉素等。另外，经修饰的抗体可以含有一种或者多种非典型氨基酸。
可以通过交换不同框架中不同链上的不同CDR而生产功能等同物。因此，例如对于给定的CDR组可以通过替代不同的重链而有不同类别的抗体，例如可以产生IgG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE抗体类型和同种型。类似的，可以通过将给定的CDR组嵌入到完全合成的框架中而生产本发明范围内的人工抗体。
在特定CDR组的两侧使用多种本领域中已知的方法，可以通过可变区和/或恒定区序列中的突变、缺失和/或插入而容易产生功能等同物。
本发明的抗体片段以及功能等同物包括与37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体相比，具有可检测水平与EphA结合的那些分子。可检测水平的结合包括鼠37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体与EphA结合能力的至少10～100％，优选至少50％、60％或70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％。
改进的抗体
CDR对于表位识别和抗体结合是最重要的。然而，可以对包含CDR的残基进行改变，而不干扰抗体识别并结合其同类表位的能力。例如，可以进行不影响表位识别，但仍提高抗体对表位的结合亲和力的改变。
因此，同样包括在本发明范围内的是，鼠和人源化抗体二者的改进变型，其也会特异性识别和结合EphA，优选具有提高的亲和力。
已经进行了调研研究在抗体序列中的多个位置基于抗体初级序列引入一个或者多个氨基酸改变对其性能例如结合和表达水平(Yang，W.P.等人，1995，J.Mol.Biol.，254：392-403；Rader，C.等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95：8910-8915；Vaughan，T.J.等人，1998，Nature Biotechnology，16：535-539)。
在这些研究中，已经产生了初级抗体的等同物，其通过改变在CDR1、CDR2、CDR3或框架区中的重链和轻链基因序列，使用诸如寡核苷酸介导的定点突变、盒突变、错误倾向PCR、DNA重排或大肠杆菌(E.coli)的突变株(Vaughan，T.J.等人，1998，Nature Biotechnology，16：535-539；Adey，N.B.等人，1996，Chapter 16，pp.277-291，in″PhageDisplay of Peptides and Proteins″，Eds.Kay，B.K.等人，Academic Press)的方法。这些改变初级抗体序列的方法已经导致二级抗体亲和力的改进(Gram，H.等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：3576-3580；Boder，E.T.等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97：10701-10705；Davies，J.and Riechmann，L，1996，Immunotechnolgy，2：169-179；Thompson，J.等人，1996，J.Mol.Biol.，256：77-88；Short，M.K.等人，2002，J. Biol.Chem.，277：16365-16370；Furukawa，K.等人，2001，J.Biol.Chem.，276：27622-27628)。
通过类似的定向改变抗体一个或者多个氨基酸残基的策略，在本发明中所描述的抗体序列可以用于开发具有改进的功能的抗-EphA抗体，包括改进的对EphA的亲和力。
优选的氨基酸取代是那些：(1)降低蛋白质水解敏感度，(2)降低氧化敏感度，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)提供或修饰这些类似的其他物理化学或功能性能的取代。类似物可以包括除了天然存在的肽序列之外的各种序列的突变。例如，可以在天然存在的序列中(优选在形成分子间接触的区域之外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应该实质上改变亲代序列的结构特征(例如氨基酸替代不应该倾向破坏在亲代序列中存在的螺旋，或者破坏秦代序列特征的其他二级结构类型)。公认的多肽二级和三级结构的例子被描述在Proteins，Structures andMolecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，NewYork(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等人，1991，Nature，354：105中，均被通过参照并入本文中。
改进的抗体还包括具有改进特征的那些抗体，其是通过标准的动物免疫、杂交瘤形成和选择具有特异性特征的技术制备的那些抗体。
本发明还包括细胞毒性缀合物。这些细胞毒性缀合物包含两种主要组分，细胞结合剂和细胞毒性剂。
本文所使用的，术语“细胞结合剂”指特异性识别和结合细胞表面上的EphA受体的试剂。在一个实施方式中，细胞结合剂特异性识别EphA受体，以便其能够使缀合物以靶向模式发挥作用，而几乎没有因非特异性结合所引起的副作用。
在另一个实施方式中，本发明的细胞结合剂还特异性识别EphA受体，以便缀合物能够与靶细胞接触持续充分的时间段以使得缀合物的细胞毒性药物部分对细胞发挥作用，和/或使得缀合物被细胞内化充分长的时间。
在优选的实施方式中，细胞毒性缀合物包含抗-EphA抗体作为细胞结合剂，更优选鼠37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗-EphA单克隆抗体。在更优选的实施方式中，细胞毒性缀合物包含人源化37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体或其表位结合片段。37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体能够特异性识别EphA受体例如EphA2，并且将细胞毒性剂以靶向模式引导到异常细胞或组织例如癌细胞。
本发明细胞毒性缀合物的第二组分是细胞毒性剂。本文所使用的术语“细胞毒性剂”指降低或阻断细胞功能或生长和/或造成细胞破坏的物质。
在优选的实施方式中，细胞毒性剂是紫杉醇类化合物(taxoid)、类美登素例如DM1或DM4、小分子药物、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物、前药、CC-1065或CC-1065类似物。在优选的实施方式中，本发明的细胞结合剂被直接或者通过可切割的连接物共价结合到细胞毒性剂。
下面更详细讨论细胞结合剂、细胞毒性剂和连接物。
细胞结合剂
本发明的化合物作为治疗药物的效率依赖于仔细选择适当的细胞结合剂。细胞结合剂可以是任何目前已知的类型，或者成为已知的类型，并且包括肽和非肽。细胞结合剂可以是任何能够结合细胞的化合物，以特异性或非特异性方式。通常，这些能够是抗体(特别是单克隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素、营养素转运分子(例如转铁蛋白)或任何其他细胞结合分子或物质。
可以使用的细胞结合剂的更具体实施例包括：
·多克隆抗体；
·单克隆抗体；
·抗体片段，例如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fv(Parham，1983，J.Immunol.，131：2895-2902；Spring等人，1974，J.Immunol.，113：470-478；Nisonoff等人，1960，Arch.Biochem.Biophys.，89：230-244)。
优选，将人源化抗-EphA抗体用作本发明的细胞结合剂。更优选，从人源化或表面重建的37.3D7，37.1F5；53.2H11；EphA2-N1和EphA2-N2抗体选择人源化抗-EphA抗体。
细胞毒性剂
在另一个实施方式中，人源化抗体或其表位结合片段可以缀合到药物例如类美登素或茅屋霉素衍生物上以形成前药，其通过将药物靶向EphA2受体而对表达抗原的细胞具有特异细胞毒性。包含这类抗体以及小型、高毒性药物(例如类美登素、紫杉烷类化合物、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物、CC-1065和CC-1065类似物)的细胞毒性缀合物可以用作治疗肿瘤例如乳癌和卵巢癌的治疗剂。
在本发明的细胞毒性缀合物中所使用的细胞毒性剂可以是任何引起细胞死亡或诱导细胞死亡或以某些方式降低细胞存活力的化合物。优选的细胞毒性剂包括例如下面所定义的类美登素和类美登素类似物、前药、茅屋霉素衍生物、紫杉醇类化合物(taxoid)、来普霉素衍生物、CC-1065和CC-1065类似物。这些细胞毒性剂被缀合到本文所公开的抗体、抗体片段、功能等同物、改进的抗体和它们的类似物。
可以通过体外方法制备细胞毒性缀合物。为了将药物或前药连接到抗体，使用连接基团。适当的连接基团是本领域中公知的，包括二硫基团、硫醚基团、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团和酯酶不稳定的基团。优选的连接基团是二硫基团和硫醚基团。例如，可以使用二硫化物交换反应或者通过在抗体和药物或前药之间形成硫醚键而构建缀合物。
类美登素
在细胞毒性剂中，在本发明中可以用于形成细胞毒性缀合物是类美登素和类美登素类似物。适当的类美登素的例子包括美登醇和美登醇类似物。类美登素是抑制微管形成的药物，其对哺乳动物细胞是高度毒性的。
适当的美登醇类似物的例子包括具有经修饰的芳香环的那些和在其他位置具有修饰的那些。这些适当的类美登素被公开在美国专利No.4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；和5,846,545。
具有经修饰芳香环的美登醇的适当类似物的具体例子包括：
(1)C-19-去氯(美国专利No.4,256,746)(通过ansamytocin P2的LAH还原而制得)；
(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利No.4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)的去甲基化或者使用LAH的去氯化制备的)；和
(3)C-20-去甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-去氯(美国专利No 4,294,757)(通过使用酰氯的酰基化制备的)。
具有其他位置的修饰的美登醇适当类似物的具体实施例包括：
(1)C-9-SH(美国专利No.4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应制备的)；
(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利No.4,331,598)；
(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)(从诺卡氏菌(Nocardia)制备的)；
(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)(通过链霉菌(Streptomyces)转化美登醇而制备的)；
(5)C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和4,315,929)(从滑桃树(Trewia nudiflora)分离的)；
(6)C-18-N-去甲基(美国专利No.4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌(Streptomyces)对美登醇去甲基化而制备的)；以及
(7)4，5-去氧(美国专利No 4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇而制备的)。
在优选的实施方式中，本发明的细胞毒性缀合物利用含有硫醇的类美登素(DM1)，其正式命名为N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素作为细胞毒性剂。DM1是由下列结构式(I)表示的：
Figure A20078003072100401
在另一个优选实施方式，本发明的细胞毒性缀合物利用含有硫醇的类美登素，其正式命名为N2’-去乙酰基-N2’-(4-甲基4-巯基-1-氧代戊基)-美登素作为细胞毒性剂。DM4是由下列结构式(II)表示的：
Figure A20078003072100411
在本发明进一步的实施方式中，可以使用其他美登素，包括在携带硫原子的碳原子上携带单烷基或二烷基取代的含硫醇和二硫化物的类美登素。这些包括在C-3、C-14具有羟甲基，C-15羟基或C-20去甲基，具有携带受阻巯基的酰基的酰基化氨基酸侧链的类美登素，其中携带硫醇官能团的碳原子具有一个或者两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基、杂环芳基或杂环烷基，进一步，其中取代基之一可以是H，其中酰基在羰基官能团与硫原子之间具有至少3个碳原子的直链长度。
这类其他的美登素包括由式(III)表示的化合物：
Figure A20078003072100412
其中：
Y’表示
(CR7R8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中：
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
A、B和D分别独立地为具有3～10个碳原子的环烷基或环烯基，未被取代的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；
R3、R4、R5，R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s和t分别独立地为0或者1～5的整数，条件是：l、m、n、o、p、q、r、s和t当中的至少两个不同时为零；以及
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、或者未被取代的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
式(III)的优选实施方式，包括一些式(III)的化合物，其中：
R1是甲基，R2是H，且Z是H。
R1和R2是甲基，且Z是H。
R1是甲基，R2是H，且Z是-SCH3。
R1和R2是甲基，且Z是-SCH3。
这些额外的美登素还包括式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L)所表示的化合物：
Figure A20078003072100421
其中Y代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中：
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
R3、R4、R5，R6、R7和R8分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m和n分别独立地为1～5的整数，另外n可以为0；
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的环烷基或烯基、或者未被取代的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；以及
May代表类美登素，其携带侧链C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基。
式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)的优选实施方式包括一些式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)的化合物，其中：
R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，n是0，且Z是H。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m是1，n是0，且Z是H。
R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，n是0，且Z是-SCH3。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m是1，n是0，且Z是-SCH3。
优选地，细胞毒性剂是由(IV-L)表示的。
这些其他的美登素还包括由式(V)表示的化合物：
Figure A20078003072100441
其中Y代表(CR7R8)l(CR5R5)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
R3、R4、R5，R6、R7和R8分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m和n分别独立地为1～5的整数，另外n可以为0；以及
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的环烷基或烯基、或者未被取代的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
式(V)的优选实施方式包括一些式(V)的化合物，其中：
R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，n是0，且Z是H。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m是1，n是0，且Z是H。
R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，n是0，且Z是-SCH3。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m是1，n是0，且Z是-SCH3。
这些其他的美登素还包括由式(VI-L)、(VI-D)或(VI-D，L)表示的化合物：
Figure A20078003072100451
其中Y2代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2，
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
R3、R4、R5，R6、R7和R8分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m和n分别独立地为1～5的整数，另外n可以为0；
Z2是SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的环烷基或烯基、或者未被取代的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；以及
May代表类美登素。
这些其他的美登素还包括由式(VII)表示的化合物：
Figure A20078003072100461
其中：
Y2’代表
(CR7R8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBl(CR3R4)nCR1R2SZ2，
其中：
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
A、B和D分别独立地为具有3～10个碳原子的环烷基或环烯基，未被取代的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；
R3、R4、R5，R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s和t分别独立地为0或者1～5的整数，条件是：l、m、n、o、p、q、r、s和t当中的至少两个不同时为零；以及
Z2是SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、或者未被取代的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
式(VII)的优选实施方式包括一些式(VII)的化合物，其中：R1是甲基，R2是H。
上述类美登素能够缀合到抗-EphA抗体37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2或其同源物或片段，其中抗体连接到类美登素，其利用在酰基化氨基酸侧链的酰基基团上存在的硫醇或二硫化物官能团，其中所述酰基化氨基酸侧链是在类美登素C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基上存在的，其中酰基化氨基酸侧链的酰基具有位于具有一个或两个取代基的碳原子上的其硫醇或二硫化物，所述取代基是CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外取代基之一可以是H，其中酰基在羰基官能团与硫原子之间具有至少3个碳原子的直链长度。
本发明优选的缀合物是一种缀合物，其包含缀合到式(VIII)的类美登素上的抗-EphA抗体37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2或其同源物或片段：
Figure A20078003072100471
其中
Y1’代表
(CR7R8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2S-，
其中：
A、B和D分别独立地为具有3～10个碳原子的环烷基或环烯基，未被取代的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；
R3、R4、R5，R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；以及
l、m、n、o、p、q、r、s和t分别独立地为0或者1～5的整数，条件是：l、m、n、o、p、q、r、s和t当中的至少两个不同时为零。
优选地，R1是甲基，R2是H，或者R1和R2是甲基。
本发明更加优选的缀合物是一种缀合物，其包含缀合到式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D，L)的类美登素上的抗-EphA抗体37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2或其同源物或片段：
Figure A20078003072100481
其中：
Y1代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2S-，
其中：
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
R3、R4、R5，R6、R7和R8分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m和n分别独立地为1～5的整数，另外n可以为0；
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的环烷基或烯基、或者未被取代的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；以及
May代表类美登素，其携带侧链C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基。
式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D，L)的优选实施方式包括一些式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D，L)的化合物，其中：
R1是甲基，R2是H，或者R1和R2是甲基，
R1是甲基，R2是H，R5，R6，R7和R8分别为H；l和m分别为1；n是0，
R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8分别为H；l和m是1；n是0。
由式式(IX-L)代表的细胞毒性剂是优选的。
本发明更加优选的缀合物是一种缀合物，其包含缀合到式(X)的类美登素上的抗-EphA抗体37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2或其同源物或片段：
其中取代基是如上面对式(IX)所定义的。
特别优选的是任何上述化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，且n是0。
进一步特别优选的是任何上述化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，且n是0。
进一步，优选L-氨基酰基立体异构体。
在未决的于2004年5月20日提交的美国专利申请No.10/849,136中所教导的每种类美登素也可以用于本发明的细胞毒性缀合物中。通过参照将美国专利申请No.10/849,136的全部公开内容并入本文中。
含有二硫化物的连接基团
为了将类美登素连接到细胞结合剂例如37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体，类美登素包含连接部分。连接部分在特定的位点含有允许释放完全完全活性类美登素的化学键。适当的化学键是本领域中公知的，并且包括二硫键、酸不稳定的键、光不稳定的键、肽酶不稳定的键和酯酶不稳定的键。优选的是二硫键。
连接部分还包含反应性化学基团。在优选的实施方式中，反应性化学基团可以通过二硫键连接部分共价结合到类美登素上。
特别优选的反应性化学基团是N-琥珀酰亚胺基酯和N-磺基琥珀酰亚胺基酯。
特别优选的包含含有反应性化学基团的连接部分的类美登素是美登醇的C-3酯及其类似物，其中连接部分含有二硫键，化学反应性基团包括N-琥珀酰亚胺基酯或N-磺基琥珀酰亚胺基酯。
类美登素上的许多位置能够作为化学连接部分的位置。例如，具有羟基的C-3位，被羟甲基修饰的C-14位，被羟基修饰的C-15位，具有羟基的C-20位都被认为是有用的。然而，C-3位是优选的，美登醇的C-3位是特别优选的。
尽管已经就含有二硫键的连接部分描述了具有连接部分的美登醇酯的合成，但本另一技术人员能够理解具有其他化学键的连接部分(上面所述的)也能够如同其他类美登素用于本发明。其他化学键的具体例子包括酸不稳定的键、光不稳定的键、肽酶不稳定的键和酯酶不稳定的键。本文所并入的美国专利No.5,208,020的公开内容交到了生产携带这类键的类美登素。
具有二硫化物部分的类美登素和类美登素衍生物的合成被描述在美国专利No.6,441,163和6,333,410以及美国专利申请No.10/161,651中，均通过参照并入本文中。
含有反应性基团的类美登素例如DM1与抗体反应，例如37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体，以产生细胞毒性缀合物。可以通过HPLC或通过凝胶过滤纯化这些缀合物。
生产这类抗体-类美登素缀合物的某些优秀方案被提供在美国专利No.6,333,410和美国专利申请No.09/867,598、10/161,651和10/024,290中，均通过参照全部并入本文中。
通过可以将抗体在含水缓冲液的溶液与摩尔过量的类美登素孵育，其中该类美登素孵育具有携带反应性基团的二硫化物部。可以通过加入过量的胺(例如乙醇胺、牛磺酸等)淬灭反应混合物。接着可以通过凝胶过滤纯化类美登素-抗体缀合物。
可以通过分光光度法测量252nm和280nm的吸光度值比例，测定每个抗体分子所结合的类美登素分子的数目。平均1～10个类美登素分子/抗体分子是优选的。
可以对抗体与类美登素药物的缀合物进行评价它们体外抑制各种不期望细胞系的增殖的能力。例如，细胞系诸如人类表皮癌细胞系A-431、人小细胞肺癌细胞系SW2、人乳房肿瘤细胞系SKBR3和伯基特(Burkitt′s)淋巴瘤细胞系Namalwa能够被容易地用于检验这些化合物的细胞毒性。可以将待评估的细胞暴露到化合物24小时，并通过已知的方法以直接检验测量存活的细胞分数。接着可以从检验的结果计算IC50值。
含PEG的连接基团
正如在美国申请No.10/024,290中所描述的，类美登素也可以被使用PEG连接基团连接到细胞结合剂。这些PEG连接基团可以溶解在水和非水溶剂中，并且可以用于将一种或者多种细胞毒性及连接到细胞结合剂。示范性的PEG连接基团包括杂-双官能团PEG连接物，其在连接物的相对末端通过一端的功能团巯基或二硫化物基团以及在另一端的活性酯结合到细胞毒性剂和细胞结合剂。
作为使用PEG连接基团合成细胞毒性缀合物的通用例子，具体细节再次参照美国专利申请No.10/024,290。合成是从一种或者多种携带反应性PEG部分的细胞毒性剂与细胞结合剂的反应开始的，其结果是每个反应性PEG部分的末端活性酯被替代为诸如例如37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体的细胞结合剂的氨基酸残基，以产生细胞毒性缀合物，该细胞毒性缀合物包含通过PEG连接基团共价键合到细胞结合剂的一种或者多种细胞毒性剂。
紫杉烷类化合物
在本发明的细胞毒性缀合物中所使用的细胞毒性剂也可以是紫杉烷或其衍生物。
紫杉烷类化合物是一种化合物家族，其包括一种细胞毒性自然产品帕利他西(紫杉醇)和一种半合成衍生物多西他赛(脱乙酰基紫杉醇)，两种化合物都被广泛用于癌症治疗中。紫杉烷类化合物是有丝分裂纺锤体毒剂，其抑制微管蛋白的解聚，引起细胞死亡。尽管多西他赛和帕利他西都是可以用于癌症治疗的试剂，但由于它们对正常细胞的非特异性毒性，因此它们的抗肿瘤活性是有限的。进一步，类似帕利他西和多西他赛它们的化合物不是充分有效以用于细胞结合剂的缀合物中。
用于制备细胞毒性缀合物的优选紫杉烷是式(XI)的紫杉烷：
Figure A20078003072100521
用于合成可以用于本发明细胞毒性缀合物的紫杉烷类化合物的方法，连同用于将紫杉烷类化合物缀合到诸如37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2的细胞结合剂的方法被详细描述在美国专利No.5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931以及美国专利申请No.10/024,290、10/144,042、10/207,814、10/210,112和10/369,563中。
茅屋霉素衍生物
本发明的细胞毒性剂也可以是茅屋霉素衍生物。茅屋霉素衍生物是吡咯并[1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100531
(PBD)，一种已知的化合物类型，其通过共价结合到DNA小沟中鸟嘌呤的N2表现出生物性能。PBD包括一些小沟结合剂例如安曲霉素、新安拉霉素和DC-81。
保持高细胞毒性并可以被有效连接到细胞结合剂的新型茅屋霉素衍生物被公开在国际申请No.PCT/IB2007/000142中，通过参照将其内容并入本文中。细胞结合剂-茅屋霉素衍生物复合物允许调节以靶向模式施加的茅屋霉素衍生物仅对不期望的细胞发挥细胞毒性作用，因此避免了由于对未靶向健康细胞的损伤而引起的副作用。
本发明的细胞毒性剂包含一种或者多种茅屋霉素衍生物，其通过连接基团连接到细胞结合剂例如37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1或EphA2-N2抗体。连接基团是通过传统方法共价结合到托马霉衍生物的化学部的一部分。在优选的实施方式中，该化学部可以通过二硫键共价结合到茅屋霉素衍生物。
可以用于本发明的茅屋霉素衍生物具有下面显示的式(XII)：
Figure A20078003072100532
其中
----代表任选的单键；
代表单键或双键；
如果在
Figure A20078003072100534
代表单键，U和U′相同或不同并独立地代表H，W和W’相同或不同并独立地选自OH，醚如-OR，酯(例如醋酸酯)如-OCOR，碳酸酯如-OCOOR，氨基甲酸酯如-OCONRR′，环氨基甲酸酯以便N10和C11是环的一部分，脲如-NRCONRR′，硫代氨基甲酸酯如-OCSNHR，环硫代氨基甲酸酯以便N10和C11是环的一部分，-SH，硫化物如-SR，亚砜如-SOR，砜如-SOOR，磺酸酯如-SO3-，磺酰胺如-NRSOOR，胺如-NRR′，任选地环胺以便N10和C11是环的一部分，羟胺衍生物如-NROR′，胺如-NRCOR，叠氮基如-N3，氰基，卤素，三烷基或三烷基鏻、氨基酸衍生基团；优选W和W’相同或不同并是OH、Ome、Oet、NHCONH2、SMe；
当
Figure A20078003072100541
代表双键时，U和U′不存在，W和W’代表H；
■R1、R2、R1′、R2′相同或不同并独立地选自卤化物或任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、芳基、Het、S(O)qR取代的烷基，或者R1和R2以及R1′和R2′分别共同形成含有基团＝B和＝B′的双键。
优选地，R1和R2以及R1′和R2′分别共同形成含有基团＝B和＝B′的双键。
■B和B′相同或不同并独立地选自任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、芳基、Het、S(O)qR取代的烯基，或者B和B′代表氧原子。
优选地，B＝B′。
更优选地，B＝B′＝＝CH2或＝CH-CH3，
■X、X′相同或不同并独立地选自一个或多个-O-、-NR-、-(C＝O)-、-S(O)q-。
优选地，X＝X′。
更优选地，X＝X′＝O。
■A、A′相同或不同并独立地选自任选含有氧、氮或硫原子的烷基或烯基，所述烷基或烯基分别任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、-S(O)q、芳基、Het、烷基、烯基取代。
优选地，A＝A′。
更优选地，A＝A′＝直链未取代的烷基。
■Y、Y′相同或不同并独立地选自H、OR；
优选地，Y＝Y′。
更优选地，Y＝Y′＝O烷基，更优选O甲基。
■T是-NR-、-O-、-S(O)q或者4～10元芳基、环烷基、杂环或杂芳基，所述基团分别任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、R、OR、S(O)qR和/或连接物(linker)取代，或者支链烷基，所述支链烷基任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、S(O)qR和/或连接物取代，或者直链烷基，所述直链烷基被一个或多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、S(O)qR和/或连接物取代。
优选地，T是4～10元芳基或杂芳基，更优选苯基或吡啶，其任选地被一个或者多个连接物取代。
所述连接物包含连接基团。适当的连接基团是本领域中公知的，并且包括硫醇、硫化物、二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团和酯酶不稳定的基团。优选的是二硫化物基团和硫醚基团。
如果连接基团是含有硫醇-、硫化物(或者所谓硫醚-S-)或二硫化物(-S-S-)-的基团，携带硫化物或二硫化物基团的侧链可以是直链或支链、芳族或杂环的。本领域技术人员能够容易识别适当的侧链。
优选地，所述连接物是下式表示的：
-G-D-(Z)p-S-Z′
其中
G是单键或双键、-O-、-S-或-NR-；
D是单键或-E-、-E-NR-、-E-NR-F-、-E-O-、-E-O-F-、-E-NR-CO-、-E-NR-CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E-CO-F、-E-S-、-E-S-F-、-E-NR-C-S-、-E-NR-CS-F-；
其中E和F相同或不同且独立地选自直链或支链-(OCH2CH2)i烷基(OCH2CH2)j-、-烷基(OCH2CH2)i-烷基-、-(OCH2CH2)i-、-(OCH2CH2)i环烷基(OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i杂环(OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i芳基(OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i杂芳基(OCH2CH2)j-、-烷基-(OCH2CH2)i烷基(OCH2CH2)j-、-烷基-(OCH2CH2)i-、-烷基-(OCH2CH2)i环烷基(OCH2CH2)j-、-烷基(OCH2CH2)i杂环(OCH2CH2)j-、-烷基-(OCH2CH2)i芳基(OCH2CH2)j-、-烷基(OCH2CH2)i杂芳基(OCH2CH2)j-、-环烷基-烷基-、-烷基-环烷基-、-杂环-烷基-、-烷基-杂环-、-烷基-芳基-、-芳基-烷基-、-烷基-杂芳基-、-杂芳基-烷基-；
其中，i和j相同或不同且是独立地选自0、1～2000的整数；
Z是直链或支链-烷基-；
p是0或1；
Z′代表H、硫醇保护基团例如COR、R20或SR20，其中R20代表H、甲基、烷基、任选被取代的环烷基、芳基、杂芳基或杂环，条件是：当Z′是H时，所述化合物与通过由于在PBD部分之一的亚胺键-NH＝上加入硫醇基团-SH而发生的分子内环化所形成的相应化合物平衡。
■n、n′相同或不同，并且是0或1。
■q是0、1或2。
■R、R′相同或不同，并且选自H、烷基和芳基，所述基团分别任选地被Hal、CN、NRR′、CF3、R、OR、S(O)qR、芳基、Het取代；
或者它们的药物上可以接受的盐、水合物或水合盐、或者这些化合物的多形态晶体结构或它们光学异构体、外消旋物、非对映异构体和对映异构体。
具有几何和立体异构体的通式(XII)的化合物也是本发明的一部分。
已知式(XII)的茅屋霉素衍生物的N-10、C-11双键在存在水、硫醇、伯胺或仲胺、脲、和其他亲核试剂时容易以可逆的方式被转化成相应的亚胺加成物。这种过程是可逆的，并且能够在存在脱水机时在非质子有机溶剂中、在真空中或高温下容易再生相应的茅屋霉素衍生物(Z.Tozuka，1983，J.Antibiotics，36：276)。
因此通式(XIII)的茅屋霉素衍生物的可逆衍生物也可以用于本发明中：
Figure A20078003072100561
其中A、X、Y、n、T、A′、X′、Y′、n′、R1、R2、R1′、R2′是如上面在式(VII)中所定义的，W和W’相同或不同并独立地选自OH，醚如-OR，酯(例如醋酸酯)如-OCOR，-OCOOR，碳酸酯如-OCOOR，氨基甲酸酯如-OCONRR′，环氨基甲酸酯以便N10和C11是环的一部分，脲如-NRCONRR′，硫代氨基甲酸酯如-OCSNHR，环硫代氨基甲酸酯以便N10和C11是环的一部分，-SH，硫化物如-SR，亚砜如-SOR，砜如-SOOR，磺酸酯如-SO3-，磺酰胺如-NRSOOR，胺如-NRR′，任选地环胺以便N10和C11是环的一部分，羟胺衍生物如-NROR′，胺如-NRCOR，-NRCONRR′，叠氮基如-N3，氰基，卤素，三烷基或三烷基鏻、氨基酸衍生基团。优选地，W和W’相同或不同并是OH、Ome、Oet、NHCONH2、SMe；。
因此式(XIII)的化合物可以被认为是溶剂化物，在溶剂是水时包含水；这些溶剂化物可以是特别有用的。
在优选的实施方式中，本发明的茅屋霉素衍生物选自下列：
·8，8′-[1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100571
-5-酮]
·8，8′-[5-甲氧基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100572
-5-酮]
·8，8′-[1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100573
-5-酮]
·8，8′-[1，4-亚丁基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100574
-5-酮]
·8，8′-[3-甲基-1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100575
-5-酮]
·8，8′-[2，6-亚吡啶基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100576
-5-酮]
·8，8′-[4-(3-叔丁氧羰基氨基丙氧基)-2，6-亚吡啶基双-(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100577
-5-酮]
·8，8′-[5-(3-氨基丙氧基)-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-3-叔丁氧羰基氨基丙基)-1，3-亚苯基双-(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100579
-5-酮]
·8，8′-{5-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)丙氧基]-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)}-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100581
-5-酮]
·8，8′-[5-乙酰基硫代甲基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100582
-5-酮]
·双-{2-[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-5-氧代-1，3，，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100583
-8-基氧基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯
·8，8′-[3-(2-乙酰基硫代乙基)-1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100584
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100585
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100586
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-亚苯基(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-亚苯基(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-(4-巯基-4-甲基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100589
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A200780030721005810
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A200780030721005811
-5-酮]
·8，8′-[(4-(4-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100591
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100592
-5-酮]
·8，8′-[(1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100593
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-
1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100594
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100595
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100596
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100597
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100598
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[甲基(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100599
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(1-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003072100601
-5-酮]
以及相应的巯基衍生物或它们药物上可以接受的盐、水合物或水合物盐或者这些化合物的多形态晶体结构或它们光学异构体、外消旋物、非对映异构体和对映异构体。
优选的化合物是下列式表示的：
Figure A20078003072100602
其中X、X’、A、A’、Y、Y’、T、n、n’是如上所定义的。
可以根据本领域技术人员公知的许多方法制备式(XII)的化合物。可以通过采用或改编下面所描述的方法或本领域技术人员能够理解的其变化而合成这些化合物。适当的修饰和替代对于本领域技术人员是容易明白的、公知的或者通过科技文献是容易获得的。特别的，这些方法可以在R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，Wiley-VCH Publishers，1999中发现。
可以用于本发明的合成茅屋霉素衍生物的方法被描述在国际申请No.PCT/IB2007/000142中。可以通过多种合成路线制备本发明的化合物。试剂和原材料是商业上可以获得的，或者容易被本领域技术人员通过公知的技术合成的(参见例如WO 00/12508，WO 00/12507，WO2005/040170，WO 2005/085260，FR1516743，M.Mori等人，1986，Tetrahedron，42：3793-3806)。
可以使用任何技术形成本发明的缀合物分子。本发明的茅屋霉素衍生物可以通过酸不稳定的连接物或光不稳定的连接物连接到抗体或其他细胞结合剂。这些衍生物可以与具有适当序列的肽缩合，并接着连接到细胞结合剂以生产肽酶不稳定的连接物。这些缀合物可以被制备成含有伯羟基，其可以被琥珀酰基化，以产生可以被细胞内酯酶切割以释放自由衍生物的缀合物。优选地，这些衍生物被合成为含有自由或被保护的巯基基团，接着含有一个或者多个二硫化物或硫醇的衍生物可以被通过二硫键或硫醚键共价连接到细胞结合剂上。
在USP 5,416,064和USP 5,475,092中教导了许多缀合方法。茅屋霉素衍生物可以被修饰成产生游离氨基，接着通过酸不稳定的连接物或光不稳定的连接物连接到抗体或其他细胞结合剂。具有自由氨基或羧基的茅屋霉素衍生物可以与肽缩合，接着连接到细胞结合剂以生产肽酶不稳定的连接物。在连接物上具有自由羟基的茅屋霉素衍生物可以被琥珀酰基化，并连接到细胞结合剂以产生可以被细胞内酯酶切割以释放自由药物的缀合物。最优选地，对茅屋霉素衍生物进行处理以形成自由或被保护的巯基基团，接着将含有二硫化物-或硫醇的茅屋霉素二聚体通过二硫键连接到细胞结合剂。
优选地，单克隆抗体-或细胞结合剂-茅屋霉素衍生物缀合物是上面所讨论的通过二硫键连接的哪些，其能够释放茅屋霉素衍生物。这些细胞结合缀合物是通过已知的方法制备的，例如通过使用琥珀酰亚胺基吡啶基-二硫代丙酸酯(SPDP)修饰单克隆抗体(Carlsson等人，1978，Biochem.J.，173：723-737)。接着通过使用含有硫醇的茅屋霉素衍生物处理将所得到的硫代吡啶基置换以产生二硫化物连接的缀合物。可替代的，在芳基二硫基-茅屋霉素衍生物的情况中，细胞结合缀合物的形成是通过直接将茅屋霉素衍生物的芳基-硫醇替代为之前引入到抗体分子的巯基而实现的。通过每种方法都容易制备含有通过二硫桥连接的1～10个茅屋霉素衍生物药物的缀合物。
更具体的，在含有2mM EDTA的0.05M pH 7.5磷酸钾缓冲液中浓度为2.5mg/ml的二硫代-硝基吡啶基修饰的抗体溶液被含有硫醇的茅屋霉素衍生物处理(1.3摩尔当量/二硫代吡啶基)。通过分光光度计在325nm监控从经修饰的抗体释放硫代硝基吡啶，并在大约16小时内完成。通过凝胶过滤通过Sephadex G-25或Sephacryl S300柱而对抗体-茅屋霉素衍生物进行纯化并且不含未处理的药物和其他低分子量材料。每个抗体分子结合的茅屋霉素衍生物部的数目可以被通过测量230nm和275nm的吸光度值比例而测定。通过该方法可以通过二硫键连接平均1-10茅屋霉素衍生物分子/抗体分子。
可以通过之前Liu等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93：8618-8623所描述的方法测定缀合物对针对表达抗原的细胞的结合亲和力的影响。根据在Goldmacher等人，1985，J.Immunol.，135：3648-3651中所描述的，可以通过细胞增殖曲线的反推法(back-extrapolation)测定茅屋霉素衍生物和它们抗体缀合物对细胞系的细胞毒性。根据在Goldmacher等人，1986，J.Cell Biol.，102：1312-1319中所描述的可以通过集落产生检验测定这些化合物对附着细胞系的细胞毒性。
来普霉素衍生物
本发明的细胞毒性剂还可以是来普霉素衍生物。根据本发明，“来普霉素衍生物”指在Kalesse等人(2002，Synthesis 8：981-1003)中所定义的来普霉素家族的成员，并且包括：来普霉素如来普霉素A和来普霉素B，Callystatins，Ratjadone如Ratjadone A和Ratjadone B，Anguinomycin如Anguinomycin A、B、C、D，春雷霉素(Kasusamycin)、Leptolstatin、Leptofuranin如Leptofuranin A、B、C、D。来普霉素A和B的衍生物是优选的。
更具体的，本发明的衍生物是式(I)表示的：
Figure A20078003072100621
其中
Ra和Ra′是H或-Alk；优选地，Ra是-Alk，优选甲基，Ra′是H；
R17是烷基，所述烷基任选被OR、CN、NRR′、全氟烷基取代；优选R17是烷基，更优选是甲基或乙基；
R9是烷基，所述烷基任选被OR、CN、NRR′、全氟烷基取代；优选R9是烷基，更优选是甲基；
X是-O-或-NR-；优选地，X是-NR-；
Y是-U-、-NR-U-、-O-U-、-NR-CO-U-、-U-NR-CO-、-U-CO-、-CO-U-；
优选地，当X是-O-时，Y是-U-、-NR-U-、-U-NR-CO-；
其中U选自直链或支链-Alk-、-Alk(OCH2CH2)m-、-(OCH2CH2)m-Alk-、-Alk(OCH2CH2)m-Alk-、-(OCH2CH2)m-、-环烷基-、-杂环-、-环烷基-Alk-、-Alk-环烷基-、-杂环-Alk-、-Alk-杂环-；
其中m是选自1～2000的整数；
优选地，U是直链或支链-Alk-，
Z是-Alk-；
n是0或1；优选地，n是0；
T代表H，硫醇保护基团例如Ac，R1或SR1，其中R1代表H、甲基、烷基、环烷基，任选地被取代的芳基或杂环，或T代表
Figure A20078003072100631
其中
Ra、Ra′、R17、R9、X、Y、Z、n是如上定义的；
优选地，T是H或SR1，其中R1代表烷基，更优选甲基；
R、R′相同或不同且为H或烷基；
Alk代表直链或支链烷基；优选烷基代表(-(CH2-q(CH3)q)p-，其中p代表1～10的整数；q代表0～2的整数；优选地，Alk代表-(CH2)-或-C(CH3)2-。
或者它们的药物上可以接受的盐、水合物或水合物盐、或者这些化合物的多形态晶体结构或它们光学异构体、外消旋物、非对映异构体和对映异构体。
优选的化合物可以选自：
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基硫基-乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸]的二-[(2-巯基乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基二硫基-乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-2-甲基-丙基)-酰胺
或者它们的药物上可以接受的盐、水合物或水合物盐、或者这些化合物的多形态晶体结构或它们光学异构体、外消旋物、非对映异构体和对映异构体。
为了将衍生物连接到细胞结合剂上，衍生物必须包含能够允许将该衍生物通过键连接到细胞结合剂的部(连接基团)，其中所述键例如二硫键、硫键(或本文中称作硫醚)、酸不稳定的基团、光不稳定的基团或酯酶不稳定的基团。这些衍生物被制备成它们含有将来普霉素衍生物连接到细胞结合剂所必要的部，例如通过二硫键、硫醚键、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团或酯酶不稳定的基团。为了进一步增强在水溶液中的溶解度，连接基团可以含有聚乙二醇间隔物。优选地，使用硫键或二硫键，因为靶细胞的还原环境会引起硫键或二硫化物的切割，并释放具有相关细胞毒性提高的衍生物。
可以通过多种合成路线制备本发明的化合物。试剂和原材料是商业上可以获得的，或者容易被本领域技术人员通过公知的技术合成的。用于合成可以用于本发明细胞毒性缀合物的来普霉素衍生物的方法以及用于将所述来普霉素衍生物缀合到细胞结合剂如抗体的方法被详细描述在欧洲专利申请No.06290948.6中，通过参照将其内容并入本文。
CC-1065类似物
在根据本发明的细胞毒性缀合物中所使用的细胞毒性剂也可以是CC-1065或其衍生物。
CC-1065是有效的抗-肿瘤抗生素，其是从链霉菌(Streptomyceszelensis)的培养液分离的。CC-1065在体外的效力是通常使用的抗癌药物如阿霉素、氨甲蝶呤和长春新碱的大约1000倍(B.K.Bhuyan等人，1982，Cancer Res.，42，3532-3537)。CC-1065及其类似物被公开在美国专利No.6,372,738、6,340,701、5,846,545和5,585,499。
CC-1065的细胞毒性效力与其烷基化能力及其DNA-结合或DNA-插入活性相关。这两种活性位于分子的不同部分。因此，烷基化活性包含在环丙基吡咯啉(pyrroloindole)(CPI)亚基中，DNA-结合活性位于两个吡咯啉亚基中。
尽管CC-1065在治疗用途中作为细胞毒性剂具有某些吸引人的特征，但其在治疗用途中有限制。将CC-1065给药给小鼠造成延迟的肝中毒，这导致在单次静脉剂量12.5μg/kg之后第50天死亡(V.L.Reynolds等人，1986，J.Antibiotics，XXIX：319-334)。这已经激发试图开发不会造成延迟毒性的类似物，以CC-1065为模型合成简单的类似物已经被描述(M.A.Warpehoski等人，1988，J.Med.Chem.，31：590-603)。
在另一系列类似物中，CPI部被替换为环丙苯并吲哚(CBI)部(D.L.Boger等人，1990，J.Org.Chem.，55：5823-5833；D.L.Boger等人，1991，BioOrg.Med.Chem.Lett.，1：115-120)。这些化合物保持亲代药物的高体外效力，而没有在小鼠中引起延迟毒性。与CC-1065类似，这些化合物是烷基化剂，其以共价模式结合到DNA的小沟引起细胞死亡。然而对最有前途的类似物阿多来新(Adozelesin)  和卡折来新(Carzelesin)的临床评估得到了令人失望的结果(B.F.Foster等人，1996，Investigational New Drugs，13：321-326；I.Wolff等人，1996，Clin.Cancer Res.，2：1717-1723)。这些药物显示治疗效果差，因为它们系统毒性高。
通过经靶向递送到肿瘤位点改变体内分布引起对非靶组织的低毒性进而系统毒性低，能够大大提高CC-1065类似物的治疗效力。为了达到该目标，CC-1065的类似物和衍生物与特异性靶向肿瘤细胞的细胞结合剂的缀合物已经被描述(美国专利5,475,092；5,585,499；5,846,545)。通常这些缀合物显示了体外的高靶特异性细胞毒性，以及在小鼠的人肿瘤异种移植物模型中表现出杰出的抗肿瘤活性(R.V.J.Chari等人，1995，Cancer Res.，55：4079-4084)。
最近已经描述了在水溶液中溶解度增强的CC-1065类似物的前药(欧洲专利申请No.06290379.4).在这些前药中，分子的烷基化部分的酚基被官能团保护，其使得药物在酸性水溶液中保存后仍稳定，并且为药物提供了与未保护的类似物相比提高的水溶性。保护即溶在体内生理pH下容易被切割以提供相应的活性药物。在EP 06290379.4中所描述的前药中，酚取代基被保护为含有磺酸的氨基甲酸苯酯，其在生理条件下具有电荷，因此具有增强的水溶性。为了进一步增强水溶性，可以将任选的聚乙二醇间隔物引入到吲哚亚基和可切割键如二硫化物基团之间的连接物中。这种间隔物的引入不会改变药物的效力。
合成可以用于本发明细胞毒性缀合物的CC-1065类似物的方法以及用于将这些类似物缀合到细胞结合剂例如抗体的方法被详细描述在EP 06290379.4(通过参照将其内容并入本文)和美国专利No.5,475,092、5,846,545、5,585,499、6,534,660和6,5 86,618以及美国申请No.10/116,053和10/265,452中。
其他药物
药物例如氨甲蝶呤、柔毛霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、瘤可宁、卡奇霉素(calicheamicin)、tubulysin和tubulysin类似物，duocarmycin和duocarmycin类似物、海兔毒素(dolastatin)和海兔毒素类似物也适于制备本发明的缀合物。药物分子也可以通过中间物载体分子例如血清白蛋白连接到抗体分子。Doxarubicin和Danorubicin类似物被描述在例如美国专利No.6,630,579，也可以是有用的细胞毒性剂。
治疗组合物
本发明涉及用于治疗哺乳动物的增殖过度(hyperproliferative)异常的治疗组合物，其包含治疗有效量的本发明化合物和药物上可以接受的载体。在一个实施方式中，所述药物组合物是用于治疗癌症，其包括(但不限于)下列：癌包括膀胱癌、乳癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞片状皮肤癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤；骨髓谱系的造血系统肿瘤包括急性和慢性骨髓型白血病和前髓细胞肿瘤；间叶细胞来源的肿瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其他肿瘤包括黑色素瘤、精原细胞瘤、tetratocarcinoma、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢神经系统和外周神经系统的肿瘤包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和施旺细胞瘤；间叶细胞来源的肿瘤包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌和其他被测定为主导表达EphA的癌症。在优选的实施方式中，本发明的药物组合物用于治疗肺癌、乳癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌和淋巴器官癌、骨肉瘤、滑液癌、肉瘤、头颈癌、神经胶质瘤、胃癌、肝癌或其他表达EphA的癌。特别的，癌症是转移癌。在另一个实施方式中，所述药物组合物涉及其他异常例如自体免疫疾病例如系统性类风湿性关节炎和多发性硬化症；移植排异例如肾移植排异、肝移植排异、肺移植排异、心脏移植排异和骨髓移植排异；移植物抗宿主病；病毒感染如mV感染、HIV感染、AIDS等；和寄生虫感染如贾第虫病、阿米巴病、血吸虫病以及其他本领域技术人员确定的。
本发明提供了药物组合物，其包含：
·有效量的本发明抗体、抗体片段或抗体缀合物，以及
·药物上可以接受的载体，其可以是惰性的或者生理活性的。
本文所使用的“药物上可以接受的载体”包括任何和所有生理上兼容的溶剂、分散液介质、涂覆、抗菌剂和抗真菌剂等。适当的载体、溶剂和/或赋形剂的例子包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等的一种或者多种及其组合。在许多情况中，优选组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇或氯化钠。特别的，适当载体的相关实施例包括(1) Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水，pH～7.4，其含有或者不含油大约1mg/ml～25mg/ml的人血清白蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))和(3)5％(w/v)葡萄糖；并且还可以含有抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如吐温20。
如果对于特定治疗的异常必要，本文的组合物还可以进一步含有治疗剂。优选地，本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物以及补充活性化合物将具有补充活性，其不会相互有不利影响。在优选的实施方式中，所述进一步的治疗剂是成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)或HER2受体的拮抗剂。
本发明的组合物可以是各种形式的。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，但优选的形式依赖于所期冀的给药模式和治疗应用。典型的优选组合物是可注射或可灌注溶液的形式。优选的给药模式是肠胃外(例如静脉内、肌内、腹膜内、皮下)。在优选的实施方式中，本发明的组合物被作为快速浓注(bolus)静脉内给药，或者通过持续灌注一段时间静脉内给药。在另一个优选的实施方式中，可以通过肌内、皮下、关节内、肿瘤内、肿瘤周、损伤内、损伤周路线，以提供局部以及系统性治疗效果。
能够通过将所需量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物加入到适当的溶剂中，接着通过微过滤进行灭菌而制备用于肠胃外给药的无菌组合物。作为溶剂或媒介，可以使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。在许多情况中，优选组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇或氯化钠。这些组合物还可以含有佐剂，特别是湿润剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。用于肠胃外给药的无菌组合物也可以制备成无菌固体组合物的形式，其可以在使用时溶解在无菌水或其他可注射无菌介质中。
本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物也可以口服给药。作为口服给药的固体组合物，可以使用药片、药丸、粉末(明胶胶囊、香囊(sachet))或颗粒。在这些组合物中，本发明的活性成分与一种或者多种惰性稀释剂例如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅在氩气流下混合。这些组合物还可以包含稀释剂以外的物质，例如一种或者多种润滑剂例如硬脂酸镁或云母、着色剂、涂覆(糖衣药片)或薄膜(glaze)。
作为口服给药的液体组合物，可以使用药物上可以接受的溶液、悬浮液、乳化液、糖浆、酏剂，其含有惰性稀释剂例如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油。这些组合物可以包含稀释剂以外的物质，例如湿润剂、甜味剂、增稠剂、调味剂或稳定剂产品。
剂量依赖于期望的效果、治疗持续时间和所使用的给药路线；通常对于成人它们在每日5mg和1000mg之间，单位剂量在1mg～250mg活性物质的范围内。通常，医生将根据待治疗的个体的年龄、体重和其他具体的因素确定适当的剂量。
治疗应用方法
在另一个实施方式中，本发明提供了一种抑制EphA2受体活性的方法，其通过为有此需要的患者给药拮抗。治疗上可以使用任何类型的本发明的抗体、抗体片段或细胞毒性缀合物。因此，本发明包括了拮抗抗-EphA2抗体、其片段或或细胞毒性缀合物作为药物的用途。
在优选的实施方式中，本发明的抗体、抗体片段或细胞毒性缀合物被用于治疗哺乳动物的增殖过度(hyperproliferative)异常。在更优选的实施方式中，上面所公开的含有本发明抗体、抗体片段或细胞毒性缀合物的药物组合物之一被用于治疗哺乳动物的增殖过度(hyperproliferative)异常。在一个实施方式中所述异常是癌症。特别的，癌症是转移癌。本发明的抗体、抗体片段或细胞毒性缀合物也可以被用于治疗所述癌症肿瘤的新血管形成。
因此，本发明的药物组合物可以用于治疗或防止多种癌症，其包括(但不限于)下列：癌包括膀胱癌、乳癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞片状皮肤癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤；骨髓谱系的造血系统肿瘤包括急性和慢性骨髓型白血病和前髓细胞肿瘤；间叶细胞来源的肿瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤包括黑色素瘤、精原细胞瘤、tetratocarcinoma、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢神经系统和外周神经系统的肿瘤包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和施旺细胞瘤；间叶细胞来源的肿瘤包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌和其他被测定为主导表达EphA的癌症。在优选的实施方式中，所述癌症是肺癌、乳癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌和淋巴器官癌、骨肉瘤、滑液癌、肉瘤、头颈癌、神经胶质瘤、胃癌、肝癌或其他表达EphA的癌。在另一个实施方式中，所述药物组合物涉及其他异常例如自体免疫疾病例如系统性类风湿性关节炎和多发性硬化症；移植排异例如肾移植排异、肝移植排异、肺移植排异、心脏移植排异和骨髓移植排异；移植物抗宿主病；病毒感染如mV感染、HIV感染、AIDS等；和寄生虫感染如贾第虫病、阿米巴病、血吸虫病以及其他本领域技术人员确定的。
类似的，本发明提供了已知选定细胞群生长的方法，其包括将靶细胞或含有靶细胞的组织与有效量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物或者包含细胞毒性缀合物的抗体、抗体片段或治疗剂接触，单独或联合其他细胞毒性或治疗剂接触。
可以在体外、体内或离体(ex vivo)实施抑制选定细胞群生长的方法。本文所使用的“抑制生长”的意思是在短时间或长时间内使细胞的生长变慢，降低细胞活力，造成细胞死亡，裂解细胞和诱导细胞死亡。
体外应用的例子包括在移植到相同患者之前处理自体骨髓，以杀死患病的或恶性细胞；在移植之前处理骨髓以杀死活性T细胞病并防止移植物抗宿主病(GVHD)；处理细胞培养物以杀死除了期望的不表达目标抗原的变体外的全部细胞；或者杀死表达不期望抗原的变体。
非临床体外应用的条件容易被本领域技术人员确定。
临床的先体外后体内的应用是在癌症治疗或自体免疫疾病的治疗中在自体移植之前从骨髓除去肿瘤细胞或淋巴细胞，或者在移植之前从自体或异源骨髓或组织中除去T细胞和其他淋巴细胞，以防止移植物抗宿主病(GVHD)。如下进行处理。从患者或其他个体收获骨髓，接着孵育在含有血清的介质中，其中向介质中加入本发明的细胞毒性剂。浓度在大约10μM～1pM的范围内，在大约37℃下持续大约30分钟～大约48小时。本领域技术人员容易确定精确的浓度条件和孵育时间，即剂量。在孵育后，使用含有血清的介质清洗骨髓细胞，并根据已知的方法通过i.v.灌注返回到患者。在收获骨髓和重新灌注经处理的细胞之间的时间内，患者接受其他治疗例如常规化疗(ablativechemotherapy)或全身辐射的情况下，精处理的细胞被使用标准医学设备冷冻储藏在液氮中。
对于临床体内应用，本发明的抗体、表位结合抗体片段或细胞毒性缀合物将作为溶液提供，其被测试无菌行和内毒素水平。给药细胞毒性缀合物的适当规程的例子如下。每周作为i.v.丸药提供缀合物持续4周。丸药剂量是在50～100ml正常盐水中提供的，向该盐水中可以加入5～10ml人血清白蛋白。剂量将为每次给药i.v.10μg～100mg(每日100ng～1mg/kg的范围内)。更有选，剂量将在50μg～30mg的范围。最优选地，剂量将在1mg～20mg的范围内。治疗4周后，患者能够继续接受每周一次的治疗。关于给药路线、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等的具体临床规程能够被本领域技术人员根据临床状况许可来确定。
诊断
本发明的抗体或抗体片段也能够用于体外或体内检测生物样品中的EphA2。在一个实施方式中，本发明的抗-EphA2被用于测定组织或来自组织的细胞中EphA2的水平。在优选的实施方式中，组织是患病组织。在方法的优选的实施方式中，组织是肿瘤或其活体样品。在方法的优选实施方式中，组织或其活体样品是首次从患者切离的，接着在利用本发明抗体或抗体片段的免疫检验中测定组织或活体样品中EphA2的水平。可以将组织或其活体样品冷冻或固定。相同的方法可以用于测定EphA2蛋白的其他性质，例如其酪氨酸磷酸化水平、细胞表面水平或细胞定位。
上述方法可以用于诊断已知或怀疑患有癌症的个体中的癌症，其中所述患者中所测量的EphA2水平与正常参照个体或标准的EphA2水平进行比较。接着可以将所述方法用于测定是否肿瘤表达EphA2，这可以暗示肿瘤将对利用本发明抗体、抗体片段或抗体缀合物的治疗充分应答。优选地，所述肿瘤是肺癌、乳癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌和淋巴器官癌、骨肉瘤、滑液癌、肉瘤、神经胶质瘤、胃癌、肝癌、头颈癌或其他表达EphA的癌、以及其他被测定为主导表达EphA的癌症。
本发明还提供了单克隆抗体、人源化抗体和其表位结合片段，其被进一步标记以用于研究或诊断应用中。在优选的实施方式中，标记为放射性标记、荧光团、发光团、成像剂或金属离子。
还提供了用于诊断的方法，其中所述标记的抗体或其表位结合片段被给药给怀疑患有癌症的个体，并且测量或监控个体体内标记的分布。
试剂盒
本发明还包括试剂盒，例如包含所描述的细胞毒性缀合物和使用该细胞毒性缀合物杀死特定细胞类型的说明书。说明书可以包括体外、体内或先体外后体内使用细胞毒性缀合物的指导。
典型的，试剂盒将具有含有细胞毒性缀合物的隔间。细胞毒性缀合物可以是冻干形式、液体形式或其他适于包含在试剂盒中的形式。试剂盒还可以含有实施试剂盒的说明书中所描述方法需要的其他成分，例如无菌溶液用于重建冻干粉末，其他试剂用于在为患者给药之前与细胞毒性缀合物组合，以及辅助为患者给药缀合物的工具。
实施例
实施例1
产生抗-EphA2单克隆抗体杂交瘤
使用人EphA2-转化来自BALB/c小鼠的pre-B细胞系300-19细胞转化四只BALB/c VAF小鼠。通过使用全长人EphA2 cDNA转染300-19细胞产生过表达抗原的稳定转染细胞，并通过流式细胞仪选择高表达克隆。选择在细胞表面高表达人EphA2受体的克隆4-6作为免疫小鼠的免疫原，并进行杂交瘤的抗体筛选。将EphA2-转染的细胞维持在选择培养基中，所述选择培养基含有终浓度为1mg/mL的G418，并使用商业上可以获得的抗体进行常规EphA2表达。
将Balb/c小鼠每只小鼠皮下注射在200μl磷酸盐缓冲液(PBS)中的大约5×106个EphA2-转染的300-19细胞。通过在ImmunoGen，Inc.使用的标准免疫规程每2～3周进行一次注射。在细胞融合之前3天，将小鼠使用相同的抗原剂量经腹膜内再加强一次，并在细胞融合日根据标准的动物使用程序处死小鼠用于制备脾细胞。
从经免疫的小鼠在无菌手术条件下收集脾，并在两片无菌和毛面显微镜玻片之间磨碎，以得到RPMI-1640培养基中的单细胞悬浮液。沉淀脾细胞，并在细胞融合之前使用RPMI-1640培养基清洗2次。使用聚乙二醇-1500作为融合剂(Roche 783 641)将脾细胞与鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞混合并融合(Kearney，J.F.等人，1979.J.Immunol.，123：1548-1550)。在细胞融合和离心后，将细胞悬浮在含有次黄嘌呤-氨喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)(Sigma H-0262)补充物的完全RPMI-1640培养基中(200mL)，并接种到十个96孔平底平板上(Coming-Costar 3596，每孔200μL细胞悬浮液)。在37℃、5％CO2中孵育5天后，从平板的每个孔取出100μl培养物上清，并替换为等体积的含有次黄嘌呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HT)补充物(Sigma H-0137)的完全RPMI-1640培养基。继续孵育(在37℃下5％CO2的氛围中)，直到杂交瘤已经生长成用于抗体筛选的足够大的克隆。
在融合后第10天，杂交瘤细胞在孔中已经生长成一半汇合并且上清变成黄色，则从融合板中取杂交瘤上清样品进行通过免疫检验筛选抗体。对于初步筛选，通过流式细胞仪对EphA2-转染的细胞对比亲代300-19细胞进行杂交瘤上清测试。使用50μl杂交瘤上清对细胞进行染色，接着与荧光素-山羊抗-小鼠IgG(H+L)缀合物孵育，并通过流式细胞仪利用Becton Dickinson FACSCalibur或FACSArray设备进行分析。选择经分析对EphA2-转染的细胞为阳性但对300-19细胞为阴性的杂交瘤克隆，并冷冻进行保藏，或者通过限制稀释已获得单克隆群而亚克隆。使用商业上可以获得的同种型分型试剂(Roche 1493027)对杂交瘤细胞所分泌的特异性抗体进行同种型分型。
根据流式细胞仪的数据，从被免疫人EphA2抗原的小鼠鉴定并选择了29个杂交瘤克隆，其特异性地与人EphA2-转染的细胞反应而不与亲代300-19细胞反应。
实施例2
抗-EphA2抗体37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2的结合鉴定
使用过表达人EphA2的细胞以及通过使用不表达EphA2的细胞通过荧光激活细胞分选(FACS)证明纯化的抗-EphA2抗体37.3D7、37.1F5和53.2H11每一种的特异性结合(图1A、B和C)。使用在圆底96孔板中过表达EphA2的细胞以及不表达EphA2的细胞在冰上进行37.3D7抗体或37.1F5抗体或53.2H11抗体(60nM)在100μl冷FACS缓冲液(1mg/mL Dulbecco′s MEM培养基中的BSA)中的孵育。1小时后，通过离心沉淀细胞，并使用冷FACS缓冲液进行清洗，接着与山羊-抗小鼠-IgG抗体-FITC缀合物(100μL，在FACS缓冲液中6μg/ml)在冰上孵育1小时。接着将细胞沉淀、清洗并重悬浮在200μL 1％甲醛在PBS的溶液中。接着使用FACSCalibur reader(BD Biosciences)对细胞样品进行分析。
与经过将不表达人EphA2的细胞和37.3D7、37.1F5或53.2H11抗体孵育之后不显著的移动不同，经过过表达人EphA2的细胞和37.3D7、37.1F5或53.2H11抗体孵育之后获得了强荧光移动，这证明了37.3D7、37.1F5和53.2H11抗体选择性结合人EphA2。阳性对照抗-EphA2抗体，B2D6(Upstate)显示了在与过表达人EphA2的细胞孵育后类似的荧光移动(图1A)。使用37.3D7和人癌细胞如人乳癌MDA-MB-231细胞、人结肠癌HT-29细胞、人胰腺癌BxPC3细胞的FACS检验而观察到了强荧光移动，这显示37.3D7抗体结合人肿瘤细胞表面的人EphA2(图2)。使用37.1F5和53.2H11抗体与人肿瘤细胞系也获得了类似的数据。
通过多种浓度的抗体与过表达人EphA2的细胞和人乳癌MDA-MB-231细胞的FACS检验测定了37.3D7、37.1F5和53.2H11抗体与细胞表面的人EphA结合的表观解离常数(KD)(图3)。通过单位点结合的非直链回归评估KD的数值。结合曲线得出37.3D7抗体的表观KD为0.3nM，37.1F5抗体的表观KD为0.07nM，53.2H11抗体的表观KD为0.14nM(图3A、3C和3E)。
使用相同的实验规程，测定EphA2-N1和EphA2-N2的表观KD数值分别为0.18nM和0.05nM。
与经过将不表达鼠EphA2或大鼠EphA2的细胞和37.3D7抗体或53.2H11抗体孵育之后不显著的移动不同，经过过表达表达鼠EphA2或大鼠EphA2的细胞和37.3D7抗体或53.2H11抗体孵育之后获得了强荧光移动(图4)，这证明了37.3D7和53.2H11抗体选择性结合鼠EphA2和大鼠EphA2。使用37.3D7或37.1F5或53.2H11抗体与猴(非洲绿猴(Cercopithecus aethiops))上皮VERO细胞的FACS检验也观察到强荧光移动，这显示37.3D7、37.1F5和53.2H11还结合猴EphA2。通过单位点结合的非直链回归评估KD的表观数值。FACS检验的结合曲线得出对于猴细胞，37.3D7的KD数值为0.15nM，37.1F5的KD数值为0.05nM，53.2H11的KD数值为0.07nM(图5B、5D和5F)。
实施例3
37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体抑制ephrinA1与MDA-MB-231细胞的结合
37.3D7、37.1F5和53.2H11抗体抑制ephrin A1与MDA-MB-231细胞的结合(图6)。将MDA-MB-231细胞孵育2小时具有或没有100ng/mL 37.3D7、37.1F5或53.2H11抗体，接着在4℃下与5μg/mL生物素化ephrin A1孵育30分钟。接着使用无血清培养基清洗细胞2此，以除去未结合的生物素化ephrin A1，接着在含有1％NP-40和蛋白质酶抑制剂的50mM HEPES缓冲液，pH 7.4中裂解。使用小鼠单克隆抗-EphA2抗体涂覆lmmulon-2HB ELISA板(D7，Upstate)，并用于从裂解液中捕获EphA2和结合的生物素-ephrin A1。所涂覆的抗体与EphA2的胞质C-末端区的结合但不干扰生物素-ephrin A1与EphA2的胞外区的结合。将孔清洗，与链霉素-辣根过氧化物酶缀合物孵育，再次清洗，接着利用ABTS/H2O2底物进行显影。5μg/mL 37.3D7、37.1F5或53.2H1抗体基本上定量地抑制ephrinA1与MDA-MB-231细胞的结合；信号与使用缺少生物素-ephrin A1的对照所获得的ELISA背景的信号相比几乎相同(图6A、6B和6C)。
EphA2-N1和Epha2-N2都能够与37.3D7相同程度地抑制人ephrinA1与MDA-MB-231细胞结合。
实施例4
37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体抑制EphA2介导的信号传导
正如抑制EphA2受体自磷酸化(图7A)和抑制其下游效应子例如Akt的磷酸化(图7B)所显示的，使用37.3D7或37.1F5抗体处理MDA-MB-231人乳癌细胞完全抑制细胞内EphA2受体信号传导。正如抑制EphA2受体自磷酸化(图7C)所显示的，使用37.3D7抗体或53.2H11抗体处理胰腺癌CFPAC-1细胞完全抑制细胞内EphA2受体信号传导。
在图7A和7C中，哺乳动物MDA-MB-231细胞或胰腺CFPAC-1细胞在具有血清的常规培养基(如ATCC对每种细胞系所建议的)中生长3天，接着在无血清培养基中生长12～14小时。使用15μg/ml的37.3D7、37.1F5或53.2H11抗体或对照IgG处理血清饥饿的细胞2小时，接着使用1μg/ml ephrin A1-Fc(R&D)在37℃下刺激10分钟。接着在含有蛋白质酶和磷酸酶抑制剂冰冷却的裂解缓冲液(50mMHEPES缓冲液pH 7.4、1％NP-40、1mM原钒酸钠、100mM氟化钠、10mM焦磷酸钠、2.5mM EDTA、10μM亮抑蛋白酶肽、5μM胃蛋白酶抑制剂、1mM PMSF、5mM苄脒和5μg/mL抑肽酶)中裂解细胞。使用缀合到蛋白质A/G珠的抗-EphA2抗体D7(Upstate)对裂解液进行免疫沉淀。将免疫沉淀的EphA2在SDA-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并使用磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体，4G10(Cell Signaling Technology)进行Western印迹。为了评估每种免疫沉淀样品中EphA2蛋白水平，使用抗-EphA2抗体，D7(Upstate)对相同的膜进行重新印迹。使用对照抗体显示没有抑制ephrin A1-刺激的EphA2受体自磷酸化(图7C)。相反，使用37.3D7、37.1F5或53.2H11抗体处理之后，获得了ephrinA1-刺激的自磷酸化的完全抑制(图7A和7C)。正如使用裂解物的Western印迹以及兔多克隆抗-磷酸-Ser473Akt抗体(Cell Signaling Technology)(图7B)所显示的，37.3D7或37.1F5抗体在MDA-MB-231细胞中还抑制了ephrin A1-刺激的下游效应子Akt的激活。
与ephrinA1在MDA-MB-231细胞中对EphA2的刺激作用相反，37.3D7和53.2H11抗体自身不会在人乳癌MDA-MB-231细胞中刺激EphA2自磷酸化(图8A和8B)。使用MDA-MB-231细胞对37.1F5抗体获得了类似的数据。在图8中，MDA-MB-231细胞在具有血清的常规培养基中生长3天，接着在无血清培养基中培养12～14小时。使用1μg/ml ephrinA1-Fc或15μg/mL 37.3D7或53.2H11抗体处理血清饥饿的细胞10分钟。使用抗-EphA2抗体，D7(Upstate)对细胞裂解液进行免疫沉淀。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离之后，使用抗-磷酸酪氨酸抗体，4G10(Cell Signaling Technology)和抗-EphA2抗体D7(Upstate)对印迹进行探测。获得了与EphA2-N1和EphA2-N2二者在人乳癌MDA-MB-231细胞中所获得的类似结果，因为抗体自身都不会刺激EphA2自磷酸化，尽管它们均防止EphA2受体的ephrinA1-依赖性磷酸化。
因此，在所有已知的抗-EphA2抗体中，37.3D7、37.1F5、53.2H11、EphA2-N1和EphA2-N2抗体在抑制ephrinA1-刺激的EphA2细胞内信号传导的效率方面是独特的。
实施例5
37.3D7和53.2H11抗体抑制人肿瘤细胞的血清刺激生长和存活
在无血清条件下测试多种人肿瘤细胞系在存在37.3D7或53.2H11抗体时对血清的生长和存活响应
将大约3000个细胞/孔接种在96孔板中具有血清的常规培养基中(如ATCC对每种细胞系所建议的)，第二天替换为无血清培养基。在无血清培养基中生长一天后，将细胞与15μg/mL 37.3D7抗体或53.2H11抗体或对照IgG1孵育，接着加入血清以获得最终浓度为1％或1.5％的血清。接着使细胞再生长3天。接着加入MTT溶液[3-(4，5)-二甲基噻唑-2-基-2，3-二苯基四唑鎓溴化物；25μL在PBS中的5mg/mL溶液]，并将细胞返回到恒温箱中2～3小时。接触除去培养基，并替换为100μLDMSO，混合，在545nm处测量平板的吸光度。多种人肿瘤细胞系显示在加入血清后的生长和存活响应被37.3D7或53.2H11抗体显著抑制。作为例子，显示了使用直肠肿瘤细胞系HT-29、LoVo；胰腺肿瘤细胞系CFPAC-2、BxPC3；和黑色素瘤UACC-257的结果。
37.3D7抗体强烈抑制血清刺激的人结肠癌HT-29细胞的生长和存活(图9A)。在另一个实验中，37.3D7抗体以剂量依赖性模式强烈抑制人胰腺癌的血清刺激生长和存活，其IC50值为40nM(图10A)。另外，37.3D7或53.2H11抗体强烈抑制LoVo人结肠癌细胞(图9B)、CFPAC-1人胰腺癌细胞(图9C)和UACC-257黑色素瘤癌细胞(图9D)的血清刺激生长和存活，53.2H11抗体以剂量依赖性模式抑制LoVo细胞的血清或EGF刺激生长和存活，其IC50值为2nM(图10B和10C)。在图10中，0％血清处理的样品的OD545值被设定为100％抑制，使用经1.5％血清或10ng/ml EGF处理的样品设定0％抑制。之前报道的抗-EphA2抗体对人肿瘤细胞贴壁生长(单层生长)都没有抑制活性。因此，37.3D7和53.2H11抗体在它们抑制人肿瘤细胞贴壁生长(单层生长)的能力方面是独特的。
实施例6
37.3D7、37.1F5和53.2H11抗体抑制VEGF介导的信号传导和VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长和存活
在将HUVEC细胞与37.3D7、37.1F5或53.2H11抗体孵育后通过FACS分析获得了强荧光移动，这说明37.3D7、37.1F5和53.2H11抗体结合到HUVEC细胞所表达的EphA2受体。从结合曲线测定37.3D7、37.1F5和53.2H11抗体与细胞表面的EphA2结合的表观解离常数(KD)，所述结合曲线是使用多种浓度进行的FACS结合检验所建立的，并且显示在图11中。通过单位点的非直链回归估计37.3D7抗体的KD值＝0.3nM，这与37.3D7抗体与人癌细胞的结合KD值类似。类似的，获得37.1F5抗体KD值＝0.01nM，53.2H11抗体的KD值＝0.06nM。这说明37.3D7、37.1F5和53.2H11抗体通过EphA2受体特异性地结合到HUVEC细胞。
37.3D7抗体强烈抑制VEGF-诱导的HUVEC生长和存活。其活性与抗-VEGF阻断抗体
Figure A20078003072100781
(Genentech)类似或更好(图12)。拮抗抗-EphA2抗体不抑制VEGF-诱导的HUVEC生长和存活(图12)。在图12中，HUVEC细胞在具有血清和内皮细胞(EC)补充物(Clonetics)的EBM-2培养基中生长3天。在无血清加上缺乏VEGF的EC生长补充物的培养基中培养细胞12～14小时。在血清饥饿后，使用加入0.4％血清具有或不具有指定抗体(100μg/mL)的5ng/mL VEGF对细胞进行刺激。根据实施例5所描述的MTT检验在加入抗体和VEGF后3天测定VEGF-诱导的HUVEC生长和存活。图12中显示了抗体抑制VEGF-介导的生长和存活的百分比。将载体处理的样品的OD545值设定为0％抑制，并将缺少VEGF的样品的OD545值设定为100％抑制。
通过检测对其下游效应子例如Akt的磷酸化的抑制，显示使用37.3D7抗体处理HUVEC抑制细胞内EphA2受体信号传导。
抑制与抗-VEGF阻断抗体
Figure A20078003072100782
(Genentech)类似(图13)。拮抗抗-EphA2抗体在HUVEC细胞中不抑制VEGF-诱导的Akt磷酸化。在图13中，HUVEC细胞在无血清加入缺少VEGF的EC补充物的培养基中被饥饿12～14小时。在加入VEGF(100ng/mL)之前1小时，使用抗体(20μg/mL)处理细胞。在加入VEGF后15分钟裂解细胞，并使用指定的抗体对免疫印迹进行探测。
实施例7
37.3D7抗体抑制小鼠中人结肠癌HT-29异种移植物的生长37.3D7抗体(图14)。
通过皮下注射人2×106个HT-29细胞在SCID小鼠中建立结肠癌HT-29异种移植物。当小鼠显示出明显的(50mm3)HT-29异种移植物肿瘤时，使用37.3D7抗体或对照抗体(IgG1)(1mg/小鼠，i.v.，每周2次)或仅PBS(100μL/小鼠，i.v.，每周2次)对他们进行处理。与使用对照抗体处理或仅PBS处理相比，37.3D7抗体处理显著地使肿瘤生长变慢。根据小鼠体重的测量，没有观察到37.3D7抗体的毒性。
实施例8
抗-EphA2抗体hu53.2H11抑制早期哺乳动物MDA-MB-231转移
在单次剂量水平上评估抗-EphA2抗体hu532H11针对皮下植入到雌性SCID小鼠中的早期哺乳动物MDA-MB-231肿瘤的抗肿瘤活性。还研究了这种抗体对MDA-MB-231肿瘤侵入表面腋窝和腹股沟淋巴结的影响。为此，通过iv路线，在植入肿瘤后的第1、5、8、12、15、19、22和26天给药40mg/kg/adm hu532H11。对照组不经受处理。
为了评估hu532H11的抗肿瘤活性，每日对动物进行称重，并每周用卡钳测量肿瘤2～3次。使用公式计算肿瘤重量，质量(mg)＝[长度(mm)×宽度(mm)2]/2。根据3个标准评估抗肿瘤活性，包括：1)T/C，其被定义为所处理组的中值肿瘤重量(mg)除以未处理对照的中值肿瘤重量；2)测定肿瘤生长的延迟(T-C)，其中T被定义为处理组肿瘤达到750mg所需要的中值时间，C是对照组肿瘤达到相同尺寸的中值时间；以及3)肿瘤细胞杀死，其被定义为log10细胞杀死(总)＝[T-C值，天数]/(Tdx3.32)。T-C如上定义，Td是对照肿瘤以天数计肿瘤体积倍增的时间，这是从指数生长(100-1,000mg范围)的对照组肿瘤对数直链生长图通过最适直线估计的。
在平行试验中，如前所述处理动物，在植入肿瘤后第28天，处死所有小鼠，并手机腋窝和腹股沟淋巴结(对照组的中值肿瘤尺寸＝1558mg)。使用人Ki67抗体用于特异性通过免疫染色鉴定淋巴结中的MDA-MB-231肿瘤细胞。淋巴结中转移的表面面积(2个切片的平均值)被计算为S＝人Ki67表面面积×100/淋巴结表面面积。
·对初生肿瘤的效力：
充分忍受40mg/kg/adm hu532H11(总剂量320mg/kg)，并且第27天的体重变化为8.9％。尽管肿瘤在治疗后存活了，但该剂量延迟了初生肿瘤的肿瘤生长(T/C＝27％，1.0的log总细胞杀死)。
·抗-转移活性：
hu532H11在腋窝淋巴结和腹股沟淋巴结中都诱导转移面积的降低(＞50％)。
总之，在携带哺乳动物肿瘤MDA-MB-231的小鼠中，hu532H11在肿瘤发生的早期阶段延迟了经过处理的初生肿瘤的生长(T/C＝27％，1.0的log总细胞杀死)，并降低了在腋窝淋巴结和腹股沟淋巴结二者中的转移表面(＞50％)。
在另一个研究中，能够在人直肠HT29肝“转移”模型中评估抗-EphA2抗体的活性。从在SCID小鼠中皮内植入HT29细胞(对于不携带肿瘤的经处理的和对照动物(NTBA)，n＝每组20之小鼠)后第4天开始每周2次，iv给药鼠抗-EphA2抗体53.2H1。在第50天，第13次给药抗-EphA2之后第3天，将小鼠进行尸体解剖，并称重它们的脾和肝，以评估在初生肿瘤位点(脾)或在转移位点(肝)的肿瘤质量。还评估了转移数目。使用本领域技术人员已知的统计工具对数据进行分析。
·使用40mg/kg/inj的抗-EphA2(总剂量520mg/kg)进行的处理被充分忍受
·初生肿瘤重量(脾)：在NTBA和植入对照的小鼠之间观察到了脾重量的显著差异，后者较大。在植入对照的小鼠和一只抗-EphA2处理的小鼠的脾重量之间没有显著差异。
·转移重量(肝)：植入对照的肝重量比NTBA的肝重量显著大；另一方面抗-EphA2处理的小鼠中比植入对照的小鼠中显著地小。
·肝转移的数目：在植入对照和抗-EphA2处理的小鼠之间没有观察到统计学上的差异。
总之，脾内植入人结肠腺癌HT-29显著又到了肝重量的提高，这是由于转移肿瘤负担。正如通过降低被植入小鼠的肝重量所观察到的，抗-EphA2处理能够显著降低转移肿瘤负担，而不会影响肝上所计数的转移数目。
实施例9
克隆和测序37.1 F5抗体的轻链和重链
从产生37.1F5抗体的杂交瘤细胞制备RNA
使用Qiagen′s RNeasy miniprep试剂盒从5×106个产生37.1F5抗体的杂交瘤细胞获得总RNA的制备。简言之，沉淀5×106个细胞并重悬浮在350μL RLT缓冲液(含有1％β-巯基乙醇)。通过将其通过21.5管针并冲洗10～20次或直到其不再粘性，将悬浮液进行匀浆。将乙醇(350μL70％乙醇水溶液)加入到被充分混合的匀浆液中。将溶液转移到离心柱上，置于2mL收集管并在＞8000×g下离心15秒。使用500μL RPE缓冲液清洗柱2此，接着转移到新管并使用30μL无RNA酶的水利用1分钟离心进行洗脱。将洗脱液(30μL)返回柱子上进行第二次一分钟洗脱离心。使用水对一份30μL洗脱液进行稀释，并用于测量260nm的UV吸收进行RNA定量。
利用反转录(RT)反应制备cDNA
使用Invitrogen′s Superscriptll试剂盒从总RNA产生可变区37.1F5抗体cDNA。紧密遵循试剂盒规程，利用最高达到5μg来自Qianeasymini preps的总RNA。简言之，将RNA、1μL随机引物和1μL dNTP混合物加入到12μL无RNA酶的无菌过滤水中，并在65℃下孵育5分钟。接着将混合物置于冰上持续至少1分钟。接着加入4μL 5×反应缓冲液，2μL 0.1M DTT和1μL RNaseOUT并在MJ Research热循环仪中25℃下孵育2分钟。将热循环仪暂停，以便能够加入1μL SuperscriptII酶，接着在25℃下重新启动额外10分钟，之后转换成55℃持续50分钟。通过加热到70℃持续15分钟，使反应热失活，并通过加入1μL RNA酶H并在37℃孵育20分钟除去RNA。
简并PCR反应
根据在Wang等人(2000；J Immunol Methods.；233(1-2)：167-77)和Co等人(1992；J Immunol.；148(4)：1149-54)中所描述的方法对来自杂交瘤细胞的cDNA进行第一轮简并PCR反应。这一轮的引物(表2)含有限制性位点以促进克隆到pBluescriptII质粒中。
在冰上将PCR反应组分(表3)混合在薄壁PCR管中，并转移到预热并暂停在94℃的MJ Research热循环仪。
使用如下来自Wang等人(2000；J Immunol Methods.；233(1-2)：167-77)的程序进行反应：
名称：Wang45
1)94℃  3:00分钟
2)94℃  0:15秒
3)45℃  1:00分钟
4)72℃  2:00分钟
5)返回  2 29次
6)72℃  6:00分钟
7)4℃永久
8)结束
接着在1％低熔点琼脂糖凝胶上对PCR反应混合物进行电泳，切除300～400bp的带，使用Zymo DNA mini柱进行纯化，并送到Agencourt biosciences进行测序，各自的5′和3′PCR引物被用作测序引物以从两个方向得到37.1F5可变区cDNA。
克隆5′末端序列
由于用于克隆37.1F5可变区轻链和重链cDNA序列的的简并引物改变了5′末端序列，因此需要额外的测序工作破译完整的序列。从上述方法获得的初步cDNA序列对产生37.1F5序列的鼠生殖系序列进行用于检索NCBI IgBlast位点(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/iqblast/)。PCR引物(表4)被设计成与鼠抗体的前导序列退火，以便新的PCR反应能够产生没有被PCR引物改变的完整可变区cDNA。如上所述进行PCR反应，带纯化和测序。可能产生轻链和重链mu37.1F5的生殖系序列是分别根据Genbank收录号MUSIGKVR3和AF303839容易获取的。
进行序列确认的肽分析
将可变区的cDNA序列信息与生殖系恒定区序列组合已获得的全长抗体cDNA序列。接着计算重链和轻链的分子量，并与鼠37.1F5抗体的LC/MS分析所获得的分子量进行比较。
表5给出了从37.1F5 LC和HC的cDNA序列计算的质量，以及通过LC/MS测量的数值。分子量测量与37.1F5轻链和重链的cDNA序列一致。
使用基本上相同的方法克隆37.3D7和53.2H11的轻链和重链。可能产生7.3D7轻链和重链的生殖系序列的Genbank收录号分别是MMU231217和AF303868。对于53.2H11，它们分别是MMU231196和AF303833；对于EphA2-N1，分别是K02161和J00488；对于EphA2-N2，分别是AJ231222和J00488。
实施例10
人源化-37.3D7-SPDB-DM4和人源化-53.2H11-SPDB-DM4抑制表达EphA2的肿瘤细胞生长
使用(4-[2-吡啶基二硫基]丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)连接物将人源化37.3D7和人源化53.2H11抗体缀合到L-DM4 N2’去乙酰基-N2’(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素上。简言之，使用对hu53.2H11和hu37.3D7分别为5.5或6.5倍摩尔过量的SPDB，对8mg/mL的抗体进行修饰。室温下，在具有乙醇(5％v/v)的缓冲液A(50mM KP/50mMNaCl/2mM EDTA，pH 6.5，95％v/v)中进行该反应90分钟。接着通过SephadexG25脱盐柱利用缓冲液A对经修饰的抗体进行纯化。下一步，将经修饰的抗体与相对于SPDB连接物1.7倍摩尔过量的DM4进行反应。在室温下，以缓冲液A(97％v/v)中的2.5mg/mL抗体与DMA(二甲基乙酰胺3％v/v)进行该反应20小时。通过SephadexG25脱盐柱利用10mM组氨酸，130mM甘氨酸，5％蔗糖，pH5.5对缀合物进行纯化。对于hu37.3D7-SPDB-DM4药物与抗体的比例为4.0，hu53.2H11-SPDB-DM4为3.1。
首先使用体外细胞增殖WST-8((2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓，单钠盐)检验(Catalog#CK04-11，Dojindo Molecular Technogies，Inc)，测试hu37.3D7-SPDB-DM4和hu53.2H11-SPDB-DM4对表达EphA2的肿瘤细胞生长的影响。测试了多种人肿瘤细胞系。将大约2000个细胞/孔接种在96孔板中常规培养基(根据ATCC对每种细胞系所建议的)中，该培养基含有10％血清并存在不同浓度的hu37.3D7-SPDB-DM4或hu53.2H11-SPDB-DM4。接着使细胞生长5天。接着加入WST-8溶液[20μL溶液]并将细胞返回到恒温器中2～3小时。在450nm和650nm处测量平板的吸光度。在该实验中使用两个对照组。0％存活是仅培养基的对照，100％存活是仅细胞的对照。对于数据分析，首先从相应的A450nm数值减去A650nm(参照波长)数值。接着通过减去背景参照(仅培养基)的A450nm数值，对每种样品的A450数值进行标准化。通过将样品经标准化的A450数值处理来自仅对照的细胞的A450数值(100％存活-0％存活)，计算存活分数。将Log[Ab-DM4]数值绘制在x轴上，存活分数绘制在y轴上。
Hu37.3D7-SPDB-DM4和hu53.2H11-SPDB-DM4显著抑制表达EphA2的人肿瘤细胞的生长，包括PC3前列腺肿瘤细胞、MDA-MDA-MB-231乳房肿瘤细胞、WM-115黑色素瘤细胞、A375黑色素瘤细胞和LoVo直肠肿瘤细胞。作为例子，显示了使用PC3前列腺肿瘤细胞的结果。hu37.3D7-SPDB-DM4或hu53.2H11-SPDB-DM4以剂量依赖性方式强烈抑制PC3细胞生长，近似IC50数值为0.02nM(图15A&15B)。缀合物的效力与EphA2表达水平相关。需要超过50倍浓度的hu37.3D7-SPDB-DM4或hu53.2H11-SPDB-DM4抑制SK-Mel28细胞的生长(IC50数值分别为1.3nM和＞5nM；图15A & 15B)，其中SK-Mel28细胞在细胞表面上表达几乎无法检测到的水平的EphA2(通过FACS测量，数据未示出)(图15A & 15B)。因此，体外生长抑制检验的结果证明拮抗剂抗-EphA2抗体-缀合物特异性抑制表达EphA2的肿瘤细胞系的生长。
测试了hu37.3D7-SPDB-DM4和hu53.2H11-SPDB-DM4对表达EphA2的肿瘤异种移植物生长的影响。作为例子，显示了使用MDA-MB-231乳房肿瘤异种移植物模型的研究。通过皮下注射1x107MDA-MB-231个细胞，在5周鼠龄的雌性CB17 SCID小鼠中建立人乳癌MDA-MB-231异种移植物。在建立MDA-MB-231异种移植物肿瘤时(平均尺寸为83mm3)，使用单次i.v注射hu3D7-SPDB-DM4或hu2H11-SPDB-DM4或PBS对小鼠进行处理。抗体的剂量为15mg/kg小鼠体重、7.5mg/kg小鼠体重和3.25mg/kg小鼠体重。除了3.25mg/kghu2H11-SPDB-DM4外，所有测试浓度的hu3D7-SPDB-DM4或hu2H11-SPDB-DM4抗体-缀合物都完全抑制MDA-MB-231肿瘤的生长，其中3.25mg/kg  hu2H11-SPDB-DM4相对于PBS对照显示了显著的肿瘤细胞生长的延迟。图16&B中显示了每组(每组6只小鼠)中的中值肿瘤体积。总之，hu3D7-SPDB-DM4和hu2H11-SPDB-DM4在体内对表达EphA2的肿瘤均具有有力的生长抑制。根据体重测量，没有观察到两种抗体缀合物的毒性。
表
表1A：
mu37.3D7轻链框架表面残基和在人28E4抗体中相同Kabat位置的相应残基。不同的残基进而在hu37.3D7抗体中被改变的不同是在灰色框中。
Figure A20078003072100861
表1B：
mu37.3D7重链框架表面残基和在人28E4抗体中相同Kabat位置的相应残基。不同的残基进而在hu37.3D7抗体中被改变的不同是在灰色框中。在一个或者多个hu37.3D7变体中，标记星号(*)的残基被突变回mu37.3D7残基。
Figure A20078003072100871
表2：
除了HindKL(SEQ ID NO：58)是基于Co等人1992之外，用于简并PCR反应的引物是基于Wang等人，2000中的。混合碱基被定义为如下：H＝A+T+C、S＝g+C、Y＝C+T、K＝G+T、M＝A+C、R＝A+g、W＝A+T、V＝A+C+G。
 引物           序列
 BamlgG1(SEQ    GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGCID NO：53)
 IgG2Abam(SEQ   GGAGGATCCCTTGACCAGGCATCCTAGAGTCAID NO：54)
 EcoMH1(SEQ ID  CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCNO：55)
 EcoMH2(SEQ ID  CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGGNO：56)
 SaclMK(SEQ ID  GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCANO：57)
 HindKL(SEQ ID  TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGNO：58)        GTGC
表3：
用于克隆37.1F5可变区cDNA序列的轻链和重链PCR反应混合物。
轻链反应混合物 重链反应混合物
5μl 10×PCR反应缓冲液(Roche)4μl 10mM dNTP混合物(分别为2.5mM)2μl 模板(RT反应)5μl 10μM SaclMK左引物5μl 10μM HindKL右引物5μl DMSO0.5μl Taq聚合酶(Roche)23.5μl无菌蒸馏H2O 5μl 10×PCR反应缓冲液(Roche)4μl 10mM dNTP混合物(分别为2.5mM)2μl模板(RT反应)2.5μl 10μM EcoMH1左引物2.5μl 10μM EcoMH2左引物5μl 10μM BamlgG1右引物5μl DMSO0.5μl Taq聚合酶(Roche)23.5μl无菌蒸馏H2O
总计50μl 总计50μl
表4：
用于37.1F5第二轮PCR反应的5′末端鼠前导序列引物。3′末端引物与在第一轮反应中所使用的引物相同，因为它们引导各自的恒定区序列。
引物                    序列
轻链38SB13LC前导序列(SEQ    GACAGACACACTCCTGCTATGGGID NO：59)
重链5F85HC前导序列(SEQ ID   GCAGAATTCATGGGATGGAGCYGGATCTTTCTNO：60)
表5：
鼠37.1F5抗体轻链和重链的cDNA计算和LC/MS测量分子量。
Figure A20078003072100901
序列表
<110>SANOFI-AVENTIS
<120>用于治疗癌症的抗EPHA2的拮抗抗体
<130>FR2006030 PCT
<150>EP 06291 160.7
<151>2006-07-18
<160>80
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>1
Ser Tyr Trp Met His
1                5
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>2
Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Met
1                5                    10                   15
Asn
<210>3
<211>12
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>3
Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr
1                5                    10
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>4
Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser Tyr Leu His
1                5                    10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>5
Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser
1                5
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>6
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Gln Phe Thr
1                5                    10
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>7
Gly Tyr Thr Met Asn
1                5
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>8
Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Lys Phe Lys
1                5                    10                   15
Gly
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>9
Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr
1                5
<210>10
<211>15
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>10
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr
1                5                    10                   15
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>11
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1                5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>12
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr
1                5
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>13
Ala Tyr Tyr Met His
1                5
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>14
Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Glu
1                5                    10                   15
Asp
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>15
Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val
1                5                    10
<210>16
<211>16
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>16
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1                5                    10                   15
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>17
Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser
1                5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>18
Trp Gln Gly Ser His Phe Pro Arg Thr
1                5
<210>19
<211>363
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(363)
<400>19
cag gtc caa ctg caa caa cct ggg tct gaa ctg gtg agg cct gga gct     48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1                5                    10                  15
tca gtg cag ctg tcc tgt aag gct tct ggc tac tca ttc acc agc tac     96
Ser Val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
             20                   25                  30
tgg atg cac tgg gtg aga cag agg cct gga caa ggc ctt caa tgg att    144
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
         35                   40                  45
gga aat att tat cct ggt act ggt aat act aat tac gat gag aaa ttc    192
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
    50                   55                   60
atg aac aag gcc aca ctg act gta gac aca tat tcc agc aca acc tac    240
Met Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ser Thr Thr Tyr
65                   70                   75                   80
atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt    288
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gca aga tgg ggg tta gta cgg tat ttc ttt gca atg gac tac tgg ggt    336
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
             100                  105                  110
caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca                                363
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
<210>20
<211>121
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
             20                   25                   30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
         35                   40                   45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
     50                  55                   60
Met Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ser Thr Thr Tyr
65                   70                   75                   80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
             100                  105                  110
Gln Gly Thr Ser Val  Thr Val Ser Ser
         115                   120
<210>21
<211>354
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(354)
<400>21
gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct gga gct    48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
tca atg aag att tcc tgc agg gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac     96
Ser Met Lys Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
             20                   25                   30
acc atg aac tgg gtg agg cag agc cat gga aag aac ctt gag tgg att    144
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
         35                   40                   45
gga ctt att aat cct cac aat ggt ggt tct agc tac aac ctg aag ttc    192
Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Lys Phe
    50                   55                   60
aag ggc aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc agc aca gcc tac    240
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gaa gac tct gca gtc tat tac tgt    288
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gta aga tgg ggt gac tac ggc tct ttt gct tac tgg ggc caa ggg act    336
Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
             100                  105                  110
ctg gtc act gtc tct gca                                            354
Leu Val Thr Val Ser Ala
         115
<210>22
<211>118
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>22
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
             20                   25                   30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
         35                   40                  45
Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Lys Phe
    50                   55                   60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                  105                  110
Leu Val Thr Val Ser Ala
        115
<210>23
<211>357
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<400>23
gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct     48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
tca gtg aag att tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act gcc tac     96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
             20                   25                   30
tac atg cac tgg gtg aag caa agt cat gta aag agt ctt gag tgg att    144
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile
         35                  40                   45
gga ctt gtt aat cct tac aat ggt ttt agt agc tac aac cag aat ttc    192
Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
    50                   55                   60
gag gac aag gcc agc ttg act gta gat aag ttc tcc agc acc gcc tac     240
Glu Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
atg gaa ctc cac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt     288
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gca aga gaa ttc tac ggc tac cgg tac ttc gat gtc tgg ggc gca ggg     336
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
             100                  105                  110
acc gcg gtc acc gtc tcc tca                                         357
Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>24
<211>119
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>24
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
             20                   25                   30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile
         35                   40                   45
Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
    50                   55                   60
Glu Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
             100                  105                  110
Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>25
<211>333
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(333)
<400>25
caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cta ggg     48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gtc agc tca agt gtg aat tcc agt     96
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser
             20                   25                   30
tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg    144
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
         35                   40                   45
att tat agc aca tcc aac ctg cct tct gga gtc cca gct cgc ttc agt    192
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
    50                   55                   60
ggc agt gga tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc acc ata gag    240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Ile Glu
65                   70                   75                   80
tct gaa gat gct gcc act tat tac tgt cac cag tat cat cgt tcc cca    288
Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
                 85                   90                   95
caa ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gag ata aaa cgg gct        333
Gln Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
             100                  105                  110
<210>26
<211>111
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>26
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser
             20                   25                   30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
         35                   40                   45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
    50                   55                   60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Ile Glu
65                   70                   75                   80
Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
                 85                   90                   95
Gln Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
             100                  105                  110
<210>27
<211>336
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
<400>27
gac att gtg ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct gtg tct cta ggg     48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt gtt gat act ttt     96
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe
             20                   25                   30
ggc tat agt ttt ata tac tgg tac cag cag aag cca gga cag cca ccc    144
Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
         35                  40                   45
aga ctc ctc atc tat cgt gca tcc aac cta gaa tct ggg atc cct gcc    192
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                   55                   60
agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc acc ctc acc att aat    240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                   70                   75                   80
cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc tat tac tgt cag caa agt aat    288
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                 85                   90                   95
gag gat cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg    336
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105                  110
<210>28
<211>112
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>28
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe
             20                   25                   30
Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
         35                   40                   45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                   55                   60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                   70                   75                   80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                 85                   90                   95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105                  110
<210>29
<211>339
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(339)
<400>29
gat gtt gtg atg tcc cag att cca ctc act ttg tcg gtc acc att gga    48
Asp Val Val Met Ser Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1                5                    10                   15
caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc ata cat agt    96
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser
             20                   25                   30
gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct    144
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
         35                   40                   45
cca aag cgc cta att tat ctg gtg tct aga ctg gac tct gga gtc cct    192
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro
    50                   55                   60
gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc    240
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                   70                   75                   80
agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt    288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
                 85                   90                   95
tca cat ttt cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa    336
Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
             100                  105                  110
cgg                                                                339
Arg
<210>30
<211>113
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>30
Asp Val Val Met Ser Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1                5                    10                   15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser
             20                   25                   30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
         35                   40                   45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro
    50                   55                   60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                   70                   75                   80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
                 85                   90                   95
Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
             100                  105                  110
Arg
<210>31
<211>363
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(363)
<220>
<221>来源
<222>(1)..(90)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(91)..(105)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(106)..(147)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(148)..(192)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(193)..(294)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(295)..(330)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(331)..(363)
<223>人(homo sapiens)
<400>31
cag gtt cag ctt gtc cag cct gga gct gaa gtg gta aag cca gga gcc     48
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
tct gtg aag ctc tct tgt aaa gca agc ggc tac aac ttc acc agc tat     96
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr
             20                   25                   30
tgg atg cac tgg gtg cgt cag cgt ccc ggc cag gga ctc cag tgg ata    144
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
         35                   40                   45
ggc aac atc tac ccc ggc acc ggt aat aca aac tat gac cag aag ttc    192
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe
    50                   55                   60
caa ggc aag gct acc ctt aca gtt gac acc tct acc agc act act tat    240
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr
65                   70                   75                   80
atg caa ttg tcc agc ctg act agc gag gat tcc gcc gtg tat tat tgt    288
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gcc agg tgg ggc ctt gtt agg tac ttc ttc gct atg gat tac tgg ggg    336
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
             100                  105                  110
cag ggt act agc gtt aca gtt tcc agt                                363
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                   120
<210>32
<211>121
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<400>32
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                    10                   15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr
             20                   25                   30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
         35                   40                   45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe
    50                   55                   60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr
65                   70                   75                   80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
             100                  105                  110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
<210>33
<211>363
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(363)
<220>
<221>来源
<222>(1)..(90)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(91)..(105)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(106)..(147)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(148)..(192)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(193)..(294)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(295)..(330)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(331)..(363)
<223>人(homo sapiens)
<400>33
cag gtg cag ctc gtc cag ccc ggt gcc gaa gtg gtg aaa ccc ggt gct     48
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
tct gtg aag ctg tca tgc aag gcc tca ggc tat agt ttc acc tca tat     96
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
             20                   25                   30
tgg atg cat tgg gtc cgc cag agg cca ggc cag ggc ctc caa tgg atc    144
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
         35                   40                   45
gga aac atc tac cct ggc aca gga aat acc aat tat gac cag aaa ttc    192
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe
    50                   55                   60
caa ggt aag gcc act ctg acc gtg gac act agc aca tca acc aca tac    240
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr
65                   70                   75                   80
atg cag ctg tct tct ctc act tca gaa gac agt gct gtc tac tac tgc    288
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gca cga tgg ggc ctc gtt cgt tat ttc ttc gca atg gat tat tgg ggt    336
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
             100                  105                  110
caa ggc aca tca gtt acc gtg tcc tct                                363
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
<210>34
<211>121
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<400>34
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                   25                   30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
         35                   40                   45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe
    50                   55                   60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr
65                   70                   75                   80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
             100                  105                  110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
<210>35
<211>363
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(363)
<220>
<221>来源
<222>(1)..(90)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(91)..(105)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(106)..(147)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(148)..(192)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(193)..(294)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(295)..(330)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(331)..(363)
<223>人(homo sapiens)
<400>35
cag gtg cag ctg gtg cag ccc ggg gct gag gtg gta aag cca gga gcc     48
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
agt gtg aag ttg tcc tgc aag gcc tcc ggg tac aat ttc acc tct tac     96
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr
             20                   25                   30
tgg atg cat tgg gtg cgt cag cgg cct ggg caa gga ctt caa tgg atc    144
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
         35                   40                   45
ggg aat att tac ccc ggt acc ggc aat aca aat tat gat cag aag ttc    192
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe
    50                   55                   60
cag ggc aag gct aca ttg acc gtg gat acc tac act tct act act tac    240
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr Thr Ser Thr Thr Tyr
65                   70                   75                   80
atg caa ctg agc tca ctg acc tcc gag gac tca gcc gtg tac tat tgc    288
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gca cgc tgg gga ctc gtc agg tat ttc ttt gcc atg gat tac tgg gga    336
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
             100                  105                 110
cag ggg acc tct gtc acc gtg agc agt                                363
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
<210>36
<211>121
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<400>36
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr
             20                   25                   30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
        35                   40                   45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe
    50                   55                   60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr Thr Ser Thr Thr Tyr
65                   70                   75                   80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
             100                  105                  110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
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<211>118
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<400>37
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Met Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
             20                   25                   30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
         35                   40                   45
Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp Ser Phe
    50                   55                   60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
             100                  105                  110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>38
<211>118
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<400>38
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Met Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
             20                   25                   30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
         35                   40                   45
Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp Ser Phe
    50                   55                   60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                   90                   95
Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
             100                  105                  110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>39
<211>357
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<220>
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<220>
<221>来源
<222>(1)..(90)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(91)..(105)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(106)..(147)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(148)..(195)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(196)..(294)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(295)..(324)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(325)..(357)
<223>人(homo sapiens)
<400>39
cag gtg caa ctg gtg caa tcc ggt gcc gag gtc gtc aaa ccc gga gca     48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
tct gtg aag ata tcc tgt aag gcc tcc ggc tac act ttt aca gcc tac     96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
             20                   25                   30
tat atg cat tgg gtt aaa cag agt ccc gtg cag tcc ctg gaa tgg atc    144
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp Ile
         35                   40                   45
ggc ttg gtg aac cct tat aac gga ttc tca agt tac aat caa aag ttt    192
Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                   55                   60
cag ggc aag gct tcc ctg act gta gac aag agc agt tcc aca gcc tac    240
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
atg gag ctc cat tca ctg aca tca gaa gac agc gcc gta tac tat tgc    288
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gca cgt gag ttc tac ggc tat aga tac ttt gac gtc tgg ggc caa ggc    336
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
             100                  105                  110
aca gcc gtc aca gtg agc tct                                        357
Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>40
<211>119
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<400>40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
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Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
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Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>41
<211>357
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<220>
<221>CDS
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<220>
<221>来源
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<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
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<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(106)..(147)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(148)..(195)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(196)..(294)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
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<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
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<223>人(homo sapiens)
<400>41
cag gtc cag ttg gtg cag tct gga gca gag gtt gtg aaa cca ggc gca    48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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agt gtc aaa atc agc tgt aag gct agc gga tac tcc ttt aca gca tat    96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
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tat atg cac tgg gtg aag cag agc cct gtt cag agc ctg gaa tgg atc    144
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp Ile
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cag ggc aaa gcc agc ctg aca gtg gat aag agt agc agc act gcc tat    240
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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atg gaa ctg cat tct ctc acc tct gaa gat agt gca gtg tac tat tgt    288
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gct cgc gag ttc tac ggt tat cga tat ttc gac gtg tgg ggc cag ggt    336
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
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act gcc gtg aca gta agc agt                                        357
Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>42
<211>119
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<400>42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
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Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp Ile
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Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                   55                   60
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
             100                  105                  110
Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>43
<211>119
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<400>43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
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Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
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Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>44
<211>357
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<220>
<221>来源
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<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(91)..(105)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(106)..(147)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(148)..(195)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(196)..(294)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(295)..(324)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
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<223>人(homo sapiens)
<400>44
cag gtt caa ctg gtt cag agt ggg gca gaa gtc gta aag ccc gga gct     48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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tat atg cac tgg gtc aag caa tct cct ggg cag agc ctg gag tgg atc    144
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cag gga aaa gcc tcc ctt aca gta gac aag tca tct tcc act gcc tac    240
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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atg gaa ctt cac tcc ctt aca agc gag gat agc gcc gtt tat tat tgt    288
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Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>45
<211>119
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<400>45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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65                   70                   75                   80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
             100                  105                  110
Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>46
<211>330
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(330)
<220>
<221>来源
<222>(1)..(71)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(72)..(105)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(106)..(150)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(151)..(171)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(172)..(269)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(270)..(299)
<223>Mus sp.
<220>.
<221>来源
<222>(300)..(330)
<223>人(homo sapiens)
<400>46
gag atc gtt ctc aca cag tca cca gcc acc atg agc gcc tct ccc ggg    48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly
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ggt tca ggt tct ggc act agt tac tct ctg acc atc agc acc atc gaa    240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Ile Glu
65                   70                   75                   80
tcc gaa gat gct gca aca tac tac tgt cac cag tat cac agg tcc ccc    288
Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
                 85                   90                   95
cag ttt aca ttc ggt ggc ggc acc aaa ctt gag att aag cgt            330
Gln Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105                  110
<210>47
<211>110
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<400>47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly
1                5                    10                   15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser
             20                   25                   30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
         35                   40                   45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
    50                   55                   60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Ile Glu
65                   70                   75                   80
Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
                 85                   90                   95
Gln Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105                  110
<210>48
<211>112
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<400>48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe
             20                   25                   30
Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
         35                   40                   45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
    50                   55                   60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                   70                   75                   80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                 85                   90                   95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu  Ile Lys Arg
            100                  105                  110
<210>49
<211>112
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<400>49
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe
             20                   25                   30
Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
         35                   40                   45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                   55                   60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                   70                   75                   80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                 85                   90                   95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105                  110
<210>50
<211>112
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<400>50
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe
             20                   25                   30
Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
         35                   40                   45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
    50                   55                   60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                   70                   75                   80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                 85                   90                   95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105                  110
<210>51
<211>339
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人源化抗体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(339)
<220>
<221>来源
<222>(1)..(69)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(70)..(117)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(118)..(162)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(163)..(183)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(184)..(279)
<223>人(homo sapiens)
<220>
<221>来源
<222>(280)..(306)
<223>Mus sp.
<220>
<221>来源
<222>(307)..(339)
<223>人(homo sapiens)
<400>51
gac gtc gtg atg aca caa acc cct ctg tcc ctg agc gtc act ctg gga     48
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1                5                    10                   15
caa ccc gct tcc att agc tgc aaa tca tca caa tct ctc atc cac tca     96
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser
             20                   25                   30
gac ggc aaa aca tac ctc aat tgg ctg ctg cag aga cca gga cag tcc    144
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
         35                   40                   45
cct aaa agg ctt atc tac ctg gtc tct cgt ttg gac tct ggt gta cca    192
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro
    50                   55                   60
gac cgg ttt act ggt tcc ggg gcc gga acc gat ttc act ctg aag att    240
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                   70                   75                   80
tcc agg gtg gaa gct gaa gat ctc gga gtg tat tat tgc tgg cag ggc    288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
                 85                   90                   95
agc cat ttc ccc cgt act ttt ggt ggg ggt acc aaa ttg gaa att aag    336
Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
             100                  105                  110
cgt                                                                339
Arg
<210>52
<211>113
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<400>52
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1                5                    10                   15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser
             20                   25                   30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                   40                   45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro
    50                   55                   60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                   70                   75                   80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
                 85                   90                   95
Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
             100                  105                  110
Arg
<210>53
<211>36
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>53
ggaggatcca tagacagatg ggggtgtcgt tttggc    36
<210>54
<211>32
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>54
ggaggatccc ttgaccaggc atcctagagt ca        32
<210>55
<211>32
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(32)
<223>mixed bases are defined as follows：H＝A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，K＝
     G+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，V＝A+C+G，N＝A+C+G+T
<400>55
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tc       32
<210>56
<211>35
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>n是a，c，g或t
<400>56
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg    35
<210>57
<211>31
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(31)
<223>混合碱基是如下定义的：H＝A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，K＝
     G+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，V＝A+C+G，N＝A+C+G+T
<400>57
ggagctcgay attgtgmtsa cmcarwctmc a                       31
<210>58
<211>46
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>58
tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc       46
<210>59
<211>23
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>59
gacagacaca ctcctgctat ggg                                23
<210>60
<211>32
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(32)
<223>mixed bases are defined as follows：H＝A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，K＝
     G+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，V＝A+C+G，N＝A+C+G+T
<400>60
gcagaattca tgggatggag cyggatcttt ct    32
<210>61
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>61
Glu Tyr Asn Met His
1                5
<210>62
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>62
Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe Lys
1                5                    10                   15
Asn
<210>63
<211>11
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>63
Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr
1                5                    10
<210>64
<211>15
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>64
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
1                5                    10                   15
<210>65
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>65
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1                5
<210>66
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>66
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr
1                5
<210>67
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>67
Asp Tyr Asn Met His
1                5
<210>68
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>68
Phe Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
1                5                    10                   15
Asn
<210>69
<211>10
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>69
Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Tyr
1                5                    10
<210>70
<211>10
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>70
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1                5                    10
<210>71
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>71
Ile Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1                5
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>72
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
1                5
<210>73
<211>360
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>73
gag gtc cag ctt cag cag tca gga cct gac ctg gtg aaa cct ggg gcc     48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct gga tac aga ttc act gaa tac     96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Glu Tyr
             20                   25                   30
aat atg cac tgg atg aag cag agc cat gga gag agc ctt gag tgg att    144
Asn Met His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
         35                   40                   45
gga tat att tat cct tac aat ggt gat act ggc tac agg cag aaa ttc    192
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe
    50                   55                   60
aag aac atg gcc aca ttg act gca gac att tcc tcc aat aca gcc tac    240
Lys Asn Met Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
atg gaa ctc cgc agc ctg aca tct gac gac tct gca gtc tat ttc tgt    288
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                 85                   90                   95
gca aga tgg ggc tac ggt agt ggc ggg ggg ttt act tac tgg ggc caa    336
Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
             100                  105                  110
ggg act ctg gtc act gtc tct gca                       360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
        115                  120
<210>74
<211>120
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>74
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Glu Tyr
             20                   25                   30
Asn Met His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
         35                   40                   45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe
    50                   55                   60
Lys Asn Met Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
             100                  105                  110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
        115                  120
<210>75
<211>357
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<400>75
gag gtc cag ctt cag cag tca gga cct gag ctg gtg aaa cct ggg gcc    48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc act gac tac    96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
             20                   25                   30
aac atg cac tgg gtg aaa cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att    144
Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                   40                   45
gga ttt att tat cct tac aat ggt ggt act ggc tac aac cag agg ttc    192
Gly Phe Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe
    50                   55                   60
aag aac aag gcc aca ttg act gta gac act tcc tcc agc aca gcc tac    240
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
atg gag gtc cgc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt    288
Met Glu Val Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                 85                   90                   95
gca agg gga tat tac tac ggt agg cac ttt gac tac tgg ggc caa ggc    336
Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
             100                  105                  110
acc act ctc aca gtc tcc tca                                        357
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>76
<211>119
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>76
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
             20                   25                   30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
         35                   40                   45
Gly Phe Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe
    50                   55                   60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
Met Glu Val Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
             100                  105                  110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>77
<211>336
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
<400>77
gac att gtg ctg acc caa tct cca ggt tct ttg gct gtg tct cta ggg     48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt gtt gac act tat     96
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
             20                   25                   30
ggc aat agt ttc atg cac tgg tac cag cag aaa gca gga cag ccg ccc    144
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
         35                   40                   45
aga ctc ctc atc tat cgt gca tcc aac cta gaa tct ggg atc cct gcc    192
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                   55                   60
agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc acc ctc acc att aat    240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                   70                   75                   80
cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc tat tac tgt cag caa agt aat    288
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                 85                   90                   95
gag gat cct ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgg    336
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
             100                  105                  110
<210>78
<211>112
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>78
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
             20                   25                   30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
         35                   40                   45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                   55                   60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                   70                   75                   80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                 85                   90                   95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
             100                  105                  110
<210>79
<211>321
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<400>79
caa att gtt ctc acc cag tct cca gca ctc atg tct gca tct cca ggg     48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1                5                    10                   15
gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt gtg agt tac atg     96
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
             20                   25                   30
tac tgg tac cag cag aag cca aga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat    144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
        35                   40                   45
atc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt    192
Ile Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
    50                   55                   60
ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa    240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                   70                   75                   80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca ccc acg    288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
                 85                   90                   95
ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg                        321
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105
<210>80
<211>107
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>80
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1                5                    10                   15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
             20                   25                   30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
        35                   40                   45
Ile Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
    50                   55                   60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                   70                   75                   80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
                 85                   90                   95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105
PCT/RO/134表
  申请人或代理人档案号FR2006/030   国际申请号PCT/IB2007/003074
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003072101691
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
  申请人或代理人档案号FR2006/030   国际申请号PCT/IB2007/003074
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003072101701
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
  申请人或代理人档案号FR2006/030   国际申请号PCT/IB2007/003074
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003072101711
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
  申请人或代理人档案号FR2006/030   国际申请号PCT/IB2007/003074
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003072101721
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
  申请人或代理人档案号FR2006/030   国际申请号PCT/IB2007/003074
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(细则13之二)
Figure A20078003072101731
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)

Claims (74)

1.抗体或其表位结合片段，所述抗体或其表位结合片段特异性结合EphA2受体并且是所述受体的拮抗剂。
2.权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段是单克隆抗体。
3.权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段是Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv片段。
4.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够抑制癌细胞的生长。
5.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够抑制癌细胞的迁移。
6.根据权利要求4和5任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述癌细胞是选自乳癌、结肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、滑液癌、胰腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、头颈癌、胃癌、肝癌和其他癌的癌细胞。
7.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够抑制血管生成。
8.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段没有激动活性。
9.根据权利要求8的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段不刺激EphA2酪氨酸磷酸化。
10.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够抑制配体与所述受体结合。
11.权利要求10的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述配体是ephrinA1。
12.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够抑制EphA2酪氨酸磷酸化。
13.权利要求12的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段在存在ephrinA1时能够抑制EphA2酪氨酸磷酸化。
14.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够抑制EphA2-介导的信号传导。
15.权利要求14的抗体或其表位结合片段，其特征在于EphA2-介导的信号传导是Akt磷酸化的提高。
16.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段以3×10-10M或更低的KD结合EphA2。
17.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述EphA2受体是人EphA2受体。
18.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含一个或者多个互补决定区，所述互补决定区具有选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71和72的氨基酸序列。
19.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO：26、28、30、78和80的氨基酸序列。
20.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含重链可变区，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO：20、22、24、74和76的氨基酸序列。
21.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有由SEQ ID NO：1、2和3表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区，并且其中所述轻链包含具有由SEQ ID NO：4、5和6表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
22.根据权利要求21的抗体或其表位结合片段，其中所述抗体或其表位结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：26所构成的氨基酸序列。
23.根据权利要求21的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含一个或者多个具有由SEQ ID NO：20构成的氨基酸序列的重链可变区。
24.根据权利要求1～20任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有由SEQ ID NO：7、8和9表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区，并且其中所述轻链包含具有由SEQ ID NO：10、11和12表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
25.根据权利要求24的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ IDNO：28所构成的氨基酸序列。
26.根据权利要求24的抗体或其表位结合片段，特征在于所述抗体或其表位结合片段包含一个或者多个具有由SEQ ID NO：22构成的氨基酸序列的重链可变区。
27.根据权利要求1～20任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有由SEQ ID NO：13、14和15表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区，并且其中所述轻链包含具有由SEQ ID NO：16、17和18表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
28.根据权利要求27的抗体或其表位结合片段，其中所述抗体或其表位结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：30所构成的氨基酸序列。
29.根据权利要求27的抗体或其表位结合片段，特征在于所述抗体或其表位结合片段包含一个或者多个具有由SEQ ID NO：24构成的氨基酸序列的重链可变区。
30.根据权利要求1～20任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有由SEQ ID NO：61、62和63表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区，并且其中所述轻链包含具有由SEQ ID NO：64、65和66表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
31.根据权利要求30的抗体或其表位结合片段，其中所述抗体或其表位结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：78所构成的氨基酸序列。
32.根据权利要求30的抗体或其表位结合片段，特征在于所述抗体或其表位结合片段包含一个或者多个具有由SEQ ID NO：74构成的氨基酸序列的重链可变区。
33.根据权利要求1～20任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有由SEQ ID NO：67、68和69表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区，并且其中所述轻链包含具有由SEQ ID NO：70、71和72表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
34.根据权利要求33的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ IDNO：80所构成的氨基酸序列。
35.根据权利要求33的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含一个或者多个具有由SEQ ID NO：76构成的氨基酸序列的重链可变区。
36.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段是鼠抗体或其表位结合片段，并且是由以下杂交瘤产生的：被称作37.3D7的杂交瘤，其中该杂交瘤被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTA-7660；被称作37.1F5的杂交瘤，其中该杂交瘤被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTA-7661；被称作53.2H11的杂交瘤，其中该杂交瘤被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTA-7662；被称作EphA2-N 1的杂交瘤，其中该杂交瘤被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTA-8407；或被称作EphA2-N2的杂交瘤，其中该杂交瘤被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTM-8408。
37.人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其与根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段结合相同的表位。
38.根据前述权利要求任一项的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含一个或者多个互补决定区，所述互补决定区具有选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71和72的氨基酸序列。
39.根据前述权利要求任一项的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO：47、48、49、50和52的氨基酸序列。
40.根据前述权利要求任一项的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含重链可变区，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO：32、34、36、37、38、40、42、43和45的氨基酸序列。
41.根据前述权利要求任一项的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有由SEQ IDNO：1、2和3表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区，并且其中所述轻链包含具有由SEQ ID NO：4、5和6表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
42.根据权利要求41的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段具有轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：47所表示的氨基酸序列。
43.根据权利要求41的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含一个或者多个重链可变区，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO：32、34和36的氨基酸序列。
44.根据权利要求1～40任一项的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有由SEQID NO：7、8和9表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区，并且其中所述轻链包含具有由SEQ ID NO：10、11和12表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
45.根据权利要求44的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO：48、49和50的氨基酸序列。
46.根据权利要求44的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含一个或者多个重链可变区，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO：37和38的氨基酸序列。
47.根据权利要求1～40任一项的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有由SEQID NO：13、14和15表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区，并且其中所述轻链包含具有由SEQ ID NO：16、17和18表示的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
48.根据权利要求47的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52所表示的氨基酸序列。
49.根据权利要求47的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含一个或者多个重链可变区，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO：40、42、43和45的氨基酸序列。
50.根据权利要求1～40任一项的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有选自SEQ ID NO：61、62和63的氨基酸序列的三个连续互补决定区，并且其中所述轻链包含具有选自SEQ ID NO：64、65和66的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
51.根据权利要求1～40任一项的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含具有选自SEQ ID NO：67、68和69的氨基酸序列的三个连续互补决定区，其中所述轻链包含具有选自SEQ ID NO：70、71和72的氨基酸序列的三个连续互补决定区。
52.根据前述权利要求任一项的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段选自hu37.3D7、hu37.1F5、hu53.2H 11、huEphA2-N 1和huEphA2-N2。
53.一种缀合物，其包含连接到细胞毒性剂上的根据权利要求1～52任一项的抗体或其表位结合片段。
54.权利要求53的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂选自类美登素、小分子药物、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物、前药、紫杉醇类化合物、CC-1065或CC-1065类似物。
55.权利要求53的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂是下式的美登素DM1：
56.权利要求53的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂是下式的美登素DM4：
Figure A2007800307210008C2
57.权利要求53的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂是选自下列的茅屋霉素衍生物：
·8，8′-[1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210008C3
-5-酮]
·8，8′-[5-甲氧基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210008C4
-5-酮]
·8，8′-[1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210008C5
-5-酮]
·8，8′-[1，4-亚丁基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210008C6
-5-酮]
·8，8′-[3-甲基-1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210009C1
-5-酮]
·8，8′-[2，6-亚吡啶基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[4-(3-叔丁氧羰基氨基丙氧基)-2，6-亚吡啶基双-(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210009C3
-5-酮]
·8，8′-[5-(3-氨基丙氧基)-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210009C4
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-3-叔丁氧羰基氨基丙基)-1，3-亚苯基双-(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210009C5
-5-酮]
·8，8′-{5-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)丙氧基]-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)}-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210009C6
-5-酮]
·8，8′-[5-乙酰基硫代甲基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210009C7
-5-酮]
·双-{2-[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-5-氧代-1，3，，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210009C8
-8-基氧基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯
·8，8′-[3-(2-乙酰基硫代乙基)-1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210009C10
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210009C11
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-亚苯基(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210010C1
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-亚苯基(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210010C2
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-(4-巯基-4-甲基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210010C3
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210010C4
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210010C5
-5-酮]
·8，8′-[(4-(4-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210010C6
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210010C7
-5-酮]
·8，8′-[(1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210010C10
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210010C11
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210011C1
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210011C2
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[甲基(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210011C3
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800307210011C4
-5-酮]
·8，8′-[(1-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]。
58.权利要求53的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂是选自下列的来普霉素衍生物：
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基硫基-乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸]的二-[(2-巯基乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基二硫基-乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五-烯酸的(2-巯基-2-甲基-丙基)-酰胺。
59.药物组合物，其含有权利要求1～52任一项的抗体或其表位结合片段，或者根据权利要求53～58任一项的缀合物，以及药物上可以接受的载体或赋形剂。
60.用作药物的权利要求1～52任一项的抗体或其表位结合片段，或者根据权利要求53～58任一项的缀合物。
61.权利要求1～52任一项的抗体或其表位结合片段，或者根据权利要求53～58任一项的缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
62.权利要求61的应用，其特征在于所述癌症是转移性癌症。
63.权利要求61-62的应用，其特征在于所述抗体或其表位结合片段或者所述缀合物抑制肿瘤新血管生成。
64.权利要求61～63任一项的应用，其中所述癌症选自乳癌、结肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、肾癌、前列腺癌、肺癌、滑液癌、胰腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、头颈癌、胃癌、肝癌和其他癌。
65.权利要求61～64任一项的应用，其进一步包括另外的治疗剂在制备相同或不同组合物中的应用。
66.权利要求65的应用，其特征在于，所述另外的治疗剂是成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)或HER2受体的拮抗剂。
67.诊断个体中癌症的方法，其中已知或怀疑所述个体患有癌症，所述方法包括：
a)将所述患者的细胞与抗体或其表位结合片段接触，
b)测量所述抗体或其表位结合片段与所述细胞的结合，以及
c)将b)部分中的表达与正常参照个体或标准的表达进行比较。
68.权利要求67的方法，其中所述癌症是选自乳癌、结肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、肾癌、前列腺癌、肺癌、滑液癌、胰腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、头颈癌、胃癌、肝癌和其他癌的癌的细胞。
69.权利要求68的方法，其特征在于所述细胞是冷冻的或固定的来自所述患者的组织或细胞。
70.多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、37、38、40、42、43、45、47、48、49、50、52、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、74、76、78和80的多肽。
71.权利要求70的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸具有与选自SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、39、41、44、46、51、73、75、77和79的多核苷酸具有至少80％的同源性的序列。
72.重组载体，其包含权利要求70和71任一项的核酸。
73.宿主细胞，其包含权利要求72的载体。
74.杂交瘤细胞系，其特征在于所述杂交瘤细胞系选自被称作37.3D7的杂交瘤细胞系，其中该杂交瘤细胞系被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTA-7660；被称作37.1F5的杂交瘤细胞系，其中该杂交瘤细胞系被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTA-7661；被称作53.2H 11的杂交瘤细胞系，其中该杂交瘤细胞系被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTA-7662；被称作EphA2-N 1的杂交瘤细胞系，其中该杂交瘤细胞系被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTA-8407；被称作EphA2-N2的杂交瘤细胞系，其中该杂交瘤细胞系被保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号为PTA-8408。
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