EA020324B1 - АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ ЭФРИНА EphA2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ ЭФРИНА EphA2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
EA020324B1
EA020324B1 EA200970130A EA200970130A EA020324B1 EA 020324 B1 EA020324 B1 EA 020324B1 EA 200970130 A EA200970130 A EA 200970130A EA 200970130 A EA200970130 A EA 200970130A EA 020324 B1 EA020324 B1 EA 020324B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
epitope
binding fragment
amino acid
methyl
Prior art date
Application number
EA200970130A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970130A1 (ru
Inventor
Вероник Блан
Клодья Фромон
Фабьенн Паркер
Цзявэнь Хань
Даниэль Таварес
Чунхой Чжан
Минь Ли
Сяо-Май Чжоу
Мишель Стрели
Original Assignee
Санофи-Авентис
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37635710&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA020324(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Санофи-Авентис filed Critical Санофи-Авентис
Publication of EA200970130A1 publication Critical patent/EA200970130A1/ru
Publication of EA020324B1 publication Critical patent/EA020324B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Предложены антитела, в том числе гуманизированные и поверхностно-модифицированные, и их фрагменты, а также конъюгаты вышеперечисленных соединений с цитотоксическими средствами, которые специфически связывают и ингибируют рецепторы эфрина Eph класса А, противодействуют эффектам факторов роста на размножение и выживание опухолевых клеток и которые обладают минимальной агонистической активностью или предпочтительно лишены агонистической активности. Указанные антитела и их фрагменты можно применять для лечения опухолей, которые экспрессируют повышенные уровни рецепторов Eph класса А, таких как рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легких, карцинома яичников, синовиальная карцинома и рак поджелудочной железы, а также для диагностики и визуализации опухолей, которые экспрессируют повышенные уровни рецепторов Eph класса А. Также предложены терапевтические композиции, содержащие указанные конъюгаты.

Description

Область техники изобретения
Настоящее изобретение относится к новым мышиным анти-Ерй моноклональным антителам или их фрагментам, а также их гуманизированным или поверхностно-модифицированным вариантам. Более конкретно, изобретение относится к новым моноклональным антителам или их фрагментам, а также их гуманизированным или поверхностно-модифицированным вариантам, которые взаимодействуют с семейством рецепторов ЕрйЛ и действуют как антагонисты. Более конкретно, изобретение относится к антителам против рецептора Ер11Л2. которые ингибируют клеточные функции рецептора Ер11Л2. Еще более конкретно, изобретение относится к антителам против рецептора ЕрйА2, которые препятствуют росту и выживанию опухолевых клеток и которые лишены агонистической активности.
Кроме того, настоящее изобретение относится к цитотоксическим конъюгатам, содержащим связывающее клетки средство и цитотоксическое средство, терапевтическим композициям, содержащим конъюгат, способам применения конъюгатов для ингибирования клеточного роста и лечения заболевания, а также к набору, включающему цитотоксический конъюгат. В частности, связывающее клетки средство представляет собой моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, а также его гуманизированный или поверхностно-модифицированный вариант, который распознает и связывает семейство рецепторов ЕрйЛ.
Уровень техники изобретения
Рецепторные тирозинкиназы играют многообразную роль в клеточном росте и дифференциации при нормальных физиологических ответах, а также при онкогенной трансформации и развитии опухоли. Рецепторы Ерй представляют собой уникальное семейство рецепторных тирозинкиназ (ВТК), самое большое в геноме, состоящее по меньшей мере из 16 рецепторов, которые взаимодействуют с девятью мембраносвязанными эфриновыми лигандами (Ракциак, Е.В. е1 а1., 2005, Иа1ите Веуге^к Мо1. Се11 ΒίοΙ., 6: 462-475). Их можно дополнительно подразделять на две группы, класс А и В, на основе гомологичности последовательности и афинности связывания (Ракциак, Е.В. е1 а1., 2005, №11иге Веуге^к Мо1. Се11 Βίο1., 6: 462-475). Рецепторы Ерй класса А взаимодействуют с множественными лигандами семейства эфринов А, группы гликозилфосфатидилинозитол (ОР1)-связанных мембранных белков, тогда как рецепторы Ер1г класса В связываются с эфриновыми В лигандами, семейством трансмембранных белков. Связывание рецепторов Ерй со своими лигандами индуцирует группирование рецепторов, активацию киназной активности и последующее транс-фосфорилирование цитоплазматических доменов по остаткам тирозина с образованием центров причаливания для целого ряда сигнальных белков (Ки11апйег, К. апй К1еш, В., 2002, ИаШге Ве\зе\\'к Мо1. Се11 Βίο1., 3: 475-486, Иогеп, Ν.Κ. апй Ракциак, Е.В., 2004, Се11 кгдпа1., 16: 655-666).
Рак представляет собой заболевание, характеризующееся неконтролируемой пролиферацией, являющейся следствием искаженной сигнальной трансдукции. Наиболее опасные формы рака представляют собой злокачественные клетки, обладающие способностью к распространению, либо непосредственно прорастая в прилегающие ткани посредством инвазии, либо путем имплантации в отдаленные участки с помощью метастазов. Метастатические клетки приобрели способность отделяться от первичной опухоли, перемещаться к отдаленным участкам по кровотоку или лимфатической системе и колонизировать отдаленное и чужеродное микроокружение.
В настоящее время, очевидно, что молекулы Ер1г также играют роль в болезненных состояниях, таких как рак. В частности, сообщают о повышенной экспрессии рецептора Ер1гА2 при раке яичников, молочной железы, предстательной железы, легких, толстой кишки, пищевода, клеток почечного эпителия, шейки матки, а также при меланоме. Предполагают, что Ер1гА2 является позитивным регулятором клеточного роста и выживания злокачественных клеток (Ьапйеп, С.И. е1 а1., 2005, ЕхрегЕ Орш. Тйет. Татде1к, 9 (6): 1179-1187). Также описана роль Ер1гА2 в метастазировании, поскольку сама по себе повышенная экспрессия Ер1гА2 является достаточной для трансформации эпителиальных клеток молочной железы в злокачественный фенотип (УеШАй е1 а1., 2001, Сапсег Век., 61: 2301-2306) и увеличивает спонтанное метастазирование в отдаленные участки (Ьапйеп, С.И. е1 а1., 2005, ЕхрегЕ Орш. Т1гег. ТагдеА 9 (6): 11791187). Более того, имеется все больше указаний на то, что Ер1гА2 принимает участие в ангиогенезе опухолей (Ода\та е1 а1., 2000, Опсодепе, 19: 6043-6052, Сйепд е1 а1. 2002, Мо1. Сапсег Век., 1: 2-11, Сйепд е1 а1. 2003, Иеор1акга, 5 (5): 445-456, ОоЬг/апк1б е1 а1., 2004, Сапсег Век., 64: 910-919).
Показано, что фосфорилирование Ер1гА2 связано с его избытком. Фосфорилированный по остаткам тирозина Ер11Л2 быстро интернализируется и обрекается на деградацию, в то время как нефосфорилированный Ер11Л2 характеризуется замедленным метаболизмом и вследствие этого накапливается на клеточной поверхности. В настоящее время считается, что подобная модель может вносить вклад в высокую частоту встречаемости сверхэкспрессии Ер1гА2 при раке (Ьапйеп, С.И. е1 а1., 2005, Ехрей. Орш. Тйет. Тагде1к, 9 (6): 1179-1187). Однако реальная ситуация может быть более сложной, поскольку последние данные, судя по всему, свидетельствуют о роли зависимых и независимых от киназы функций Ер1гА2 в развитии опухоли (Еапд А.В., 2005, Опсодепе, 24: 7859-7868).
Разработаны агонистические антитела, которые стимулируют фосфорилирование по остаткам тирозина и интернализацию ЕрйА2, что в конечном итоге приводит к ингибированию роста опухолевых клеток (Сойде-УиПек е1 а1., 1999, Се11 Οίιοχχΐΐι & ОгЕЕег., 10: 629-638, АО 01/12172, АО 03/094859, АО
- 1 020324
2004/014292, \\Ό 2004/101764, \\Ό 2006/023403, \\Ό 2006/047637, \\Ό 2007/030642). Данные антитела направлены против внеклеточного домена Ер11Л2. Поскольку данные агонистические антитела не ингибируют, а скорее стимулируют фосфорилирование рецептора Ер11Л2 и сигналы в нисходящем направлении, данные антитела не могут быть эффективными в отношении опухолей, развитию которых способствует киназная активность Ер11Л2. С другой стороны, предложено использовать антагонистические средства, включая антитела (\УО 2004/092343), однако в данном документе не раскрыто ни одного фактически существующего антагонистического антитела. Более того, подобные антитела были предложены скорее для стимулирования, чем для ингибирования клеточной пролиферации. В патентной заявке \¥О 2006/084226 раскрывают антитела, которые ни увеличивают, ни уменьшают киназную активность Ер11А2. однако способны сдерживать пролиферацию опухолевых клеток. Однако в данном документе отсутствуют указания на то, что данные антитела предотвращают связывание эфрина А1 с рецептором и ингибируют индуцированное эфрином А1 фосфорилирование Ер11А2. Скорее, они могут влиять на пролиферацию опухолевых клеток посредством совершенно иного механизма, например, предотвращая группирование рецепторов после связывания эфрина А1. Таким образом, специалист в данной области не сочтет такие антитела антагонистами, скорее, механизм их действия является неизвестным.
Вследствие этого существует необходимость в новых антагонистических анти-ЕрйА2 антителах, которые связываются с внеклеточными доменами рецептора ЕрйА2, ингибируют его активацию лигандом эфрином А1 и ингибируют зависимый от киназы Ер11А2 рост опухолевых клеток. Такие антагонистические антитела должны быть полезны для лечения рака.
Сущность изобретения
Соответственно, целью данного изобретения является предложить средства, которые специфически связываются с членами семейства рецепторов Ерй класса А, такими как ЕрйА2, и ингибируют клеточную активность рецептора, вызывая антагонизм рецептора. Таким образом, настоящее изобретение включает антитела или их фрагменты, которые распознают рецептор ЕрйА2, предпочтительно человека, и действуют как антагонисты указанного рецептора.
Рецептор Ер11А2 играет роль в развитии и росте опухолей, а также принимает участие в метастазировании. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению способны ингибировать рост раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению способны предотвращать миграцию метастатических раковых клеток. В предпочтительных вариантах осуществления раковая клетка представляет собой клетку злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, рака толстой кишки, рака эндометрия, карциномы яичника, остеосаркомы, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака легких, синовиальной карциномы, рака поджелудочной железы, саркомы, глиомы, рака головы и шеи, рака желудка, рака печени и других карцином. В другом варианте осуществления антитела по изобретению способны ингибировать ангиогенез.
Поскольку анти-ЕрйА2 антитела, раскрытые в документах известного уровня техники, преимущественно являлись агонистами (например, \¥О 03/094859, \УО 2004/014292, \УО 2004/101764, \УО 2006/023403, \УО 2006/047637, \УО 2007/030642), данное изобретение охватывает антитела, распознающие указанный рецептор, которые обладают минимальной агонистической активностью, или предпочтительно полностью лишены агонистической активности в отношении рецептора. В предпочтительном варианте осуществления антитела по изобретению не стимулируют фосфорилирование ЕрйА2 по остаткам тирозина.
Антитела по изобретению способны ингибировать связывание лиганда, предпочтительно эфрина А1, с рецептором Ер11А2. В некоторых вариантах осуществления они способны ингибировать фосфорилирование Ер11А2 по остаткам тирозина. В другом варианте осуществления фосфорилирование ЕрйА2 по остаткам тирозина ингибируется антителами по изобретению даже в присутствии эфрина А1. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению способны блокировать опосредованную Ер11А2 передачу сигнала, в частности, они способны ингибировать ЕрйА2-зависимое фосфорилирование Ак1.
Данное изобретение также относится к антителам, которые связывают рецептор Ер11А2 с Ко, составляющей 0,3 х 10-9 М или меньше.
Антитела по изобретению могут быть поликлональными или моноклональными. Эпитопсвязывающие фрагменты, такие как фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2 или Ρν, включены в объем данного изобретения. Предпочтительными являются моноклональные анти-ЕрйА2 антитела. В более предпочтительном варианте осуществления предлагают мышиные антитела, выбранные из 37.3Ό7, 37.1Ρ5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 и ЕрйА2-Ы2, которые полностью охарактеризованы в данном описании в отношении их аминокислотных последовательностей вариабельных областей как легких, так и тяжелых цепей, последовательностей кДНК генов вариабельных областей легких и тяжелых цепей, идентификации их СЭР (определяющих комплементарность областей), идентификации их поверхностных аминокислот и способов их экспрессии в рекомбинантной форме. Г ибридомы, продуцирующие мышиные анти-ЕрйА2 моноклональные антитела 37.3Ό7, 37.1Ρ5 и 53.2Н11, а также ЕрйА2-Ы1 и ЕрйА2-Ы2, депонированы в соответствии с Будапештской конвенцией 16 июня 2006 г. и 3 мая 2007 г., соответственно, в Американской коллекции типовых культур, 10801 Ипщегайу ВоЫстагТ Мапаккак, Уйщша 20110-2209, и8Л, под входящими номерами РТА7660, РТА-7661, РТА-7662, РТА-8407 и РТА-8408, соответственно.
- 2 020324
Настоящее изобретение включает мышиные анти-ЕрйА2 моноклональные антитела, выбранные из 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 и Ερ1ιΑ2-Ν2. а также поверхностно-модифицированные или гуманизированные варианты антител 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 и Ερ1ιΑ2-Ν2, где экспонированные на поверхности остатки каркасов вариабельной области антител, или их эпитопсвязывающие фрагменты, заменены как в легких, так и в тяжелых цепях для большего сходства с поверхностями известных человеческих антител. Гуманизированные антитела и их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению обладают улучшенными свойствами в том отношении, что они являются менее иммуногенными (или полностью неиммуногенными), чем мышиные варианты в субъектах-людях, которым их вводят. Таким образом, различные варианты гуманизированных антител 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 и Ερ1ιΑ2-Ν2, а также их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению специфически распознают рецептор ЕрйА2, при этом не являясь иммуногенными для человека.
Гуманизированные варианты антител 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 и Ερ1ιΑ2-Ν2 по настоящему изобретению в данном описании полностью охарактеризованы в отношении их соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельных областей как легких, так и тяжелых цепей, последовательностей ДНК генов вариабельных областей легких и тяжелых цепей, идентификации определяющих комплементарность областей (СЭВ), идентификации их поверхностных аминокислотных остатков каркасов вариабельных областей и раскрытия способов их экспрессии в рекомбинантной форме.
Данное изобретение также предусматривает применение конъюгатов между цитотоксическими конъюгатами, включающих (1) связывающее клетки средство, которое распознает и связывает рецептор ΕρΙιΑ, такой как рецептор ЕрйА2, а также (2) цитотоксическое средство. В цитотоксических конъюгатах связывающее клетки средство обладает высокой афинностью для рецептора ЕрйА (например, рецептора Ер11А2), и цитотоксическое средство обладает высокой степенью цитотоксичности для клеток, экспрессирующих рецептор ЕрйА, так что цитотоксические конъюгаты по настоящему изобретению образуют эффективные цитолизирующие средства.
В предпочтительном варианте осуществления связывающее клетки средство представляет собой анти-ЕрйА2 антитело (например, 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 или ЕрйА2-Ы2) или его эпитопсвязывающий фрагмент, более предпочтительно гуманизированное анти-ЕрйА2 антитело (например, 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 или ЕрйА2-Ы2) или его эпитопсвязывающий фрагмент, где цитотоксическое средство является ковалентно присоединенным, напрямую или через расщепляемый, либо нерасщепляемый линкер, к антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту. В более предпочтительных вариантах осуществления связывающее клетки средство представляет собой гуманизированные антитела 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 и ЕрйА2-Ы2 или их эпитопсвязывающий фрагмент, а цитотоксическое средство представляет собой таксол, мейтанзиноид, производное томеймицина, производное лептомицина, СС-1065 или аналог СС-1065.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения связывающее клетки средство представляет собой гуманизированное анти-ЕрйА2 антитело 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 или ЕрйА2Ν2, и цитотоксическое средство представляет собой мейтанзиновое соединение, такое как ΌΜ1 или ΌΜ4.
Настоящее изобретение также охватывает применение фрагментов анти-ЕрйА2 антител, которые сохраняют способность связывать рецептор ЕрйА2. В другом аспекте изобретения предусмотрено применение функциональных эквивалентов анти-ЕрйА2 антител.
Настоящее изобретение также охватывает способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих рецептор ЕрйА2. В предпочтительных вариантах осуществления способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих рецептор ЕрйА2, применяется ίη νίνο и приводит к гибели клеток, хотя применения ίη νίΐτο и ех νίνο также включены.
Настоящее изобретение также относится к терапевтической композиции, содержащей анти-ЕрйА2 антитело или конъюгат анти-ЕрйА2 антитело-цитотоксическое средство и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиенты. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая композиция содержит второе терапевтическое средство. Это второе терапевтическое средство может быть выбрано из группы, включающей антагонисты фактора роста фибробластов (ЕСЕ), фактора роста гепатоцитов (НСЕ), тканевого фактора (ТЕ), белка С, белка 8, тромбоцитарного фактора роста (ΡΌ6Ε) или рецептора НЕВ2.
Кроме того, настоящее изобретение включает способ лечения субъекта, страдающего от рака, при помощи терапевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой метастатический рак. В частности, раковая клетка представляет собой клетку злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, рака толстой кишки, рака эндометрия, карциномы яичника, остеосаркомы, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака легких, синовиальной карциномы, рака поджелудочной железы, саркомы, глиомы, рака головы и шеи, рака желудка, рака печени и других карцином. В предпочтительных вариантах осуществления цитотоксический конъюгат содержит анти-ЕрйА2 антитело и цитотоксическое средство. В более предпочтительных вариантах осуществления цитотоксический конъюгат представляет собой конъюгат гуманизированное 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-М и Ер11А2-\2 антитело-ЭМ1, гуманизированное 37.3Ό7, 37.1Е5,
- 3 020324
53.2Н11, Ερ1ιΛ2-Ν1 и Ερ1ιΛ2-Ν2 антитело-БМ4, конъюгат гуманизированное 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ερ1ιΛ2-Ν1 и Ερ1ιΛ2-Ν2 антитело-таксан или конъюгат гуманизированное 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ερ1ιΛ2-Ν1 и Ερ1ιΛ2-Ν2 антитело-производное томеймицина, и конъюгат вводят совместно с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентами.
В другом аспекте изобретения анти-ЕрйА2 антитела применяют для выявления белка Ερ1ιΑ2 в биологическом образце. В предпочтительном варианте осуществления указанные антитела используют для определения уровней Ер11А2 в опухолевой ткани.
Настоящее изобретение также относится к набору, включающему анти-ЕрйА2 антитело или конъюгат анти-Ер11А2 антитело-цитотоксическое средство и инструкцию по применению. В предпочтительных вариантах осуществления анти-ЕрйА2 антитела представляют собой гуманизированные антитела 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 и Ер11А2-№. цитотоксическое средство представляет собой мейтанзиновое соединение, такое как БМ1 или БМ4, таксан, производное лептомицина или производное томеймицина, а инструкции относятся к применению конъюгатов в лечении субъекта, страдающего от рака. Набор может также включать компоненты, необходимые для приготовления фармацевтически приемлемого препарата, такие как разбавитель, в случае, если конъюгат находится в лиофилизированном состоянии или в концентрированной форме, а также для введения препарата.
Если не указано особо, все литературные источники и патенты, цитированные в данном описании, включены в него посредством ссылок.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен анализ методом РАС8-анализа специфического связывания анти-ЕрйА2 антител с клетками, сверхэкспрессирующими Ер11А2 человека (клетки 300-19/йи-ЕрйА2). На фиг. 1А представлены данные для антитела 37.3Ό7, на фиг. 1В - для антитела 37.1Р5 и на фиг. 1С - для антитела 53.2Н11, соответственно.
На фиг. 2 представлено специфическое связывание очищенного антитела 37.3Ό7 с клетками ВхРС3 рака поджелудочной железы человека, клетками МБА-МВ-231 рака молочной железы человека и клетками НТ-29 рака толстой кишки человека. Представлены гистограммы РАС8-анализа.
На фиг. 3 представлены кривые связывания для антител 37.3Ό7 (фиг. 3А), 37.1Р5 (фиг. 3В) и 53.2Н11 (фиг. 3С), полученные с мышиными клетками 300-19, сверхэкспрессирующими Ер11А2 человека (300-19/йи-ЕрйА2).
На фиг. 4 представлено специфическое связывание очищенных антител 37.3Ό7 и 53.2Н11 с клетками, сверхэкспрессирующими Ер11А2. Представлены гистограммы РАС8-анализа. На фиг. 4А представлены данные для клеток, сверхэкспрессирующих мышиный Ер11А2 (300-19/ши-ЕрйА2), и на фиг. 4В представлены данные для клеток, сверхэкспрессирующих крысиный Ер11А2 (300-19/га(-Ер1тА2).
На фиг. 5А представлено специфическое связывание очищенных антител 37.3Ό7, 37.1Р5 и 53.2Н11 с эпителиальными клетками почки обезьяны УЕРО. Представлены гистограммы РАС8-анализа.
На фиг. 5В представлены кривые связывания для антител 37.3Ό7, 37.1Р5 и 53.2Н11, полученные с эпителиальными клетками почки обезьяны УЕКО.
На фиг. 6 показано ингибирование антителами 37.3Ό7, 37.1Р5 и 53.2Н11 связывания биотинилированного эфрина А1 с клетками МБА-МВ-231 рака молочной железы человека.
На фиг. 7А показано ингибирование антителами 37.3Ό7 и 37.1Р5 стимулированного эфрином А1 фосфорилирования Ер11А2 в клетках МБА-МВ-231 молочной железы.
На фиг. 7В показано ингибирование антителами 37.3Ό7 и 53.2Н11 стимулированного эфрином А1 фосфорилирования Ер11А2 в клетках МБА-МВ-231 молочной железы.
На фиг. 7С показано ингибирование антителами 37.3Ό7 и 37.1Р5 стимулированного эфрином А1 фосфорилирования Ак1 в клетках СРРАС-1 поджелудочной железы.
На фиг. 8А и В показано стимулирование фосфорилирования Ер11А2 эфрином А1 и отсутствие стимулирования фосфорилирования Ер11А2 антителами 37.3Ό7, 37.1Р5 и 53.2Н11 в клетках МБА-МВ-231 молочной железы.
На фиг. 9А-9Б показано ингибирование стимулированных сывороткой роста и выживания клеток НТ-29 толстой кишки (9А), клеток ЬоУо толстой кишки (9В), клеток СРРАС-1 поджелудочной железы (9С) и клеток ИАСС-257 меланомы (9Ό) антителами 37.3Ό7 и 53.2Н11.
На фиг. 10А показано дозозависимое ингибирование стимулированного сывороткой роста клеток ВхРС3 поджелудочной железы антителом 37.3Ό7.
На фиг. 10В показано дозозависимое ингибирование стимулированного сывороткой роста клеток ЬоУо толстой кишки антителом 53.2Н11.
На фиг. 10С показано дозозависимое ингибирование стимулированного ЕСР роста клеток ЬоУо толстой кишки антителом 53.2Н11.
На фиг. 11А представлена кривая связывания антитела 37.3Ό7 с клетками НИУЕС.
На фиг. 11В представлена кривая связывания антитела 37.1Р5 с клетками НИУЕС.
На фиг. 12 показано ингибирование стимулированного УЕСР роста и выживания клеток НИУЕС антителом 37.3Ό7.
На фиг. 13 показано ингибирование антителом 37.3Ό7 индуцированного УЕСР фосфорилирования
- 4 020324
Лк1 в клетках НИУЕС.
На фиг. 14 показан эффект воздействия антителом 37.3Ό7 на рост ксенотрансплантата рака толстой кишки НТ-29 в мышах. Эффект сравнивается с таковым для анти-ЕСРК антитела и контрольного не связывающегося антитела 1дС1.
На фиг. 15А показано ингибирование роста клеток РС3 опухоли предстательной железы с помощью йи37.3Б7-§РБВ-ОМ4.
На фиг. 15В показано ингибирование роста клеток РС3 опухоли предстательной железы с помощью йи53.2Н11-§РБВ-ОМ4.
На фиг. 16А показан эффект воздействия Ηπ37.3Ό7-8ΡΌΒ-ΌΜ4 на рост ксенотрансплантата опухоли молочной железы ΜΌΑ-ΜΒ-231 у мышей.
На фиг. 16В показан эффект воздействия Ηυ53.2Η11-8ΡΌΒ-ΌΜ4 на рост ксенотрансплантата опухоли молочной железы ΜΌΑ-ΜΒ-231 у мышей.
Подробное описание изобретения
В данном описании предложены новые средства, способные специфически связывать рецепторы ΕρΙιΑ и вызывать антагонизм указанных рецепторов. В частности, авторы настоящего изобретения открыли новые антитела, которые специфически связываются с рецепторами ΕρΙιΑ на клеточной поверхности. В то время как известные ранее антитела, которые специфически связывают рецептор ΕρΙιΑ. также активируют его даже в отсутствие его лигандов, антитела или фрагменты по настоящему изобретению предпочтительно лишены любой агонистической активности. С другой стороны, они обладают уникальной способностью ингибировать клеточные функции рецептора даже в присутствии его лигандов, свойством, которое полностью отсутствует у известных ранее Ер11Л2-связывающих антител. Более того, антагонистические антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению ингибируют рост и/или миграцию опухолевых клеток человека, и/или ангиогенез, три свойства, абсолютно неожиданные, принимая во внимание известный уровень техники (Ьапбеп, С.К с1 а1., 2005, Ехрей. Ορίη. ТНег. Тагде18, 9 (6): 11791187, νθ 01/12172, νθ 2004/014292, νθ 2004/092343).
Как используется в данном описании, термин рецептор Ερίι означает тирозинкиназу, принадлежащую к семейству рецепторов Ερίι (обзор в Раэдиак, Е.В. е1 а1., 2005, №1Шге Веук\\ъ Μο1. Се11 ΒίοΙ., 6, 462-475). Семейство рецепторов Ερίι класса А или рецепторы ΕρΗΑ, как используется в данном описании, предпочтительно взаимодействуют с гликозилфосфатидилинозитол (СР1)-связанными лигандами (подкласса эфрина А, который в настоящее время включает пять лигандов). Специфические рецепторы ΕρΙιΑ включают: Ερ1ιΑ1 (также называемый Ερίι и ΕκΕ), Ερ1ιΑ2 (также называемый ΕοΕ, тΕск, Μук2, 8ек2), Ερ1ιΑ3 (также называемый Нек, Μек4, Туго4 и Сек4), Ερ1ιΑ4 (также известный как Нек8, 8ек1, Туго1 и Сек8), Ερ1ιΑ5 (также называемый Нек7, ΒκΕ, ΕΗΚ1, Рек7 и Сек7), Ερ1ιΑ6 (также называемый Η1Ε11Ε2 и Ε11Ε2), Ερ1ιΑ7 (иначе называемый Нек11, Μ6Ε1, Ε№, Ε11Ε3) и Ερ1ιΑ8 (также называемый Εек и тΕек), а также их существующие в природе варианты. Предпочтительным рецептором Ερίι в данном описании является рецептор ΕρΗΑ2, обладающий, например, аминокислотной последовательностью под номерами доступа в СепЬапк ΝΜ_004431 (человеческий ΕρΗΑ2), ΝΜ_010139 (мышиный Ερ1ιΑ2) или ΝΧΜ_345596 (крысиный Ερ1ιΑ2). Термин лиганд Ερίι, как используется в данном описании, означает белок, который связывает и необязательно активирует (например, стимулирует его аутофосфорилирование) рецептор Ερίι. В данном описании предпочтительным лигандом Ερίι является эфрин А1, который связывается с рецептором Ερ1ιΑ2 и обладает, например, аминокислотной последовательностью под номером достура в СепЬапк ΝΜ_004428 (человеческий эфрин А1).
Термин антагонист, как используется в данном описании, означает молекулу, которая способна ингибировать одну или более биологических активностей молекулы-мишени, такой как рецептор ΕρΙιΑ. Антагонисты могут действовать, препятствуя связыванию рецептора с лигандом и наоборот, уменьшая фосфорилирование Ερ1ιΑ2 и/или выводя из строя, либо уничтожая клетки, которые были активированы лигандом. Антагонисты могут полностью блокировать взаимодействия рецептор-лиганд или могут существенно уменьшать такие взаимодействия. Все подобные особенности вмешательства со стороны антагониста следует считать эквивалентными для целей данного изобретения. Таким образом, в объем изобретения входят антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с рецептором ΕρΙιΑ, лигандом Ερίι или комплексом рецептора Ερίι и лиганда Ερίι: варианты, отличающиеся по аминокислотным последовательностям, или производные рецептора ΕρΙιΑ или лиганда ΕρΙιΑ, которые препятствуют взаимодействию между рецептором ΕρΙιΑ и лигандом ΕρΙιΑ: растворимый рецептор ΕρΙιΑ или растворимый лиганд ΕρΙιΑ, необязательно слитые с гетерологичной молекулой, такой как область иммуноглобулина (например, иммуноадгезин): комплекс, включающий рецептор ΕρΙιΑ, связанный с лигандом ΕρΙιΑ: пептиды с синтетической или природной последовательностью, которые связываются с рецептором ΕρΙιΑ или лигандом ΕρΙιΑ.
Термин агонист, как используется в данном описании, означает любое соединение, включая белок, полипептид, пептид, антитело, фрагмент антитела, конъюгат, большую молекулу, малую молекулу, способное активировать одну или более биологических активностей молекулы-мишени. Агонисты ΕρΙιΑ действуют, стимулируя фосфорилирование белка, тем самым запуская процесс деградации указанного
- 5 020324 белка.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится, среди прочих отличительных признаков, к анти-ЕрНА моноклональным антителам, анти-ЕрНА гуманизированным антителам, а также фрагментам анти-ЕрНЛ антител. Все антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению разработаны для специфического распознавания и связывания рецептора ЕрНА2 и действуют как антагонисты рецептора ЕрНА2. Кроме того, антагонистические антитела и фрагменты антител по изобретению обладают уникальными свойствами, будучи способными ингибировать рост опухолевых клеток человека и/или миграцию метастатических раковых клеток, и/или ангиогенез.
Предпочтительный рецептор ЕрНА, связываемый антагонистическими антителами и фрагментами антител по изобретению, представляет собой рецептор ЕрНА2. Человеческий ЕрНА2 является предпочтительным рецептором ЕрНА2.
Рецептор ЕрНА2 принадлежит к семейству рецепторов, у которых фосфорилирование цитоплазматического концевого сегмента возрастает после связывания лиганда для взаимодействия с множеством регулирующих и сигнальных белков, что приводит к активации различных клеточных сигнальных каскадов реакций в нисходящем направлении (Ки11апбег, К. апб ΚΙθίη, К., 2002, №Шге Рсу1С\\'5 Мо1. Се11 ΒίοΙ., 3: 475-486, Ыогеп, Ν.Κ. апб Ра8диа1е, Е. В., 2004, Се11 ЦдпаК 16: 655-666). Как используется в данном описании, термин опосредованная ЕрНА2 передача сигнала означает все клеточные события, которые происходят в ответ на связывание лиганда с ЕрНА2. В то время как антитела, раскрытые в документах известного уровня техники, действуют как агонисты рецептора ЕрНА2 и, в частности, увеличивают фосфорилирование по остаткам тирозина белка ЕрНА2, антитела и фрагменты антител по изобретению предпочтительно лишены любых подобных агонистических свойств. В частности, они не способны сами стимулировать фосфорилирование ЕрНА2.
С другой стороны, данное изобретение относится к первым подлинно антагонистическим антиЕрНА2 антителам. В одном варианте осуществления антитела и фрагменты антител по изобретению способны ингибировать связывание лиганда с рецептором ЕрНА. В предпочтительном варианте осуществления связывание эфрина А1 с ЕрНА2 предотвращают антитела и их фрагменты, предложенные по данному изобретению. Примечательно, что в другом варианте осуществления антитела и фрагменты антител по изобретению способны ингибировать фосфорилирование по остаткам тирозина рецептора ЕрНА2, даже в присутствии эфрина А1. Более того, указанные антитела и их фрагменты способны ингибировать опосредованную ЕрНА2 передачу сигнала. В частности, зависимое от эфрина А1 фосфорилирование Ак1 можно предотвращать с помощью антител и фрагментов антител по изобретению.
Антитела
Термин антитело в данном описании используется в самом широком смысле и, в особенности, охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела) любого изотипа, такие как 1дС, 1дМ, 1дА, 1дЭ и 1дЕ, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела, химерные антитела и фрагменты антител. Антитело, способное вступать в реакцию с определенным антигеном, можно получать рекомбинантными методами, такими как селекция библиотек рекомбинантных антител в фаге или схожих векторах, либо иммунизируя животное антигеном или кодирующей антиген нуклеиновой кислотой.
Типичное антитело состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, которые соединены дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область. Каждая вариабельная область содержит три сегмента, называемые определяющие комплементарность области (СОК) или гипервариабельные области, которые в первую очередь ответственны за связывание эпитопа антигена. Обычно их называют СОРТ, СЭК2 и СЭК3. пронумерованные последовательно, начиная с Ν-конца. Более консервативные участки вариабельных областей называются каркасные области.
Как используется в данном описании, Ун или УН означает вариабельную область иммуноглобулиновой тяжелой цепи антитела, включая тяжелую цепь фрагмента Ρν, βοΡν, 6δΡν, РаЬ, РаЬ' или Р(аЬ')2. Обозначение Уь или УЪ относится к вариабельной области иммуноглобулиновой легкой цепи антитела, включая легкую цепь фрагмента Ρν, βοΡν, 6δΡν, РаЬ, РаЬ' или Р(аЬ')2.
Поликлональное антитело представляет собой антитело, которое было получено в числе прочих или в присутствии одного или большего количества других, не идентичных антител. Как правило, поликлональные антитела получают из В-лимфоцитов в присутствии нескольких других В-лимфоцитов, продуцирующих не идентичные антитела. Обычно поликлональные антитела получают непосредственно от иммунизированного животного.
Моноклональное антитело, как используется в данном описании, представляет собой антитело, полученное из популяции в основном гомогенных антител, то есть антитела, образующие данную популяцию, являются по существу идентичными, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Данные антитела направлены против одного эпитопа и вследствие этого являются высоко специфическими.
Эпитоп представляет собой участок антигена, с которым связывается антитело. Он может быть
- 6 020324 образован смежными остатками или несмежными остатками, расположенными в непосредственной близости друг от друга при укладке антигенного белка. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, обычно сохраняются в условиях денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные несмежными аминокислотами, обычно утрачиваются в указанных условиях.
Как используется в данном описании, термин Кс означает константу диссоциации при взаимодействии конкретное антитело/антиген.
В основе настоящего изобретения лежат мышиные анти-ЕрйЛ2 антитела, в данном описании обозначенные 37.3Ό7, 37.1Б5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 и Ερ1ιΑ2-Ν2. которые полностью охарактеризованы в отношении аминокислотных последовательностей как легких, так и тяжелых цепей, идентификации СЭЯ, идентификации поверхностных аминокислот, а также способов их экспрессии в рекомбинантной форме. Первичные аминокислотные последовательности и последовательности ДНК легких и тяжелых цепей антител 37.3Ό7, 37.1Б5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 и ΕρΗΑ2-Ν2, а также гуманизированных вариантов, раскрыты в данном описании.
Антитела 37.3Ό7, 37.1Б5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 и Ερ1ιΑ2-Ν2 получены с помощью гибридом, соответственно обозначенных 37.3Ό7, 37.1Б5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 и ΕρΗΑ2-Ν2, и депонированы в соответствии с Будапештской конвенцией 16 июня 2006 г. и 3 мая 2007 г., соответственно, в Американской коллекции типовых культур, 10801 Ишуегкйу Вои1еуагй, Мапаккак, Уйщша 20110-2209, И8А, под номерами доступа РТА-7660, РТА-7661, РТА-7662, РТА-8407 и РТА-8408, соответственно.
Объем настоящего изобретения не ограничен антителами и фрагментами, обладающими данными последовательностями.
Напротив, все антитела и фрагменты, которые специфически связываются с рецептором Ер11А2 и противодействуют биологической активности рецептора, но которые лишены агонистической активности, входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, антитела и фрагменты антител могут отличаться от антитела 37.3Ό7, 37.1Б5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 и ΕρΗΑ2-Ν2, либо от гуманизированных производных, по аминокислотным последовательностям их каркасной структуры, СЭЯ, легкой цепи и тяжелой цепи, и все-таки входить в объем настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления данное изобретение относится к антителам или их эпитопсвязывающим фрагментам, содержащим одну или более СЭЯ, обладающих аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 и 72.
В предпочтительном варианте осуществления антитела по изобретению содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, и указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 61, 62, 63, 67, 68 и 69, и указанная легкая цепь содержит три последовательные СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 64, 65, 66, 70, 71 и 72.
В более предпочтительном варианте осуществления антитела по изобретению содержат три СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:1, 2, 3, 4, 5 и 6. В еще более предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело 37.3Ό7, которое содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, и указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕО ГО ΝΟ:1, 2 и 3, и указанная легкая цепь содержит три последовательные СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕО ГО ΝΟ:4, 5 и 6.
В другом более предпочтительном варианте осуществления антитела по изобретению содержат три СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:7, 8, 9, 10, 11 и 12. В еще более предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело 37.1Б5, которое содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, и указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕО ГО ΝΟ:7, 8 и 9, и указанная легкая цепь содержит три последовательные СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕО ГО ΝΟ:10, 11 и 12.
В другом более предпочтительном варианте осуществления антитела по изобретению содержат три СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:13, 14, 15, 16, 17 и 18. В еще более предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело 53.2Н11, которое содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, и указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕО ГО ΝΟ:13, 14 и 15, и указанная легкая цепь содержит три последовательные СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕО ГО ΝΟ:16, 17 и 18.
В другом более предпочтительном варианте осуществления антитела по изобретению содержат три СЭЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:61, 62, 63, 64, 65 и 66. В еще более предпочтительном варианте осуществления предлагают анти
- 7 020324 тело Ερ1ιΛ2-Ν1. которое содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, и указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СЭВ обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕЦ ΙΌ N0:61, 62 и 63, и указанная легкая цепь содержит три последовательные СОЕ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕЦ ΙΌ N0:64, 65 и 66.
В другом более предпочтительном варианте осуществления антитела по изобретению содержат три СОВ, обладающие аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:67, 68, 69, 70, 71 и 72. В еще более предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело ΕρΗΆ2-Ν2, которое содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, и указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СОВ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕЦ ΙΌ N0:67, 68 и 69, и указанная легкая цепь содержит три последовательные СОВ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ЕЦ ΙΌ N0:70, 71 и 72.
В другом варианте осуществления антитела по изобретению содержат νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:20, 22, 24, 74 и 76. В предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело 37.3Ό7, содержащее νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:20. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело 37.1Е5, содержащее νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:22. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело 53.2Н11, содержащее νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:24. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело ЕрйА2-№, содержащее νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:74. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело ЕрйЛ2-№, содержащее νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:76.
В другом предпочтительном варианте осуществления антитела по изобретению содержат Уь, обладающую аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:26, 28, 30, 78 и 80. В предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело 37.3Ό7, содержащее Уъ, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:26. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело 37.1Е5, содержащее Уъ, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:28. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело 53.2Н11, содержащее Уь, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:30. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело ЕрйЛ2-№, содержащее Уь, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:78. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают антитело ЕрНЛЗ-Ш, содержащее Уь, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:80.
Гуманизированные или поверхностно-модифицированные антитела 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ер11Л2-Ю и Ер11Л2А'2
Как используется в данном описании, термин гуманизированное антитело означает химерное антитело, которое содержит минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, отличного от человеческого. Химерное антитело, как используется в данном описании, представляет собой антитело, в котором константная область или ее часть подвергнута изменению, замене или обмену таким образом, что вариабельная область присоединена к константной области других видов, либо принадлежащей к другому классу или подклассу антител. Химерное антитело также означает антитело, в котором вариабельная область или ее часть подвергнута изменению, замене или обмену таким образом, что константная область присоединена к вариабельной области других видов, либо принадлежащей к другому классу или подклассу антител.
Целью гуманизации является снижение иммуногенности ксеногенного антитела, такого как мышиное антитело, для введения человеку, но при этом с сохранением полной антигенсвязывающей активности и специфичности антитела. Гуманизированные антитела, или антитела, адаптированные, чтобы не отторгаться другими млекопитающими, можно получать с помощью различных методик, таких как поверхностная модификация и пересадка СОВ. Как используется в данном описании, в методике поверхностного модифицирования используют сочетание молекулярного моделирования, статистического анализа и мутагенеза для изменения отличных от СОВ поверхностей вариабельных областей антитела с тем, чтобы они напоминали поверхности известных антител целевого хозяина.
Стратегии и способы поверхностной модификации антител, а также другие способы снижения иммуногенности антител в отличающемся хозяине описаны в патенте США №5639641, полное содержание которого включено в данное описание посредством ссылки. Кратко, в предпочтительном способе (1) производят выравнивания по позициям пула вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антител для получения набора экспонированных на поверхности позиций каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи, где выравниваемые позиции для всех вариабельных областей являются по меньшей мере примерно на 98% идентичными, (2) набор экспонированных на поверхности аминокислотных остатков
- 8 020324 каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи определяют для антитела грызуна (или фрагмента антитела), (3) определяют набор экспонированных на поверхности аминокислотных остатков каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи, который в наибольшей степени идентичен набору экспонированных на поверхности аминокислотных остатков грызуна, (4) набор экспонированных на поверхности аминокислотных остатков каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи, определенный на этапе (2), замещают набором экспонированных на поверхности аминокислотных остатков каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи, определенным на этапе (3), за исключением тех аминокислотных остатков, которые находятся в пределах 5 А от любого атома любого остатка определяющих комплементарность областей антитела грызуна, и (5) получают гуманизированное антитело грызуна, обладающее специфичностью связывания.
Антитела можно гуманизировать, применяя разнообразные методики, включая пересадку СЭЯ (ЕР 0239400, νθ 91/09967, патенты США №5530101 и 5585089), маскирование или поверхностную модификацию (ЕР 0592106, ЕР 0519596, Рак1ап Е.А., 1991, Мо1еси1аг 1ттипо1оду 28(4/5): 489-498, 81икшска С.М. е! а1., 1994, Рго1ет Епдтееппд 7(6): 805-814, Яодлкка М.А. е! а1., 1994, Ргос. №11. Асак. 8сЕ И.8.А., 91:969-973), а также перетасовку цепи (патент США №5565332). Человеческие антитела можно получать с помощью разнообразных методов, известных в данной области, включая методы фагового дисплея. См. также патенты США №4444887, 4716111, 5545806 и 5814318, а также публикации международных патентных заявок номера νθ 98/46645, νθ 98/50433, νθ 98/24893, νθ 98/16654, νθ 96/34096, νθ 96/33735 и νθ 91/10741 (полное содержание указанных литературных источников включено посредством ссылок).
Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам или их фрагментам, которые распознают рецептор ЕрйА2 и действуют как антагонисты. В другом варианте осуществления гуманизированные антитела или их эпитопсвязывающие фрагменты обладают дополнительной способностью ингибировать рост раковых клеток, экспрессирующих рецептор Ер11А2. В следующем варианте осуществления гуманизированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент обладает дополнительной способностью ингибировать миграцию метастатических раковых клеток, экспрессирующих рецептор ЕрйА2.
Предпочтительным вариантом осуществления такого гуманизированного антитела является гуманизированное антитело 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 или Ер11А2-№, либо его эпитопсвязывающий фрагмент.
В более предпочтительных вариантах осуществления предлагают поверхностномодифицированные или гуманизированные варианты антител 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 и ЕрйА2-Ы2, где экспонированные на поверхности остатки антитела или его фрагментов заменены как в легкой, так и в тяжелой цепях, чтобы в большей степени напоминать поверхности известных человеческих антител. Гуманизированные антитела 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 и Ер11А2-№ или их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению обладают улучшенными свойствами. Например, гуманизированные антитела 37.3Ό7, 37.1Е5 и 53.2Н11 или их эпитопсвязывающие фрагменты специфически распознают рецептор Ер11А2. Более предпочтительно гуманизированные антитела 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 и ЕрйА2-Ы2 или их эпитопсвязывающие фрагменты обладают дополнительной способностью ингибировать рост клеток, экспрессирующих рецептор Ер11А2.
Гуманизированные варианты антител 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 и Ер11А2-№ также полностью охарактеризованы в данном описании в отношении соответствующих им аминокислотных последовательностей вариабельных областей как легкой, так и тяжелой цепи, последовательностей ДНК генов вариабельных областей легких и тяжелых цепей, идентификации СЭЯ, идентификации их поверхностных аминокислот и раскрытия способов для их экспрессии в рекомбинантной форме. Однако объем настоящего изобретения не ограничен антителами и фрагментами, обладающими данными последовательностями. Напротив, все антитела и фрагменты, которые специфически связываются с рецептором Ер11А2. включены в настоящее изобретение. Предпочтительно антитела и фрагменты, которые специфически связываются с рецептором Ер11А2, проявляют антагонизм с биологической активностью рецептора. Более предпочтительно такие антитела, дополнительно, по существу лишены агонистической активности. Таким образом, антитела и эпитопсвязывающие фрагменты антител по настоящему изобретению могут отличаться от антитела 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 или Ер11А2-№ или его гуманизированных производных по аминокислотным последовательностям их каркасной структуры, СЭЯ и/или легкой цепи и тяжелой цепи, и все-таки входить в объем настоящего изобретения.
СЭЯ антител 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 или Ер11А2-№ идентифицированы при помощи моделирования, и их молекулярные структуры прогнозируемы. Кроме того, хотя СЭЯ являются важными для распознавания эпитопа, они не являются незаменимыми для антител и фрагментов по изобретению. Соответственно, предлагают антитела и фрагменты, которые обладают улучшенными свойствами, полученными, например, при помощи созревания афинности антитела по настоящему изобретению. Гены гаметического типа для 1дУк и 1к легкой цепи мыши, а также гены гаметического типа для 1дУЪ и Л1 тяжелой цепи, производными от которых, очевидно, являются 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрйА2-Ы1 и
- 9 020324
Ερ1ιΛ2-Ν2. были идентифицированы, как раскрыто в разделе экспериментальных примеров. Такие последовательности генов гаметического типа полезны для выявления соматических мутаций в антителах, в СЭВ включительно.
Последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антител 37.3Ό7, 37.1Т5, 53.2Н11, Ερ1ιΛ2-Ν1 и Ερ1ιΛ2-Ν2. а также последовательности их СОЕ ранее не были известны и опубликованы в данной заявке. Подобную информацию можно использовать для получения гуманизированных вариантов антител 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ερ1ιΛ2-Ν1 и Ερ1ιΛ2-Ν2. Данные гуманизированные антиΕρΙιΛ антитела или их производные могут также быть использованы в качестве связывающего клетки средства по настоящему изобретению.
Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение относится к гуманизированным антителам или их эпитопсвязывающим фрагментам, содержащим одну или более СОЯ, обладающих аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 и 72. В предпочтительном варианте осуществления гуманизированные антитела по изобретению содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, и указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 61, 62, 63, 67, 68 и 69, и указанная легкая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 64, 65, 66, 70, 71 и 72. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления гуманизированные антитела по изобретению содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, представленными 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:1, 2 и 3, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, представленными 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:4, 5 и 6. В другом дополнительном предпочтительном варианте осуществления гуманизированные антитела по изобретению содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, представленными 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:7, 8 и 9, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, представленными 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:10, 11 и 12. В другом дополнительном предпочтительном варианте осуществления гуманизированные антитела по изобретению содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, представленными 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:13, 14 и 15, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, представленными 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:16, 17 и 18. В другом более предпочтительном варианте осуществления гуманизированные антитела по изобретению содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:61, 62 и 63, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:64, 65 и 66. В другом более предпочтительном варианте осуществления гуманизированные антитела по изобретению содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:67, 68 и 69, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные СОЯ, обладающие аминокислотными последовательностями, состоящими из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:70, 71 и 72.
В одном варианте осуществления данное изобретение относится к гуманизированным антителам или их фрагментам, которые содержат νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43 и 45. В предпочтительном варианте осуществления предлагают гуманизированное антитело 37.1Ό7, которое содержит νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:32, 34 и 36. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают гуманизированное антитело 37.1Р5, которое содержит νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:37 и 38. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают гуманизированное антитело 53.2Н11, которое содержит νΗ, обладающую аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из δΕΟ ΙΌ ΝΟ:40, 42, 43 и 45.
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к гуманизированным антителам или их фрагментам, которые содержат обладающую аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:47, 48, 49, 50 и 52. В предпочтительном варианте осуществления предлагают гуманизированное антитело 37.1Ό7, которое содержит обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:47. В другом предпочтительном варианте осуществления предлагают гуманизированное антитело 37.1Р5, которое содержит У^ обладающую аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:48, 49 и 50. В другом предпочти
- 10 020324 тельном варианте осуществления предлагают гуманизированное антитело 53.2Н11, которое содержит Уь, обладающую аминокислотной последовательностью, состоящей из ЗЕО ГО N0:52.
Гуманизированные антитела 37.3Ό7 и их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут также содержать замены аминокислотных остатков в легкой и/или тяжелой цепи на одной или большем числе позиций, маркированные серым остатки в табл. 1А и 1В, которые представляют собой мышиные поверхностные остатки каркаса, претерпевшие изменение с исходного мышиного остатка на соответствующий поверхностный остаток каркаса в человеческом антителе, 28Е4. Помеченные звездочкой (*) остатки в табл. 1В соответствуют мышиным обратным мутациям в вариантах тяжелой цепи гуманизированного 37.3Ό7 (8Е0 ГО N0:34 и ЗЕО ГО N0:36). Остатки для обратных мутаций являются проксимальными относительно СЭР и были выбраны, как описано в патенте США №5639641, или по аналогии с выбором остатков, который в предыдущих попытках гуманизации привел к снижению афинности связывания антигена (Водикка с1 а1., 1996, Рго1еш Епд.; 9(10): 895-904, публикации патентных заявок США 2003/0235582 и 2005/0118183).
Аналогичным образом, гуманизированные антитела 37.1Е5, 53.2Н11, Ερ1ιΛ2-Ν1 и Ερ1ιΛ2-Ν2 и их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут также содержать замены аминокислотных остатков в легкой и/или тяжелой цепи.
Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева
Предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие анти-ЕрЬА2 антитела по изобретению. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую и/или легкую цепь антиЕр11А2 иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления одна нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь анти-ЕрЬА2 иммуноглобулина, и другая молекула нуклеиновой кислоты кодирует легкую цепь анти-ЕрЬА2 иммуноглобулина.
В другом аспекте данного изобретения предлагают полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, обладающие аминокислотной последовательностью, выбранной из группы 8Е0 ГО N0:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 78 и 80. В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по изобретению выбирают из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0:19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 39, 41, 44, 46, 51, 73, 75, 77 и 79. Изобретение не ограничивается указанными полинуклеотидами в чистом виде, но также включает все полинуклеотиды, характеризующиеся по меньшей мере 80% идентичностью с указанными полинуклеотидами.
Изобретение относится к векторам, содержащим полинуклеотиды по изобретению. В одном варианте осуществления вектор содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь анти-ЕрЬА2 иммуноглобулина. В другом варианте осуществления указанный полинуклеотид кодирует легкую цепь антиЕр11А2 иммуноглобулина. Изобретение также относится к векторам, содержащим молекулы полинуклеотида, кодирующие слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды.
Для того чтобы экспрессировать тяжелую и/или легкую цепь анти-ЕрЬА2 антител по изобретению, полинуклеотиды, кодирующие указанные тяжелые и/или легкие цепи, встраивают в экспрессионные векторы таким образом, что гены являются функционально связанными с транскрипционными и трансляционными последовательностями. Экспрессионные векторы включают плазмиды, Υ АС, космиды, ретровирусы, производные от ЕВУ эписомы, а также все другие векторы, которые, как известно квалифицированному специалисту в данной области, удобно использовать для гарантированной экспрессии указанных тяжелых и/или легких цепей. Специалист в данной области понимает, что полинуклеотиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи, могут быть клонированы в различные векторы или в один и тот же вектор. В предпочтительном варианте осуществления указанные полинуклеоитды клонированы в один и тот же вектор.
Полинуклеотиды по изобретению и векторы, содержащие данные молекулы, можно использовать для трансформации подходящей клетки-хозяина млекопитающего, либо любого другого типа клеткихозяина, известного специалисту в данной области. Трансформацию можно проводить любым из известных способов введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области и включают опосредованную декстраном трансформацию, преципитацию с фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида в липосомы, биолистические инъекции и прямые микроинъекции ДНК в ядра.
Фрагменты антител
Антитела по настоящему изобретению включают как полноразмерные антитела, обсуждавшиеся выше, так и эпитопсвязывающие фрагменты. Как используется в данном описании, фрагменты антител включают любые части антитела, которые сохраняют способность связывать эпитоп, распознаваемый полноразмерным антителом, обычно называемые эпитопсвязывающими фрагментами. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2, Еб, одноцепочечные Εν (δοΕν), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными мостиками Ενκ (ά&Εν), и фрагменты, содержащие либо Уь, либо Ун-область. Эпитопсвязывающие фрагменты, включая одноцепочечные антитела, могут
- 11 020324 включать вариабельную область(ти) саму по себе или в сочетании с полным или частичным вариантом перечисленного далее: шарнирная область, домены Сн1, Сн2 и Сн3.
Такие фрагменты могут содержать один или оба фрагмента ЕаЬ или фрагмент Е(аЬ')2. Предпочтительно фрагменты антитела содержат все шесть СОЯ полноразмерного антитела, хотя фрагменты, содержащие менее шести подобных областей, например, три, четыре или пять СОЯ, также являются функциональными. Далее, фрагменты могут представлять собой или сочетать в себе членов любого из следующих классов иммуноглобулинов: 1дС, 1дМ. 1дА, 1дО или 1дЕ, а также их подклассов.
Фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')2 можно получать протеолитическим расщеплением при помощи ферментов, таких как папаин (фрагменты ЕаЬ) или пепсин (фрагменты Е(аЬ')2).
Одноцепочечные ЕУк (ксЕук) фрагменты представляют собой эпитопсвязывающие фрагменты, которые содержат по меньшей мере один фрагмент вариабельной области тяжелой цепи антитела (Ун), связанный с по меньшей мере одним фрагментом вариабельной области легкой цепи антитела (Уъ). Линкер может представлять собой короткий гибкий пептид, выбранный так, чтобы гарантировать правильную трехмерную укладку областей (Уь) и (Ун), в то время как они связаны таким образом, чтобы сохранять специфичность связывания молекулы-мишени целого антитела, от которого происходит данный одноцепочечный фрагмент антитела. Карбоксильный конец последовательности (Уъ) или (Ун) может быть ковалентно присоединен к амино-концу комплементарной последовательности (Уъ) или (Ун).
Одноцепочечные фрагменты антител по настоящему изобретению содержат аминокислотные последовательности, обладающие по меньшей мере одной из вариабельных или определяющих комплементарность областей (СОЯ) полноразмерных антител, описанных в данном описании, однако лишенные некоторых или всех константных доменов таких антител. Данные константные домены не являются необходимыми для связывания антигена, однако представляют собой большую часть структуры полноразмерных антител. Вследствие этого, использование одноцепочечных фрагментов антител позволит преодолеть некоторые из проблем, связанных с применением антител, содержащих константный домен частично или полностью. Например, одноцепочечные фрагменты антител, как правило, свободны от нежелательных взаимодействий между биологическими молекулами и константной областью тяжелой цепи, либо от другой нежелательной биологической активности. Кроме того, одноцепочечные фрагменты антител значительно меньше, чем целые антитела, и вследствие этого могут обладать большей способностью проникать в капилляры, чем целые антитела, что позволяет одноцепочечным фрагментам антител локализовать и связывать центры связывания целевого антигена более эффективно. Кроме того, можно наладить относительно крупномасштабную продукцию фрагментов антител в прокариотических клетках, что облегчает их производство. Более того, относительно малые размеры одноцепочечных фрагментов антител делает менее вероятным развитие иммунного ответа у реципиента, чем в случае с полноразмерными антителами.
Одноцепочечные фрагменты антител можно получать молекулярным клонированием, с помощью библиотек фагового дисплея антител или аналогичных методик, хорошо известных квалифицированным специалистам в данной области. Данные белки можно получать, например, в эукариотических клетках или прокариотических клетках, включая бактерии. Эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно также получать, используя различные методы фагового дисплея, известные в данной области. В методах фагового дисплея функциональные домены антитела экспонированы на поверхности фаговых частиц, которые несут полинуклеотидные последовательности, кодирующие их. В частности, такие фаги можно использовать, чтобы экспонировать эпотопсвязывающие домены, экспрессированные из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши). Фаг, экспрессирующий эпитопсвязывающий домен, который связывает интересующее антитело, можно выбирать или идентифицировать при помощи антигена, например, используя меченый антиген, связанный или иммобилизованный на твердой поверхности или гранулах. Фаги, используемые в данных методах, обычно представляют собой нитчатые фаги, включая Гб и М13 связывающие домены, экспрессированные из фага с ЕаЬ, Εν или стабилизированными при помощи дисульфидных мостиков Εν-доменами антитела, рекомбинантно слитыми либо с фаговым геном III, либо с белком гена УШ.
Примеры методов фагового дисплея, которые можно использовать для получения эпитопсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, включают те, что описаны в Вппктап е1 а1., 1995, I. 1ттипо1. МеШобк, 182: 41-50, Атек е1 а1., 1995, I. 1ттипо1. МеШобк, 184: 177-186, КеШеЬогоидй е1 а1., 1994, Еиг. I. 1ттипо1., 24:952-958, Регк1с е1 а1., 1997, Оепе 187: 9-18, Вийоп е1 а1., 1994, Абνаηсеκ ίη 1ттипо1оду, 57: 191-280, РСТ заявке № РСТ/ОВ91/01134, РСТ публикациях АО 90/02809, АО 91/10737, АО 92/01047, АО 92/18619, АО 93/11236, АО 95/15982, АО 95/20401 и патентах США №5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108, полное содержание каждого из которых включено в данное описание посредством ссылок.
После выбора фага, области фага, кодирующие фрагменты можно выделять и использовать для получения эпитопсвязывающих фрагментов посредством экспрессии в выбранном хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии, с применением методики рекомбинантных ДНК, например, как описано подробно ниже. Например, можно также использовать методики для рекомбинантной продукции фрагментов ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2 при помощи способов, известных
- 12 020324 специалистам в данной области, таких как те, что описаны в РСТ публикации νΟ 92/22324, МиШпах е! а1., 1992, ВюТесНшдиек, 12(6): 864-869; 8аета1 е! а1., 1995, АЖЕ 34: 26-34; а также Вейег е! а1., 1988, δοίепсе, 240: 1041-1043, полное содержание указанных литературных источников включено посредством ссылок. Примеры методик, которые можно использовать для продуцирования одноцепочечных Ρν и антител, включают те, что описаны в патентах США №4946778 и 5258498; Ник!оп е! а1., 1991, Ме!Нобк ш Епхуто1оду 203: 46-88, 8йи е! а1., 1993, Ргос. Νη11. Асаб. 8с1. И.8.А., 90: 7995-7999, 8кегга е! а1., 1988, 8с1епсе, 240: 1038-1040.
Функциональные эквиваленты
В объем данного изобретения также включены функциональные эквиваленты анти-ЕрНА антитела и гуманизированного антитела против рецептора ЕрНА2. Термин функциональные эквиваленты охватывает антитела с гомологичными последовательностями, химерные антитела, искусственные антитела и модифицированные антитела, например, где каждый функциональный эквивалент охарактеризован по его способности связываться с рецептором ЕрНА2. Квалифицированный специалист в данной области понимает, что группа молекул, называемых фрагменты антитела, и группа, называемая функциональные эквиваленты, перекрываются. Способы получения функциональных эквивалентов известны специалистам в данной области и описаны, например, в РСТ заявке νΟ 93/21319, европейском патенте № ЕР 0239400, РСТ заявке νΟ 89/09622, европейском патенте № ЕР 0338745 и европейской патентной заявке ЕР 0332424, соответствующее полное содержание которых включено посредством ссылок.
Антитела с гомологичными последовательностями представляют собой такие антитела, аминокислотные последовательности которых обладают гомологией последовательностей с аминокислотной последовательностью анти-ЕрНА антитела и гуманизированного анти-ЕрНА антитела по настоящему изобретению. Предпочтительно гомология существует с аминокислотной последовательностью вариабельных областей анти-ЕрНА антитела и гуманизированного анти-ЕрНА антитела по настоящему изобретению. Гомология последовательности, применительно к аминокислотной последовательности в данном описании, определена как последовательность с по меньшей мере примерно 90, 91, 92, 93 или 94% гомологией последовательности, более предпочтительно с по меньшей мере примерно 95, 96, 97, 98 или 99% гомологией последовательности с другой аминокислотной последовательностью, как определено, например, методом поиска РА8ТА в соответствии с Реагкоп апб Ыртап, 1988, Ргос. Νη11. Асаб. 8сЕ И.8.А., 85: 2444-2448.
Химерное антитело представляет собой антитело, в котором различные части антитела происходят из различных видов животных. Например, антитело, обладающее вариабельной областью, происходящей из мышиного моноклонального антитела, в паре с константной областью человеческого иммуноглобулина. Способы получения химерных антител известны в данной области. См., например, Моткоп, 1985, 8с1епсе, 229: 1202, Οί е! а1., 1986, ВюТесНшдиек, 4: 214, Сййек е! а1., 1989, I. 1ттипо1. Ме!Нобк, 125: 191202; патенты США №5807715, 4816567 и 4816397, полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылок.
Гуманизированные формы химерных антител получают, вставляя определяющие комплементарность области, например, мышиного антитела, в человеческий каркасный домен, например, см. РСТ публикацию νθ 92/22653. Гуманизированные химерные антитела предпочтительно имеют константные области и вариабельные области за исключением определяющих комплементарность областей (СОК), происходящие, в основном или исключительно, из соответствующих областей антитела человека, и СОК, происходящие, в основном или исключительно, из млекопитающих, отличных от человека.
Искусственные антитела включают фрагменты ксЕу, диатела, триатела, тетратела и тги (см. обзоры νίπ^η О. апб М11к!ет, С, 1991, №!иге, 349: 293-299, Нибкоп, Р.Е, 1999, Сиггеп! Ортюп т 1ттипо1оду, 11: 548-557), каждое из которых обладает антигенсвязывающей способностью. В одноцепочечном фрагменте Ρν (ксЕу) домены Ун и антитела связаны гибким пептидом. Как правило, длина данного линкерного пептида составляет примерно 15 аминокислотных остатков. Если линкер намного короче, например, 5 аминокислот, образуются диатела, которые представляют собой двухвалентные димеры ксЕу. Если линкер укорочен до менее чем трех аминокислотных остатков, образуются трехмерные и тетрамерные структуры, которые называют триатела и тетратела. Наименьшей связывающей единицей антитела является СОК, как правило, СЭК2 тяжелой цепи, который обладает способностью к специфическому распознаванию и связыванию, достаточной, чтобы быть использованным самостоятельно. Такой фрагмент называют молекулярная распознающая единица или тги. Несколько подобных тги можно сшивать вместе при помощи коротких линкерных пептидов, образуя, таким образом, искусственный связывающий белок с более высокой авидностью, чем отдельная тги.
Функциональные эквиваленты согласно настоящему изобретению также включают модифицированные антитела, например, антитела, модифицированные ковалентным присоединением молекулы любого типа к антителу. Например, модифицированные антитела включают антитела, которые модифицированы, например, гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расще- 13 020324 плением, сшиванием с клеточным лигандом или другим белком, и так далее. Ковалентное присоединение не мешает антителу вызывать анти-идиотипический ответ. Такие модификации можно осуществлять известными способами, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и так далее. Кроме того, модифицированные антитела могут содержать одну или более неклассических аминокислот.
Функциональные эквиваленты можно получать путем взаимного обмена различных СЭР на различных цепях в различных каркасах. Так, например, различные классы антител являются возможными для данного набора СОВ путем замещения различных тяжелых цепей, посредством чего можно получать, например, 1дС1-4, 1дМ, ЦА1-2, 1дЭ, 1дЕ типы и изотипы антител. Аналогично, искусственные антитела в объеме данного изобретения можно получать, вставляя данный набор СОВ в полностью синтетический каркас.
Функциональные эквиваленты можно легко получать посредством мутаций, делеций и/или вставок в последовательностях вариабельной и/или константной области, которые примыкают к конкретному набору СОВ, используя широкое разнообразие способов, известных в данной области.
Фрагменты антител и функциональные эквиваленты по настоящему изобретению охватывают молекулы с детектируемой степенью связывания с ЕрЬА, при сравнении с антителом 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрЬА2-Ы1 или ЕрЬА2-Ы2. Детектируемая степень связывания включает все значения в диапазоне по меньшей мере 10-100%, предпочтительно по меньшей мере 50, 60 или 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95 или 99% связывающей способности мышиного антитела 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, ЕрЬА2-Ы1 или ЕрЬА2-Ы2 по отношению к ЕрЬА.
Усовершенствованные антитела
СЭР обладают первостепенной важностью для распознавания эпитопа и связывания антитела. Однако можно производить изменения в остатках, которые составляют СОВ, без отрицательного влияния на способность антитела распознавать и связывать родственный ему эпитоп. Например, можно осуществлять изменения, которые не влияют на распознавание эпитопа, но увеличивают афинность связывания антитела для эпитопа.
Таким образом, в объем настоящего изобретения также включены усовершенствованные варианты как мышиных, так и гуманизированных антител, которые также специфически распознают и связывают ЕрЬА, предпочтительно с повышенной афинностью.
Во многих исследованиях изучали эффекты от введения одного или более аминокислотных изменений на различных позициях в последовательности антитела, на основании знаний о первичной последовательности антитела, на его свойства, такие как связывание или уровень экспрессии (Уапд, ^.Р. е( а1., 1995, 1. Мо1. Вю1., 254: 392-403, Вабег, С. е1 а1., 1998, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8οΐ. И.8.А., 95: 8910-8915, УаидЬап, Т. 1. е( а1., 1998, №11иге Вю1есйпо1оду, 16: 535-539).
В данных исследованиях получали эквиваленты первичного антитела путем изменения последовательностей генов тяжелой и легкой цепей в СЦВ1, СЦВ2, СЭВ3 или каркасных областях с помощью таких методов, как опосредованный олигонуклеотидами направленный мутагенез, кассетный мутагенез, ошибочно-направленная ПЦР, перетасовка ДНК или штаммы-мутаторы Е. со11 (Уаидйап, Т.1. е( а1., 1998, Найте Вю1есЬпо1оду, 16: 535-539, Абеу, Ν.Β. е( а1., 1996, СЬар1ег 16, рр. 277-291, ίη РЬаде О1кр1ау о£ Рер11беь апб Рго1етк, Ебк. Кау, В.К. е( а1., Асабешю Ргекк). Данные способы изменения последовательности первичного антитела привели к повышенным уровням афинности вторичных антител (Огаш, Н. е( а1., 1992, Ргос. Ыаб. Асаб. 8сг И.8.А., 89: 3576-3580, Вобег, Е. Т. е1 а1., 2000, Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И.8.А., 97: 10701-10705, Оау1ек, 1. апб В1есЬтапп, Ь., 1996, 1ттипо1есйпо1ду, 2: 169-179, ТЬотркоп, 1. е( а1., 1996, 1. Мо1. Вю1., 256: 77-88, 8Ьой, М.К. е1 а1., 2002, 1. Вю1. СЬет., 277: 16365-16370, Еигика^а, К. е1 а1., 2001, 1. Вю1. СЬет., 276: 27 622-27 628).
С помощью аналогичным образом направленной стратегии изменения одного или более аминокислотных остатков антитела, последовательности антител, описанные в данном изобретении, можно использовать для разработки анти-ЕрЬА антител с улучшенными функциями, включая более высокую афинность для ЕрЬА.
Предпочтительными аминокислотными заменами являются такие, которые: (1) уменьшают подверженность протеолизу, (2) уменьшают подверженность окислению, (3) изменяют афинность связывания для образования белковых комплексов и (4) придают или изменяют другие физико-химические или функциональные свойства подобных аналогов. Аналоги могут включать различные мутеины с последовательностью, отличной от природной пептидной последовательности. Например, одну или множество аминокислотных замен (предпочтительно консервативные аминокислотные замены) можно осуществлять в природной последовательности, предпочтительно в области полипептида за пределами домена(ов), образующих межмолекулярные контакты. Консервативные аминокислотные замены не должны существенно изменять структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не должна приводить к нарушению спирали, которая имеет место в исходной последовательности, или разрушать другие типы вторичной структуры, которые характеризуют исходную последовательность). Примеры принятых в данной области техники вторичных и третичных структур поли
- 14 020324 пептидов описаны в Рго1етк, 81гнс1нгек апб Мо1еси1аг Ргтар1ек (ΟΐΌίβΙιΙοη, Еб., \У.Н. Ргеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк (1984)), 1п1гобисбоп ίο РгоШп §1гис1иге (С. Вгапбеп апб 1. Тоохе, ебк., 6аг1апб РиЬйкйтд, №\ν Уогк, Ν.Υ. (1991)), и Т1югп1оп е1 а1., 1991, Ыа1иге, 354: 105, полное содержание всех источников включено в данное описание посредством ссылок.
Усовершенствованные антитела также включают такие антитела с улучшенными характеристиками, которые получены с помощью стандартных методик иммунизации животных, создания гибридом и отбора на антитела со специфическими характеристиками.
Настоящее изобретение также включает цитотоксические конъюгаты. Данные цитотоксические конъюгаты содержат два первичных компонента, связывающее клетки средство и цитотоксическое средство.
Как используется в данном описании, термин связывающее клетки средство означает средство, которое специфически распознает и связывает рецепторы Ер1А на клеточной поверхности. В одном варианте осуществления связывающее клетки средство специфически распознает рецептор таким образом, что это дает возможность конъюгатам действовать целевым образом с незначительными побочными эффектами, происходящими вследствие неспецифического связывания.
В другом варианте осуществления связывающее клетки средство по настоящему изобретению также специфически распознает рецептор Ер1А таким образом, что конъюгаты будут находиться в контакте с клеткой-мишенью в течение периода времени, достаточного, чтобы дать возможность цитотоксической лекарственной части конъюгата воздействовать на клетку и/или обеспечить достаточно времени для того, чтобы конъюгат был интернализован клеткой.
В предпочтительном варианте осуществления цитотоксические конъюгаты содержат анти-Ер1А антитело в качестве связывающего клетки средства, более предпочтительно мышиное анти-Ер1А моноклональное антитело 37.3Ό7, 37.1Ρ5, 53.2Н11, ЕрйЛ2-N1 или Ер11А2-№. В более предпочтительном варианте осуществления цитотоксические конъюгаты содержат гуманизированное антитело 37.3Ό7, 37.1Ρ5, 53.2Н11, Ер11А2-Ю или Ер11А2-№ или его эпитопсвязывающий фрагмент. Антитело 37.3Ό7, 37.1Ρ5, 53.2Н11, Ер11А2-Ю или Ер11А2-№ способно специфически распознавать рецептор ЕрНА, такой как Ер1А2, и направлять цитотоксическое средство на аномальную клетку или ткань, такую как раковые клетки, целевым образом.
Второй компонент цитотоксических конъюгатов по настоящему изобретению представляет собой цитотоксическое средство. Термин цитотоксическое средство, как используется в данном описании, означает вещество, которое снижает или блокирует функцию или рост клеток и/или вызывает разрушение клеток.
В предпочтительных вариантах осуществления цитотоксическое средство представляет собой токсоид, мейтанзиноид, такой как ΌΜ1 или ΌΜ4, низкомолекулярное лекарственное средство, производное томеймицина, производное лептомицина, пролекарство, аналог СС-1065 или СС-1065. В предпочтительных вариантах осуществления связывающие клетки средства по настоящему изобретению являются ковалентно присоединенными, напрямую или через расщепляемый или нерасщепляемый линкер, к цитотоксическому средству.
Связывающие клетки средства, цитотоксические средства и линкеры обсуждаются более подробно ниже.
Связывающие клетки средства
Эффективность соединений по настоящему изобретению как терапевтических средств зависит от тщательного отбора соответствующего связывающего клетки средства. Связывающие клетки средства могут представлять собой любой тип известных в настоящее время средств, или тех, что становятся известными, и включают пептиды и не-пептиды. Связывающее клетки средство может представлять собой любое соединение, которое способно связывать клетку, либо специфическим, либо неспецифическим образом. Как правило, это могут быть антитела (особенно моноклональные антитела), лимфокины, гормоны, факторы роста, витамины, молекулы, переносящие питательные вещества (такие как трансферрин) или любые другие связывающие клетки молекулы или вещества.
Более конкретные примеры связывающих клетки средств, которые можно использовать, включают поликлональные антитела, моноклональные антитела, фрагменты антител, такие как РаЬ, РаЬ' и Р(аЬ')2, Ρν (Ратйат, 1983, I. 1ттипо1., 131:2895-2902, 8ргтд е! а1., 1974, I. 1ттипо1., 113: 470-478, МкопоГГ е! а1., 1960, Атсй. Вюсйет. Вюрйук., 89: 230-244).
Предпочтительно гуманизированное анти-Ер1А антитело используют в качестве связывающего клетки средства по настоящему изобретению. Более предпочтительно гуманизированное анти-Ер1А антитело выбирают из гуманизированных или поверхностно-модифицированных антител 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ер11А2А1 и Ер11А2А2.
Цитотоксические средства
В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированными с лекарственным средством, таким как мейтанзиноид или производное томеймицина, с образованием пролекарства, обладающего специфической цитотоксичностью в
- 15 020324 отношении зкспрессирующих антиген клеток вследствие нацеливания лекарственного средства на рецептор Ер11А2. Цитотоксические конъюгаты, содержащие такие антитела и небольшое высокотоксичное лекарственное средство (например, мейтанзиноиды, таксаны, производные томеймицина, производные лептомицина, аналоги СС-1065 и СС-1065), можно использовать в качестве терапевтических средств для лечения опухолей, таких как опухоли молочной железы и яичников.
Цитотоксическое средство, используемое в цитотоксическом конъюгате по настоящему изобретению, может представлять собой любое соединение, которое приводит к гибели клетки или индуцирует клеточный лизис или каким-либо образом снижает жизнеспособность клеток. Предпочтительные цитотоксические средства включают, например, мейтанзиноиды и аналоги мейтанзиноидов, пролекарства, производные томеймицина, токсоиды, производные лептомицина, аналоги СС-1065 и СС-1065, охарактеризованные ниже. Данные цитотоксические средства конъюгированы с антителами, фрагментами антител, функциональными эквивалентами, усовершенствованными антителами и их аналогами, как раскрыто в данном описании.
Цитотоксические конъюгаты можно получать методами ίη νίΙΐΌ. Чтобы присоединить лекарственное средство или пролекарство к антителу, используют сшивающую группу. Подходящие сшивающие группы хорошо известны в данной области и включают дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, расщепляемые пептидазой группы и расщепляемые эстеразой группы. Предпочтительными сшивающими группами являются дисульфидные группы и тиоэфирные группы. Например, конъюгаты можно создавать, используя дисульфидную обменную реакцию, или образуя тиоэфирную связь между антителом и лекарственным средством или пролекарством.
Мейтанзиноиды
Среди цитотоксических средств, которые можно использовать по настоящему изобретению для получения цитотоксического конъюгата, находятся мейтанзиноиды и аналоги мейтанзиноидов. Примеры соответствующих мейтанзиноидов включают мейтанзинол и аналоги мейтанзинола. Мейтанзиноиды представляют собой лекарственные средства, которые ингибируют образование микротрубочек и которые являются высокотоксичными для клеток млекопитающих.
Примеры соответствующих аналогов мейтанзинола включают те, которые имеют модифицированное ароматическое кольцо и которые имеют модификации по другим позициям. Такие соответствующие мейтанзиноиды раскрыты в патентах США №4424219, 4256746, 4294757, 4307016, 4313946, 4315929, 4331598, 4361650, 4362663, 4364866, 4450254, 4322348, 4371533, 6333410, 5475092, 5585499 и 5846545.
Конкретные примеры соответствующих аналогов мейтанзинола, имеющих модифицированное ароматическое кольцо, включают (1) С-19-дехлоро (патент США №4256746) (полученный восстановлением анзамитоцина Р2 при помощи ЬАН), (2) С-20-гидрокси (или С-20-деметил) +/-С-19-дехлоро (патенты США №4361650 и 4307016) (полученный деметилированием при помощи 81гер1отусе5 или Асбпотусек, либо дехлорированием при помощи ЬАН), и (3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-ОСОЯ), +/-дехлоро (патент США №4294757) (полученный ацилированием при помощи ацилхлоридов).
Конкретные примеры соответствующих аналогов мейтанзинола, имеющих модификации по другим позициям, включают (1) С-9-8Н (патент США №4424219) (полученный в результате реакции мейтанзинола с Н28 или Р285), (2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СН2ОЯ) (патент США №4331598), (3) С-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (СН2ОН или СН2ОАс) (патент США №4450254) (полученный из Мосагб1а), (4) С-15-гидрокси/ацилокси (патент США №4364866) (полученный конверсией мейтанзинола 81гер1отусе8), (5) С-15-метокси (патенты США №4313946 и 4315929) (выделенные из Тге\\та пибШога), (6) С-18-Ы-деметил (патенты США №4362663 и 4322348) (полученный деметилированием мейтанзинола 81гер1отусе5), и (7) 4,5-дезокси (патент США №4371533) (полученный восстановлением мейтанзинола трихлоридом титана/ЬАН).
- 16 020324
В предпочтительном варианте осуществления в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению используют тиолсодержащий мейтанзиноид (ΌΜ1), официально называемый Ν2-деацетил-Ν2 (3-меркапто-1-оксопропил)мейтанзин, в качестве цитотоксического средства. ΌΜ1 представлен следующей структурной формулой (I):
В другом предпочтительном варианте осуществления в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению используют тиолсодержащий мейтанзиноид Ν2-деацетил-Ν2-(4-метил-4-меркапто-1оксопентил)мейтанзин в качестве цитотоксического средства. ΌΜ4 представлен следующей структурной формулой (II):
В дополнительных вариантах осуществления изобретения можно использовать другие мейтанзины, включая тиол- и дисульфидсодержащие мейтанзиноиды, имеющие моно- или диалкильное замещение по атому углерода, несущему атом серы. Сюда входит мейтанзиноид, имеющий на С-3, С-14 гидроксиметил, С-15 гидрокси или С-20 дезметил, ацилированную аминокислотную боковую цепь с ацильной группой, несущей экранированную сульфгидрильную группу, где атом углерода ацильной группы, несущей тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, где указанные заместители представляют собой СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и где дополнительно один из заместителей может представлять собой Н, и где ацильная группа имеет длину линейной цепи по меньшей мере три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы.
Такие дополнительные мейтанзины включают соединения, представленные формулой (III)
где Υ' представляет собой (СВ7В8)1(СВ9=СВ10)р(С=С)(1Аг(СВ5Я6)тПи(СВ11=СВ12)г(С=С)8В1(СВ3В4)пСВ1В282, где
В1 и В2 каждый независимо представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и дополнительно В2 может представлять собой Н,
А, В, Ό представляют собой циклоалкил или циклоалкенил, содержащий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,
В3, В4, В5, Ве, В7, В8, В9, В10, Вп и В12 каждый независимо представляют собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический
- 17 020324 ароматический или гетероциклоалкильный радикал,
1, т, η, о, р, с.|, г, к и ΐ каждый независимо равен 0 или целому числу от 1 до 5, при условии, что по меньшей мере два из 1, т, η, о, р, с.|, г, к и ΐ не равны нулю одновременно, и
Ζ представляет собой Н, 8Я или -СΟЯ, где Я представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, либо простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Предпочтительные варианты осуществления формулы (III) включают соединения формулы (III), где Я1 представляет собой метил, Я2 представляет собой Н, и Ζ представляет собой Н.
Я1 и Я2 представляют собой метил, и Ζ представляет собой Н.
Я1 представляет собой метил, Я2 представляет собой Н, и Ζ представляет собой -8СН3.
Я1 и Я2 представляют собой метил, и Ζ представляет собой -8СН3.
Такие дополнительные мейтанзины также включают соединения, представленные формулами (IVЬ), (Γν-ϋ) или (Γν-ϋΛ)
где Υ представляет собой (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)т(СЯ3Я4)пСЯ1Я2^, где
Я1 и Я2 каждый независимо представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и дополнительно Я2 может представлять собой Н,
Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 каждый независимо представляют собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,
1, т и η каждый независимо равен целому числу от 1 до 5, и дополнительно η может быть равен 0,
Ζ представляет собой Н, 8Я или -СΟЯ, где Я представляет собой линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, либо простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и
Мау представляет собой мейтанзиноид, который несет боковую цепь на С-3, С-14 гидроксиметиле, С-15 гидрокси или С-20 дезметиле.
Предпочтительные варианты осуществления формул (Щ-Ь), (Щ-Э) и (Щ-ЭХ) включают соединения формул (^-Ь), (Щ-Э) и (Щ-ЭЪ), где
Я1 представляет собой метил, Я2 представляет собой Н, Я5, Я6, Я7 и Я8 каждый представляет собой Н, 1 и т каждый равен 1, η равен 0, и Ζ представляет собой Н.
Я1 и Я2 представляют собой метил, Я5, Я6, Я7, Я8 каждый представляет собой Н, 1 и т равны 1, η равен 0, и Ζ представляет собой Н.
Я1 представляет собой метил, Я2 представляет собой Н, Я5, Я6, Я7 и Я8 каждый представляет собой Н, 1 и т каждый равен 1, η равен 0, и Ζ представляет собой -8СН3.
Я1 и Я2 представляют собой метил, Я5, Я6, Я7, Я8 каждый представляет собой Н, 1 и т равны 1, η равен 0, и Ζ представляет собой - 8СН3.
Предпочтительно цитотоксическое средство представлено формулой (Щ-Ь).
Такие дополнительные мейтанзины также включают соединения, представленные формулой (V)
где Υ представляет собой (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)1П(СЯ3Я4)пСЯ1Я2^, где
Я1 и Я2 каждый независимо представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3
- 18 020324 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и дополнительно К2 может представлять собой Н,
Я3, К4, К5, Кб, К7 и К8 каждый независимо представляют собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,
1, т и η каждый независимо равен целому числу от 1 до 5, и дополнительно η может быть равен 0,
Ζ представляет собой Н, 8К или -СОК, где К представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, либо простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Предпочтительные варианты осуществления формулы (V) включают соединения формулы (V), где
К1 представляет собой метил, К2 представляет собой Н, К5, Кб, К7 и К8 каждый представляет собой Н, 1 и т каждый равен 1, η равен 0, и Ζ представляет собой Н.
К1 и К2 представляют собой метил, К5, К6, К7, К8 каждый представляет собой Н, 1 и т равны 1, η равен 0, и Ζ представляет собой Н.
К1 представляет собой метил, К2 представляет собой Н, К5, К6, К7 и К8 каждый представляет собой Н, 1 и т каждый равен 1, η равен 0, и Ζ представляет собой -8СН3.
К1 и К2 представляют собой метил, К5, К6, К7, К8 каждый представляет собой Н, 1 и т равны 1, η равен 0, и Ζ представляет собой - 8СН3.
Такие дополнительные мейтанзины добавочно включают соединения, представленные формулами (УЕ-Ь), (Ύΐ-Ό) или (ΑΊ-ΌΛ)
где Υ2 представляет собой (СКЩДЩКбКбЩСКзКЩСК^^, где
К1 и К2 каждый независимо представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и дополнительно К2 может представлять собой Н,
К3, К4, К5, К6, К7 и К8 каждый независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,
1, т и η каждый независимо равен целому числу от 1 до 5, и дополнительно η может быть равен 0,
Ζ2 представляет собой 8К или СОК, где К представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, либо простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и
Мау представляет собой мейтанзиноид.
Такие дополнительные мейтанзины также включают соединения, представленные формулой (VII)
где Υ2' представляет собой (СК7К8)1(СК9=СК1( )р(С С) А.(С1иО..1)(СК СК-;).(С С).В.(СК;1Т)..СККЖ;. где
К1 и К2 каждый независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и дополнительно К2 может представлять собой Н,
А, В и Ό каждый независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, содержащий от 3
- 19 020324 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил, либо гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,
В3, В4, В5, В6, В7, В8, В9, В10, Вп и В12 каждый независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,
1, т, п, о, р, ср г, 8 и ΐ каждый независимо равен 0 или целому числу от 1 до 5, при условии, что по меньшей мере два из 1, т, п, о, р, ср г, 8 и ί не равны 0 одновременно, и
Ζ2 представляет собой 8В или -С0В, где В представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, либо простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Предпочтительные варианты осуществления формулы (νΙΙ) включают соединения формулы (УП), где В1 представляет собой метил, В2 представляет собой Н.
Вышеуказанные мейтанзиноиды можно конъюгировать с анти-ЕрйЛ антителом 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ер11Л2-Ю или Ερ11Α2-N2. либо его гомологом или фрагментом, где антитело сшито с мейтанзиноидом при помощи тиоловой или дисульфидной функциональной группы, которая находится на ацильной группе ацилированной аминокислотной боковой цепи, находящейся на С-3, С-14 гидроксиметиле, С-15 гидрокси или С-20 дезметиле мейтанзиноида, и где у ацильной группы ацилированной аминокислотной боковой цепи тиоловая или дисульфидная функциональная группа расположена на атоме углерода, который имеет один или два заместителя, где указанные заместители представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и, дополнительно, один из заместителей может представлять собой Н, и где ацильная группа имеет длину линейной цепи по меньшей мере три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы.
Предпочтительный конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, который содержит анти-ЕрйЛ антитело 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ер11А2-Ю или Ερ11Α2-N2. либо его гомолог или фрагмент, конъюгированный с мейтанзиноидом формулы (νΙΙΙ)
(СВ7В8)1(СВ9=СВ10)р(С^С)чАг(СВ5Вб)тПи(СВ11=СВ12)г(С^С)8В1(СВ3В4)пСВ1В28-, где
А, В и Ό каждый независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, содержащий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил, либо гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,
В3, В4, В5, В6, В7, В8, В9, В10, Вп и В12 каждый независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и
1, т, п, о, р, ср г, 8 и ί каждый независимо равен 0 или целому числу от 1 до 5, при условии, что по меньшей мере два из 1, т, п, о, р, ср г, 8 и ΐ не равны нулю одновременно.
Предпочтительно В1 представляет собой метил, В2 представляет собой Н или В1 и В2 представляют собой метил.
Еще более предпочтительный конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, который содержит анти-ЕрЕА антитело 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ер11А2-Ю или Ερ11А2-N2. либо его гомолог или фрагмент, конъюгированный с мейтанзиноидом формул (ΙΧ-Ь), (ΙΧ-Ό) или (ΙΧ-Ό,Ε)
- 20 020324
где Υ1 представляет собой (СК7К8)1(СК5К6)т(СКзК4)пСК1К2§-, где
К! и К2 каждый независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и дополнительно К2 может представлять собой Н,
К3, К4, К5, К6, К7 и К8 каждый независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,
1, т и η каждый независимо равен целому числу от 1 до 5, и дополнительно η может быть равен 0, и
Μау представляет собой мейтанзинол, который несет боковую цепь на С-3, С-14 гидроксиметиле, С-15 гидрокси или С-20 дезметиле.
Предпочтительные варианты осуществления формул (ΙΧ-Ь), (ΙΧ-Ό) и (1Х-Б,Ь) включают соединения формул (ΙΧ-Ь), (ΙΧ-Б) и (1Х-Б,Ь), где
К! представляет собой метил, К2 представляет собой Н, или К! и К2 представляют собой метил,
К! представляет собой метил, К2 представляет собой Н, К5, Кб, К7 и К8 каждый представляет собой Н, 1 и т каждый равен 1, η равен 0,
К1 и К2 представляют собой метил, К5, Кб, К7 и К8 каждый представляет собой Н, 1 и т равны 1, η равен 0.
Предпочтительно цитотоксическое средство представлено формулой (ΙΧ-Ь).
Дополнительный предпочтительный конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, который содержит анти-ΕρΙιΑ антитело 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 или Ερ1ιΑ2-Ν2, либо его гомолог или фрагмент, конъюгированный с мейтанзиноидом формулы (Χ)
где заместители такие, как определены для вышеприведенной формулы (ΙΧ).
Особенно предпочтительными являются любые из вышеописанных соединений, где К1 представляет собой Н, К2 представляет собой метил, К5, К6, К7 и К8 каждый представляет собой Н, 1 и т каждый равен 1, и η равен 0.
Дополнительно особенно предпочтительными являются любые из вышеописанных соединений, где К1 и К2 представляют собой метил, К5, Кб, К7, К8 каждый представляет собой Н, 1 и т равны 1, и η равен 0.
Дополнительно предпочтительным является стереоизомер Ь-аминоацил.
Каждый из мейтанзиноидов, о котором сообщается в находящейся на рассмотрении патентной заявке США №10/849136, зарегистрированной 20 мая 2004 г., можно также использовать в цитотоксическом конъюгате по настоящему изобретению. Полное содержание патентной заявки США №10/849136 включено в данное описание посредством ссылки.
Дисульфидсодержащие сшивающие группы
Для присоединения мейтанзиноида к связывающему клетки средству, такому как антитело 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 или Ερ1ιΑ2-Ν2, в состав мейтанзиноида входит сшивающий фрагмент. Сшивающий фрагмент содержит химическую связь, которая позволяет высвобождать полностью активные мейтанзиноиды в определенном участке. Соответствующие химические связи хорошо известны в данной области и включают дисульфидные связи, кислотолабильные связи, фотолабильные связи, расщепляемые пептидазой связи и расщепляемые эстеразой связи. Предпочтительными являются дисульфидные связи.
- 21 020324
В состав сшивающего фрагмента также входит реакционно-способная химическая группа. В предпочтительном варианте осуществления реакционно-способная химическая группа может быть ковалентно присоединена к мейтанзиноиду посредством сшивающего фрагмента с дисульфидной связью.
Особенно предпочтительными реакционно-способными химическими группами являются Νсукцинимидильные сложные эфиры и Ν-сульфосукцинимидильные сложные эфиры.
Особенно предпочтительными мейтанзиноидами, в состав которых входит сшивающий фрагмент, содержащий реакционно-способную химическую группу, являются сложные С-3 эфиры мейтанзинола и его аналоги, где сшивающий фрагмент содержит дисульфидную связь, а в состав реакционно-способной химической группы входит Ν-сукцинимидильный или Ν-сульфосукцинимидильный сложный эфир.
Многие позиции на мейтанзиноидах могут служить в качестве позиции для химического присоединения сшивающего фрагмента. Например, позиция С-3 с гидроксильной группой, позиция С-14, модифицированная гидроксиметилом, позиция С-15, модифицированная гидрокси-, и позиция С-20 с гидроксигруппой, предположительно, все являются пригодными. Однако позиция С-3 является предпочтительной, и позиция С-3 мейтанзинола является особенно предпочтительной.
В то время как синтез сложных эфиров мейтанзинола, содержащих сшивающий фрагмент, описан в отношении сшивающих фрагментов с дисульфидными связями, любому специалисту в данной области будет понятно, что сшивающие фрагменты с другими химическими связями (как описано выше) можно также использовать по настоящему изобретению, так же как и другие мейтанзиноиды. Конкретные примеры других химических связей включают кислотолабильные связи, фотолабильные связи, расщепляемые пептидазой связи и расщепляемые эстеразой связи. В раскрытии патента США №5208020, включенного в данное описание, сообщается о получении мейтанзиноидов, содержащих такие связи.
Синтез мейтанзиноидов и производных мейтанзиноидов с дисульфидным фрагментом, содержащим реакционно-способную группу, описан в патентах США №6441163 и 6333410, а также в патентной заявке США №10/161651, все они включены в данное описание посредством ссылок.
Содержащие реакционно-способные группы мейтанзиноиды, такие как ΌΜ1, реагируют с антителом, таким как антитело 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 или Ερ1ιΛ2-Ν2. образуя цитотоксические конъюгаты. Данные конъюгаты можно очищать с помощью ВЭЖХ или гель-фильтрации.
Несколько наулучших схем производства таких конъюгатов антитело-мейтанзиноид приведены в патенте США №6333410 и патентных заявках США №09/867598, 10/161651 и 10/024290, полное содержание их всех включено в данное описание посредством ссылок.
Как правило, раствор антитела в водном буфере можно инкубировать с молярным избытком мейтанзиноидов с дисульфидным фрагментом, содержащим реакционно-способную группу. Реакционную смесь можно гасить добавлением избытка аминов (таких как этаноламин, таурин и так далее). Конъюгат мейтанзиноид-антитело затем можно очищать гель-фильтрацией.
Количество молекул мейтанзиноида, связанных с молекулой антитела, можно определять спектрофотометрическим измерением отношения поглощений при 252 и 280 нм. Предпочтительным является среднее значение 1-10 молекул мейтанзиноида/молекулу антитела.
Конъюгаты антител с мейтанзиноидными лекарственными средствами можно оценивать по их способности подавлять пролиферацию различных нежелательных клеточных линий ίη νίίτο. Например, такие клеточные линии, как линия А-431 человеческого плоскоклеточного рака, линия 8А2 человеческого мелкоклеточного рака легких, линия 8КВК.3 рака молочной железы человека и линия ЫашаГета лимфомы Беркитта, легко могут быть использованы для оценки цитотоксичности этих соединений. Оцениваемые клетки можно подвергать действию данных соединений в течение 24 ч, и выжившие фракции клеток измерять в прямых анализах известными способами. Затем по результатам анализов могут быть рассчитаны значения 1С50.
ПЭГ-содержащие сшивающие группы
Мейтанзиноиды можно также сшивать со средствами, связывающими клетки, с помощью ПЭГсодержащих сшивающих групп, как указано в патентной заявке США №10/024290. Эти ПЭГсодержащие сшивающие группы растворимы как в воде, так и в неводных растворителях и могут быть использованы для присоединения одного или большего количества цитотоксических средств к связывающему клетки средству. Иллюстративные примеры ПЭГ-содержащих сшивающих групп включают гетеробифункциональные ПЭГ-линкеры, которые соединяют цитотоксические средства и связывающие клетки средства по противоположным концам линкеров через функциональную сульфгидрильную или дисульфидную группу на одном конце и активный сложный эфир на другом конце.
В качестве основного примера синтеза цитотоксического конъюгата с использованием ПЭГсодержащей сшивающей группы можно опять сослаться на патентную заявку США №10/024290 для конкретизации деталей. Синтез начинается с реакции одного или более цитотоксических средств, имеющих в составе реакционно-способный фрагмент ПЭГ, со средством, связывающим клетки, что приводит к замещению концевого активного сложного эфира каждого реакционно-способного фрагмента на аминокислотный остаток средства, связывающего клетки, такого как антитело 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ερ1ιΑ2-Ν1 или ΕρΡΑ2-Ν2, приводя в результате к образованию цитотоксического конъюгата, содержащего одно или более цитотоксических средств, ковалентно связанных со средством, связывающим клетки,
- 22 020324 через ПЭГ -содержащую сшивающую группу.
Таксаны
Цитотоксическим средством, используемым в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению, может также являться таксан или его производные.
Таксаны представляют собой класс соединений, который включает паклитаксел (таксол), цитотоксический природный продукт, и доцетаксел (таксотер), полусинтетическое производное, два соединения, которые широко применяются в лечении раковых заболеваний. Таксаны являются ядами митотического веретена, которые ингибируют деполимеризацию тубулина, что приводит к гибели клетки. Несмотря на то что доцетаксел и паклитаксел являются полезными средствами для лечения рака, их противоопухолевая активность ограничена из-за их неспецифической токсичности для нормальных клеток. Кроме того, соединения типа паклитаксела и доцетаксела сами по себе недостаточно эффективны для применения в конъюгатах средств, связывающих клетки.
Предпочтительным таксаном, используемым для получения цитотоксических конъюгатов, является таксан формулы (XI)
Способы синтеза таксанов, которые можно применять в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению, наряду со способами конъюгирования таксанов со средством, связывающим клетки, таким как антитело 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ер11А2-Ю или Ер11А2-№, подробно описаны в патентах США №5416064, 5475092, 6340701, 6372738 и 6436931, а также в патентных заявках США №10/024290, 10/144042, 10/207814, 10/210112 и 10/369563.
Производные томеймицина
Цитотоксические средства по настоящему изобретению могут также являться производными томеймицина. Производные томеймицина представляют собой пирроло[1,4]бензодиазепины (РВЭк), известный класс соединений, проявляющих свои биологические свойства путем ковалентного связывания с N2 гуанина в малой бороздке молекулы ДНК. ΡΒΌδ включают целый ряд связывающих малую бороздку соединений, таких как антрамицин, неотрамицин и ЭС-81.
Новые производные томеймицина, которые сохраняют высокую цитотоксичность и могут быть эффективно присоединены к связывающим клетки средствам, описаны в международной заявке № РСТ/1В2007/000142, содержание которой включено в данное описание в качестве ссылки. Комплексы связывающее клетки средство-производное томеймицина позволяют в полной мере использовать цитотоксическое действие производных томеймицина целенаправленно только против нежелательных клеток, тем самым избегая побочных эффектов из-за повреждения нецелевых здоровых клеток.
Цитотоксическое средство по настоящему изобретению включает одно или более производных томеймицина, сшитых со связывающим клетки средством, таким как антитело 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ер11А2-Ю или Ер11А2-№, через сшивающую группу. Сшивающая группа является частью химического фрагмента, который ковалентно связан с производным томеймицина обычными способами. В предпочтительном варианте осуществления химический фрагмент может быть ковалентно связан с производным томеймицина через дисульфидную связь.
Производные томеймицина, применяемые по настоящему изобретению, имеют формулу (XII), представленную ниже
где — представляет собой необязательную одинарную связь, представляет собой либо одинарную, либо двойную связь, при условии, что когда —Тпредставляет собой одинарную связь, и и и', одинаковые или различные, независимо представляют собой Н, а ν и V, одинаковые или различные, независимо выбирают из группы, состоящей из ОН, простого эфира, такого как -ОЯ, сложного эфира (например, ацетата), такого как -ОСОЯ, карбоната, такого как -ОСООЯ, карбамата, такого как -ОСОNЯЯ', циклокарбамата, в котором N10 и С11 являются частью цикла, мочевины, такой как -ΝΒί.ΌΝΒΒ', тиокарбамата, такого как
- 23 020324
ΟСδNΗЯ, циклотиокарбамата, в котором Ν10 и С11 являются частью цикла, -δΗ, сульфида, такого как 8Я, сульфоксида, такого как -δΟΒ, сульфона, такого как -δΟΟΒ, сульфоната, такого как -δΟ3-, сульфонамида, такого как -NΚδΟΟЯ, амина, такого как -ΝΚΚ', необязательно, циклического амина, в котором Ν10 и С11 являются частью цикла, производного гидроксиламина, такого как -ΝΚ.ΟΚ', амида, такого как -NΚСΟЯ, азида, такого как -Ν3, циано, галогена, триалкила или триарилфосфония, группы аминокислотного происхождения; предпочтительно V и V являются одинаковыми или различными и представляют собой ОН, Οте, Οβΐ, ΝΗ^ΝΗ2, δΜβ;
и когда представляет собой двойную связь, и и и' отсутствуют, а V и V' представляют собой Н;
Я1, Я2, Я1', Я2' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из галида или алкила, необязательно замещенного одним или более На1, ΟΝ, ΝΚΚ', СР3, ΟЯ, арилом, Не!, δίΟί^Ρ, или Я1 и Я2, а также Я1' и Я2' образуют вместе двойную связь, содержащую группу =В и =В', соответственно.
Предпочтительно Я1 и Я2, а также Я1' и Я2' образуют вместе двойную связь, содержащую группу =В и =В', соответственно.
В и В' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из алкенила, необязательно замещенного одним или более На1, СЫ, ΝΡΚ', СР3, ΟЯ, арилом, Не!, δζΟί^Ρ, либо В и В' представляют собой атом кислорода.
Предпочтительно В=В'.
Более предпочтительно В=В'= =СН2 или =СН-СН3, - X, X' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из одного или более -Ο-, -ΝΚ-, -(Ο=Ο)-, -δ(Ο)4-.
Предпочтительно Х=Х'.
Более предпочтительно Х=Х'=О.
А, А' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из алкила или алкенила, необязательно содержащего атом кислорода, азота или серы, каждый из которых необязательно замещен одним или более На1, СМ, МЯЯ', СР3, ΟЯ, δ^),^ арилом, Не!, алкилом, алкенилом.
Предпочтительно А=А'.
Более предпочтительно А=А'=линейный незамещенный алкил.
Υ, Υ' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из Н, ΟЯ.
Предпочтительно Υ=Υ'.
Более предпочтительно Υ=Υ'=Оалкил, более предпочтительно Ометил.
Т является -ИЯ-, -Ο-, -δ(Ο)4-, или 4-10-членным арилом, циклоалкилом, гетероциклом или гетероарилом, каждый необязательно замещен одним или более На1, СК, МЯЯ', СР3, Я, ΟЯ, δ(Ο)^Я, и/или линкером(ами), или разветвленным алкилом, необязательно замещенным одним или более На1, СН, МЯЯ', СР3, ΟЯ, δ(Ο)^Я и/или линкером(ами), или линейным алкилом, замещенным одним или более На1, СЫ, NΒΒ'. СР3, ΟЯ, δ^)^ и/или линкером(ами).
Предпочтительно Т является 4-10-членным арилом или гетероарилом, более предпочтительно фенилом или пиридилом, необязательно замещенными одним или более линкером(ами).
Указанный линкер содержит сшивающую группу. Подходящие сшивающие группы хорошо известны в данной области и включают тиоловые, сульфидные, дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, расщепляемые пептидазой группы и расщепляемые эстеразой группы. Предпочтительными являются дисульфидные группы и тиоэфирные группы.
Когда сшивающая группа представляет собой тиол-, сульфид (или так называемый тиоэфир -δ-)или дисульфид (АА-)-содержащую группу, боковая цепь, содержащая тиоловую, сульфидную или дисульфидную группу, может быть линейной или разветвленной, ароматической или гетероциклической. Специалист в данной области легко определит подходящие боковые цепи.
Предпочтительно указанный линкер имеет формулу -6-Ό-(Ζ)ρ-δ-Ζ', где представляет собой одинарную или двойную связь, -Ο-, -δ-или -ΝΡ-;
Ό представляет собой одинарную связь или -Е-, -Ε-ΝΡ-, -Е-ЫЯ-Р-, -Е-Ο-, -Ε-Ο-Ρ-, -ΕNΚ-СΟ-Ρ-, -Е-СО-, -СО-Е-, -Ε^Ο-Ρ, -Ε-δ-, -Ε-δ-Ρ-, ^-^-6-8-, ^-№-€8^-;
где Е и Р являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из линейных или разветвленных -(ОСН2СН2)1-алкил(ОСН2СН2)_)-, -алкил(ОСН2СН2)1-алкил-, -(ОСН2СН2)1-, (ОСН2СН2)1циклоалкил(ОСН2СН2)_) -, -(ОСН2СН2)1-гетероцикл(ОСН2СН2)_) -, (ОСН2СН2)1-арил(ОСН2СН2)_) -,
-(ОСН2СН2)1-гетероарил(ОСН2СН2)_)-, -алкил-(ОСН2СН2)1-алкил(ОСН2СН2)_)-, -алкил(ОСН2СН2)1-, алкил(ОСН2СН2)1-циклоалкил(ОСН2СН2)_) -, алкил(ОСН2СН2)1-гетероцикл(ОСН2СН2)_) -, -алкил(ОСН2СН2)1арил^СН^НД]-, -алкил(ОСН2СН2)1-гетероарил(ОСН2СН2)_)-, циклоалкил-алкил-, -алкил-циклоалкил-, -гетероцикл-алкил-, -алкил-гетероцикл-, -алкил-арил-, -арил-алкил-, -алкил-гетероарил-, гетероарил-алкил-;
где ί и _), одинаковые или различные, являются целыми числами и независимо выбраны из 0, 1 до 2000;
Ζ представляет собой линейный или разветвленный -алкил-;
р равен 0 или 1;
Ζ' представляет собой Н, защищающие тиол группы, такие как СΟЯ, Я20 или δΡ20, где Я20 представляет собой Н, метил, алкил, необязательно замещенный циклоалкил, арил, гетероарил или гетеро
- 24 020324 цикл, при условии, что если Ζ' представляет собой Н, указанное соединение находится в равновесии с соответствующим соединением, образованным внутримолекулярной циклизацией, полученной в результате добавления тиоловой группы -8Н к иминной связи -ΝΗ= одного из фрагментов РВЭ;
п, п', одинаковые или различные, равны 0 или 1;
с.| равен 0, 1 или 2;
В, В' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из Н, алкила, арила, каждый из которых необязательно замещен На1, ΟΝ, ΝΚΚ', СР3, В, ОВ, 8(О)ЧВ, арилом, Не!;
или его фармацевтически приемлемые соли, гидраты или гидратированные соли, или полиморфные кристаллические структуры этих соединений, или его оптические изомеры, рацематы, диастереоизомеры или энантиомеры.
Соединения общей формулы (XII), имеющие геометрические и стереоизомеры, также являются частью данного изобретения.
Известно, что двойная связь между Ν-10 и С-11 у производных томеймицина формулы (XII) легко превращается обратимым образом в соответствующие иминные аддукты в присутствии воды, спирта, тиола, первичного или вторичного амина, мочевины и других нуклеофилов. Этот процесс является обратимым и соответствующие производные томеймицина могут быть легко регенерированы в присутствии дегидратирующего средства, в непротонированных органических растворителях, в вакууме или при высоких температурах (Ζ. Тохика, 1983, 1. АпйЬюйск, 36: 276).
Таким образом, обратимые производные томеймицина общей формулы (XIII) также можно применять согласно настоящему изобретению
(XIII) где А, X, Υ, п, Т, А', X', Υ', п', В1, В2, В1', В2' определены, как в формуле (XII), а А, А', одинаковые или различные, выбирают из группы, состоящей из ОН, простого эфира, такого как -ОВ, сложного эфира (например, ацетата), такого как -ОСОВ, -СООВ, карбоната, такого как -ОСООВ, карбамата, такого как ОСОХКК', циклокарбамата, в котором Ν10 и С11 являются частью цикла, мочевины, такой как ХКСОХКК', тиокарбамата, такого как -ОС8ХНВ, циклотиокарбамата, в котором Ν10 и С11 являются частью цикла, -8Н, сульфида, такого как -8В, сульфоксида, такого как -8ОВ, сульфона, такого как 8ООВ, сульфоната, такого как -8О3-, сульфонамида, такого как -ХК8ООВ, амина, такого как -ΝΚΚ', необязательно циклического амина, в котором Ν10 и С11 являются частью цикла, производного гидроксиламина, такого как -ХКОВ', амида, такого как -ЫВСОВ, -ЫВСОХКК', азида, такого как -Ν3, циано, галогена, триалкила или триарилфосфония, группы аминокислотного происхождения; предпочтительно А и А' являются одинаковыми или различными и представляют собой ОН, Оте, Ое!, МНСОХН2, 8Ме.
Соединения формулы (XIII) могут, таким образом, считаться сольватами, включающими воду, если растворителем является вода, эти сольваты могут быть особенно полезны.
В предпочтительном варианте осуществления производные томеймицина по изобретению выбирают из группы, включающей
8,8'-[1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Нпирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[5-метокси-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[1,5-пентандиилбис(окси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло[2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[1,4-бутандиилбис(окси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло[2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[3-метил-1,5-пентандиилбис(окси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Нпирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[2,6-пиридиндиилбис(окси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло[2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[4-(3-трет-бутоксикарбониламинопропилокси)-2,6-пиридиндиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2эт(Е)илиден-7 -метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[5-(3-аминопропилокси)-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1 -с] [1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[5-(N-метил-3-трет-бутоксикарбониламинопропил)-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2эт(Е)илиден-7 -метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4]бензодиазепин-5 -он];
8,8'-{5-[3 -(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)пропилокси] -1,3 -бензолдиилбис(метиленокси)}бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
- 25 020324
8,8'-[5-ацетилтиометил-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2-метилен-7-метокси-1,2,3,11атетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
трет-бутиловый эфир бис{2-[(З)-2-метилен-7-метокси-5-оксо-1,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло[2,1е][1,4]бензодиазепин-8-илокси]этил}карбаминовой кислоты;
8,8'-[3-(2-ацетилтиоэтил)-1,5-пентандиилбис(окси)]бис[(8)-2-метилен-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[5-(№4-меркапто-4,4-диметилбутаноил)амино-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[7-метокси2-метилен-1,2,3,11 а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[5-(№4-метилдитио-4,4-диметилбутаноил)амино-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[7-метокси-2-метилен-1,2,3,11 а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[5-(№метил-№(2-меркапто-2,2-диметилэтил)амино-1,3-бензолдиил(метиленокси)]бис[7-метокси-2-метилен-1,2,3,11 а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[5-(№метил-№(2-метилдитио-2,2-диметилэтил)амино-1,3-бензолдиил(метиленокси)]бис[7-метокси-2-метилен-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[(4-(2-(4-меркапто-4-метил)пентанамидоэтокси)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11 а-тетрагидропирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[(1-(2-(4-метил-4-метилдисульфанил)пентанамидоэтокси)бензол-3,5-диметил)диокси]бис[(З)-2эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[(4-(3-(4-метил-4-метилдисульфанил)пентанамидопропокси)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[(4-(4-(4-метил-4-метилдисульфанил)пентанамидобутокси)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[(4-(3-[4-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноил)пиперазин-1-ил]пропил)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5он];
8,8'-[(1-(3-[4-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноил)пиперазин-1-ил]пропил)бензол-3,5-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5он];
8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)этокси]этокси}этокси)пиридин-2,6диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)этокси]этокси}этокси)этокси]этокси}этокси)бензол-3,5-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[(1-(2-{2-[2-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)этокси]этокси}этокси)бензол-3,5диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)этокси]этокси}этокси)этокси]этокси}этокси)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[(1-(2-[метил(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)амино]этокси)бензол-3,5-диметил)диокси]бис [(З)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5 -он];
8,8'-[(4-(3-[метил(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноил)амино]пропил)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[(4-(3-[метил(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)амино]пропил)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
8,8'-[(1-(4-метил-4-метилдисульфанил)пентанамидо)бензол-3,5-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11 а-тетрагидропирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он], а также соответствующие меркапто-производные, либо их фармацевтически приемлемые соли, гидраты, или гидратированные соли, либо полиморфные кристаллические структуры этих соединений, либо их оптические изомеры, рацематы, диастереоизомеры или энантиомеры.
Предпочтительными соединениями являются соединения формулы или
- 26 020324
где X, X', А, Α', Υ, Υ', Т, η, п' определены, как указано выше.
Соединения формулы (XII) могут быть получены множеством способов, хорошо известных специалистам в данной области. Соединения можно синтезировать, например, путем приложения или адаптации способов, описанных ниже, или их вариациями, как признают квалифицированные специалисты. Соответствующие модификации или замены совершенно очевидны и хорошо известны, либо легко могут быть получены из научной литературы специалистами в данной области. В частности, такие способы можно найти в К.С. Ьагоск, Сотргейепыуе Огдашс ТгапЦогтайопк, \УПсу-УСН РиЫщйега, 1999.
Способы синтеза производных томеймицина, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению, описаны в международной заявке № РСТ/1В2007/000142. Соединения по настоящему изобретению можно получать различными путями синтеза. Реагенты и исходные материалы являются коммерчески доступными, либо легко синтезируемыми с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области (см., например, \¥О 00/12508, \УО 00/12507, \УО 2005/040170, \УО 2005/085260, РВ1516743, М. Моп е! а1., 1986, Те!гайебгоп, 42: 3793-3806).
Молекулы-конъюгаты по данному изобретению можно получать с помощью любой методики. Производные томеймицина по изобретению могут быть сшиты с антителом или другим связывающим клетки средством через кислотолабильный линкер, либо с помощью фотолабильного линкера. Производные можно конденсировать с пептидом, имеющим подходящую последовательность, а затем сшивать со связывающим клетки средством для получения линкера, расщепляемого пептидазой. Можно получать конъюгаты, содержащие первичную гидроксильную группу, которая может быть сукцинилирована и сшита со связывающим клетки средством для получения конъюгата, который может быть расщеплен внутриклеточными эстеразами для высвобождения свободных производных. Предпочтительно производные синтезируют содержащими свободные или защищенные тиоловые группы, а затем одно или более дисульфидных или тиолсодержащих производных каждое ковалентно сшивают со связывающим клетки средством через дисульфидную связь или тиоэфирный мостик.
Многочисленные способы конъюгации изложены в И8Р 5416064 и 5475092. Производные томеймицина можно модифицировать так, чтобы получить свободную аминогруппу, и затем сшить с антителом или другим связывающим клетки средством через кислотолабильный линкер, либо фотолабильный линкер. Производные томеймицина со свободной амино- или карбоксильной группой можно конденсировать с пептидом, а затем сшивать со связывающим клетки средством для получения линкера, расщепляемого пептидазой. Производные томеймицина со свободной гидроксильной группой в составе линкера можно сукцинилировать и сшивать со связывающим клетки средством для получения конъюгата, который может быть расщеплен внутриклеточными эстеразами для высвобождения свободного лекарственного средства. Наиболее предпочтительно производные томеймицина обрабатывают так, чтобы создать свободные или защищенные тиоловые группы, а затем дисульфидные или тиолсодержащие димеры томеймицина сшивают со связывающим клетки средством через дисульфидные связи.
Предпочтительно конъюгатами моноклональное антитело- или связывающее клетки средствопроизводное томеймицина являются те, которые соединены через дисульфидную связь, как обсуждалось выше, которые способны обеспечить доставку производных томеймицина. Такие связывающие клетки конъюгаты получают известными способами, такими как модификация моноклональных антител сукцинимидилпиридилдитиопропионатом (8ΡΌΡ) (Сагккоп е! а1., 1978, Вюсйет. I., 173: 723-737). Полученную в результате тиопиридиловую группу затем замещают обработкой тиолсодержащими производными томеймицина для получения конъюгатов, сшитых через дисульфид. Альтернативно, в случае арилдитиопроизводных томеймицина, образование связывающего клетки конъюгата осуществляется прямым замещением арил-тиола производного томеймицина сульфгидрильными группами, заранее встроенными в молекулы антитела. Конъюгаты, содержащие от 1 до 10 молекул лекарственного средства из производных томеймицина, сшитых через дисульфидный мостик, легко получать любым из способов.
Конкретнее, раствор модифицированного дитионитропиридилом антитела в концентрации 2,5 мг/мл в 0,05 М калий-фосфатном буфере, при рН 7,5, содержащем 2 мМ ΕΌΤΑ, обрабатывают тиолсодержащим производным томеймицина (1,3 молярных экв./дитиопиридиловую группу). Высвобождение тионитропиридина из модифицированного антитела контролируется спектрофотометрически при 325 нм и завершается приблизительно через 16 ч. Конъюгат антитело-производное томеймицина очищают и освобождают от непрореагировавшего лекарственного средства и другого низкомолекулярного материала гель-фильтрацией на колонке с 8ерйабех 0-25 или 8ерйасгу1 8300. Количество связанных фрагментов производного томеймицина на молекулу антитела можно определять измерением отношения поглощений при 230 и 275 нм. В среднем таким способом может быть пришито через дисульфидные связи 1-10 молекул производного томеймицина/молекулу антитела.
Эффект конъюгации на аффинность связывания в отношении клеток, экспрессирующих антиген,
- 27 020324 можно определять способами, ранее описанными Ыи е1 а1., 1996, Ргос. ЫаЙ. Αсаά. 8с1. υ.δ.Α., 93: 86188623. Цитотоксичность для клеточных линий производных томеймицина и их конъюгатов с антителом можно измерять путем обратной экстраполяции кривых клеточной пролиферации, как описано в Со1йтасйег е1 а1., 1985, I. Iттиηо1., 135: 3648-3651. Цитотоксичность этих соединений для адгезивных клеточных линий можно определять клоногенными анализами, как описано в Со1йтасйег е1 а1., 1986, I. Се11 Вю1., 102: 1312-1319.
Производные лептомицина
Согласно настоящему изобретению цитотоксическим может также являться производное лептомицина. Согласно настоящему изобретению производные лептомицина относятся к членам лептомицинового семейства, как определено у Ка1екке е1 а1. (2002, 8уййек1к 8: 981-1003), и включают: лептомицины, такие как лептомицин А и лептомицин В, каллистатины, ратжадоны, такие как ратжадон А и ратжадон В, ангвиномицины, такие как ангвиномицин А, В, С, Ό, казусамицины, лептолстатины, лептофуранины, такие как лептофуранин А, В, С, Ό. Производные лептомицина А и В являются предпочтительными.
Конкретнее, производные по данному изобретению представлены формулой (I)
где Яа и Яа' представляют собой Н или -алк; предпочтительно Яа представляет собой -алк, предпочтительно метил, и Яа' представляет собой Н,
Я17 представляет собой алкил, необязательно замещенный ΟЯ, ΟΝ, ΝΡΚ', перфторалкилом; предпочтительно Я17 представляет собой алкил, более предпочтительно метил или этил,
Я9 представляет собой алкил, необязательно замещенный ΟЯ, СЫ, ΝΡΚ', перфтороалкилом; предпочтительно Я9 представляет собой алкил, более предпочтительно метил,
X представляет собой -О- или -ΝΡ-; предпочтительно X представляет собой -ИЯ-,
Υ представляет собой -υ-, -ΝΚ-υ-, -Ο-υ-, -ΝΚ-€Ο-υ-, -υ-ΝΚ-СО-, -υ-ϋΟ-, -ϋΟ-υ-, предпочтительно, если X представляет собой -О-, Υ представляет собой -υ-, -Νβ.-υ-, -Π-ΝΕ^Ο-, где υ выбирают из линейных или разветвленных -алк-, алк(ОСН2СН2)т-, -(ОСН2СН2)т-алк-, -алк (ОСН2СН2)т-алк-, - (ОСН2СН2)т-, -циклоалкил-, -гетероцикл-, -циклоалкил-алк-, -алк-циклоалкил-, гетероцикл-алк-, -алк-гетероцикл-, где т представляет собой целое число, выбранное от 1 до 2000, предпочтительно υ представляет собой линейный или разветвленный -алк-,
Ζ представляет собой -алк, η равен 0 или 1, предпочтительно η равен 0,
Т представляет собой Н, тиоловую защитную группу, такую как Αα Я1 или 8ЯЬ где Я! представляет собой Н, метил, алк, циклоалкил, необязательно замещенный арил или гетероцикл, либо Т представля-
предпочтительно Т представляет собой Н или 8ЯЬ где Я! представляет собой алк, более предпочтительно метил,
Я, Я', одинаковые или различные, представляют собой Н либо алкил, алк представляет собой линейный или разветвленный алкил, предпочтительно алк представляет собой - (СН2-ч(СН3)ч)р-, где р представляет собой целое число от 1 до 10, и с.| представляет собой целое число от 0 до 2; предпочтительно алк представляет собой -(СН2)- или -С(СН3)2-, или их фармацевтически приемлемые соли, гидраты или гидратированные соли, либо полиморфные кристаллические структуры этих соединений, или их оптические изомеры, рацематы, диастереоизомеры или энантиомеры.
Предпочтительные соединения можно выбирать из следующих:
(2-метилсульфанилэтил)амид (2Е,10Е,12Е,16Ζ,18Е)-(Я)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гептаметил-19((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты;
бис[(2-меркаптоэтил)амид(2Е,10Е,12Е,16Ζ,18Е)-(Я)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гептаметил-19((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты;
- 28 020324 (2-меркаптоэтил)амид (2Е,10Е,12Е,162,18Е)-(К)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гепгаметил-19-((28,3§)3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты;
(2-метилдисульфанилэтил)амид(2Е,10Е,12Е,162,18Е)-(К)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гептаметил19-((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты;
(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)амид(2Е,10Е,12Е,162,18Е)-(К)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17гептаметил-19-((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18пентаеновой кислоты;
(2-меркапто-2-метилпропил)амид (2Е,10Е,12Е,162,18Е)-(К)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гептаметил19-((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты;
или их фармацевтически приемлемых солей, гидратов или гидратированных солей, либо полиморфных кристаллических структур этих соединений, или их оптических изомеров, рацематов, диастереоизомеров или энантиомеров.
Для того чтобы сшить производное со связывающим клетки средством, данное производное должно содержать фрагмент (сшивающую группу), который позволяет производным быть сшитыми со связывающим клетки средством через сочленение, такое как дисульфидная связь, сульфидная (иначе называемая в данном описании тиоэфирной) связь, кислотолабильная группа, фотолабильная группа, расщепляемая пептидазой группа и расщепляемая эстеразой группа. Производные получают таким образом, чтобы они содержали фрагмент, необходимый для сшивки производного лептомицина со связывающим клетки средством через, например, дисульфидную связь, тиоэфирную связь, кислотолабильную группу, фотолабильную группу, расщепляемую пептидазой группу и расщепляемую эстеразой группу. Для того чтобы дополнительно повысить растворимость в водных растворах, сшивающая группа может содержать полиэтиленгликолевый спейсер. Предпочтительно применяют сульфидное или дисульфидное сочленение, так как восстановительная среда клетки-мишени приводит к расщеплению сульфида или дисульфида и к высвобождению производных с сопутствующим возрастанием цитотоксичности.
Соединения по настоящему изобретению можно получать различными путями синтеза. Реагенты и исходные материалы являются коммерчески доступными, либо легко синтезируемыми с помощью методов, хорошо известных рядовым специалистам в данной области. Методы синтеза производных лептомицина, которые можно использовать для цитотоксических конъюгатов по настоящему изобретению, наряду с методами конъюгации указанных производных лептомицина со связывающими клетки средствами, такими как антитела, подробно описаны в европейской патентной заявке №062909486, содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.
Аналоги СС-1065
Цитотоксическое средство, используемое в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению, может также представлять собой СС-1065 или его производное.
СС-1065 является эффективным противоопухолевым антибиотиком, выделенным из среды культивирования ЕйгерЮшусек хе1еп818. СС-1065 примерно в 1000 раз более эффективен ίη убго по сравнению с обычно применяемыми противораковыми лекарственными средствами, такими как доксорубицин, метотрексат и винкристин (В.К. Вйиуап е! а1., 1982, Сапсег Кек., 42, 3532-3537). СС-1065 и его аналоги раскрыты в патентах США №6372738, 6340701, 5846545 и 5585499.
Цитотоксическая эффективность СС-1065 коррелировала с его алкилирующей активностью и его ДНК-связывающей или ДНК-интеркалирующей активностью. Эти две активности свойственны различным частям данной молекулы. Так, алкилирующая активность присуща циклопропапирролоиндольной (СР1) субъединице, а ДНК-связывающая активность свойственна двум пирролоиндольным субъединицам.
Хотя СС-1065 обладает определенными привлекательными свойствами в качестве цитотоксического средства, оно имеет ограничения в терапевтическом применении. Введение СС-1065 мышам вызывало отсроченную гепатотоксичность, приводящую к летальному исходу на 50 день после единичной внутривенной дозы, составляющей 12,5 мкг/кг (У.Ь. Кеупо1б8 е! а1., 1986, ί. АпбЬюбск, XXIX: 319-334). Это привело к форсированным попыткам разработать аналоги, не вызывающие отсроченную токсичность, и был описан синтез более простых аналогов, смоделированных на основе СС-1065 (М.А. \Уагре1ю8к| е! а1., 1988, I. Меб. С1ет., 31: 590-603).
В другой серии аналогов фрагмент СР1 был заменен циклопропабензиндольным (СВ1) фрагментом (Б.Ь. Водег е! а1., 1990, I. Огд. С1ет., 55: 5823-5833, Б.Ь. Водег е! а1., 1991, ВюОгд. Меб. Сйет. Ье!!., 1: 115-120). Эти соединения сохраняют высокую эффективность ίη уйго исходного лекарственного средства, но не приводят к отсроченной токсичности у мышей. Как и СС-1065, эти соединения являются алкилирующими средствами, которые связываются с малой бороздкой ДНК ковалентным образом, что приводит к гибели клетки. Однако клиническая экспертиза наиболее перспективных аналогов, адоцелезина и карцелезина, привела к разочаровывающим результатам (В.Р. Рок!ег е! а1., 1996, 1пуекбда!юпа1 Ν™ Бгидк, 13: 321-326; I. \Уо1ГГ е! а1., 1996, С1т. Сапсег Кек., 2: 1717-1723). Эти лекарственные средства обладали неудовлетворительным терапевтическим действием из-за своей высокой системной токсичности.
- 29 020324
Терапевтическая эффективность аналогов СС-1065 может быть значительно улучшена изменением распределения ίη νίνο посредством направленной доставки к месту опухоли, что приводит к меньшей токсичности для нецелевых тканей и, таким образом, снижению системной токсичности. Для достижения этой цели были описаны конъюгаты аналогов и производных СС-1065 со связывающими клетки средствами, которые специфически направлены против опухолевых клеток (патенты США №5475092, 5585499, 5846545). Эти конъюгаты обычно демонстрируют высокую целеспецифическую цитотоксичность ίη νίΐτο и исключительную противоопухолевую активность у мышиных моделей ксенотрансплантатов человеческих опухолей (К.У. 1. Сйай е1 а1., 1995, Сзпссг Кек., 55: 4079-4084).
Недавно были описаны пролекарства на основе аналогов СС-1065 с повышенной растворимостью в водной среде (европейская патентная заявка №062903794). В этих пролекарствах фенольная группа алкилирующей части молекулы защищена функциональной группой, что делает данное лекарственное средство стабильным при хранении в кислых водных растворах и придает лекарственному средству повышенную растворимость в воде по сравнению с незащищенным аналогом. Защитная группа легко расщепляется ίη νίνο при физиологическом рН с получением соответствующего активного лекарственного средства. У пролекарств, описанных в ЕР 062903794, фенольный заместитель защищен в виде сульфоновой кислоты, содержащей фенилкарбамат, который заряжен при физиологическом рН и, таким образом, обладает повышенной растворимостью в воде. Для дальнейшего повышения растворимости в воде, при желании, можно вводить полиэтиленгликолевый спейсер в линкер между индолильной субъединицей и расщепляемой связью, такой как дисульфидная группа. Введение этого спейсера не влияет на эффективность лекарственного средства.
Методы синтеза аналогов СС-1065, которые можно использовать в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению, наряду с методами конъюгации аналогов со связывающими клетки средствами, такими как антитела, подробно описаны в ЕР 062903794 (содержание которого включено в данное описание посредством ссылки), патентах США №5475092, 5846545, 5585499, 6534660 и 6586618, а также в патентных заявках США №10/116053 и 10/265452.
Другие лекарственные средства
Такие лекарственные средства, как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, калихимицин, тубулизин и аналоги тубулизина, дуокармицин и аналоги дуокармицина, доластатин и аналоги доластатина, также пригодны для получения конъюгатов по настоящему изобретению. Молекулы лекарственного средства могут быть также сшиты с молекулами антитела через молекулу промежуточного носителя, такого как сывороточный альбумин. Соединения доксорубицина и данорубицина, как описано, например, в патенте США №6630579, также могут быть полезными цитотоксическими средствами.
Терапевтическая композиция
Данное изобретение также относится к терапевтической композиции для лечения гиперпролиферативных заболеваний у млекопитающих, которая содержит терапевтически эффективное количество соединения по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения раковых заболеваний, включая (но не ограничиваясь ими) следующие: карциному, включая карциномы мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почек, печени, легких, яичников, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи, включая плоскоклеточную карциному: гемопоэтические опухоли лимфоидной линии дифференцировки, включая лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Беркитта: гемопоэтические опухоли миелоидной линии дифференцировки, включая острые и хронические миелогенные лейкозы и промиелоцитарный лейкоз: опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому: другие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому: опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванному: опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому: а также другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоактантому, семиному, тиреофоликуллярную карциному и тератокарциному, а также другие, которые еще предстоит определить, раковые заболевания, при которых главным образом экспрессируются ΕρΙιΑ. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции по данному изобретению применяют для лечения рака легких, молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, почек, поджелудочной железы, яичников, шейки матки и лимфатических органов, остеосаркомы, синовиальной карциномы, саркомы головы и шеи, глиомы, желудочных, печеночных и других карцином, при которых экспрессируются ΕρΙιΑ. В частности, рак представляет собой метастатический рак. В другом варианте осуществления указанная фармацевтическая композиция относится к другим заболеваниям, таким как, например, аутоиммунные заболевания, такие как системная волчанка, ревматоидный артрит и рассеянный склероз: отторжения трансплантата, такие как отторжение почечного трансплантата, отторжение трансплантата печени, отторжение трансплантата легкого, отторжение сердечного трансплантата и отторжение трансплантата костного мозга; реакция трансплантат против хозяина: вирусные инфекции, такие как корь, ВИЧ, СПИД и тому подобные: и паразитарные инфекции, такие как лямблиоз, амебиаз, шистосомоз и
- 30 020324 другие, как определит специалист в данной области.
По настоящему изобретению предлагают фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество антитела, фрагмента антитела или конъюгата антитела по настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель, который может быть инертным или физиологически активным.
Как используется в данном описании, понятие фармацевтически приемлемые носители включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства и им подобные, которые являются физиологически совместимыми. Примеры соответствующих носителей, разбавителей и/или эксципиентов включают одно или более из следующих: вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстроза, глицерин, этанол и им подобные, а также их сочетания. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические средства, такие как сахара, многоатомные спирты или хлорид натрия. В частности, характерные примеры подходящих носителей включают: (1) фосфатно-солевой буферный раствор на среде Дульбекко, рН~7,4, содержащий или не содержащий примерно от 1 до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, (2) 0,9% солевой раствор (0,9% вес/объем хлорида натрия (№С1)) , и (3) 5% (вес/объем) декстрозу; и могут также содержать антиоксидант, такой как триптамин, а также стабилизирующее средство, такое как Т\тееп 20.
Композиции в данном описании могут также содержать добавочное терапевтическое средство, если этого требует лечение конкретного заболевания. Предпочтительно, чтобы антитело, фрагмент антитела или конъюгат антитела по настоящему изобретению и дополнительное активное соединение обладали дополняющими друг друга активностями, которые не влияют неблагоприятно друг на друга. В предпочтительном варианте осуществления добавочное терапевтическое средство является антагонистом фактора роста фибробластов (РСР), фактора роста гепатоцитов (НОР), тканевого фактора (ТР), белка С, белка 8, тромбоцитарного фактора роста (РЭСЕ) или рецептора НЕЯ2.
Композиции по данному изобретению могут находиться в разных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, но предпочтительная форма зависит от намеченных способов введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции находятся в форме инъецируемых или инфузируемых растворов. Предпочтительным способом введения является парентеральный (например, внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный, подкожный). В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению вводят внутривенно в виде болюсной инъекции или путем непрерывной инфузии в течение определенного периода времени. В другом предпочтительном варианте осуществления их инъецируют внутримышечно, подкожно, интраартикулярно, внутрисуставно, внутрь опухоли, возле опухоли, в пораженную ткань или возле пораженной ткани для проявления как местных, так и системных эффектов.
Стерильные композиции для парентерального введения можно получать путем внесения антитела, фрагмента антитела или конъюгата антитела по настоящему изобретению в необходимом количестве в подходящий растворитель с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. В качестве растворителя или среды можно использовать воду, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстрозу, глицерин, этанол и им подобные, а также их сочетания. Во многих случаях в композицию предпочтительно включать изотонические средства, такие как сахара, многоатомные спирты или хлорид натрия. Эти композиции могут также содержать адъюванты, в частности, увлажняющие, изотонирующие, эмульгирующие, диспергирующие и стабилизирующие средства. Стерильные композиции для парентерального введения можно также получать в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворять во время использования в стерильной воде или любой другой стерильной среде для инъекции.
Антитело, фрагмент антитела или конъюгат антитела по настоящему изобретению можно также вводить перорально. В качестве твердых композиций для перорального введения можно использовать таблетки, пилюли, порошки (желатиновые капсулы, пакеты-саше) или гранулы. В этих композициях активный ингредиент по данному изобретению смешивают в потоке аргона с одним или более инертными разбавителями, такими как крахмал, целлюлоза, сахароза, лактоза или силикагель. Эти композиции могут также содержать вещества, отличные от разбавителей, например, одно или более смазывающих веществ, таких как стеарат магния или тальк, краситель, оболочку (покрытая сахаром таблетка) или глазурь.
В качестве жидких композиций для перорального введения можно использовать фармацевтически приемлемые растворы, суспензии, эмульсии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, такие как вода, этанол, глицерин, растительные масла или парафиновое масло. Эти композиции могут содержать вещества, отличные от разбавителей, например, увлажняющие вещества, подсластители, загустители, ароматизирующие или стабилизирующие продукты.
Дозы зависят от желаемого эффекта, продолжительности лечения и используемого способа введения; они составляют обычно от 5 до 1000 мг в сутки перорально для взрослого при однократной дозе в пределах от 1 до 250 мг активного вещества. Как правило, подходящую дозировку подбирает врач в зависимости от возраста, веса и других факторов, специфических для субъекта, подвергающегося лечению.
Терапевтические методы применения
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования ак
- 31 020324 тивности рецептора ЕрЕА2 путем введения антитела, которое является антагонистом указанного рецептора ЕрЕА2, пациенту, который в этом нуждается. Терапевтически можно использовать любой тип антител, фрагментов антител или цитотоксических конъюгатов по изобретению. Таким образом, данное изобретение включает применение антагонистических анти-ЕрЕА2 антител, их фрагментов, или их цитотоксических конъюгатов в качестве лекарственных средств.
В предпочтительном варианте осуществления антитела, фрагменты антител или цитотоксические конъюгаты по данному изобретению применяют для лечения гиперпролиферативного заболевания у млекопитающего. В более предпочтительном варианте осуществления одну из раскрытых выше фармацевтических композиций, содержащую антитело, фрагмент антитела или цитотоксический конъюгат по изобретению, применяют для лечения гиперпролиферативного заболевания у млекопитающего. В одном варианте осуществления данное заболевание представляет собой рак. В частности, рак представляет собой метастатический рак. Антитела, фрагменты антител и цитотоксические конъюгаты по изобретению можно также использовать для лечения неоваскуляризации в указанной раковой опухоли.
Соответственно, фармацевтические композиции по данному изобретению являются полезными для лечения или профилактики различных видов рака, включая (но не ограничиваясь ими) следующие: карциному, включая карциномы мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почек, печени, легких, яичников, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи, включая плоскоклеточную карциному; гемопоэтические опухоли лимфоидной линии дифференцировки, включая лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Беркитта; гемопоэтические опухоли миелоидной линии дифференцировки, включая острые и хронические миелогенные лейкозы и промиелоцитарный лейкоз; опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому; другие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванному; опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; а также другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоактантому, семиному, тиреофоликуллярную карциному и тератокарциному, а также другие, которые еще предстоит определить, раковые заболевания, при которых главным образом экспрессируются ЕрЕА. В предпочтительном варианте осуществления рак представляет собой рак легких, молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, почек, поджелудочной железы, матки, яичников, шейки матки и лимфатических органов, остеосаркому, синовиальную карциному, саркому головы и шеи, глиому, желудочную, печеночную и другие карциномы, при которых экспрессируются ЕрЕА. В другом варианте осуществления указанная фармацевтическая композиция относится к другим заболеваниям, таким как, например, аутоиммунные заболевания, такие как системная волчанка, ревматоидный артрит и рассеянный склероз; отторжения трансплантата, такие как отторжение почечного трансплантата, отторжение трансплантата печени, отторжение трансплантата легкого, отторжение сердечного трансплантата и отторжение трансплантата костного мозга; реакция трансплантат против хозяина; вирусные инфекции, такие как корь, ВИЧ, СПИД и тому подобные; а также паразитарные инфекции, такие как лямблиоз, амебиаз, шистосомоз и др., как определит рядовой специалист в данной области.
Аналогичным образом, настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста выбранных клеточных популяций, включающему приведение в контакт клеток-мишеней, или ткани, содержащей клетки-мишени, с эффективным количеством антитела, фрагмента антитела или конъюгата антитела по настоящему изобретению, либо антитела, фрагмента антитела или терапевтического средства, содержащего цитотоксический конъюгат, либо в отдельности, либо в сочетании с другими цитотоксическими или терапевтическими средствами.
Способ ингибирования роста выбранных клеточных популяций может быть применен на практике ш νίΐτο, ш νίνο или ех νίνο. Как используется в данном описании, ингибирование роста означает замедление роста клетки, снижение жизнеспособности клетки, вызывающее гибель клетки, лизис клетки и индукцию гибели клетки в течение либо короткого, либо длительного периода времени.
Примеры использования ш νίΐτο включают терапевтическую обработку аутогенного костного мозга перед его трансплантацией тому же пациенту с целью уничтожения пораженных болезнью или злокачественных клеток; терапевтическую обработку костного мозга перед его трансплантацией с целью уничтожения компетентных Т-клеток и предотвращения реакции трансплантат-против-хозяина (Ογκο); терапевтическую обработку клеточных культур с целью уничтожения всех клеток, за исключением желательных вариантов, которые не экспрессируют целевой антиген; либо уничтожения вариантов, экспрессирующих нежелательный антиген.
Условия неклинического использования ш νίΐτο могут быть легко определены специалистом в данной области.
Примерами клинического ех νίνο использования являются удаление опухолевых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга перед аутологической трансплантацией при лечении рака или при лечении аутоиммунных заболеваний, либо удаление Т-клеток и других лимфоидных клеток из аутоген
- 32 020324 ных или аллогенных костного мозга или ткани перед трансплантацией для предотвращения реакции трансплантат-против-хозяина (СУНЭ). Терапевтическую обработку проводят следующим образом. Костный мозг отбирают у пациента или другого индивидуума и затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, к которой добавлено цитотоксическое средство по данному изобретению. Диапазон концентраций составляет примерно от 10 мкМ до 1 пМ, в течение примерно от 30 мин до примерно 48 ч при примерно 37°С. Точные параметры концентрации и времени инкубации, то есть дозировку, может легко определить специалист в данной области. После инкубации клетки костного мозга промывают средой, содержащей сыворотку, и снова вводят пациенту путем внутривенной инфузии известными способами. При обстоятельствах, когда пациент получает другое лечение, такое как курс разрушающей химиотерапии или тотального облучения всего организма, между временем отбора костного мозга и реинфузией терапевтически обработанных клеток, обработанные клетки костного мозга хранят замороженными в жидком азоте, используя стандартное медицинское оборудование.
Для клинического ш νί\Ό использования антитело, эпитопсвязывающий фрагмент антитела или цитотоксический конъюгат по данному изобретению будет поставляться в виде растворов, которые проверены на стерильность и уровни эндотоксинов. Примерами подходящих протоколов введения цитотоксического конъюгата являются следующие. Конъюгаты вводят еженедельно в течение 4 недель в виде в/в болюсной инъекции каждую неделю. Болюсные дозы вводят в объеме от 50 до 100 мл изотонического раствора, к которому может быть добавлено от 5 до 10 мл человеческого сывороточного альбумина. Дозировки составят от 10 мкг до 100 мг за одно в/в введение (диапазон от 100 нг до 1 мг/кг в сутки). Более предпочтительно дозировки будут находиться в пределах от 50 мкг до 30 мг. Наиболее предпочтительно дозировки будут находиться в пределах от 1 до 20 мг. Через четыре недели лечения пациент может продолжать получать лечение на еженедельной основе. Конкретные клинические протоколы в отношении пути введения, эксципиентов, разбавителей, дозировок, расписания и так далее, могут быть определены специалистом в данной области в виде предписаний в зависимости от клинической ситуации.
Диагностика
Антитела или фрагменты антител по данному изобретению можно также использовать для обнаружения Ер11А2 в биологическом образце ш νίΙΐΌ или ш νί\Ό. В одном варианте осуществления анти-ЕрйА2 по изобретению применяют для определения уровня Ер11А2 в ткани или в клетках, происходящих из данной ткани. В предпочтительном варианте осуществления данная ткань является пораженной болезнью тканью. В предпочтительном варианте осуществления способа данная ткань является опухолью или ее биопсией. В предпочтительном варианте осуществления способа ткань или ее биопсию сначала иссекают у пациента, а затем могут быть определены уровни Ер11А2 в данной ткани или биопсии иммуноанализом с антителами или фрагментами антител по изобретению. Ткань или ее биопсия может быть заморожена или фиксирована. Такой же способ можно применять для определения других свойств белка Ер11А2, таких как его уровень фосфорилирования по остаткам тирозина, уровни на клеточной поверхности или клеточная локализация.
Вышеописанный способ можно применять для диагностирования рака у субъекта, страдающего от рака, или у которого подозревают рак, при этом уровень Ер11А2, измеренный у указанного пациента, сравнивают с таковым у нормального контрольного субъекта или со стандартом. Указанный способ затем можно применять для определения, экспрессирует ли опухоль Ер11А2, и это может означать, что данная опухоль хорошо отреагирует на лечение антителами, фрагментами антител или конъюгатами антител по настоящему изобретению. Предпочтительно опухоль является раком легких, молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, почек, поджелудочной железы, матки, яичников, шейки матки и лимфатических органов, остеосаркомой, синовиальной карциномой, саркомой, глиомой, желудочной, печеночной, головы и шеи, а также другими карциномами, при которых экспрессируются Ер11А2, и другими, которые еще предстоит определить, видами рака, при которых главным образом экспрессируются ЕрйА2.
Настоящее изобретение дополнительно относится к моноклональным антителам, гуманизированным антителам и их эпитопсвязывающим фрагментам, которые дополнительно метят для использования в исследованиях или диагностических применениях. В предпочтительных вариантах осуществления метка является радиоактивной меткой, флюорофором, хромофором, визуализирующим средством или металлическим ионом.
Также предлагают способ диагностики, при котором указанные меченые антитела или их эпитопсвязывающие фрагменты вводят субъекту с подозрением на раковое заболевание и измеряют или контролируют распределение метки в организме субъекта.
Набор
Настоящее изобретение также включает наборы, например, содержащие описанный цитотоксический конъюгат и инструкции по применению данного цитотоксического конъюгата для уничтожения конкретных типов клеток. Инструкции могут включать указания для применения цитотоксических конъюгатов ш νίΙΐΌ, ш νί\Ό или ех νί\Ό.
Как правило, такой набор будет иметь отделение, содержащее цитотоксический конъюгат. Данный цитотоксический конъюгат может быть в лиофилизированной форме, жидкой форме или других формах,
- 33 020324 модифицируемых так, чтобы быть включенными в набор. Набор может также содержать дополнительные элементы, необходимые для практического применения способа, описанного в инструкциях данного набора, такие как стерилизованный раствор для растворения лиофилизированного порошка, дополнительные средства для комбинирования с цитотоксическим конъюгатом перед введением пациенту и приспособления, облегчающие введение конъюгата пациенту.
Примеры
Пример 1.
Получение гибридом анти-Ер11Л2 моноклональных антител
Четыре мыши ВАЬВ/с νΛΕ иммунизировали трансфицированными ЕрЬА2 человека клетками 30019, линией В-клеток-предшественников, происходящих из мышей ВЛЬВ/с. Стабильно трансфицированные клетки, сверхэкспрессирующие антиген, получали трансфекцией клеток 300-19 кДНК полноразмерного человеческого Ер11Л2 и селекцией клонов с высокой экспрессией с помощью проточной цитометрии. Клон 4-6, клон с высокой экспрессией человеческого рецептора ЕрЬА2 на поверхности клеток, был выбран в качестве иммуногена для иммунизации мышей и для скрининга гибридом с помощью антител. Клетки, трансфицированные Ер11Л2. поддерживали в селекционной среде, содержащей 0418 в конечной концентрации 1 мг/мл, и регулярно тестировали на экспрессию ЕрЬА2 с помощью коммерчески доступного антитела.
Мышам Ва1Ь/с инъецировали подкожно примерно 5х 106 трансфицированных ЕрЬА2 клеток 300-19 в 200 мкл фосфатно-солевого буферного раствора (РВ8) на мышь. Инъекции выполняли каждые 2-3 недели по стандартным протоколам иммунизации компании IттиηοΟеη, 1пс. За три дня до слияния клеток мышам проводили еще одну внутрибрюшинную бустер-инъекцию той же дозой антигена и в день слияния клеток умерщвляли для получения клеток селезенки согласно стандартным протоколам процедур использования лабораторных животных.
Селезенку забирали у иммунизированной мыши в стерильных хирургических условиях и измельчали между двух стерильных и матированных предметных стекол, чтобы получить суспензию единичных клеток в среде КРМ1-1640. Спленоциты осаждали и дважды промывали средой КРМ1-1640 перед слиянием клеток. Клетки селезенки смешивали с клетками мышиной миеломы Р3Х63Лд8.653 (Кеагиеу, ТЕ. с1 а1., 1979. I. Iттиηο1., 123: 1548-1550) и проводили слияние, используя полиэтиленгликоль-1500 в качестве вещества, способствующего слиянию (КосЬе 783 641). После слияния клеток и центрифугирования клетки суспендировали в полной среде КРМ1-1640 (200 мл), содержащей добавку гипоксантинаминоптерин-тимидин (НАТ) (81дта Н-0262), и высевали в десять 96-луночных плоскодонных планшетов (Соттд-Сов1аг 3596, 200 мкл клеточной суспензии на лунку). После инкубации при 37°С, 5% СО2 в течение 5 дней 100 мкл культурального супернатанта удаляли из каждой лунки планшета и заменяли равным объемом полной среды КРМ1-1640, содержащей добавку гипоксантин-тимидин (НТ) (81дта Н0137). Инкубацию (в атмосфере 5% СО2 при 37°С) продолжали до тех пор, пока клоны гибридом не вырастали в колонии, достаточно крупные для проведения скрининга с помощью антител.
На 10 день после слияния, когда количество гибридомных клеток в лунках увеличивалось до половинной конфлюэнтности, и супернатант изменил цвет на оранжевый, гибридомные супернатанты отбирали из гибридизационных планшетов для скрининга антителами методом иммуноанализа. Для предварительного скрининга гибридомные супернатанты тестировали на клетках, трансфицированных ЕрЬА2, против родительских клеток 300-19 методом проточной цитометрии. Клетки окрашивали 50 мкл гибридомного супенатанта с последующей инкубацией в присутствии конъюгата флуоресцеина с антителами козы против мышиных 1д0 (Н+Ь) и анализировали проточной цитометрией на приборе ВесЮи ΟχΕίηδοη ЕАС8Са11Ьиг или ЕАС8Аггау. Гибридомные клоны с положительными результатами анализа на клетках, трансфицированных Ер11А2, но с отрицательными результатами на клетках 300-19, отбирали, наращивали, замораживали для хранения или субклонировали методом серийных разведений, чтобы добиться моноклональной популяции. Специфические антитела, секретируемые гибридомными клетками, изотипировали с помощью коммерчески доступных реагентов для изотипирования (КосЬе 1493027).
На основе данных проточной цитометрии, 29 гибридомных клонов, которые специфически реагировали с клетками, трансфицированными человеческим ЕрЬА2, но не с родительскими клетками 300-19, были идентифицированы и выбраны в результате иммунизации мышей человеческими антигенами ЕрЬА2.
Пример 2.
Характеристики связывания анти-ЕрЬА2 антител 37.3Ό7, 37.1Е5, 53.2Н11, Ερ1ιΛ2-Ν1 и Ερ1ιΛ2-Ν2
Специфическое связывание каждого из очищенных анти-ЕрйА2 антител, 37.3Ό7, 37.1Е5 и 53.2Н11, было показано методом клеточной сортировки с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) с использованием клеток, сверхэкспрессирующих человеческий ЕрЬА2, и с использованием клеток, не экспрессирующих ЕрЬА2 (фиг. 1А, В и С). Инкубацию антитела 37.3Ό7 или антитела 37.1Е5, или антитела 53.2Н11 (60 нМ) в 100 мкл холодного ЕАС8-буфера (1 мг/мл В8А в среде Дульбекко МЕМ) проводили с использованием клеток, сверхэкспрессирующих человеческий ЕрЬА2, и клеток, не экспрессирующих ЕрЬА2, в круглодонных 96-луночных планшетах на льду. Через 1 ч клетки осаждали центрифугированием и промывали холодным ЕАС8-буфером, а затем инкубировали с конъюгатом антитела козы против 1д0 мыши-Е1ТС
- 34 020324 (100 мкл, 6 мкг/мл в РАСЗ-буфере) на льду в течение 1 ч. Клетки затем осаждали, промывали и ресуспендировали в 200 мкл 1% раствора формальдегида в РВ8. Образцы клеток затем анализировали на ридере ЕАСЗСаНЬнг (ВО Вюкаепсек).
Был получен сильный сдвиг флуоресценции во время инкубации клеток, сверхэкспрессирующих человеческий Ер11А2, с антителом 37.3Ό7, 37.1Р5 или 53.2Н11, в отличие от незначительного сдвига при инкубации клеток, не экспрессирующих человеческий Ер11А2, с антителом 37.3Ό7, 37.1Р5 или 53.2Н11 (фиг. 1А, 1В и 1С), что свидетельствует о том, что антитела 37.3Ό7, 37.1Р5 и 53.2Н11 избирательно связываются с человеческим Ер1А2. Положительно-контрольное анти-Ер11А2 антитело, В2Э6 (Ирк1а1е), вызывало похожий сдвиг флуоресценции при инкубациях с клетками, сверхэкспрессирующими человеческий Ер1А2 (фиг. 1А). Сильный сдвиг флуоресценции также наблюдали при РАСЗ-анализе с использованием 37.3Ό7 и человеческих раковых клеток, таких как человеческие МЭА-МВ-231 клетки рака молочной железы, человеческие НТ-29 клетки рака толстой кишки, человеческие ВхРС3 клетки рака поджелудочной железы, что свидетельствует о том, что антитело 37.3Ό7 связывается с человеческим Ер1А2 на поверхности человеческих опухолевых клеток (фиг. 2). Схожие данные были также получены с использованием антител 37.1Р5 и 53.2Н11 с линиями человеческих опухолевых клеток.
Относительные константы диссоциации (Кс) для связывания антител 37.3Ό7, 37.1Р5 и 53.2Н11 с человеческим Ер1А2 на поверхности клеток определяли РАСЗ-анализами связывания антитела в различных концентрациях с клетками, сверхэкспрессирующими человеческий Ер11А2, и человеческими МЭАМВ-231 клетками рака молочной железы (фиг. 3). Значения Кс оценивали нелинейной регрессией для связывания по одному сайту. Из кривых связывания получали значения относительных Кс, составляющие 0,3 нМ для антитела 37.3Ό7, 0,07 нМ для антитела 37.1Р5 и 0,14 нМ для антитела 53.2Н11 (фиг. 3А, 3С и 3Е).
С помощью того же экспериментального протокола были определены значения относительных Кс, составляющие 0,18 и 0,05 нМ, соответственно, для Ер11А2-Ю и Ер11А2-№.
Сильный сдвиг флуоресценции был получен во время инкубации клеток, сверхэкспрессирующих Ер1А2 мыши или Ер1А2 крысы, с антителом 37.3Ό7 или антителом 53.2Н11, в отличие от незначительного сдвига во время инкубации клеток, не экспрессирующих Ер1А2 мыши или Ер1А2 крысы, с антителом 37.3Ό7 или антителом 53.2Н11 (фиг. 4), что свидетельствует о том, что антитела 37.3Ό7 и 53.2Н11 связывают также Ер1А2 мыши и Ер1А2 крысы. Сильный сдвиг флуоресценции также наблюдали во время РАСЗ-анализа с использованием антитела 37.3Ό7 или 37.1Р5, или 53.2Н11 и эпителиальных клеток обезьяны УЕРО (СетсорйЬесик аебнорк) (фиг. 5А), что свидетельствует о том, что 37.3Ό7, 37.1Р5 и 53.2Н11 также связываются с Ер1А2 обезьяны. Кажущиеся значения Кс оценивали нелинейной регрессией для связывания по одному сайту. Из кривых связывания по результатам РАСЗ-анализа получали значения Кс, составляющие 0,15 нМ для 37.3Ό7, 0,05 нМ для 37.1Р5 и 0,07 нМ для 53.2Н11 на клетках обезьяны (фиг. 5В, 5Ό и 5Р).
Пример 3.
Ингибирование связывания эфрина А1 с клетками МЭА-МВ-231 антителами 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ер11/\2А1 и ЕрйА2-№
Связывание эфрина А1 с человеческими клетками МЭА-МВ-231 рака молочной железы ингибировалось антителами 37.3Ό7, 37.1Р5 и 53.2Н11 (фиг. 6). Клетки МИА-МВ-231 инкубировали в присутствии и в отсутствие 5 мкг/мл антитела 37.3Ό7, 37.1Р5 или 53.2Н11 в течение 2 ч с последующей инкубацией в присутствии 100 нг/мл биотинилированного эфрина А1 в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки дважды промывали бессывороточной средой для удаления несвязанного биотин-эфрина А1, а затем лизировали в 50 мМ буфере НЕРЕЗ, рН 7,4, содержащем 1% ΝΓ-40 и ингибиторы протеаз. Планшеты для ЕЫЗА 1тти1оп-2НВ покрывали моноклональным анти-ЕрйАЗ антителом мыши (Ό7, ирк1а1е) и использовали для захвата Ер1А2 и связанного биотин-эфрина А1 из лизата. Связывание покрывающего антитела с цитоплазматическим С-концевым доменом Ер1А2 не мешало связыванию биотин-эфрина А1 с внеклеточным доменом Ер11А2. Лунки промывали, инкубировали с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена, вновь промывали и затем проявляли субстратом АВТЗ/Н2О2. Ингибирование связывания эфрина А1 с клетками Μ^Л-ΜВ-231 антителами 37.3Ό7, 37.1Р5 или 53.2Н1 в концентрации 5 мкг/мл было в основном количественным; сигнал был практически равен фоновому сигналу ЕМЗА, полученному при использовании контроля, где не задействован биотин-эфрин А1 (фиг. 6А, 6В и 6С).
И Ер^АЗ-Ю, и Ер11А2-№ были способны ингибировать связывание человеческого эфрина А1 с клетками МЭА-МВ-231 в той же степени, что и 37.3Ό7.
Пример 4.
Ингибирование опосредованной Ер1А2 клеточной передачи сигнала антителами 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, Ер11/\2А1 и ЕрйА2-№
Обработка человеческих клеток МЭА-МВ-231 рака молочной железы антителом 37.3Ό7 или 37.1Р5 полностью ингибировала внутриклеточную передачу сигнала рецептором Ер1А2, о чем свидетельствовало ингибирование аутофосфорилирования рецептора Ер1А2 (фиг. 7А), а также ингибирование фосфорилирования его эффекторов в нисходящем направлении, таких как Ак1 (фиг. 7В). Обработка клеток СРРАС-1 рака поджелудочной железы антителом 37.3Ό7 или антителом 53.2Н11 полностью ингибирова
- 35 020324 ла внутриклеточную передачу сигнала рецептором ЕрНА2, о чем свидетельствовало ингибирование аутофосфорилирования рецептора ЕрНА2 (фиг. 7С).
На фиг. 7А и 7С клетки МЭА-МВ-231 молочной железы или клетки СРРАС-1 поджелудочной железы выращивали на обычной среде (как предложено АТСС для каждой клеточной линии), содержащей сыворотку, в течение 3 дней, затем культивировали в бессывороточной среде в течение 12-14 ч. Истощенные в бессывороточной среде клетки обрабатывали антителом 37.3Ό7, 37.1Р5 или 53.2Н11 в концентрации 15 мкг/мл, либо контрольным 1дС1, в течение 2 ч с последующей стимуляцией эфрином А1-Рс (Η&Ό) в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 мин при 37°С. Затем клетки лизировали в ледяном лизисном буфере, содержащем ингибиторы протеаз и фосфатаз (50 мМ буфер НЕРЕ8, рН 7,4, 1% ΝΈ-40, 1 мМ ортованадат натрия, 100 мМ фторид натрия, 10 мМ пирофосфат натрия, 2,5 мМ ЕЭТА, 10 мкМ леупептин, 5 мкМ пепстатин, 1 мМ РМ8Р, 5 мМ бензамидин и 5 мкг/мл апротинин). Лизаты подвергали иммунопреципитации с помощью анти-ЕрНА2 антитела Ό7 (Ирк!а!е), присоединенного к бусам с белком А/О. Иммунопреципитированный ЕрНА2 разделяли в δΌδ-полиакриламидном геле и анализировали методом вестерн-блоттинга с моноклональным антителом 4О10 (Се11 ЗщпаНпд ТесНпо1оду), специфичным для остатков фосфотирозина. Чтобы оценить уровень белка ЕрНА2 в каждом иммунопреципитированном образце, ту же самую мембрану подвергали повторному блоттингу с анти-ЕрНА2 антителом Ό7 (Ирк1а!е). Использование контрольного антитела не выявило ингибирования стимулированного эфрином А1 аутофосфорилирования рецептора ЕрНА2 (фиг. 7С). Напротив, полное ингибирование стимулированного эфрином А1 аутофосфорилирования рецептора ЕрНА2 было получено при обработке антителом 37.3Ό7, 37.1Р5 или 53.2Н11 (фиг. 7А и 7С). Стимулированная эфрином А1 активация эффекторов в нисходящем направлении, таких как Ак1, также была ингибирована в клетках МЭА-МВ-231 антителом 37.3Ό7 или 37.1Р5, как показано методом вестерн-блоттинга лизатов с использованием поликлонального антифосфо-8ег473 Ак! антитела кролика (Се11 ЗщпаНпд ТесНпо1оду) (фиг. 7В).
Антитела 37.3Ό7 и 53.2Н11 сами по себе не стимулировали аутофосфорилирование ЕрНА2 в человеческих клетках МЭА-МВ-231 рака молочной железы, в противоположность стимулирующему эффекту эфрина А1 на аутофосфорилирование ЕрНА2 в клетках МОА-МВ-231 (фиг. 8А и 8В). Сходные данные получены для антитела 37.1Р5 с использованием клеток МОА-МВ-231. На фиг. 8 клетки МОА-МВ-231 выращивали на обычной среде, содержащей сыворотку, в течение 3 дней, затем культивировали в бессывороточной среде в течение 12-14 ч. Истощенные в бессывороточной среде клетки обрабатывали эфрином А1-Рс в концентрации 1 мкг/мл, либо антителом 37.3Ό7 или 53.2Н11 в концентрации 15 мкг/мл в течение 10 мин. Клеточные лизаты подвергали иммунопреципитации с помощью анти-ЕрНА2 антитела Ό7 (Ирк1а!е). После разделения в δΌδ-полиакриламидном геле блот исследовали с помощью антифосфотирозинового антитела 4О10 (Се11 ЗщпаНпд ТесНпо1оду) и анти-ЕрНА2 антитела Ό7 (Ирк!а!е). Сходные результаты были получены на человеческих клетках МЭА-МВ-231 рака молочной железы как с ЕрНА2-№, так и с ЕрНА2-№, поскольку ни одно из данных антител не стимулирует аутофосфорилирование ЕрНА2 само по себе, в то время как каждое из них предотвращает эфрин А1-зависимое фосфорилирование рецептора ЕрНА2.
Следовательно, антитела 37.3Ό7, 37.1Р5, 53.2Н11, ЕрНА2-М и ЕрНА2-№ являются уникальными среди всех известных анти-ЕрНА2 антител по своей способности ингибировать стимулированную эфрином А1 внутриклеточную передачу сигнала ЕрНА2.
Пример 5.
Ингибирование стимулированных сывороткой роста и выживаемости человеческих опухолевых клеток антителами 37.3Ό7 и 53.2Н11
Некоторые линии человеческих опухолевых клеток тестировали в бессывороточных условиях на зависимость их роста и выживаемости от сыворотки в присутствии антитела 37.3Ό7 или 53.2Н11. Приблизительно по 3000 клеток/лунку высаживали на 96-луночный планшет в обычной среде (как предложено АТСС для каждой клеточной линии), содержащей сыворотку, которую заменяли на бессывороточную среду на следующий день. После одного дня роста в бессывороточной среде клетки инкубировали с 15 мкг/мл антитела 37.3Ό7 или антитела 53.2Н11 или контрольного 1дС1, после чего добавляли сыворотку до конечной концентрации, составляющей 1 или 1,5%. Затем клеткам давали возможность расти в течение еще 3 дней. Затем добавляли раствор МТТ [3-(4,5)диметилтиазол-2-ил-2,3-дифенилтетразолия бромид, 25 мкл 5 мг/мл раствора в РВ8], и клетки вновь помещали в инкубатор на 2-3 ч. Затем среду удаляли и заменяли на 100 мкл ΌΜ8Ο, перемешивали и измеряли поглощение в планшете при 545 нм. Некоторые линии человеческих опухолевых клеток демонстрировали ответную реакцию роста и выживаемости на добавление сыворотки, которая существенно ингибировалась антителом 37.3Ό7 или 53.2Н11. В качестве примеров представлены результаты по линиям опухолевых клеток толстой кишки, НТ-29, ЬоУо; линии опухолевых клеток поджелудочной железы, СРРАС-2, ВхРС3 и меланомы ИАСС-257.
Антитело 37.3Ό7 сильно ингибировало стимулированные сывороткой рост и выживаемость человеческих клеток НТ-29 рака толстой кишки (фиг. 9А). В другом эксперименте антитело 37.3Ό7 сильно ингибировало стимулированные сывороткой рост и выживаемость человеческих клеток ВхРСЗ рака поджелудочной железы дозозависимым образом со значением 1С50, равным 4 нМ (фиг. 10А). Кроме того, антитело 37.3Ό7 или 53.2Н11 сильно ингибировало стимулированные сывороткой рост и выживаемость че
- 36 020324 ловеческих клеток ЬоУо рака толстой кишки (фиг. 9В), человеческих клеток СЕРАС-1 рака поджелудочной железы (фиг. 9С) и раковых клеток ИАСС-257 меланомы (фиг. 90), а антитело 53.2Н11 ингибировало стимулированные сывороткой или ЕСЕ рост и выживаемость клеток ЬоУо дозозависимым образом со значением 1С50, равным 2 нМ (фиг. 10В и 10С). На фиг. 10 значения ОО545 для обработанных 0% сыворотки образцов было принято за 100% ингибирования, а 0% ингибирования было установлено с помощью образцов, обработанных 1,5% сывороткой или 10 нг/мл ЕСЕ. Ни одно из ранее описанных антиЕрЬА2 антител не обладало ингибиторными активностями в отношении зависимого от якорной подложки (монослойного) роста человеческих опухолевых клеток. Следовательно, антитела 37.307 и 53.2Н11 являются уникальными по их способности ингибировать зависимый от якорной подложки рост (монослойный рост) человеческих опухолевых клеток.
Пример 6.
Ингибирование опосредованной УЕСЕ клеточной передачи сигнала и стимулированных УЕСЕ роста и выживаемости эндотелиальных клеток пупочной вены человека (НИУЕС) антителом 37.307, 37.1Е5 и 53.2Н11
Сильный сдвиг флуоресценции был получен ЕАС8-анализом после инкубации клеток НИУЕС с антителом 37.307, 37.1Е5 или 53.2Н11, что указывает на связывание антител 37.307, 37.1Е5 и 53.2Н11 с рецепторами ЕрЬА2, экспрессированными на клетках НИУЕС. Кажущиеся константы диссоциации (Кс) для связывания антител 37.307, 37.1Е5 и 53.2Н11 с ЕрЬА2 на поверхности клеток были определены из кривых связывания, построенных с помощью ЕАС8-анализа связывания, проведенного при нескольких концентрациях, и представленных на фиг. 11. Значение Кс=0,3 нМ для антитела 37.307 было оценено нелинейной регрессией для связывания по одному сайту (фиг. 11), которое сходно со значением Кс связывания антитела 37.307 с человеческими раковыми клетками. Значение Кс=0,01 нМ для антитела 37.1Е5 и значение Кс=0,06 нМ для антитела 53.2Н11 были получены аналогично. Это означает, что антитела 37.307, 37.1Е5 и 53.2Н11 специфически связываются с клетками НИУЕС через рецептор ЕрЬА2.
Антитело 37.307 сильно ингибировало индуцированные УЕСЕ рост и выживаемость НИУЕС. Данная активность такая же или лучше, чем у Авастина®, анти-УЕСЕ блокирующего антитела (СепейесЬ) (фиг. 12). Агонистическое анти-ЕрЬА2 антитело не ингибировало индуцированные УЕСЕ рост и выживаемость НИУЕС (фиг. 12). На фиг. 12 клетки НИУЕС выращивали на среде ЕВМ-2 с добавлением сыворотки и эндотелиально-клеточных (ЕС) добавок (С1опеЕск) в течение 3 дней. Клетки культивировали в бессывороточной среде плюс ЕС ростовые добавки без УЕСЕ в течение 12-14 ч. После сывороточного истощения клетки стимулировали 5 нг/мл УЕСЕ плюс 0,4% сыворотки в присутствии или в отсутствие указанных антител (100 мкг/мл). Эффекты антител на индуцированные УЕСЕ рост и выживаемость клеток НИУЕС определяли через 3 дня после добавления антител и УЕСЕ с помощью анализа МТТ, как описано в примере 5. Процент ингибирования антителами опосредованных УЕСЕ роста и выживаемости показан на фиг. 12. Значения ОО545 для обработанных контрольной средой образцов были приняты за 0% ингибирования, а 100% ингибирования было установлено с помощью образцов без УЕСЕ.
Такая обработка клеток НИУЕС антителом 37.307 ингибирует внутриклеточную передачу сигнала рецептором ЕрЬА2, что было показано измерением ингибирования фосфорилирования его эффекторов в нисходящем направлении, таких как Ак!
Данное ингибирование сходно с таковым для Авастина®, анти-УЕСЕ блокирующего антитела (СепейесЬ) (фиг. 13). Агонистическое анти-ЕрЬА2 антитело не ингибировало индуцированное УЕСЕ фосфорилирование АЙ в клетках НИУЕС. На фиг. 13 клетки НИУЕС истощали в течение 12-14 ч на бессывороточной среде плюс ЕС добавки без УЕСЕ. Клетки обрабатывали антителами (20 мкг/мл) в течение 1 ч перед добавлением УЕСЕ (100 нг/мл). Клетки лизировали 15 мин после добавления УЕСЕ, и иммуноблоты изучали с помощью указанных антител.
Пример 7.
Подавление роста ксенотрансплантата НТ-29 рака толстой кишки человека у мышей антителом 37.307 (фиг. 14)
Ксенотрансплантаты НТ-29 рака толстой кишки человека приживляли мышам 8СГО подкожной инъекцией 2х106 клеток НТ-29. Когда у мышей обнаруживали пальпируемые (50 мм3) НТ-29 ксенотрансплантатные опухоли, их подвергали воздействию антитела 37.307 или контрольного антитела (1дС1) (1 мг/мышь, в/в, дважды в неделю) или одного РВ8 (100 мкл/мышь, в/в, дважды в неделю). Рост опухолей существенно замедлялся при воздействии антителом 37.307, по сравнению с воздействием контрольным антителом или одним РВ8. Никакой токсичности антитела 37.307 не наблюдали, судя по измерениям веса мышей.
Пример 8.
Ингибирование метастаза начальной МОА-МВ-231 опухоли молочной железы анти-ЕрЬА2 антителом Ьи53.2Н11
Противоопухолевую активность анти-ЕрЬА2 антитела Ьи532Н11 оценивали при однократном уровне дозы против начальной МОА-МВ-231 опухоли молочной железы, имплантированной подкожно самкам мышей 8СЮ. Также исследовали действие этого антитела на инвазию опухоли МОА-МВ-231 в по
- 37 020324 верхностных аксиальных и паховых лимфатических узлах. Для этого йи532Н11 вводили в дозе 40 мг/кг/введение внутривенно на 1, 5, 8, 12, 15, 19, 22 и 26 дни после имплантации опухоли. Контрольную группу оставляли без воздействия.
Для оценки противоопухолевой активности 1ш532Н11, животных ежедневно взвешивали, и опухоли измеряли 2-3 раза еженедельно штангенциркулем. Вес опухолей рассчитывали с помощью формулы масса (мг) = [длина (мм) х ширина (мм)2]/2. Противоопухолевую активность оценивали на основании 3 критериев 1) с учетом Т/С, определяемого как среднее значение веса опухоли (мг) обработанной группы, деленное на среднее значение веса опухоли необработанного контроля; 2) определение задержки роста опухоли (Т-С), где Т определяется как среднее время в днях, необходимое для достижения опухолями в обработанной группе 750 мг, а С представляет собой среднее время для достижения опухолями в контрольной группе такого же размера, и 3) уничтожение опухолевых клеток, определяемое как 1од10 уничтоженных клеток (в совокупности) = [значение Т-С в днях]/(Тб х 3,32). Т-С определено выше, и Тб представляет собой время в днях удвоения объема опухоли для контрольных опухолей, которое оценивается из прямой линии наилучшего соответствия на логарифмически-линейном графике роста опухолей контрольной группы в экспоненциальной фазе роста (диапазон 100-1000 мг).
В параллельном исследовании животных подвергали воздействию, как указано ранее, а на 28 день после имплантации опухоли всех мышей умерщвляли, и собирали подмышечные и паховые лимфатические узлы (средний размер опухоли в контрольной группе = 1558 мг). Для специфической идентификации опухолевых клеток ΜΌΑ-ΜΒ-231 в лимфатических узлах иммунохимическим окрашиванием использовали человеческое антитело К167. Рассчитывали площадь поверхности метастазов в лимфатических узлах (среднее по 2 гистологическим срезам) как 8 = площадь поверхности человеческих К167 х 100/площадь поверхности лимфатического узла.
Эффективность действия на первичную опухоль
1ш532Н11 хорошо переносимы при 40 мг/кг/введение (суммарная доза 320 мг/кг) при изменении веса тела +8,9% на 27 день. Такая доза замедляет опухолевый рост первичной опухоли (Т/С = 27% и 1,0 1од уничтоженных клеток в совокупности), даже если данная опухоль просочилась в процессе терапии.
Противометастатическая активность йи532Н11 вызывает снижение поверхности метастазов (> 50%) как в подмышечных, так и в паховых лимфатических узлах.
В заключение необходимо отметить, что у мышей, несущих опухоль молочной железы ΜΌΑ-ΜΒ231, 1ш53 2Н11 замедляет рост первичной опухоли, подвергнутой воздействию на ранней стадии развития опухоли (Т/С = 27% и 1,0 1од уничтоженных клеток в совокупности), и уменьшает поверхность метастазов (> 50%) как в подмышечных, так и в паховых лимфатических узлах.
В другом исследовании активность анти-Ер1А2 антитела могла быть оценена на модели печеночного метастаза человеческих клеток НТ29 рака толстой кишки. Мышиное анти-Ер1А2 антитело 53.2Н11 вводили в/в дважды в неделю, начиная с 4 дня после внутриселезеночой имплантации клеток НТ29 самкам мышей 8СШ (η=20 мышей на группу для не несущих опухоль животных (ΝΤΒΑ), подвергнутых обработке и контрольных). На 50 день, 3 дня после 13-го введения 3444^171^2, мышей подвергали некропсии, и их селезенку и печень взвешивали для оценки опухолевой массы либо по месту первичной опухоли (селезенка), либо по месту метастаза (печень). Также оценивали количество метастазов. Данные анализировали статистическими методами, известными специалисту в данной области.
Воздействие анти-ΕρйΑ2 при 40 мг/кг/инъекцию (суммарная доза 520 мг/кг) хорошо переносимо.
Вес первичной опухоли (селезенка): наблюдали значительную разницу в весе селезенки между ΝΤΒΑ и мышами с контрольной имплантацией, в последнем случае вес был больше. Не существовало никаких значимых различий между весом селезенки мышей с контрольной имплантацией и таковым для мышей, подвергнутых воздействию анти-Ερ11Α2.
Вес метастазов (печень): вес печени мышей с контрольной имплантацией был значительно больше, чем вес печени у ΝΤΒΑ; с другой стороны, он был значительно меньше у мышей, обработанных антиΕρ1Α2, чем у мышей с контрольной имплантацией.
Число печеночных метастазов: никаких статистических различий не было обнаружено между мышами с контрольной имплантацией и подвергнутыми воздействию анти-Ερ11Α2.
В заключение необходимо отметить, что внутриселезеночная имплантация человеческой аденокарциномы толстой кишки НТ-29 в значительной степени вызывает увеличение веса печени из-за метастатической опухолевой массы. Воздействие анти-Ερ11Α2 способно существенно снизить метастатическую опухолевую массу, как наблюдали по уменьшению веса печени мышей с имплантацией, без влияния на число метастазов, насчитываемых в печени.
Пример 9.
Клонирование и секвенирование легкой и тяжелой цепей антитела 37.1Р5
Получение РНК из гибридомных клеток, продуцирующих антитело 37.1Р5
Препараты суммарной РНК получали из 5х106 гибридомных клеток, продуцирующих антитело 37.1Р5, с помощью набора Κ,Νοαδν Ш1шргер кй фирмы 01адсн. Кратко, 5х106 клеток осаждали и ресуспендировали в 350 мкл буфера ВЬТ (содержащего 1% β-меркаптоэтанол). Суспензию гомогенизировали
- 38 020324 пропусканием ее через иглу калибра 21,5 и шприц примерно 10-20 раз или до тех пор, пока она не перестанет быть вязкой. Добавляли этанол (350 мкл 70% водного этанола) к гомогенату, который хорошо перемешивали. Раствор переносили в спин-колонку, помещали в 2-мл сборную пробирку и центрифугировали при >8000хд в течение 15 с. Колонку промывали дважды 500 мкл буфера ВРЕ, затем переносили в новую пробирку и элюировали 30 мкл свободной от РНКаз воды при 1-минутном центрифугировании. Элюат (30 мкл) вновь помещали на колонку для второго 1-минутного элюционного центрифугирования. Аликвоту 30 мкл элюата разбавляли водой и использовали для измерения УФ поглощения при 260 нм для количественного определения РНК.
Получение кДНК реакцией с обратной транскриптазой (ВТ) кДНК вариабельной области антитела 37.1Е5 создавали из суммарной РНК с помощью набора 8ирегкспр!П кй фирмы [пуйгодеп. Протоколам набора следовали точно, используя вплоть до 5 мкг суммарной РНК из мини-препаратов, полученных с помощью набора 01апеаку. Кратко, РНК, 1 мкл случайных праймеров и 1 мкл смеси йNТР доводили до 12 мкл свободной от РНКаз стерильной дистиллированной водой и инкубировали при 65°С в течение 5 мин. Затем смесь помещали на лед по меньшей мере на 1 мин. Затем добавляли 4 мкл 5х реакционного буфера, 2 мкл 0,1 М ЭТТ и 1 мкл ВЫакеОиТ, и смесь инкубировали при 25°С в течение 2 мин в термоциклере Μ1 Векеатсй. Термоциклер останавливали так, чтобы можно было добавить 1 мкл ферментов из набора 8ирегкспр!П, а затем запускали повторно на дополнительные 10 мин при 25°С перед сдвигом до 55°С в течение 50 мин. Реакционную смесь подвергали тепловой инактивации нагреванием до 70°С в течение 15 мин, и РНК удаляли добавлением 1 мкл РНКазы Н и инкубацией при 37°С в течение 20 мин.
Вырожденные реакции ПЦР
Данная методика для вырожденной реакции ПЦР первого цикла на кДНК, присходящей из гибридомных клеток, основана на способах, описанных у Аапд е! а1. (2000; 1 Iттипο1 Ме!йойк., 233(1-2): 16777) и Со е! а1. (1992, 1 Iттипο1., 148(4): 1149-54). Праймеры для этого цикла (табл. 2) содержат сайты рестрикции для облегчения клонирования в плазмиды рВ1иекспрШ.
Компоненты реакции ПЦР (табл. 3) смешивали на льду в тонкостенных пробирках для ПЦР, а затем переносили в термоциклер Μ1 ВекеатсЦ заранее нагретый и оставленный при 94°С.
Реакции проводили с помощью программы, взятой от Аапд е! а1., (2000, 1 Iттипο1 Ме!1ойк., 233(1-
2): 167-77), которая приведена ниже.
Название: Аапд45
1) 94°С 3:00 мин;
2) 94°С 0:15 с;
3) 4 5°С 1:00 мин;
4) 72°С 2:00 мин;
5) 6о!о 2 29 раз;
6) 72°С 6:00 мин;
7) 4°С постоянно;
8) конец.
Затем реакционные смеси ПЦР разгоняли в геле из 1% легкоплавкой агарозы, полосы от 300 до 400 п.о. вырезали, очищали с помощью мини-колонок Ζутο ΌΝΑ и посылали в фирму Адепсоий Ьюкаепсек для секвенирования. Соответствующие 5' и 3' ПЦР-праймеры использовали в качестве праймеров секвенирования для создания кДНК вариабельной области 37.1Е5 с двух направлений.
Клонирование 5'-концевой последовательности
Поскольку вырожденные праймеры, использованные для клонирования последовательностей кДНК вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи 37.1Е5, изменяют 5'-концевые последовательности, необходимы были дополнительные усилия по секвенированию для расшифровки полных последовательностей. Предварительную последовательность кДНК, полученную вышеописанными способами, применяли для поиска на сайте NСΒI ^ВИк! (1Шр://\у\у\\\псЬкп1т.ш11.доу/|с.|Ыак1/) мышиных гаметических последовательностей, от которых произошла последовательность 37.1Е5. Были разработаны ПЦРпраймеры (табл. 4) для отжига лидерной последовательности данного мышиного антитела так, чтобы новая реакция ПЦР могла привести к созданию кДНК полной вариабельной области, не измененной ПЦР-праймерами. Реакции ПЦР, очистки полос и секвенирование проводили, как описано выше. Гаметические последовательности, из которых предположительно произошли последовательности легкой цепи и тяжелой цепи ти37.1Е5, находятся в открытом доступе в СепЬапк под входящими номерами МИ8ЮКУВ3 и АР303839, соответственно.
Анализ пептидов для подтверждения последовательности
Информацию о последовательности кДНК для вариабельной области объединяли с гаметической последовательностью константной области для получения последовательностей кДНК полноразмерных антител. Затем рассчитывали молекулярные массы тяжелой цепи и легкой цепи и сравнивали с молекулярными массами, полученными методами ЖХ/МС анализов мышиного антитела 37.1Е5.
В табл. 5 приведены массы, рассчитанные на основании последовательностей кДНК для легкой це
- 39 020324 пи и тяжелой цепи 37.1Е5, вместе со значениями, измеренными методами ЖХ/МС. Измерения молекулярных масс находятся в соответствии с последовательностями кДНК как для легкой, так и для тяжелой цепи 37.1Р5.
В основном такой же способ использовали для клонирования легкой и тяжелой цепей 37.3Ό7 и 53.2Н11. Входящие номера в СенЬанк для гаметических последовательностей, из которых, очевидно, произошли легкая цепь и тяжелая цепь 37.3Ό7, являются, соответственно, ММИ231217 и ΑΓ303868. Для 53.2Н11 они являются, соответственно, ММШ31196 и ΑΓ303833; для ΕρйΑ2-N1, К02161 и 100488, соответственно; и для Ερ11Α2-N2. ΑΣ231222 и 100488, соответственно.
Пример 10.
Ингибирование роста экспрессирующих Ер^З опухолевых клеток гуманизированными-37.3И78РИВ-ИМ4 и гуманизированными-53.2Н11-8РИВ-ОМ4
Гуманизированные 37.3Ό7 и гуманизированные 53.2Н11 антитела конъюгировали с Ь-ИМ4 Х2'деацетил-М2'(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)мейтанзином при помощи линкера 8РИВ (Νгидроксисукцинимидный эфир 4-[2-пиридилдитио]масляной кислоты). Кратко, антитело модифицировали при концентрации 8 мг/мл с 5,5- или 6,5-кратным молярным избытком 8РИВ для 1ш53.2Н11 и 111.137.307, соответственно. Реакцию проводили в буфере А (50 мМ КР1/50 мМ №1С1/2 мМ Ε^ТΑ, рН 6,5, 95% об./об.) с ЕЮН (5% об./об.) в течение 90 мин при комнатной температуре. Затем модифицированное антитело очищали на колонке для обессоливания с 8ерйайех С25 в буфере А. Далее проводили реакцию модифицированного антитела с 1,7-кратным молярным избытком ИМ4 над линкером 8РИВ. Реакцию проводили при концентрации 2,5 мг/мл антитела в буфере А (97% об./об.) и ^МΑ (диметилацетамид, 3% об./об.) при комнатной температуре в течение 20 ч. Конъюгат очищали на колонке для обессоливания с 8ер11айе.х С25 с помощью 10 мМ гистидина, 130 мМ глицина, 5% сахарозы, рН 5,5. Отношение лекарственного средства к антителу составило 4,0 для йи37.3О7-8РОВ-0М4 и 3,1 для йи53.2Н11-8РОВ-ОМ4.
Эффекты 1ш37.3О7-8РОВ-ОМ4 и йи53.2Н11-8РОВ-ОМ4 на рост экспрессирующих Ер^/ опухолевых клеток были сначала протестированы в ίη уйго анализе клеточной пролиферации с А8Т-8 ((2-(2метокси-4-нитрофенил)-3 -(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2Н-тетразолия однонатриевая соль) (каталожный № СК04-11, Оорпйо Мо1еси1аг Тесйпощек, Шс). Тестировали несколько опухолевых клеточных линий человека. Приблизительно 2000 клеток/лунку высаживали в 96-луночный планшет в обычной среде (как предложено АТСС для каждой клеточной линии), содержащей 10% сыворотку, в присутствии 1ш37.3О7-8РОВ-ОМ4 или йи53.2Н11-8РОВ-ОМ4 в различных концентрациях. Затем клетки оставляли расти в течение 5 дней. Затем добавляли раствор А8Т-8 [20 мкл раствора], и клетки вновь помещали в инкубатор на 2-3 ч. Поглощение на планшете измеряли при 450 и 650 нм. В экспериментах использовали две контрольные группы. 0% выживаемости соответствует контролю из одной только среды. 100% выживаемости соответствует контролю из одних только клеток. Для анализа данных значения А650 нм (длина волны базовой линии) предварительно вычитали из соответствующих значений А450 нм. Затем значения А450 нм для каждого образца нормализовали вычитанием значений А450 нм для контроля нулевого уровня (только среда). Выживаемость фракций рассчитывали путем деления нормализованных значений А450 образцов на нормализованные значения А450 контроля (только клетки) (100% выживаемости-0% выживаемости). Значения 1од[ΑТ-^М4] откладывали по оси абсцисс, а выживаемость фракций откладывали по оси ординат.
Ни37.3О7-8РОВ-ИМ4 и 1ш53.2Н11-8РОВ-ОМ4 существенно ингибировали рост экспрессирующих Ερ11Α2 человеческих опухолевых клеток, включая клетки РС3 опухоли предстательной железы, клетки М^Α-М^Α-МВ-231 опухоли молочной железы, клетки АМ-115 меланомы, клетки А375 меланомы и клетки Ьо№ опухоли толстой кишки. В качестве примера приведены результаты, полученные на клетках РС3 опухоли предстательной железы. Ни37.3И7-8РОВ-ОМ4 или йи53.2Н11-8РОВ-ОМ4 сильно ингибировали рост клеток РС3 дозозависимым образом со сходными значениями Σί^ο, составляющими 0,02 нМ (фиг. 15А и 15В). Активность конъюгатов коррелировала с уровнями экспрессии Ερ11Α2. Требовалось более чем 50-кратное превышение концентрации 1ш,37.3О7-8РОВ-ОМ4 или 1ш53.2Н11-8РОВ-ОМ4 для ингибирования роста клеток 8К-Ме128 (значения ^0 1,3 нМ и >5 нМ, соответственно, фиг. 15А и 15В), которые экспрессировали почти не детектируемый уровень Ερ11Α2 на поверхности клеток (определено методом ΕΑС8, данные не представлены) (фиг. 15А и 15В). Следовательно, результаты ίη уйго анализов ингибирования роста продемонстрировали способность конъюгатов антагонистического 11^11^)31^2 антитела специфически ингибировать рост экспрессирующих Ερ11Α2 линий опухолевых клеток.
Были протестированы эффекты 1ш,37.3О7-8РОВ-ОМ4 и 1ш53.2Н11-8РОВ-ОМ4 на рост экспрессирующих Ερ11Α2 ксенотрансплантатов опухолей. В качестве примера приведено исследование на модели ксенотрансплантата опухоли молочной железы М^Α-МВ-231. Ксенотрансплантаты рака молочной железы человека М^Α-МВ-231 приживляли 5-недельным самкам мышей СВ17 8СГО подкожной инъекцией 1х107 клеток М^Α-МВ-231. Когда ксенотрансплантаты опухолей М^Α-МВ-231 приживлялись (средние размеры составляли 83 мм3), мышей подвергали воздействию однократной внутривенной инъекцией 1ш3О7-8РОВ-ОМ4, или йи2Н11-8РИВ-ОМ4 или РВ8. Дозы антител составляли 15 мг/кг массы тела мыши, 7,5 мг/кг массы тела мыши и 3,25 мг/кг массы тела мыши. Рост опухолей М^Α-МВ-231 полностью ингибировался конъюгатами как с 1ш,3О7-8РОВ-ОМ4, так и с йи2Н11-8РИВ-ОМ4 антителом при всех
- 40 020324 протестированных концентрациях, за исключением концентрации 3,25 мг/кг для Βπ2Η11-8ΡΌΒ-ΌΜ4, вызвавшей заметное замедление роста опухолевых клеток относительно РВ8-контроля (фиг. 16А и 16В). Средние объемы опухолей в каждой группе (6 мышей на группу) представлены на фиг. 16А и В. Таким образом, как йи3В7-8РВВ-ВМ4, так и Еи2Н11-8РПВ-ВМ4 обладают сильными ингибиторными активностями в отношении роста экспрессирующих Ер11А2 опухолей ιη у1уо. Никакой токсичности обоих конъюгатов с антителом не наблюдали, судя по измерениям массы тела.
Таблица 1А. Поверхностные остатки каркаса легкой цепи ти37.3Б7 и соответствующие остатки на тех же позициях по КаЬа! в антителе 28Е4 человека. Остатки, которые отличаются и вследствие этого изменены в антителе Еи37.3О7, находятся в серых ячейках (1, 10, 15, 100)
Поверхностные остатки каркаса легкой цепи ши37.3О7 и соответствующие остатки в антителе 28Е4 человека
позиция по КаЬаТ ти37.3ϋ7 28Е4
1 0 ΙΙ||||Ι1Ι·Ο
3 V V
5 т т
9 А А
767710/ . ' ь . у ' ·' 7 т , '
У- ~ '·
18 в в
40 Р Р
41 с с
57 с с
60 А А
67 3 3
80 3 3
81 Е Е
/7)67)70'0·; 6 ' ' ’ ‘ '/ з ’1 . ’ . ; с7:; С'·
107 К к
108 В в
Таблица 1В. Поверхностные остатки каркаса тяжелой цепи ти37.3Б7 и соответствующие остатки на тех же позициях по КаЬа! в антителе 28Е4 человека. Остатки, которые отличаются и вследствие этого изменены в антителе Еи37.3О7, находятся в серых ячейках (5, 9, 11, 13, 19, 28, 61, 64, 65, 74, 75). Остатки, отмеченные звездочкой (*), представляют собой результат обратной мутации к остатку ти37.3Б7 в одном или более вариантах Еи37.3О7
Поверхностные остатки каркаса тяжелой цепи ти37.3О7 и соответствующие остатки в антителе 28Е4 человека
позиция по КаЬаЪ ти37.3ϋ7 28Е4
1 <2 2
3 О 2
’ - 5 . . з '
\‘·;· '. Л.,' ' ’ ' з ; 6 ; . . А ...
'.^—11 6. ··' ,
: 13 ’ ‘ К , . к '·
14 Р Р
15 С с
19 ·:· 2 7-6: 7 7· · ’ к ··· :
23 к к
' , ' 28* . 3*
41 Р Р
42 с с
43 о 2
;67 661 ' 76 .· . 6 : 7- Е уб·7 ' / ’
- 41 020324
Таблица 2. Праймеры, используемые для вырожденных реакций ПЦР, основаны на тех, что приведены у Аапь е! а1., 2000, за исключением НтбКЬ (8Ε^ ΙΌ N0:58), взятого из Со е! а1., 1992. Смешанные основания обозначены следующим образом: Н=А+Т+С, 8=д+С, Υ^+Т, К= Θ+Т, М=А+С, К^+д,
У= Α+С+О
Праймер Последовательность
Ваш1дС1 (ЗЕф Ю N0:53) ЗСАЗЗАТССАТАЗАСАЗАТ6ССЗЗТЗТССТТТТЗЗС
1д32АЬат (ЗЕС ΙΟ N0:54) ЗЗАЗЗАТСССТТЗАССАСЗСАТССТАЗАЗТСА
ЕСОМН1 (ЗЕО 10 N0:55) СТТССЗЗААТТСЗАВЗТЦМАЗСТЗЗАЗЗАЗТС
ЕсоМН2 (ЗЕ<2 Ю N0:56) СТТССЗЗААТТСЗАВСТИМАЗСТаЗАЗЗАЗТСИЗЗ
Зас1МК (ЗЕ£ Ю N0:57) ССАЗСТСЗАУАТТЗТЗМТЗАСМСАНИСТМСА
Н1ПС1КЪ (5Ες ΙΟ ΝΟ:58) ТАТАСАССТСААССТТЗСАТСЗТЗЗЗААСАТЗЗАТАСАЗТТЗЗТЗС
Таблица 3. Реакционные смеси для ПЦР легкой и тяжелой цепи для клонирования последовательностей кДНК вариабельной области 37.1Р5
Реакционная смесь легкой цепи Реакционная смесь тяжелой цепи
5 мкл 1 ОХ реакционного буфера ПЦР (Косйе) 5 мкл 10Х реакционного буфера ПЦР (Косйе)
4 мкл 10 мМ смеси ΟΝΤΡ (2,5 мМ каждый) 4 мкл 10 мМ смеси 6ΝΤΡ (2,5 мМ каждый)
2 мкл матрицы (ОТ реакция) 2 мкл матрицы (ОТ реакция)
5 мкл 10 мкМ левого праймера 8ас1МК 2,5 мкл 10 мкМ левого праймера ЕсоМН1
5 мкл 10 мкМ правого праймера НтбКЬ 2,5 мкл 10 мкМ левого праймера ЕсоМН2
5 мкл ДМСО 5 мкл 10 мкМ правого праймера Ват1ёО1
0,5 мкл Тач полимеразы (КосЬе) 5 мкл ДМСО
23.5 мкл стерильной дистиллированной НЮ 0,5 мкл Тач полимеразы (КосЬе) 23,5 мкл стерильной дистиллированной НЮ
всего 50 мкл всего 50 мкл
Таблица 4. Праймеры 5'-концевой мышиной лидерной последовательности, используемые для второго цикла реакций ПЦР 37.1Р5. 3'-концевые праймеры идентичны тем, которые используют в первом цикле реакций, так как они служат затравкой соответствующих последовательностей константных областей
- 42 020324
Таблица 5. Рассчитанные на основе кДНК и измеренные при помощи ЖХ/МС молекулярные массы легкой и тяжелой цепей мышиного антитела 37.1Р5
Легкая цепь Тяжелая цепь
кДНК ЖХ/МС разница кДНК ЖХ/МС разница
37.1Р5 24031 Да 24029 Да 2 Да 49316 Да 49333 Да 17 Да
Список последовательностей <110>
ЗАКОГТ-АЧЕВТТЗ <120>
АНТАГОНИСТИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА <130>
ЕК2006030 РСТ <150>
<151>
ЕР 06291160.7
2006-07-18 <160>
<170>
РабепЫп νΘΓΞΪΟΠ
3.3 <210>
<211>
<212>
<213>
РКТ
Миз зр.
<400>
Зег Туг Тгр МеЬ
ΗΪ3 <210>
<211>
<212>
<213>
РКТ
Миз зр.
<400>
Азп Не Туг Рго
С1у
ТЬг
С1у
Азп
ТЬг
Азп
Туг
Азр С1и Ьуз РЬе Ме!
Азп <210> <211>
<212>
<213>
РКТ
Миз зр.
<400>
Тгр С1у Ьеи Ча1
Агд
Туг
РЬе
РЬе
А1а
Ме!
Азр
Туг <210>
<211>
<212>
<213>
РКТ
Миз зр.
<400>
ТЬг Ча1 Зег Зег
Зег
Азп
Зег
Зег
Туг
Ьеи <210> 5
- 43 020324 <211>7 <212> РКТ <213> Миз зр.
<400>5
Зег ТЬг Зег Азп Ьеи Рго Зег <210> 6 <211> 10 <212> РКТ <213> Миз зр.
<400> 6
Н1з С1п Туг Н1з Агд Зег Рго 31п
5
РЬе ТЬг <210>7 <211>5 <212> РКТ <213> Миз зр.
<400>7
61у Туг ТЬг МеС Азп <210> 8 <211>17 <212> РКТ <213> Миз зр.
<400>8
Ьеи Не Азп Рго ΗΪ3 Азп С1у С1у
Зег Зег Туг Азп Ьеи Ьуз РЬе Ьуз
15 <31у <210>9 <211>9 <212> РКТ <213> Миз эр.
<400>9
Тгр С1у Азр Туг С1у Зег РЬе А1а
1 5
<210> 10
<211> 15
<212> РКТ
<213> Миз зр.
<400> 10
Туг
- 44 020324
Агд А1а 5ег С1и Зег Уа1 Аэр ТЬг
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> РРТ
<213> Низ зр.
<400> 11
Агд А1а ι Зег Азп Ьеи 61 и Зег
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> РКТ
<213> Миз зр *
<400> 12
С1п 81п Зег Азп С1и Азр Рго Рго
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> РКТ
<213> Миз зр.
<400> 13
А1а Туг Туг МеЬ Низ
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> РКТ
<213> Ми5 5р.
<400> 14
Ьеи Уа1 Азп Рго Туг Агп С1у РЬе
1 5
Азр
<210> 15
<211> 10
<212> ркт
<213> Миг зр.
<400> 15
31и РЬе Туг 01у Туг Агд Туг РЬе
1 5
ТЬг
Азр νβΐ
РЬе 81у Туг Зег РЬе Не Туг
15
Зег Зег Туг Азп С1п Азп РЬе С1и
15
- 45 020324 <210> 16 <211> 16 <212> РЕТ <213> Миз зр.
<400> 16
Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Не Н13
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> РКТ
<213> Миз зр.
<400> 17
Зег Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп
15
Ьеи Уа1 Зег Агд Ьеи Азр Зег
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> РКТ
<213> Миз эр.
<400> 13
Тгр С1п С1у Зег Н1з РЬе Рго Агд
1 5
<210> 19
<211> 363
<212> ДНК
<213> Миз зр.
<220>
<221> СОЗ
<222> (1) .(363)
<400> 19
сад дЬс саа сСд саа саа сер ддд
31п Уа1 С1п Ьёц С1п С1п Рго 61 у
1 5
Ьса дрд сад сСд Ссс ЬдЬ аад дсЬ
Зег Уа1 С1п Ьеи Зег Суз Ьуз А1а
20
Ьдд аЬд сас Ъдд дЬд ада сад адд
Тгр МеЬ ΗΪΞ Тгр Уа1 Агд 61п Агд
35 40
дда ааЬ асе СаС ссС дд! аеЬ ддь
31у Азп Не Туг Рго 61у ТЬг 61у
50 55
абд аас аад дес аса сЬд асе дЬа
МеЬ Азп Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1
65 70
ТЬг
ЬсЬ Зег даа С1и 10 сСд Ьеи дед Уа1 адд Агд ссЬ Рго дда 61у 15 дсЬ А1а 48
ЬсЬ ддс Сас Ьса ОЬс асе аде 1ас 96
Зег 25 С1у Туг Зег РЬе ТЬг 30 Зег Туг
ссЬ дда саа ддс СЬЬ саа Ьдд аР: 144
Рго С1у С1п С1у Ьеи 45 С1п Тгр 11е
ааЬ аеЬ ааС Рас даС дад ааа ЬСс 192
Азп ТЬг Азп Туг 60 Азр С1и Ьуз РЬе
дас аса СаС Ссс аде аса асе Рас 240
Азр ТЬг Туг 75 Зег Зег ТЬг ТЬг Туг 80
- 46 020324
айд Мей сад С1п сйс Ьеи аде Зег аде Зег 85 ейд Ьеи аса ТЬг ЙСЙ Зег дад <31и дас Азр 90 ЙСЙ Зег дед А1а дйс Уа1 йай Туг йас Туг 95 йдй Суз 288
дса ада Ёдд 999 ййа дйа едд йай ЙЙС ййй дса айд дас йас йдд ддй 336
А1а Агд Тгр С1у Ьеи ν&1 Агд Туг РЬе РЬе А1а Мей Азр Туг Тгр С1у
100 105 110
саа дда асе йса дйс асе дйс йсс йса 363
С1п С1у ТЬг Зег ν31 ТЬг Уа1 5ег Зег
115 120
<210> 20
<211> 121
<212> РКТ
<213> . Миз : зр.
<400> 20
С1п ν&ι С1п Ьеи С1п С1п Рго С1у Зег С1и Ьеи Уа1 Агд Рго С1у А1а
1 5 10 15
Зех Уа1 С1п Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
Тгр Мей ΗΪ5 Тгр Уа1 Агд С1п Агд Рго С1у С1п С1у Ьеи С1п Тгр 11е
35 40 45
С1у Азп Не Туг Рго С1у ТЬг С1у Азп ТЬг Азп Туг Азр 61и Ьуз РЬе
50 55 60
Мей Азп Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Туг Зег Зег ТЬг ТЬг Туг
65 70 75 80
Мей ΰΐη Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Тгр С1у Ьеи Уа1 Агд Туг РЬе РЬе А1а Мей Азр Туг Тгр С1у
100 105 110
С1п С1у ТЫ Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 21
<211> 354
<212> , днк
<213> Миз : эр.
<220>
<221> СОЗ
<222> (1! . .{354)
<400> 21
дад дйс сад ейд саа сад йей дда ссй дад ейд дйд аад ссй дда дей 48
- 47 020324
С1и Уа1 С1п 1 Ьеи С1п 5 С1п Зег С1у Рго С1и Ьеи 10 Уа1 Ьуз Рго С1у 15 А1а
Рса ард аад аРР Рсс Рдс адд дсь РсР ддр Рас Рса РРс асР ддс Рас 96
Зег МеР Ьуз Не Зег Суз Агд А1а Зег 61у Туг Зег РЬе ТЬг С1у Туг
20 25 30
асс ард аас Рдд дрд адд сад аде саР дда аад аас сРР дад рдд аРР 144
ТЬг Мер АЗП Тгр Уа1 Агд С1п Зег Н1з С1у Ьуз Азп Ьеи С1и Тгр 11е
35 40 45
дда сРР аРР ааР ссР сас ааР ддр ддр РсР аде Рас аас срд аад РРс 192
С1у Ьеи 11е Азп Рго Н1з Азп 61у С1у Зег Зег Туг Азп Ьеи Ьуэ РЬе
50 55 60
аад ддс аад дсс аса РРа асР дра дас аад Рса Рсс аде аса дсс Рас 240
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг 17а1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
аРд дад сРс сРс адр срд аса РсР даа дас РСР дса дрс Тар Рас рдр 288
Мер С1и Ьеи Ьеи Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дра ада рдд ддр дас Рас ддс РСР РРР дсР Рас рдд ддс саа ддд асР 336
Уа1 Агд Тгр 61у Азр Туг С1у Зег РЬе А1а Туг Тгр <31 у С1п С1у ТЫ
100 105 но
срд дрс асР дрс РсР дса 354
Ьеи ν3ι ТЬг Уа1 Зег А1а
115
<210> . 22
<211> 118
<212> : РКТ
<213> 1 '-Тез зр.
<400> : 22
С1и Ча1 С1п Ьеи 01п Й1п Зег 61у Рго Й1и Ьеи Уа1 Ьуз Рго 61у АЬа
1 5 10 15
Зег Мер Ьуз 11е Зег Суз Агд А1а Зег Й1у Туг Зег РЬе ТЬг 61у Туг
20 25 30
ТЬг Мер Азп Тгр УаГ Агд С1п Зег НЬз С1у Ьуз Азп Ьеи Й1и Тгр Не
35 40 45
С1у Ьеи Не Азп Рго Н1з Азп С1у С1 у Зег Зег Туг Азп Ьеи Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз 61у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеР С1и Ьеи Ьеи Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег АЬа Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
Уа1 Агд Тгр 61у Азр Туг 01 у Зег РЬе А1а Туг Тгр 61у С1п 61у ТЬг
- 48 020324
100 105110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а
115 <210>23 <211>357 <212> ДНК <213> Миз зр <220>
<221> СОЗ <222> (1) . . (357) <400> 23
дад С1и 1 дЁс Уа1 сад С1п сЁд Ьеи саа ΰΐη 5 сад С1п ёсё Зег дда ссё дад С1и 10 сЪд Ьеи дЁд νβΐ аад Ьуз ССЁ Рго ддд 01у 15 дсЁ А1а 48
С1у Рго
Ёса д^д аад эёё ЁСС Ёдс аад дсЁ ЁСЁ ддЁ Ёас Ёса ЁЁС асЁ дсс Ёас 96
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг АЬа Туг
20 25 30
Ёас аЁд сас 5дд аад саа адЁ саЁ дЁа аад адЁ СЁЁ дад Ёдд аЁЁ 144
Туг МеЁ Н15 Тгр Уа1 Ьуз 61п Зег НЬз Уа1 Ьуз Зег Ьеи С1и Тгр 1Ье
35 40 45
дда сёё дек ааЁ ССЁ Ёас ааЁ ддЁ ЁЁЁ адЁ аде Ёас аас сад ааЁ Ш 192
С1у Ьеи Уа1 Азп Рго Туг Азп С1у РЬе Зег Зег Туг Азп СЬп Азп РЬе
50 55 60
дад дас аад дсс аде ъед асЁ дЁа даЁ аад Ь.С ЁСС аде асе дсс Ёас 240
С1и Азр Ьуз А1а Зег Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьу5 РЬе Зег Зег ТЫ А1а Туг
65 70 75 80
аЁд даа СЁС сас аде сЁд аса ЁСЁ дад дас ЁСЁ дса дЁс ЁаЁ Ёас СдЁ 288
МеЁ С1и Ьеи НЬз Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дса ада даа ЁЁС Ёас ддс Сас едд Ёас ЁЁС даЁ дЁс Ёдд ддс дса ддд 336
АЬа Агд С1и РЬе Туг С1у Туг Агд Туг РЬе Азр Уа1 Тгр СЬу АЬа СЬу
100 105 110
асе дед дЁс асе дЁс ЁСС Ёса 357
ТЬг А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210>24 <211>119 <212> РКТ <213> Миз зр <400>24
С1и Уа1 61п Ьеи С1п С1п Зег 01у Рго С1и Ьеи Уа1 Ьуз Рго СЬу А1а
1 5 10 15
Зег νδΐ Ьуз Не Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг Зег РЬе ТЬг А1а Туг
20 25 30
- 49 020324
Туг МеС ΗΪ3 35 Тгр Уа1 Ьуз 31п Зег 40 ΗΪ3 Уа1 Ьуз Зег Ьеи С1и 45 Тгр Не
С1у Ьеи Уа1 Азп Рго Туг Азп С1у РЬе 8ег Зег Туг Азп С1п Азп РЬе
50 55 60
С1и Азр Ьуз А1а 5ег Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз РЬе Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Мес С1и Ьеи Н1з Зег Ьеи ТЬг Зег 61и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд С1и РЬе Туг С1у Туг Агд Туг РЬе Азр Уа1 Тгр С1у А1а С1у
100 105 110
ТЬг А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 25 <211> 333 <212> ДНК <213> Мцз зр.
<220>
<221> сое <222> (1)..(333)
<400> 25 СсС Зег сЬа Ьеи 15 ддд 31у 48
саа С1п 1 асе 11е дес Уа1 ССС Ьеи асе ТЬг 5 сад С1п ССС Зег сса Рго дса А1а аСс 11е 10 асд МеС СсС Зег дса А1а
даа едд дес асе аСд асе Сдс асе. дес аде Сса адС дед ааС Ссс адС 96
С1и Агд Уа1 ТЬг МеС ТЬг Суз ТЬг Уа1 Зег Зег Зег Уа1 Азп Зег Зег
20 25 30
Ьас ССд сас едд Ьас сад сад аад сса дда есс Ссс ссе ааа сСе ΐ-дд 144
Туг Ьеи ΗΪΕ Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго (Пу Зег Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр
35 40 45
аЫ СаС аде аса Ьсс аас еСд ссС СсС дда дес сса дсС еде есе аде 192
11е Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи Рго Зег С1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
дде адС дда СсЬ ддд асе СсС Сас СсС сСс аса аСс аде асе аСа дад 240
С1у Зег (Пу Зег С1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг 11е Зег ТЬг 11е 61и
65 70 75 80
СсС даа да С дсС дсе асе ЬаС Рас СдС сас сад СаС саС сдС Ссс сса 288
Зег 01и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз Н1г С1п Туг ΗΪ3 Агд Зег Рго
95 90 95
саа есе асд ССс дде Сед ддд аса аад ССд дад аСа ааа едд дсС 333
С1п РЬе ТЬг РЬе С1у Зег С1у ТНг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз Агд А1а
100 105 110
- 50 020324 <210> 26 <211> 111 <212> РНТ <213> Миз зр <400> 26
С1п 1 11е ν*ι Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго А1а Не 10 МеС Зег А1а Зег Ьеи 15 <31у
С1и Агд Уа1 ТЬг МеС ТЬг Суз ТЬг Уа1 Зег Зег Зег Уа1 Азп Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи ΗΪ5 Тгр туг С1п С1п Ьуз Рго 61у Зег Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр
35 40 45
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи Рго Зег С1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег ТЬг Не 31и
65 70 75 80
Зег О1и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз НЬз С1п Туг Н1з Агд Зег Рго
85 90 95
С1п РЬе ТЬг РЬе С1у Зег 31у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз Агд А1а
100 105 но
<210> 21
<211> 336
<212> . цнк
<213> ] Миз зр.
<220>
<221> ' СОЗ
<222> (1) . .(336)
<400> 27
дао аСС дьд сСд асе саа СсС сса дсС ссс ССд дсс дЬд СсС сЬа ддд 48
Азр Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а Зег Ьеи А1а УаЬ Зег Ьеи СЬу
1 5 10 15
сад адд дсс асе аСа Ссс Сдс ада дсс адС даа адС дСС даС асе ссс 96
С1п Агд А1а ТЬг 11е Зег Суз Агд А1а Зег С1и Зег Уа1 Аэр ТЬг РЬе
20 25 30
ддс сас ад1 ССС аса сас бдд Сас сад сад аад сса дда сад сса ссс 144
С1у Туг Зег РЬе 11е Туг Тгр Туг 31п Ьуз Рго С1у С1п Рго Рго
35 40 45
ада ссс ссс асе сас сде дса ссс аас сСа даа СсС ддд аСс ссС дсс 192
Агд Ьеи Ьеи 11е Туг Агд А1а Зег Азп Ьеи С1и Зег С1у 11е Рго А1а
50 55 60
- 51 020324
адд НН с адН ддс адН ддд псе адд аса дао еНс асе сНс асе аНН ааН 240
Агд РЬе Зег СЬу 8ег СЬу Зег Агд ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Азп
65 70 75 80
ссН дед дад дек даН даб дни деа асе еае еас еде сад саа адН аае 288
Рго Уа1 СЬи АЬа Азр Азр УаЬ А1а ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Зег Азп
85 90 95
дад дае ссе сод асд ННс ддП дда ддс асе аад сПд даа аНс ааа едд 336
СЬи Азр Рго Рго ТЬг РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз Агд
100 105 но
<210> 28
<211> 112
<212> РЙТ
<213> Миз ; зр.
<400> 28
Азр Не УаЬ Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго АЬа Зег Ьеи АЬа УаЬ Зег Ьеи СЬу
1 5 10 Ь5
СЬп Агд АЬа ТЬг ЬЬе Зег Суз Агд АЬа Зег СЬи Зег УаЬ Азр ТЬг РЬе
20 25 30
С1у Туг Зег РЬе ЬЬе Туг Тгр Туг СЬп ΰΐη Ьуз Рго СЬу СЬп Рго Рго
35 40 45
Агд Ьеи Ьеи 11е Туг Агд АЬа Зег Азп Ьеи С1и Зег СЬу ЬЬе Рго АЬа
50 55 60
Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег Агд ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг ЬЬе Азп
65 70 75 80
Рго Уа1 С1и А1а Азр Азр УаЬ А1а ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Зег Азп
85 90 95
С1и Азр Рго Рго ТЬг РЬе С1у СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз Агд
100 105 НО
<210> 29
<211> 339
<212> ДНК
<213> Миз : зр.
<220> <221> СОЗ
<222> пл .(339)
<400> 29
даН дПП дПд зНд Пос сад анн сса сНс асН нед Нед дПс асе аен дда 48
Азр УаЬ УаЬ Мен Зег СЬп ЬЬе Рго Ьеи ТЬг Ьеи Зег УаЬ ТЬг Не СЬу
1 5 10 15
саа оса дсс Нес аНс И сП еде аад Нса аде сад аде сес аСа саН аде 96
- 52 020324
31η Рго А1а Зег 20 11е Зег Су5 Ьуз Зег 25 Зег С1п Зег Ьеи 11е 30 ΗΪ3 Зег
даС дда аад аса еае ддд аад Ьдд ддд ЬСа сад адд сса ддс сад ссс 144
Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи ΰΐη Агд Рго О1у С1п Зег
35 40 45
сса аад еде сСа адд даЬ едд дгд дсс ада сСд дас С ос дда дсс есс 192
Рго Гу5 Агд Ьеи 11е Туг Ьеи Уа1 Зег Агд Ьеи Азр Зег С1у Уа1 Рго
50 55 60
дас адд ьЬс асе ддс адд дда еса ддд аса дад ССС аса сЬд ааа асе 240
Азр Агд РЬе ТЬг 01у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е
65 70 75 80
аде ада д^д дад дед дад дад ддд дда ддд ЬаС даС Сдс Ьдд саа ддС 288
Зег Агд Уа1 61и А1а 61и Азр Ьеи С1у Уа1 Туг Туг Суз Тгр 31п С1у
85 90 95
Сса саС ЬСд сое едд асд ддс ддд дда ддс асе аад сСд даа аСс ааа 336
Зег ΗΪ5 РЬе Рго Агд ТЬг РЬе 31у С1у С1у ТЬг ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз
100 105 110
едд 339
Агд
<210> 30
<2И> 113
<212> РКТ
<213> Миз : зр.
<400> 30
Азр Уа1 Уа1 Мед Зег С1п 11е Рго Ьеи ТЬг Ьеи Зег 7а1 ТЬг 11е С1у
1 5 10 15
С1п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи 11е Н13 Вег
20 25 30
Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи С1п Агд Рго С1у С1п Зег
35 40 45
Рго Ьуз Агд Ьеи Не Туг Ьеи Уа1 Зег Агд Ьеи Азр Зег С1у Уа1 Рго
50 55 60
Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег С1у Зег Й1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е
65 70 75 80
Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Ьеи С1у Уа1 Туг Туг Суз Тгр ΰΐη С1у
85 90 95
Зег ΗΪ8 РЬе Рго Агд ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105 110
Агд
- 53 020324 <210> 31 <211> 363 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <220>
<221> СИЗ <222> (1)..(363) <220>
<221> источник <222> (1)..(90) <223> Ното зардела <220>
<221> источник <222> (91)..(105) <223> Низ зр.
<220>
<221> источник <222> (106)..(147) <223> Ното зар!епз <220 <221> источник <222> (148)..(192) <223> Миз зр.
<220 <221> источник <222> (193)..(294) <223> Ното зархепг <220 <221> источник <222> (295)..(330) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (331)..(363) <223> Ното зартепз <400 31
сад <31п 1 дгт Уа1 сад С1п сне Неи дес Уа1 5 сад Θ1Π сое Рго ддз С1у дсе А1а даа (31и 10 дед νβΐ дна Уа1 аад Ьуз сса Р<о дда 61у 15 дсс А1а 48
НсК д!д а ад сес осе еде ааа дса аде ддс Нас аас ПЬС асе аде ГаЬ 96
Зег Уа1 Ьуз Ьеи 5ег Суз Ьуз А1а 5ег 61 у Туг Азп РЬе ТНг Зег Туг
20 25 30
1дд а£д сас Ндд дед еде сад еде сое ддс сад дда сЬс сад Ндд 144
Тгр Μεϋ Н1з Тгр Уа1 Агд С1п Агд Рго С1у С1п С1у Ьеи С1п Тгр Не
35 40 45
- 54 020324
ддс аас аСс Не £ас Туг ссс ддс асе дд£ аа! Азп аса аас ЪаС дас Азр сад СЬп аад Ьуз !5с РЬе
С1у Азп 50 Рго <31у ТЬг С1у 55 ТЬг Азп Туг 60
саа ддс аад дс! асе οί. 1 аса 9« дас асе ЬсЬ асе аде асЬ ас£ еае
СЬп С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег ТЬг Зег ТЬг ТЬг Туг
65 70 75 80
аЬд саа £сс аде с£д ас! аде дад даЕ Ьсс дсс дед 1:аЬ ПаЬ еде
МеС С1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег АЬа Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дсс адд 5дд ддс дЬЁ адд Нас 55с ЬЬс дс£ а£д да! Ьас Ьдд ддд
АЬа Агд Тгр С1у Ьеи Уа1 Агд Туг РЬе РЬе АЬа МеЬ Азр Туг Тгр С1у
100 105 но
сад дде асе аде дСС аса дее ЬСС аде
С1п С1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 32 <211> 121 <212> РКТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> . 32
С1п Уа1 С1п Ьеи νδΐ С1п Рго С1у АЬа С1и Уа1 Уа1 Ьуз Рго Е1у АЬа
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Су5 Ьуз АЬа Зег С1у Туг Азп РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
Тгр Мее Н1з Тгр Уа1 Агд СЬп Агд Рго Е1у С1п С1у Ьеи СЬп Тгр 11е
35 40 45
С1у А5П Не Туг Рго С1у ТЬг С1у Азп ТЬг Азп Туг Азр С1п Ьуз РЬе
50 55 60
С1п С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег ТЬг Зег ТЬг ТЬг Туг
65 70 75 80
МеС СЬп Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Тгр С1у Ьеи νβΐ Агд Туг РЬе РЬе А1а МеГ Азр Туг Тгр С1у
100 105 но
СЬп С1у ТЬг Зег ν^ι ТЬг УаЬ Зег Зег
115 120
<210> . 33
- 55 020324 <2ΐι> зез <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(363) <220>
<221> источник <222> (1)..(90) <223> Ьото зартепз <220>
<221> источник <222> (91)..(105) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (106)..(147) <223> Ното зартепз <220>
<221> источник <222> (148)..(192) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (193)..(294) <223> Ьошо зархелз <220>
<221> источник <222> (295)..(330) <223> Низ зр.
<220>
<221> источник <222> (331)..(363) <223> Ното зархепз <400> 33
сад С1п 1 дбд Уа1 сад Й1п сИс Ьеи дне Уа1 5 сад Й1п ССС Рго ддб е1у дсс А1а даа С1и 10 дид Уа1 дбд Уа1 ааа Ьуз ССС Рго ддб С1у 15 дс1: А1а 48
бсб дбд аад сГд Сса £дс аад дсс бса ддс адб ббс асс Оса 96
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег 61 у Туг Зег РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
бдд абд са£ бдд д£с сдс сад адд сса ддс сад ддс сбс саа бдд а£с 144
Тгр Меб Н1з Тгр Уа1 Агд 31п Агд Рго 61у С1п С1у Ьеи С1п Тгр Пе
35 40 45
дда аас аЬс бас ССИ ддс аса дда ааб асс аа£ баб дас сад ааа ИИС 192
С1у Азп Не Туг рго С1у ТЬг С1у Азп ТЬг Азп Туг Азр 61п Ьуз РЬе
50 55 60
- 56 020324
саа 65 ддб С1у аад Ьу5 дсс А1а асб ТЬг ебд Ьеи 70 асе ТЬг дбд Уа1 дас Авр асб ТЬг аде Зег 75 аса ТЬг Сса Зег асе ТЬг аса ТЬг бас Туг 80
абд сад сСд бсб бсб сбс асб бса даа дас адб дсб дбе бас бас бде
Меб С1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а УаЬ Туг Туг Суз
95 90 95
дса еда бдд ддс сбс дбб едб баб ббс 66с дса абд даб Саб ьдд ддб
А1а Агд Тгр С1у Ьеи Уа1 Агд Туг РЬе РЬе А1а Меб Азр Туг Тгр С1у
100 105 110
саа ддс аса Сса дбб асе дЬд бос бсб
С1п С1у ТЬг Зег УаЬ ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 34 <2Ц> 121 <212> РКТ <213> Искусственная <220>
<223> ! Синтетическая г конструкция
<400> 34
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Рго 51у АЬа С1и Уа1 Уа1 Ьуз Рго С1у АЬа
1 5 10 15
5ег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз АЬа Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
Тгр Меб н!з Тгр УаЬ Агд СЬп Агд Рго С1у С1п СЬу Ьеи С1п Тгр 11е
35 40 45
С1у Азп Не Туг Рго СЬу ТЬг СЬу Азп ТЬг Азп Туг Азр СЬп Ьуз РЬе
50 55 60
С1п СЬу Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег ТЬг Зег ТЬг ТЬг Туг
65 70 75 80
Меб С1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег 51и Азр Зег А1а УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Тгр СЬу Ьеи УаЬ Агд Туг РЬе РЬе АЬа Меб Азр Туг Тгр СЬу
100 105 110
С1п С1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<2Ю> <211> <212> <213> 35 363 днк Искусственная
- 57 020324 <220>
<223> Гуманизированное антитело <220>
<221> СОЗ <222> (1)-.(363) <220>
<221> источник <222> (1),.(90) <223> Ното зарЬепз <220>
<221> источник <222> (91)..(105) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (106)..(147) <223> Ьото зар1епз <220>
<221> источник <222> (148).-(192) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (193)..(294) <223> Ьотпо зархепз <220>
<221> источник <222> (295)..(330) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (331)..(363) <223> пето зархепз <400> 35
сад С1п 1 д£д сад Уа1 С1п ейд Ьеи дЕд Уа1 5 сад ссс ддд дсе дад дйд дйа аад Ьуз сса Рго дда <31у 15 дсс А1а 48
С1п Рго 61у А1а С1и 10 Уа1 ν£1
адй дрд аад ЬЬд йсс Идс аад дсс Осс ддд йас аай ййс асе РС1 йас 96
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Азп РЬе ТЬг 5ег Туг
20 25 30
Ёдд аРд сай йдд дИд сдй сад едд ССй ддд саа дда сйй саа йдд айс 144
Тгр Мер Н1з Тгр Уа1 Агд С1п Агд Рго <31у С1п С1у Ьеи С1п Тгр Не
35 40 45
ддд ааР ай Е йас ссс ддр асе ддс аай аса аай йай дай сад аад ййс 192
61у Азп Не Туг Рго 61у ТЬг 61 у Азп ТЬг Азп Туг Азр С1п Ьуз РЬе
50 55 60
сад ддс аад дей аса сед асе дрд дай асе йас аей йей ас! аей Нас 240
61п С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Туг ТЬг Зег ТЬг ТЬг Туг
65 70 75 80
- 58 020324
а!д МеС саа С1п с!д Ьеи аде Зег Тса Зег 85 сЪд асе Рсс дад дас Азр 90 !са Зег дес АЬа д!д УаЬ Сас Туг !а1 Туг 95 Ьдс Суз
Ьеи ТЬг Зег С1и
дса сдс дда сгс д!с адд еаЬ ССс ίίί: дес аЬд да! Сае Тдд дда
А1а Агд Тгр С1у Ьеи УаЬ Агд Туг РЬе РЬе АЬа Ме! Азр Туг Тгр СЬу
100 105 но
сад ддд асе Ьс! д!с аес д!д аде ад!
С1п 31у ТЬг Зег Уа1 ТЬг УаЬ Зег Зег
115 120
<210> 36
<211> 121
<212> РРТ
<213> : Искусственная
<220>
<223> | Синтетическая конструкция
<400> 36
С1п Уа1 С1п Ьеи УаЬ СЬп Рго СЬу АЬа СЬи УаЬ УаЬ Ьуз Рго СЬу АЬа
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Азп РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
Тгр МеЬ ΗΪ5 Тгр УаЬ Агд СЬп Агд Рго СЬу СЬп 01 у Ьеи СЬп Тгр 1Ье
35 40 45
С1у Азп 11е Туг Рго СЬу ТЬг СЬу А5П ТЬг Азп Туг Азр СЬп Ьуз РЬе
50 55 60
С1п С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг УаЬ Азр ТЬг Туг ТЬг Зег ТЬг ТЬг Туг
65 70 75 80
Ме! е1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а УаЬ Туг ТуГ Суз
85 90 95
А1а Агд Тгр СЬу Ьеи Уа1 Агд Туг РЬе РЬе А1а Ме! Азр Туг Тгр СЬу
100 105 110
С1п СЬу ТЬг Зег УаЬ ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<2Ю> <211> <212> <213> 37 118 РКТ Искусственная
<220 <223> Гуманизированное антитело
<400> 37
- 59 020324
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи 31п Зег С1у 31у С1и Ьеи Уа1 С1п Рго С1у А1а
1 5 10 15
Зег Мей Агд 11е Зег Суз А1а А1а Зег 01 у Туг ТЬг РЬе ТЬг С1у Туг
20 25 30
ТЬг Мей Азп Тгр Уа1 Агд С1п Зег Рго С1у Ьуз Азп Ьеи С1и Тгр Не
35 40 45
С1у Ьеи Не Азп Рго Н1з Азп С1у 31у Зег Зег Туг Азп Азр Зег РЬе
50 55 60
Ьуз С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг 7а1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Мей С1и Ьеи Ьеи Зег ьеи ТЬг А1а 31и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
Уа1 Агд Тгр С1у Азр Туг С1у Зег РЬе А1а Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЫ Уа1 Зег Зег
115
<210> 38
<211> 118
<212> РКТ
<213> : Искусственная
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 38
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1п Зег (Пу е1у С1и Ьеи Уа1 31п Рго С1у А1а
1 5 10 15
Зег Мей Агд 11е Зег Суз А1а А1а Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг С1у Туг
20 25 30
ТЬг Мей Азп Тгр ν&ι Агд С1п Зег Рго С1у Ьуз Азп Ьеи С1п Тгр 11е
35 40 45
С1у Ьеи 11е Азп Рго Н1з Азп С1у С1у Зег Зег Туг Азп Азр Зег РЬе
50 55 60
Ьуз С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Мей С1и Ьеи Ьеи Зег Ьеи ТЬг А1а С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
- 60 020324
Уа1 Агд Тгр С1у Азр Туг
100
С1у Зег РЬе А1а Туг Тгр
105
С1у 61п С1у ТЬг
110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 39 <211> 357 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <220>
<221> СОЗ <222> (1} . . (357) <220>
<221> источник <222> (1)..(90) <223> Ното зартепз <220>
<221> источник <222> (91)..(105) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (106)..(147) <223> Ното зартепз <220>
<221> источник <222> (148)..(195) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (196)..(294) <223> Ното заргепз <220>
<221> источник <222> (295)..(324) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (325)..(357) <223> Ното зар!епз <400> 39 сад дЬд саа сТд дСд саа
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п
5
Тсс ддИ дсс дад дЬс дЬс
Зег С1у А1а 61и Уа1 Уа1 ааа ссс дда дса 48
Ьуз Рго 31у А1а
- 61 020324
ЬсЬ Зег дцд УаЬ аад аеа Тсс Зег ЬдЬ Суз аад дсс Ьсс ддс СЬу Бас Туг асе ТЬг ерр РЬе аса ТЬг 30 дсс АЬа Рас Туг 96
Ьуз Не 20 Ьуз АЬа Зег 25
ЬаС аед сае Сдд дГЬ ааа сад ад! ОСС дкд сад есс сед даа едд аРс 144
Туг Мее НЬз Тгр Уа1 Ьуз СЬп Зег Рго УаЬ СЬп Зег Ьеи СЬи Тгр 11е
35 40 45
ддс еед дгд аас ссе РаЬ аас дда Ь6с Рса аде Рас ааР саа аад гл 192
СЬу Ьеи Уа1 Азп Рго Туг Азп С1у РЬе Зег Зег Туг Азп СЬп Ьуз РЬе
50 55 60
сад ддс аад дсе есс сед асе деа дас аад аде аде Ьсс аса дсс Рас 240
СЬп СЬу Ьуз А1а Зег Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 90
абд дад сЬс саЬ Ьса СЬд аса Ьса даа дас аде дсс деа Бас Ьа! еде 288
Мес СЬи Ьеи НЬз Зег Ьеи ТЬг Зег СЬи Азр Зег АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
дса еде дад ГА Рас ддс еае ада Рас Ш дас дрс едд ддс саа ддс 336
АЬа Агд 01 и РЬе Туг СЬу Туг Агд Туг РЬе Азр УаЬ Тгр СЬу СЬп СЬу
100 105 но
аса дсс дес аса дед аде Ьсе 357
Тпг А1а УаЬ 115 ТИг УаЬ Зег Зег
<2Ь0> 40 <2Η> 119 <212> РКТ <213> Искусственная <220>
<223> < Оинтетическая конструкция
<400> · 40
СЬп УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп 5ег СЬу АЬа СЬи УаЬ УаЬ Ьуз Рго СЬу АЬа
1 5 10 15
Зег УаЬ Ьуз Не Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТЬг РЬе ТЬг АЬа Туг
20 25 30
Туг Мее Н15 Тгр УаЬ Ьуз С1п Зег Рго УаЬ СЬп Зег Ьеи СЬи Тгр 1Ье
35 40 45
СЬу Ьеи УаЬ Азп Рго Туг Азп СЬу РЬе Зег Зег Туг Азп СЬп Ьуз РЬе
50 55 60
СЬп СЬу Ьуз А1а Зег Ьеи ТЬе УаЬ Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг АЬа Туе
65 70 75 80
МеР С1и Ьеи НЬз Зег Ьеи ТЬг Зег СЬи Азр Зег АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд СЬи РЬе Туг СЬу Туг Агд Туг РЬе Азр УаЬ Тгр СЬу СЬп СЬу
- 62 020324
100 105
ТЬг А1а Ча! ТЬг Ча1 Зег 5ег
115
<210> 41
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<220>
<221> ΟϋΞ
<222> ί1)- . (357)
<220>
<221> источник
<222> ¢1) - - ( 90}
<223> Κοιτ.ο зар!епз
<220>
<221> источник
<222> ¢91)..(105)
<223> Миз зр.
<220>
<221> источник
<222> (106).. (147)
<223> Иотпо зартепз
<220>
<221> источник
<222> (148)..(195)
<223> Миз зр.
<220>
<221> источник
<222> (196).,(294)
<223> Ьогпо зар1епз
<220>
<221> источник
<222> (295)..(324)
<223> Миз зр,
<220>
<221> источник
<222> (325)..(357)
<223> Кото зар!епз
<4ОО> 41
сад дрс сад ррд дрд сад СсС дда дса
С1п Ча1 С1п Ьеи Ча! Й1п Зег С1у А1а
1 5
адС дСс ааа асе аде Сдс аад дес аде
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег
20 25
но
дад дед а а а сса ддс дса 48
С1и νβΐ νβΐ Ьуз Рго С1у А1а
10 15
дда Сас Ссс ссс аса дса СаС 96
С1у Туг Зег РЬе ТЬг А1а Туг
30
- 63 020324
СаС Туг аСд МеС сас Ддд дСд аад сад аде сс£ дИЬ Уа1 сад С1п аде Зег сЬд Ьеи 45 даа СЮ Сдд Тгр аСс Не
Н15 35 Тгр Уа1 Ьуз С1п Зег Рго 40
ддс сСс дСс аас ссЬ ДаЬ ааС дда 1ζΐΛ Ιοί: ЕсД иаЬ аас саа аад ССс
С1у Ьеи Уа1 Азп Рго Туг Азп С1у РЬе Зег Зег Туг Азп С1п Ьуз РЬе
50 55 60
сад ддс ааа дсс аде с£д аса дед даС аад адЬ аде аде асЬ дсс СаС
С1п С1у Ьуз А1а Зег Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
аСд даа сЬд саЕ ДсЕ СДС асе ГсЬ даа дат адД дса дСд Дас СаС СдС
МеС С1и Ьеи Н15 Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дсс сдс дад ССС Сас дде СаЁ еда ЬаЬ СЬс дас дьд Сдд ддс сад ддс
А1а Агд (ЗЮ РЬе Туг С1у Туг Агд Туг РЬе Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у
ЮС 105 110
асС дсс дед аса дДа аде адД
ТЬг А1а Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 42 <211> 119 <212> РКТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> . 42
С1п УаЬ С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а 61и Уа1 Уа1 Ьуз Рго С1у А1а
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз 11е Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг А1а Туг
20 25 30
Туг МеЬ Η15 Тгр Уа1 Ьуз С1п Зег Рго Уа1 С1п Зег Ьеи С1и Тгр 11е
35 40 45
С1у Ьеи Уа1 Азп Рго Туг Азп С1у РЬе Зег Зег Туг Азп 61п Ьуз РЬе
50 55 60
С1п С1у Ъуз А1а Зег Ъеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеД С1и Ьеи Н15 Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суд
85 90 95
А1а Агд ЗЮ РЬе Туг С1у Туг Агд Туг РЬе Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у
100 105 но
ТЬг А1а Уа1 ТЬг УаЬ Зег Зег
- 64 020324
115 <210> 43 <211> 119 <212> РКТ <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <400>43
С1п 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 61п Зег С1у АГа С1и 10 Ча1 Уа1 Ьуз Рго С1у 15 А1а
Зег Ча1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг А1а Туг
20 25 30
Туг МеС ΗΪ3 Тгр Уа1 Ьуз 31п Зег Рго С1у С1П Зег Ьеи 61и Тгр 11е
35 40 45
С1у Ней Уа1 Азп Рго Туг Азп С1у РЬе Зег Зег Туг Азп С1п Ьуз РЬе
50 55 60
<51п <31у Туз А1а Зег Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТНг А1а Туг
65 70 75 80
Ме! С1и Ьеи Н1з Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а νβΐ Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд С1и РЬе Туг С1у Туг Агд Туг РЬе Авр Уа1 Тгр С1у 61п С1у
100 105 110
ТНг А1а Ча1 ТЬг Ча1 Зег Зег
115 <210>44 <211>357 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(357) <220>
<221> источник <222> (1)..(90) <223> Нолю зарЬепз <220>
- 65 020324 <221> источник <222> (91)..(105) <223> Миз кр.
<220>
<221> источник <222> (106).-(147) <223> кото зарЬепз <220>
<221> источник <222> (148),,(195) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (196)..(294) <223> кото зарЬепз <220>
<221> источник <222> (295)..(324) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (325).. (357) <223> кото заргепз
<400> 44 дне УаЬ 5 сад СЬп аде Зег ддд СЬу дса АЬа
сад С1п 1 дне УаЬ саа СЬп сед Ьеи
есс дне аад аее аде еде ааа дсс Пес
Зег УаЬ Ьуз Не Зег Суз Ьуз АЬа Зег
20 25
Пае аед сас Одд дес аад саа есе ссе
Туг Мер НЬз Тгр УаЬ Ьуз СЬп Зег Рго
35 40
ддс сед дкс аае сса Нас аае ддс еес
СЬу Ьеи УаЬ АЗП Рго Туг АЗП СЬу РЬе
50 55
сад дда ааа дсс Нес сне аса деа дас
С1п СЬу Ьуз АЬа Зег Ьеи Ткг УаЬ Азр
65 70
аед даа сее сас есс сее аса аде дад
Мее С1и Ьеи НЬз Зег Ьеи Ткг Зег СЬи
85
дсс ада даа нее Нас дда еае едд еае
АЬа Агд СЬи РЬе Туг СЬу Туг Агд Туг
ЬОО 105
асе дсс дед асе дес аде есе
Ткг АЬа УаЬ Ткг УаЬ Зег Зег
115
даа СЬи 10 дПс УаЬ дПа УаЬ аад Ьуз ссс Рго дда СЬу 15 дсе АЬа 48
ддс Пае аде нее аса дсе Пас 96
СЬу Туг Зег РЬе Ткг 30 АЬа Туг
ддд сад аде сНд дад едд аПс 144
СЬу СЬп Зег Ьеи 45 С1и Тгр ЬЬе
есе аде Нас аас саа ааа нее 192
Зег Зег Туг 60 А5П СЬп Ьуз Рке
аад еса есе Псс асе дсс Нас 240
Ьуз Зег 75 Зег Зег ТЬг АЬа Туг 80
даН аде дсс дее еаЬ Пае еде 288
Азр 90 Зег А1а УаЬ Туг Туг 95 Суз
еес дае дЪс едд ддд сад ддд 336
РЬе Азр УаЬ Тгр СЬу но СЬп СЬу
357 <210> 45
- 66 020324 <211> 119 <212> РРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая конструкция <400>45
С1П 1 ν^ι 61п Ьеи Уа1 5 С1п Зег С1у А1а 61и Уа1 10 Уа1 Ьуз Рго <31у 15 А1а
Зег νθΐ Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Зег РНе ТНг А1а Туг
20 25 30
туг МеЬ Ηί3 Тгр Уа1 Ьуз 61п Зег Рио С1у <31п Зег Ьеи 61и Тгр Не
35 40 45
С1у Ьеи Уа1 Азп Рго Туг Азп С1у РНе Зег Зег Туг Азп С1п Ьуз РЬе
50 55 60
С1п С1у Ьуз А1а Зег Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТНг А1а Туг
65 70 75 80
Мер С1и Ьеи Ηίβ Зег Ьеи ТНг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
35 90 95
А1а Агд 61и РНе Туг С1у Туг Агд Туг РНе Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у
100 105 но
ТНг А1а 7а1 ТНг 1/а1 Зег Зег
115 <210>46 <211>330 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(330) <220>
<221> источник <222> (1)..(71) <223> Ното зараепз <220>
<221> источник <222> (72) . . (105) <223> Миз зр.
- 67 020324 <220>
<221> источник <222> (106)..(150) <223> Ното зартепз <220>
<221> источник <222> (151)..(171) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (172)..(269) <223> Ното зархепз <220>
<221> источник <222> (270)..(299) <223> Низ зр.
<220>
<221> источник <222> (300)..(330) <223> Ното зархепз <400> 46
дад С1и 1 аСс 11е дбб Уа1 сёс Ьеи аса ТНг 5 сад С1п Пса Зег сса Рго дсс А1а асс ТНг 10 аНд МеЁ аде Зег дсс А1а бсб Зег ССС Рго 15 ддд С1у 48
даа еда дбд асс абд асН СдГ аса дПа бсс ЁСС ЁСЁ дЁд аас ЁСЁ ЁСЁ 96
С1и Агд Ча1 ТНг Меб ТЬг Суз ТНг Уа1 Зег Зег Зег Уа1 Азп Зег Зег
20 25 30
Гас сЁд саб бдд бас сад сад аад ссё ддб ЁСС аде ССС ааа СЁС Ёдд 144
Туг Ьеи Н±з Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у Зег Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр
35 40 45
аЁс Ёас адб аса аде ааЁ сНд ссс Пса ддс дЁН ссс дсН адд НЁС ЁСС 192
Не Туг Зег ТНг Зег Азл Ьеи Рго Зег 61 у Уа1 Рго А1а Агд РНе Зег
50 55 60
ддс Ёса ддб ЁСЁ ддс асН адЁ Нас ССЁ ебд асс апс аде асс аНс даа 240
С1у Зег С1у Зег <31у ТНг Зег Туг 5ег Ьеи ты 11е Зег ТНг 11е С1и
65 70 75 80
Нсс даа даб дсП дса аса Нас Пас ПдН сае сад ПаП сас адд ЁСС ссс 288
Зег С1и Азр А1а А1а ТНг Туг Туг Суз Н15 С1п Туг Н1з Агд Зег Рго
85 90 95
сад ССС аса НЁС ддб ддс ддс асс ааа С1б дад йёё аад Сдб 330
С1п РЬе ТНг РНе 61у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз Агд
100 105 110
<210> 47 <211> 110 <212> РВТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 47
- 68 020324
61и 1 11е УаЬ Ьеи ТЬг СЬп 5 Зег Рго АЬа ТЬг Меб 10 Зег АЬа Зег Рго 15 СЬу
С1и Агд УаЬ ТЬг Меб ТЬг Суз ТЬг УаЬ Зег Зег Зег УаЬ Азп Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи ΗΪΞ Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Зег Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр
35 40 45
11е Туг Зег ТЬг Зег Аап Ьеи Рго Зег СЬу Уа1 Рго АЬа Агд РЬе Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Ь1е Зег ТЬг 11е С1и
65 70 75 80
Зег СЬи А5р АЬа АЬа ТЬг Туг Туг Суз НЬз С1п Туг ΗΪ3 Агд Зег Рго
85 90 95
СЬп РЬе ТЬг РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи Не Ьуз Агд
100 105 110
<210> 48 <211> 112 <212> РКТ <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <400> 48
Азр 1 11е УаЬ Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго
СЬи Агд АЬа ТЬг 20 11е Зег Суз Агд
СЬу Туг Зег 35 РЬе Не Туг Тгр Туг 40
Агд Ьеи 50 Ьеи Не Туг Агд АЬа 55 Зег
Азр Зег 10 Ъеи АЬа УаЬ Зег Ьеи 15 С1у
АЬа 25 Зег С1и Зег УаЬ Агр 30 ТЬг РЬе
СЬп С1п Ьуз Рго СЬу 45 СЬп Рго Рго
Азп Ьеи СЬи Зег 60 СЬу Не Рго Азр
Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег Агд
65 70
Рго УаЬ СЬи АЬа С1и Аэр УаЬ АЬа
85
С1и Авр РГО Рго ТЫ РЬе СЬу СЬу
ТЬг Азр РЬе 75 ТЬг Ьеи ТЬг Не Азп 80
ТЬг Туг Туг Суз С1п СЬп Зег Адп
90 95
СЬу ТЬг Ьуз Ьеи С1и Ые Ьув Агд
- 69 020324
100 105 110 <210> 49 <211> 112 <212> РКТ <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <400> 49
Азр 1 Не Уа1 Ьеи ТЫ С1п 5 Зег Рго Азр Зег 10 Ьеи А1а Уа1 Зег Ьеи 15 С1у
С1и Агд А1а ТЬг Не Зег Суз Агд А1а Зег С1и Зег Уа1 Азр ТЬг РЬе
20 25 30
61у Туг Зег РЬе Т1е Туг Тгр Туг С1п 61п Ьуз Рго £1у С1п Рго Рго
35 40 45
Агд Ьеи Ьеи 11е Туг Агд А1а Зег Азп Ьеи 61и Зег С1у 11е Рго А1а
50 55 60
Агд РЬе Зег 61у 5ег 51 у Зег Агд ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Азп
65 70 75 Θ0
Рго Уа1 С1и А1а С1и Азр Уа1 А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п 61п Зег Азп
85 90 95
61и Азр Рго Рго ТЫ РЬе 61 у 61у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз Агд
100 105 110
<210> 50 <211> 112 <212> РКТ <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <400> 50
Азр 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 61п Зег Рго Азр Зег 10 Ьеи А 1а Уа1 Зег Ьеи 15 61у
61и Агд А1а ТЬг 20 11е Зег Суз Агд А1а 25 Зег С1и 5ег Уа1 Азр 30 ТЬг РЬе
С1у Туг Зег 35 РЬе Не Туг Тгр Туг 40 61п С1п Ьу5 Рго С1у 45 61п Рго Рго
Агд Ьеи Ьеи 11е Туг Агд А1а Зег Азп Ьеи С1и Зег С1у 11е Рго Азр
- 70 020324
5560
Агд 65 РЬе Зег 61у Зег С1у Зег Агд 70 ТЬг Азр РЬе 75 ТЬг Ьеи ТЬг Ые Азп 80
Рго Уа1 С1и АЬа Азр Аэр ν^ι АЬа ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п 5ег Азп
85 90 95
С1и Азр Рго Рго ТЬг Рке С1у С1у СЬу ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз Агд
100 105 110
<210>51 <211>339 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированное антитело <220>
<221> СОЗ <222> (1) .. (339) <220>
<221> источник <222> ¢1)--(69) <223> кото зарЬепз <220>
<221> источник <222> (70),.(117) <223> Миз зр.
<220>
<221> источник <222> (118)..(162) <223> Ьото зархепз <220>
<221> источник <222> (163)..(183) <223> Низ зр.
<220>
<221> источник <222> (184)..(279) <223> Ьогдо зарХепз <220>
<221> источник <222> (280)..(306) <223> Ми5 зр, <220>
<221> источник <222> (307)..(339) <223> кото зарЬепз <400> 51
- 71 020324
дас Азр 1 дсс Уа1 дйд айд аса ТЬг 5 саа С1п асе ТЬг ссй Рго ейд Ьеи йсс Зег 10 ейд аде дйс аей ТЬг ейд Ьеи 15 дда С1у 48
Уа1 Мер Ьеи Зег Уа1
саа ссс дей бсс абб аде йдс ааа йса бса саа йей сйс айс сас йса 96
С1п Рго А1а Зег Не Зег Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Не Н1з Зег
20 25 30
дас ддс ааа аса йас сйс аай йдд ебд ебд сад ада сса дда сад йсс 144
Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи С1п Агд Рго С1у С1п Зег
35 40 45
ссй ааа адд ебб асе йас ейд дйс йей сдй ййд дас йей ддй дйа сса 192
Рго Ьуз Агд Ьеи 11е Туг Ьеи Уа1 Зег Агд Ьеи Азр Зег С1у Уа1 Рго
50 55 60
дас едд 666 асб ддб бсс ддд дсс дда асе дай ййс аей ейд аад абб 240
Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег С1у А1а 31у ТЬг Аэр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз Не
65 70 75 80
Ссс адд дбд даа дей даа дай сйс дда дйд йай йай йдс йдд сад ддс 288
Зег Агд ν$ι С1и А1а С1и Азр Ьеи С1у ν*ι Туг Туг Суз Тгр (31п С1у
85 90 95
аде саб 66с ссс сдй аей ййй ддй ддд ддй асе ааа 66д даа абб аад 336
Зег ΗΪ5 РЬе Рго Агд ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105 110
339 сдй Агд
<210> 52
<211> ИЗ
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 52
Азр Уа1 Уа1 Меб ТЬг С1п ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Зег Уа1 ТЬг Ьеи С1у
1 5 10 15
С1п Рго А1а Зег Не Зег Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Не ΗΪ3 Зег
20 25 30
Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи С1п Агд Рго С1у ΰΐη Зег
35 40 45
Рго Ьуз Агд Ьеи Ие Туг Ьеи Уа1 Зег Агд Ьеи Азр Зег С1у Уа1 Рго
50 55 60
Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег 61у А1а С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е
65 70 75 80
Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Ьеи С1у Уа1 Туг Туг Суз Тгр С1п С1у
- 72 020324
90 95
Зег ΗΪ5 РЬе Рго Агд ТЬг РЬе <31у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз
100 105 110
Агд
<210> 53
<211> 36
<212> ДНК
<213> Ми$ зр.
<400> 53
ддаддаСсса СадасадаСд ддддСдСсдС. ССИддс 36
<210> 54
<211> 32
<212> ДНК
<213> Ми з зр.
<400> 54
ддаддаС.ссс ССдассаддс аСссСададС са 32
<210> 55
<211> 32
<212> ДНК
<213> Миз зр
<220>
<221> тхзС—ГеаСиге <222> (1)., (32) <223> смешанные основания обозначены следующим образом Н=А+Т+С, 5=С+С, У=С+Т, К= С+Т, М=А+С, К=А+С, Ы=А+Т, V = Д+С+С, N = А+С+С+Т <400>55 сССссддааС Ссзагдбпта дсСдзадзад Сс32 <210>56 <211>35 <212> ДНК <213> Миз зр.
<220>
<221> т1зс_ГеаСиге <222> (13)< . (18) <223> η ί$ а, с, д, ог С <400>56 сССссддааС СсзагдСпта дсСдзадзад Ссидд35 <210>57 <211>31 <212> ДНК <213> Миз зр.
- 73 020324
<220> <221> <222> <223> тЬзс £еа!иге (1).-(31) смешанные основания обозначены следующим образом Н=А+Т+С, 5=С+С,
У=С+Т, К= С+Т, И=А+С, Р.-А+'З, . Н=А+Т, V = А+С+С, N = А+С+С+Т
<400> 57
ддадсссдау аССдСдтсза стсагмсСтс а 31
<210> 58
<211> 46
<212> ДНК
<213> Миз зр.
<400> 58
СаСададсСс аадсССддаС ддСдддаада СддаСасадС СддСдс 46
<210> 59
<211> 23
<212> ДНК
<213> Миз зр.
<400> 59
дасадасаса сСссСдсСаС ддд 23
<210> 60
<211> 32
<212> ДНК
<213> Миг зр
<220>
<221> ш1зс_£еаСиге <222> ¢1)..(32) <223> смешанные основания обозначены следующим образом Н=А+Т+С, 5=С+С, У=С+Т, К=С+Т, М=А+С, К=А+С, Й=А+Т, V = А+С+С, N = А+С+С+Т <400>60 дсадаассса сдддасддад суддассссс сс32 <210> 61 <211>5 <212> РКТ <213> Миз эр.
<400>61
С1и Туг Азп МеС Είβ <210> 62 <211>17 <212> РЕТ <213> Миз зр
- 74 020324
- 75 020324 <211> 17 <212> РКТ <213> Миз зр.
<400> 68
РЬе Не Туг Рго Туг Азп
5
С1у С1у ТЬг у Туг Азп С1п Агд РЬе Ьуз
1015
Азп <210>69 <211> 10 <212> РКТ <213> Миз зр.
<400>69
ЗЬу Туг Туг Туг С1у Агд Н13 РЬе Азр Туг 1510 <210>70 <211> 10 <212> РКТ <213> Миз зр.
<400>70
Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Мес Туг
1510 <210>71 <211>7 <212> РРТ <213> Миз зр.
<400>71
11е ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег <210>72 <211>9 <212> РКТ <213> Миз зр.
<400>72
С1п 61п Тгр Зег Зег Азп Рго Рго ТЬг <210>73 <211>360 <212> ДНК <213> Миз зр.
- 76 020324 <220 <221> С05 <222> (1) . .(360) <400 73
дад 31и 1 дйс Уа1 сад С1п сйй Ьеи сад 31п 5 сад С1п йса Зег дда С1у ССЙ Рго дас Азр 10 ейд дйд ааа Ьуз ссй Рго ддд С1у 15 дсс А1а 48
Ьеи Уа1
йса дйд аад ай а йсс Сдс аад дей ЙСЙ дда Сас ада ССс асе даа Сас 96
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег 31у Туг Агд РЬе ТЬг С1и Туг
20 25 30
аай аСд сас йдд айд аад сад аде сай дда дад аде сйй дад йдд аСй 144
Азп Мей НЬз Тгр Мей Ьуз С1п Зег Ηίδ С1у С1и Зег Ьеи 61и Тгр Не
35 40 45
дда СаС аСй Сай ссй Сас аай ддй дай асе ддс Сас адд сад ааа Сйс 192
51у Туг 11е Туг Рго Туг Азп 31у Азр ТЬг С1у Туг Агд С1п Ьуз РЬе
50 55 60
аад аас аСд дес аса йСд аей дса дас асе йсс йсс аай аса дес йас 240
Ьуз Азп Мей А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр 11е Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
айд даа сСс еде аде ейд аса ЙСЙ дас дас Ссй дса дйс Сай ССс йдй 288
Мей С1и Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг Зег Азр Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз
85 90 95
дса ада йдд ддс йас ддй адй ддс ддд ддд ссй аей Сас йдд ддс саа 336
А1а Агд Тгр С1у Туг 61у Зег 31у С1у 31у РЬе ТЬг Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
ддд аей ейд дйс аей дйс Ссй дса 360
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а
115 120
<210 74
<211> 120
<212> РКТ
<213> 1 Миз : зр.
<400 74
С1и Уа1 С1.п Ьеи С1п С1п Зег С1у Рго Азр Ьеи Уа1 Ьуз Рго 31у А1а
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег 31у Туг Агд РЬе ТЬг С1и Туг
20 25 30
Азп Мей Н13 Тгр Мей Ьуз С1п Зег Н1з С1у С1и Зег Ьеи 61и Тгр Не
35 40 45
С1у Туг 11е Туг Рго Туг Азп С1у Азр ТЬг (51у Туг Агд С1п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз Азп Мей А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр 11е Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг
65 70 15 80
- 77 020324
МеС С1и Ьеи Агд Зег 85 Ьеи ТЬг Зег Αερ А$р Зег А1а Уа1 90 Туг РЬе 95 Суз
А1а Агд Тгр С1у Туг С1у Зег 61 у С1у С1у РЬе ТЬг Туг Тгр С1у 61 η
100 105 110
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а
115 120
<210> 75
<211> 357
<212> ДНК
<213> Миз зр.
<220>
<221> - 005
<222> (и ♦. .(357)
<400> 75
дад дес сад есс сад сад Сса дда ссС дад сед дСд ааа ссС ддд дсс 48
С1и 7а1 С1п Ьеи С1п С1п Зег С1у Рго С1и Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у А1а
1 5 10 15
Сса дед аад аСа Ссс Сдс аад дес СсС дда Сас аса ССс асС дас Сас 96
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
аас аСд сас едд дЬд ааа сад аде саС дда аад аде сее дад Сдд аСС 144
Азп Мес ΗΪ3 Тгр Уа1 Ьуз С1п Зег Н15 С1у Ьуз Зег Ьеи С1и Тгр Не
35 40 45
дда ьее асе СаС ссС Сас ааС ддС ддс асС ддс Сас аас сад адд ССс 192
С1у РЬе Не Туг Рго Туг Азп С1у 31у ТЬг 61у Туг Азп С1п Агд РЬе
50 55 60
аад аас аад дсс аса ссд асе дса дас асе ссс ссс аде аса дсс сас 240
Ьуз Азп Ьу5 А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег 5ег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
аСд дад дСс сдс аде сСд аса ссс дад дас СсС дса дсс сас ССС сдс 288
МеС С1и Уа1 Агд Зег Ьеи ТЬг Зег 61и Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз
85 90 95
дса адд дда СаС Сас Сас ддс адд сас ССС дас Сас Сдд ддс саа ддс 336
А1а Агд С1у Туг Туг Туг С1у Агд ΗΪ3 РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 НО
асс асе ССС аса дсс ССС Сса 357
ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 76
<211> 119
<212> РКТ
<213> Миз зр
<400> 76
- 78 020324
С1и 1 УаЬ С1п Ьеи СЬп 5 СЬп Зег С1у Рго С1и 10 Ьеи УаЬ Ьуз Рго СЬу 15 А1а
Зег УаЬ Ьуз 11е Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
Азп МеЁ ΗΪ3 Тгр Уа1 Ьуз СЬп Зег НЬз С1у Ьуз Зег Ьеи С1и Тгр Не
35 40 45
С1у РЬе 11е Туг Рго Туг Азп С1у С1у ТЬг С1у Туг Азп СЬп Агд РЬе
50 55 60
Ьуз Азп Ьуз АЬа ТЬг Ьеи ТЬг УаЬ Азр ТЬг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Мес СЬи УаЬ Агд Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз
85 90 95
А1а Агд СЬу Туг Туг Туг СЬу Агд НЬз РЬе Азр Туг Тгр СЬу СЬп СЬу
100 105 НО
ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг УаЬ Зег Зег
115
<210> 77
<211> 336
<212> , цнк
<213> 1 Миз : ?р.
<220>
<22Ь> ' 3ϋ3
<222> Ш > .(336)
<400> 77
дас эёё дед сед асе саа ЁСЁ сса дде ЁСЁ ЁЁд дсЁ дбд ЁСЁ сё а ддд 48
Азр Не УаЬ Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго СЬу Зег Ьеи АЬа УаЬ Зег Ьеи СЬу
1 5 10 15
Сад адд дсс асе аеа ЁСС Ёдс ада дсс аде даа адЁ дЁЬ дас асЁ ЁаЁ 96
СЬп Агд АЬа ТЬг 11е Зег Суз Агд А1а Зег С1и Зег УаЬ Азр ТЬг Туг
20 25 30
ддс ааЁ адЁ ЁЁС аЁд сас Ёдд Ёас сад сад ааа дса дда сад ссд ссс 144
СЬу Азп Зег РЬе МеЁ НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз АЬа СЬу СЬп Рго Рго
35 40 45
ада СЁС СЁ С аес ЁЙЁ сдЁ дса ЁСС аас сёэ даа ЁСЁ ддд аЁс ССЁ дсс 192
Агд Ьеи Ьеи 1Ье Туг Агд АЬа Зег Азп Ьеи С1и Зег СЬу Не РГО АЬа
50 55 60
адд ЁЁС аде ддс аде ддд ЁСЁ адд аса дас ЁЁС асе СЁС аес аЁЁ ааЁ 240
Агд РЬе Зег С1у Зег СЬу Зег Агд ТЬг А5р РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Азп
65 70 75 80
ССЁ дед дад дсЁ даЁ даб дСЁ дса асе ёэё Ёас ЁдЬ сад саа адЁ ааЁ 288
- 79 020324
Рго Уа1 С1и А1а Азр Азр Уа1 А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Азп
85 90 95
дад даС ссС сСс асд ССс ддь дсС ддд асе аад сСд дад сСд ааа едд 336
С1и Азр Рго Ьеи ТЬг РЬе С1у А1а С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Ьеи Ьуз Агд
100 105 110
<210> 73
<211> 112
<212> РЕТ
<213> Миз зр.
<4С0> 78
Азр 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго С1у Зег Ьеи А1а Уа1 Зег Ьеи С1у
1 5 10 15
С1п Агд А1а ТНг 11е Зег Суз Агд А1а Зег С1и Зег Уа1 Азр ТЬг Туг
20 25 30
С1у Азп Зег РНе МеС ΗΪ3 Тгр Туг С1п С1п Ьуз А1а С1у С1п Рго Рго
35 40 45
Агд Ьеи Ьеи 11е Туг Агд А1а Зег Азп Ьеи С1и Зег С1у Не Рго А1а
50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег (31у Зег Агд ТЬг Азр РНе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Азп
65 70 75 80
Рго Уа1 С1и А1а Азр Азр 7а1 А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Азп
85 90 95
31и Азр Рго Ьеи ТЬг РНе С1у А1а С1у ТНг Ьуз Ьеи С1и Ьеи Ьуз Агд
100 105 110
<210> 79
<211> 321
<212> ДНК
<213> Миз : зр.
<220>
<221> СОЗ
<222> (1) . .(321)
< 4 00> 79
саа аСС дСС сСс асе сад СсС сса дса сСс аСд СсС дса СсС сса ддд 48
С1п 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а Ьеи МеС Зег А1а Зег Рго С1у
1 5 10 15
дад аад дСс асе аСд асе Сде адС дес аде Сса адС дед адС Сас аСд 96
С1и Ьуз Уа1 ТЬг МеС ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеС
20 25 30
Сас Сдд Сас сад сад аад сса ада Ссс Нес ссс ааа ССС Ьдд асе СаС 144
Туг Тгр Туг С1п <31п Ьуз Рго Агд 5ег Зег Рго Ьуз Рго Тгр 11е Туг
- 80 020324
35 40 45
аес аса есс аас сед дсе есе дда дСс ссе дсе сдс еес аде ддс аде 192
Ые ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у УаЬ Рго А1а Агд РЬе Зег С1у Зег
50 55 60
ддд Ссь ддд асе есе еас есе сес аса аес аде аде аед дад дсе даа 240
С1у Зег СЬу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ме1 СЬи А1а СЬи
65 70 75 80
дае дсп дсс асе еае еас Сдс сад сад едд аде аде аас сса ссс асд 288
Азр АЬа АЬа ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Зег Зег Азп Рго Рго ТЬг
85 90 95
ЬЬс дда ддд ддд асе аад сед даа аеа ааа едд 321
РЬе СЬу С1у СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи Ые Ьуз Агд
100 105
<210> 80
<211> 107
<212> РЕТ
<213> 1 Миз : зр.
<400> 80
С1п 11е УаЬ Ьеи ТЬг С1п Зег Рго АЬа Ьеи Мее Зег А1а Зег Рго С1у
1 5 10 15
СЬи Ьуй Уа1 ТЬг Мее ТЬг Суз Зег АЬа Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Мее
20 25 30
Туг Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго Агд Зег Зег Рго Ьуз Рго Тгр Не Туг
35 40 45
Не ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго А1а Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
С1у Зег СЬу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Мее СЬи А1а СЬи
65 70 75 80
Азр А1а АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп С1п Тгр Зег Зет Азп Рго Рго ТЬг
85 90 95
РЬе С1у СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи Ые Ьуз Агд
100 105
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (62)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с рецептором эфрина Ερ1ιΑ2 и является антагонистом указанного рецептора, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит одну или несколько гипервариабельных областей с аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8Εφ ΙΌ ΝΟ:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 и 72.
  2. 2. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.1, где указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент представляет собой антитело мыши или его эпитопсвязывающий фрагмент и продуцируется гибридомой 37.3Ό7 РТА-7660; гибридомой 37.1 Р5 РТА-7661; гибридомой 53.2Н11 РТА7662; гибридомой Ερ1Α2-Ν1 ΡΤΑ-8407 или гибридомой Ερ1Α2-Ν2 ΡΤΑ-8408.
  3. 3. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.1 или 2, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент способно ингибировать рост раковой клетки.
  4. 4. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент способно ингибировать миграцию раковой клетки.
  5. 5. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.3 и 4, отличающееся тем, что указанная раковая клетка представляет собой клетку, выбранную из группы, состоящей из клеток рака молочной железы, рака толстой кишки, рака эндометрия, карциномы яичников, остеосаркомы, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака легких, синовиальной карциномы, рака поджелудочной железы, саркомы, глиомы, рака головы и шеи, рака желудка, рака печени и других карцином.
  6. 6. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент способно ингибировать ангиогенез.
  7. 7. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент лишено агонистической ак- 81 020324 тивности.
  8. 8. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.7, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент не стимулирует фосфорилирование по остаткам тирозина ЕрНА2.
  9. 9. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент способно ингибировать связывание лиганда с указанным рецептором.
  10. 10. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.9, отличающееся тем, что указанный лиганд представляет собой эфрин А1.
  11. 11. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент способно ингибировать фосфорилирование по остаткам тирозина ЕрНА2.
  12. 12. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.11, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент способно ингибировать фосфорилирование по остаткам тирозина ЕрНА2 в присутствии эфрина А1.
  13. 13. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент способно ингибировать опосредованную ЕрНА2 передачу сигнала.
  14. 14. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.13, отличающееся тем, что опосредованная ЕрНА2 передача сигнала представляет собой увеличение фосфорилирования Ак!.
  15. 15. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент связывает ЕрНА2 с Кс, составляющей 3х 10-10 М или меньше.
  16. 16. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанный рецептор ЕрНА2 является рецептором человека.
  17. 17. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5ЕО ГО N0:26, 28, 30, 78 и 80.
  18. 18. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЛА) ГО N0:20, 22, 24, 74 и 76.
  19. 19. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО N0:1, 2 и 3, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 51Е0 ГО N0:4, 5 и 6.
  20. 20. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.19, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, состоящую из 8Е0 ГО N0:26.
  21. 21. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.19, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит одну или более вариабельных областей тяжелой цепи, имеющих аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:20.
  22. 22. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-18, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО N0:7, 8 и 9, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО N0:10, 11 и 12.
  23. 23. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.22, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:28.
  24. 24. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.22, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит одну или более вариабельных областей тяжелой цепи, имеющих аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:22.
  25. 25. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-18, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные
    - 82 020324 определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО ΝΟ:13, 14 и 15, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕО ГО ΝΟ:16, 17 и 18.
  26. 26. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.25, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО ΝΟ:30.
  27. 27. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.25, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит одну или более вариабельных областей тяжелой цепи, имеющих аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ:24.
  28. 28. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-18, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО ΝΟ:61, 62 и 63, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО ΝΟ:64, 65 и 66.
  29. 29. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.28, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ:78.
  30. 30. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.28, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит одну или более вариабельных областей тяжелой цепи, имеющих аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ:74.
  31. 31. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-18, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО ΝΟ:67, 68 и 69, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 ГО ΝΟ:70, 71 и 72.
  32. 32. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.31, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ:80.
  33. 33. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.31, отличающееся тем, что указанное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент содержит одну или более вариабельных областей тяжелой цепи, имеющих аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ:76.
  34. 34. Антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-16, которые являются гуманизированными или поверхностно-модифицированными.
  35. 35. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.34, отличающееся тем, что содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО ΝΟ:47, 48, 49, 50 и 52.
  36. 36. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.34 и 35, отличающееся тем, что содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43 и 45.
  37. 37. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.34-36, отличающееся тем, что содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕО ГО ΝΟ:1, 2 и 3, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕО ГО ΝΟ:4, 5 и 6.
  38. 38. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.37, отличающееся тем, что содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО ΝΟ:47.
  39. 39. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.37, отличающееся тем, что содержит одну или более вариабельных областей тяжелой цепи, имеющих аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:32, 34 и 36.
  40. 40. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.34-36, отличающееся тем, что содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные
    - 83 020324
    ЗЕЦ ГО NО:7, 8 и 9, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные ЗЕО ГО NО:10, 11 и 12.
  41. 41. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.40, отличающееся тем, что содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ГО NО:48, 49 или 50.
  42. 42. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.40, отличающееся тем, что содержит одну или более вариабельных областей тяжелой цепи, имеющих аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО:37 и 38.
  43. 43. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.34-36, отличающееся тем, что содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные ЗЕО ГО NО:13, 14, и 15, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные ЗЕО ГО ΝΘ:16, 17 и 18.
  44. 44. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.43, отличающееся тем, что содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО NО:52.
  45. 45. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по п.43, отличающееся тем, что содержит одну или более вариабельных областей тяжелой цепи, имеющих аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО:40, 42, 43 и 45.
  46. 46. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.34-36, отличающееся тем, что содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО:61, 62 и 63, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО:64, 65 и 66.
  47. 47. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.34-36, отличающееся тем, что содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и по меньшей мере одну легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО:67, 68 и 69, и где указанная легкая цепь содержит три последовательные определяющие комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО:70, 71 и 72.
  48. 48. Гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.34-47, отличающееся тем, что указанное гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из 1и37.3П7, 1и37.1Р5, 1и53.2Н11, йиЕрйЛ2-N1 и 1иЕрйА2-№, раскрытых в описании.
  49. 49. Конъюгат, содержащий антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, по любому из пп.1-48, связанный с цитотоксическим средством.
  50. 50. Конъюгат, содержащий гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи с последовательностью, гомологичной по меньшей мере примерно на 95% последовательности ЗЕО ГО NО:52, и вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, гомологичной по меньшей мере примерно на 95% последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО:40, 42, 43 и 45, связанный с цитотоксическим средством.
  51. 51. Конъюгат, содержащий гуманизированное или поверхностно-модифицированное антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи с последовательностью, гомологичной по меньшей мере примерно на 98% последовательности ЗЕО ГО NО:52, и вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, гомологичной по меньшей мере примерно на 98% последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО:40, 42, 43 и 45, связанный с цитотоксическим средством.
  52. 52. Конъюгат по любому из пп.49-51, отличающийся тем, что указанное цитотоксическое средство выбирают из группы, состоящей из мейтанзиноида, низкомолекулярного лекарственного средства, производного томеймицина, производного лептомицина, пролекарства, токсоида, аналога СС-1065 и СС1065.
  53. 53. Конъюгат по п.52, отличающийся тем, что указанное цитотоксическое средство представляет собой мейтанзин ЭМ1 формулы
    - 84 020324
  54. 54. Конъюгат по п.52, отличающийся тем, что указанное цитотоксическое средство представляет собой мейтанзин ЭМ4 формулы
  55. 55. Конъюгат по п.52, отличающийся тем, что указанное цитотоксическое средство представляет собой производное томеймицина, выбранное из группы, состоящей из
    8,8'-[1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Нпирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[5-метокси-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[1,5-пентандиилбис(окси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[1,4-бутандиилбис(окси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[3-метил-1,5-пентандиилбис(окси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Нпирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[2,6-пиридиндиилбис(окси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[4-(3-трет-бутоксикарбониламинопропилокси)-2,6-пиридиндиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2эт(Е)илиден-7 -метокси-1,2,3,11 а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[5-(3-аминопропилокси)-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1 -с] [1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[5-(Ы-метил-3-трет-бутоксикарбониламинопропил)-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2эт(Е)илиден-7 -метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-{5-[3-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)пропилокси]-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)}бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[5-ацетилтиометил-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[(8)-2-метилен-7-метокси-1,2,3,11атетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    трет-бутиловый эфир бис{2-[(8)-2-метилен-7-метокси-5-оксо-1,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-8-илокси]этил}карбаминовой кислоты;
    8,8'-[3-(2-ацетилтиоэтил)-1,5-пентандиилбис(окси)]бис[(8)-2-метилен-7-метокси-1,2,3,11атетрагидро-5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[5-(М-4-меркапто-4,4-диметилбутаноил)амино-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[7-метокси2-метилен-1,2,3,11а-тетрагидро-5Н-пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[5-(М-4-метилдитио-4,4-диметилбутаноил)амино-1,3-бензолдиилбис(метиленокси)]бис[7метокси-2-метилен-1,2,3,11 а-тетрагидро -5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[5-(М-метил-М-(2-меркапто-2,2-диметилэтил))амино-1,3-бензолдиил(метиленокси)]бис[7метокси-2-метилен-1,2,3,11 а-тетрагидро -5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[5-(Ы-метил-М-(2-метилдитио-2,2-диметилэтил))амино-1,3-бензолдиил(метиленокси)]бис[7метокси-2-метилен-1,2,3,11 а-тетрагидро -5Н-пирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[(4-(2-(4-меркапто-4-метил)пентанамидоэтокси)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2эт(Е)илиден-7 -диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[(1-(2-(4-метил-4-метилдисульфанил)пентанамидоэтокси)бензол-3,5-диметил)диокси]бис[(8)-2эт(Е)илиден-7 -диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1 -с] [ 1,4]бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[(4-(3-(4-метил-4-метилдисульфанил)пентанамидопропокси)пиридин-2,6-диметил)диокси] бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    - 85 020324
    8,8'-[(4-(4-(4-метил-4-метилдисульфанил)пентанамидобутокси)пиридин-2,6-диметил)диокси] бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[(4-(3-[4-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноил)пиперазин-1-ил]пропил)пиридин-2,6диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[(1-(3-[4-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноил)пиперазин-1-ил]пропил)бензол-3,5-диметил) диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)этокси]этокси}этокси)пиридин-2,6диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)этокси]этокси}этокси) этокси]этокси}этокси)бензол-3,5-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11атетрагидропирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[(1-(2-{2-[2-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)этокси]этокси}этокси)бензол-3,5диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)этокси]этокси}этокси) этокси]этокси}этокси)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11атетрагидропирроло [2,1-с][1,4] бензодиазепин-5 -он];
    8,8'-[(1-(2-[метил(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)амино]этокси)бензол-3,5-диметил)диокси] бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[(4-(3-[метил(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноил)амино]пропил)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[(4-(3-[метил(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)амино]пропил)пиридин-2,6-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепин-5-он];
    8,8'-[(1-(4-метил-4-метилдисульфанил)пентанамидо)бензол-3,5-диметил)диокси]бис[(8)-2-эт(Е)илиден-7-диметокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1-с][1,4]бензодиазепин-5 -он].
  56. 56. Конъюгат по п.52, отличающийся тем, что цитотоксическое средство представляет собой производное лептомицина, выбранное из группы, состоящей из (2-метилсульфанилэтил)амид (2Е,10Е,12Е,16Ζ,18Е)-(Я)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гептаметил-19((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты;
    бис[(2-меркаптоэтил)амид (2Е,10Е,12Е,16Ζ,18Е)-(Я)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гептаметил-19((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты];
    (2-меркаптоэтил)амид (2Е,10Е,12Е,16Ζ,18Е)-(Я)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гептаметил-19-((28,38)3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты;
    (2-метилдисульфанилэтил)амид (2Е,10Е,12Е,16Ζ,18Е)-(Я)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гептаметил19-((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты;
    (2-метил-2-метилдисульфанилпропил)амид (2Е,10Е,12Е,16Ζ,18Е)-(Я)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17гептаметил-19-((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18пентаеновой кислоты;
    (2-меркапто-2-метилпропил)амид (2Е,10Е,12Е,16Ζ,18Е)-(Я)-6-гидрокси-3,5,7,9,11,15,17-гептаметил19-((28,38)-3-метил-6-оксо-3,6-дигидро-2Н-пиран-2-ил)-8-оксононадека-2,10,12,16,18-пентаеновой кислоты.
  57. 57. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-48 либо конъюгат по любому из пп.49-56 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиенты.
  58. 58. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, входящий в состав антитела по любому из пп.1-48, выбранный из группы, состоящей из 8Еф ГО ΝΟ:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 78 и 80.
  59. 59. Полинуклеотид по п.58, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид обладает последовательностью, имеющей как минимум 80% гомологию с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 39, 41, 44, 46, 51, 73, 75, 77 и 79.
  60. 60. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.58 и 59.
  61. 61. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.60.
  62. 62. Гибридомная клеточная линия, отличающаяся тем, что ее выбирают из группы, состоящей из гибридомной клеточной линии, обозначенной 37.3Ό7 РТА-7660; гибридомной клеточной линии, обозначенной 37.1Е5 РТА-7661; гибридомной клеточной линии, обозначенной 53.2Н11 РТА-7662; гибридомной клеточной линии, обозначенной ΕρйΑ2-N1 РТМ-8407; или гибридомной клеточной линии, обозначенной Ερ11Α2-N2 РТМ-8408, продуцирующая антитело по п.1.
EA200970130A 2006-07-18 2007-07-13 АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ ЭФРИНА EphA2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ EA020324B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06291160 2006-07-18
PCT/IB2007/003074 WO2008010101A2 (en) 2006-07-18 2007-07-13 Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970130A1 EA200970130A1 (ru) 2009-06-30
EA020324B1 true EA020324B1 (ru) 2014-10-30

Family

ID=37635710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200970130A EA020324B1 (ru) 2006-07-18 2007-07-13 АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ ЭФРИНА EphA2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Country Status (31)

Country Link
US (4) USRE47123E1 (ru)
EP (1) EP2044122B1 (ru)
JP (2) JP5622390B2 (ru)
KR (1) KR101528939B1 (ru)
CN (1) CN101622276B (ru)
AR (1) AR061911A1 (ru)
AU (1) AU2007274738B2 (ru)
BR (1) BRPI0714871A2 (ru)
CA (1) CA2658276A1 (ru)
CL (2) CL2007002085A1 (ru)
CO (1) CO6160239A2 (ru)
CR (1) CR10558A (ru)
EA (1) EA020324B1 (ru)
EC (1) ECSP099074A (ru)
ES (1) ES2673822T3 (ru)
GT (1) GT200900002A (ru)
IL (2) IL196470A (ru)
MA (1) MA30634B1 (ru)
ME (1) ME00581A (ru)
MX (1) MX2009000709A (ru)
MY (1) MY157757A (ru)
NI (1) NI200900005A (ru)
NO (1) NO20090758L (ru)
NZ (1) NZ574215A (ru)
PE (2) PE20080430A1 (ru)
SV (1) SV2009003151A (ru)
TN (1) TN2009000007A1 (ru)
TW (1) TW200821329A (ru)
UY (1) UY30492A1 (ru)
WO (1) WO2008010101A2 (ru)
ZA (1) ZA200900545B (ru)

Families Citing this family (151)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
US7999541B2 (en) * 2005-05-16 2011-08-16 Rapiscan Security Products, Inc. System and method for improving the analysis of polymorphic chemical substance forms and concentrations using NQR
NZ609752A (en) 2005-08-24 2014-08-29 Immunogen Inc Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
USRE47123E1 (en) 2006-07-18 2018-11-13 Sanofi EPHA2 receptor antagonist antibodies
AU2008270972B2 (en) 2007-07-02 2013-10-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
ES2435779T3 (es) * 2007-07-19 2013-12-23 Sanofi Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapéutico
TWI443109B (zh) 2007-08-30 2014-07-01 Daiichi Sankyo Co Ltd 抗ｅｐｈａ２抗體
EP2177630A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-21 Institut Gustave Roussy Methods for predicting or monitoring whether a patient affected by a cancer is responsive to a treatment with a molecule of the taxoid family
WO2010070252A1 (en) 2008-12-15 2010-06-24 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
UA104605C2 (ru) 2008-12-15 2014-02-25 Зіленд Фарма А/С Аналоги глюкагона
JP5635531B2 (ja) 2008-12-15 2014-12-03 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ グルカゴン類似体
ES2502218T3 (es) 2008-12-15 2014-10-03 Zealand Pharma A/S Análogos de glucagón
PT2437790T (pt) 2009-06-03 2019-06-04 Immunogen Inc Métodos de conjugação
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
CA2767792A1 (en) 2009-07-13 2011-01-20 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
FR2949469A1 (fr) 2009-08-25 2011-03-04 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique
AR078470A1 (es) * 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2
TW201117814A (en) * 2009-10-02 2011-06-01 Sanofi Aventis New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody
EP2498796B1 (en) 2009-11-09 2017-12-27 AAL Scientifics, Inc. Treatment of heart disease
WO2011057251A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of heart disease
KR101831459B1 (ko) * 2010-03-03 2018-04-04 더 유니버시티 오브 브리티시 콜롬비아 올리고머 특이적 아밀로이드 베타 에피토프 및 항체
AU2011239525B2 (en) 2010-04-15 2015-04-09 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines used to treat proliferative diseases
EA024118B1 (ru) 2010-04-15 2016-08-31 Сиэтл Дженетикс, Инк. Конъюгаты пирролбензодиазепина направленного действия
AR081975A1 (es) 2010-06-23 2012-10-31 Zealand Pharma As Analogos de glucagon
US9169310B2 (en) 2010-06-24 2015-10-27 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
FR2963007B1 (fr) 2010-07-26 2013-04-05 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application therapeutique
RU2016123839A (ru) * 2010-12-08 2018-11-30 АббВай Стемсентркс ЭлЭлСи Новые модуляторы и способы их применения
RS58367B1 (sr) 2011-03-29 2019-03-29 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
JP6185463B2 (ja) 2011-07-15 2017-08-23 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｒｓｐｏ結合剤およびその使用法
EP2751120B1 (en) 2011-09-20 2018-08-22 MedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepines as unsymmetrical dimeric pbd compounds for inclusion in targeted conjugates
EP3309162A1 (en) 2011-10-14 2018-04-18 Seattle Genetics, Inc. Targeted conjugates of pyrrolobenzodiazepines
SG11201401021TA (en) 2011-10-14 2014-08-28 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines
US9388187B2 (en) 2011-10-14 2016-07-12 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines
JP6393617B2 (ja) 2011-10-14 2018-09-19 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド ピロロベンゾジアゼピンおよび標的コンジュゲート
JP2015502380A (ja) 2011-12-23 2015-01-22 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ グルカゴン類似体
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
RU2014148162A (ru) 2012-05-01 2016-06-20 Дженентек, Инк. Анти-pmel17 антитела и их иммуноконъюгаты
TR201815338T4 (tr) 2012-05-03 2018-11-21 Zealand Pharma As Gıp-glp-1 dual agonist bileşikleri ve yöntemler.
TW201406785A (zh) 2012-07-09 2014-02-16 Genentech Inc 抗ｃｄ２２抗體及免疫結合物
KR20150030753A (ko) 2012-07-09 2015-03-20 제넨테크, 인크. 항-cd79b 항체를 포함하는 면역접합체
MX2015000565A (es) * 2012-07-13 2015-04-10 Oncomed Pharm Inc Agentes de union de proteina de r-espondina humana (rspo3) y usos de los mismos.
DK2875043T3 (en) 2012-07-23 2017-03-27 Zealand Pharma As glucagon
MX2015001399A (es) 2012-08-02 2015-09-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-etbr e inmunoconjugados.
TWI608013B (zh) 2012-09-17 2017-12-11 西蘭製藥公司 升糖素類似物
IN2015DN03202A (ru) * 2012-10-04 2015-10-02 Immunogen Inc
EP2906249B1 (en) 2012-10-12 2018-06-27 MedImmune Limited Synthesis and intermediates of pyrrolobenzodiazepine derivatives for conjugation
WO2014057119A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
PT2906253T (pt) 2012-10-12 2018-11-05 Medimmune Ltd Conjugados de anticorpo anti-psma de pirrolobenzodiazepina
US10736903B2 (en) 2012-10-12 2020-08-11 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-anti-PSMA antibody conjugates
EP2906251B1 (en) 2012-10-12 2017-09-27 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd22 antibody conjugates
CN104703630A (zh) 2012-10-12 2015-06-10 斯皮罗根有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
US9931414B2 (en) 2012-10-12 2018-04-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
RS53818B1 (en) 2012-10-12 2015-06-30 Spirogen Sàrl PIROLOBENZODIAZEPINI I NJIHOVI conjugated
US10695433B2 (en) 2012-10-12 2020-06-30 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
AU2013349733C1 (en) 2012-11-20 2020-10-01 Sanofi Anti-CEACAM5 antibodies and uses thereof
JP6441232B2 (ja) * 2012-12-27 2018-12-19 サノフイＳａｎｏｆｉ 抗ｌａｍｐ１抗体および抗体薬物コンジュゲート、ならびにその使用
JP6340019B2 (ja) 2013-03-13 2018-06-06 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
EA027910B1 (ru) 2013-03-13 2017-09-29 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины и их конъюгаты
BR112015022019A2 (pt) 2013-03-14 2017-08-29 Genentech Inc Anticorpos isolados, ácido nucleico, célula hospedeira, método de produção de anticorpos, imunoconjugado, formulação farmacêutica, métodos de tratamento de indivíduos, de inibição da proliferação de células, de detecção de b7-h4 humano e de detecção de câncer
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
EA201690195A1 (ru) 2013-08-12 2016-05-31 Дженентек, Инк. Конъюгатные соединения антитело-лекарство на основе димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1h-бензо[e]индола и способы применения и лечения
WO2015042108A1 (en) 2013-09-17 2015-03-26 Genentech, Inc. Methods of using anti-lgr5 antibodies
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317981D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
DK3057984T3 (en) 2013-10-17 2018-10-08 Zealand Pharma As ACYLED GLUCAGON ANALOGS
US9988429B2 (en) 2013-10-17 2018-06-05 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
CN105829339B (zh) 2013-11-06 2021-03-12 西兰制药公司 胰高血糖素-glp-1-gip三重激动剂化合物
JP6682432B2 (ja) 2013-11-06 2020-04-15 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ Ｇｉｐ−ｇｌｐ−１デュアルアゴニスト化合物及び方法
WO2015089344A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Genentech, Inc. Anti-cd33 antibodies and immunoconjugates
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
CN106414499A (zh) 2014-05-22 2017-02-15 基因泰克公司 抗gpc3抗体和免疫偶联物
TW202136296A (zh) * 2014-06-27 2021-10-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
AU2015308818B2 (en) 2014-08-28 2021-02-25 Bioatla Llc Conditionally active chimeric antigen receptors for modified T-cells
BR112017004631A2 (pt) 2014-09-12 2018-01-30 Genentech, Inc. anticorpo, ácido nucleico, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, métodos de tratamento, de inibição da proliferação de uma célula e de detecção de her2 humana e método para a detecção de um câncer
WO2016040724A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3388449A3 (en) 2014-09-12 2018-10-24 F. Hoffmann-La Roche AG Cysteine engineered antibodies and conjugates
BR112017004802A2 (pt) 2014-09-12 2017-12-12 Genentech Inc anticorpos anti-cll-1 e imunoconjugados
US10064937B2 (en) 2014-09-16 2018-09-04 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of dermal fibrosis
MX2017003472A (es) 2014-09-17 2017-10-31 Genentech Inc Inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-her2.
EP3212218B1 (en) 2014-10-29 2021-06-30 Zealand Pharma A/S Gip agonist compounds and methods
JP6878287B2 (ja) 2014-11-25 2021-05-26 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム ピロロベンゾジアゼピン−抗体コンジュゲート
WO2016168388A2 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Palatin Technologies, Inc. Therapies for obesity, diabetes and related indications
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
CA2980978A1 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogue
KR101636882B1 (ko) * 2015-06-25 2016-07-06 전남대학교 산학협력단 인간 피브로넥틴 도메인 Ⅲ 기본 골격의 신규 인간 ＥｐｈＡ2 특이적 결합 단백질 및 그의 용도
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
TWI714661B (zh) 2015-11-05 2021-01-01 法商賽諾菲公司 新穎念珠藻素化合物及接合物、其製備與其治療用途
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US11534466B2 (en) 2016-03-09 2022-12-27 Aal Scientifics, Inc. Pancreatic stem cells and uses thereof
CA3021086C (en) 2016-04-15 2023-10-17 Bioatla, Llc Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017196847A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Variable new antigen receptor (vnar) antibodies and antibody conjugates targeting tumor and viral antigens
EP3455261B1 (en) 2016-05-13 2022-08-03 BioAtla, Inc. Anti-ror2 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
WO2017214182A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 The United States Of America. As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Fully human antibody targeting pdi for cancer immunotherapy
EP3494135A1 (en) 2016-08-02 2019-06-12 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (gpc2) and use thereof
CN109689111B (zh) 2016-08-11 2024-04-05 基因泰克公司 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
KR20220150408A (ko) * 2016-11-14 2022-11-10 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 결합 링커, 그러한 결합 링커를 함유하는 세포 결합 분자-약물 결합체, 링커를 갖는 그러한 결합체의 제조 및 사용
JP7313684B2 (ja) 2016-11-21 2023-07-25 キュレアブ ゲーエムベーハー 抗ｇｐ７３抗体及びイムノコンジュゲート
AU2017382883B2 (en) 2016-12-21 2024-07-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for FLT3 and uses thereof
CA3047683C (en) 2017-02-08 2020-03-10 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10093731B2 (en) 2017-02-24 2018-10-09 Kindred Biosciences, Inc. Anti-IL31 antibodies for veterinary use
DK3612537T3 (da) 2017-04-18 2022-08-08 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepinkonjugater
PL3612234T3 (pl) 2017-04-20 2024-09-02 Adc Therapeutics Sa Terapia skojarzona z koniugatem anty-AXL przeciwciało-lek
MA50764A (fr) 2017-05-10 2020-03-18 Sanofi Sa Linkers peptidiques et conjugués de cryptophycine, utiles en thérapie, et leur préparation
WO2018213064A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibody targeting tnfer2 for cancer immunotherapy
BR112019026564A2 (pt) 2017-06-14 2020-06-30 Adc Therapeutics Sa regimes de dosagem para a administração de um adc anti-cd19
WO2019006280A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Lentigen Technology, Inc. HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO CD33 AND METHODS OF USE
WO2019005208A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services ANTIBODIES TO HUMAN MESOTHELIN AND USES IN ANTICANCER THERAPY
CN111065638B (zh) 2017-08-18 2021-04-09 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂䓬缀合物
TW202404649A (zh) 2017-09-29 2024-02-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體
TWI825046B (zh) * 2017-12-19 2023-12-11 英商拜西可泰克斯有限公司 Epha2特用之雙環胜肽配位基
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
CN108490180B (zh) * 2018-03-12 2020-03-10 南通大学附属医院 EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA3105694A1 (en) 2018-07-12 2020-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Affinity matured cd22-specific monoclonal antibody and uses thereof
AU2019317565A1 (en) 2018-08-08 2021-02-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-2 and uses thereof
EP3883608A1 (en) 2019-01-08 2021-09-29 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Cross-species single domain antibodies targeting mesothelin for treating solid tumors
CN113784987B (zh) 2019-01-22 2024-09-13 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和力单克隆抗体和使用方法
EP3920972A1 (en) 2019-02-07 2021-12-15 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
EP3693023A1 (en) 2019-02-11 2020-08-12 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
WO2020227640A1 (en) * 2019-05-08 2020-11-12 Agilvax, Inc. Compositions and methods related to xct antibodies
AU2020370125A1 (en) 2019-10-22 2022-05-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity nanobodies targeting B7H3 (CD276) for treating multiple solid tumors
WO2021118968A1 (en) 2019-12-12 2021-06-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibody-drug conjugates specific for cd276 and uses thereof
BR112023001733A2 (pt) 2020-09-04 2023-03-28 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-ceacam5 e conjugados e usos dos mesmos
WO2022093745A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
TW202241935A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 美商世紀治療股份有限公司 具有可調適受體專一性之嵌合抗原受體系統
WO2022232612A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
CN113151473A (zh) * 2021-04-30 2021-07-23 宁夏医科大学 一种用于检测浸润性乳腺癌中EphA2 DNA甲基化的方法及用途
EP4349857A1 (en) 2021-05-25 2024-04-10 Vaxcell-Bio Monobody-based chimeric antigen receptor and immune cell including same
US20240270851A1 (en) 2021-06-09 2024-08-15 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
JP2024536382A (ja) 2021-10-07 2024-10-04 サノフイ イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン化合物及びそのコンジュゲート、それらの調製並びにそれらの治療用途
KR20240082410A (ko) * 2021-10-14 2024-06-10 시젱 하이스코 파마수티칼 씨오., 엘티디. EphA2 비시클릭 펩티드 리간드 및 이의 접합체
KR20240099412A (ko) 2021-11-05 2024-06-28 사노피 항-ceacam5 항체-약물 접합체 및 항-vegfr-2 항체를 함유하는 항종양 조합
IL313224A (en) 2021-12-02 2024-07-01 Sanofi Sa CEA test to select patients in cancer treatment
WO2023099682A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 Sanofi Ceacam5 adc–anti-pd1/pd-l1 combination therapy
WO2023172968A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Merck Patent Gmbh Anti-gd2 antibodies, immunoconjugates and therapeutic uses thereof
AU2023232411A1 (en) 2022-03-09 2024-10-24 Merck Patent Gmbh Anti-ceacam5 antibodies and conjugates and uses thereof
AU2023264069A1 (en) 2022-05-03 2024-10-24 Genentech, Inc. Anti-ly6e antibodies, immunoconjugates, and uses thereof
WO2024180192A1 (en) 2023-03-01 2024-09-06 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating neuroendocrine cancers expressing ceacam5
EP4427763A1 (en) 2023-03-06 2024-09-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-vegfr-2 antibodies and anti-pd1/pd-l1 antibodies
WO2024194455A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Sanofi CEACAM5 mRNA ASSAY FOR PATIENT SELECTION IN CANCER THERAPY

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004092343A2 (en) * 2003-04-11 2004-10-28 Medimmune, Inc. Epha2, hypoproliferative cell disorders and epithelial and endothelial reconstitution
WO2004101764A2 (en) * 2003-05-13 2004-11-25 Chiron Corporation Methods of modulating metastasis and skeletal related events resulting from metastases
WO2006047637A1 (en) * 2004-10-27 2006-05-04 Medimmune, Inc. Use of modulators of epha2 and ephrina1 for the treatment and prevention of infections
WO2006084226A2 (en) * 2005-02-04 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to epha2 and methods of use thereof

Family Cites Families (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1516743A (fr) 1966-04-01 1968-02-05 Rhone Poulenc Sa Nouvel antibiotique et son procédé de préparation par culture de streptomyces croceus
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
AU631545B2 (en) 1988-04-15 1992-12-03 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
JP3105898B2 (ja) 1988-04-16 2000-11-06 セルテック リミテッド 組換えｄｎａタンパクの製造方法
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0436597B1 (en) 1988-09-02 1997-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DE69233367T2 (de) 1991-04-10 2005-05-25 The Scripps Research Institute, La Jolla Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US6797492B2 (en) * 1991-05-17 2004-09-28 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0590067A1 (en) 1991-06-14 1994-04-06 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5546806A (en) * 1991-10-17 1996-08-20 Kain; Aron Z. Microwave vector displacement and acceleration transducer
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0563475B1 (en) 1992-03-25 2000-05-31 Immunogen Inc Cell binding agent conjugates of derivatives of CC-1065
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5656727A (en) * 1992-09-15 1997-08-12 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Antagonists of LHRH
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
AU1736495A (en) 1994-01-31 1995-08-15 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
NZ298145A (en) * 1994-12-29 1998-08-26 Yamanouchi Pharma Co Ltd Monoclonal antibodies having inhibitory effect on type ii phospholipase a2, proteins forming part thereof, cells producing them, dna encoding them, recombinant vector comprising the dna and medicament
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2761116A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
NO971448L (no) * 1996-04-01 1997-10-02 Sankyo Co Rekombinante anti-Fas-antistoffer og DNA for disse
US6107090A (en) * 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6986890B1 (en) * 1996-11-21 2006-01-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anti-human VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibody
PT1500329E (pt) 1996-12-03 2012-06-18 Amgen Fremont Inc Anticorpos humanos que se ligam especificamente ao tnf alfa humano
EP0970126B1 (en) 1997-04-14 2001-04-18 Micromet AG Novel method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP1071700B1 (en) 1998-04-20 2010-02-17 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9818731D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Compounds
DE69930328T2 (de) 1998-08-27 2006-12-14 Spirogen Ltd., Ryde Dimere Pyrrolobenzodiazepine
EP1014361B1 (en) * 1998-12-11 2006-08-09 Sony Corporation Technique for controlling copying of data
ES2261230T3 (es) * 1999-08-17 2006-11-16 Purdue Research Foundation Tratamiento de la enfermedad metastasica.
PT1242401E (pt) 1999-11-24 2007-03-30 Immunogen Inc Agentes citotóxicos compreendendo taxanos e o seu uso terapêutico
ATE344801T1 (de) 1999-12-29 2006-11-15 Immunogen Inc Doxorubicin- und daunorubicin-enthaltende, zytotoxische mittel und deren therapeutische anwendung
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US7101976B1 (en) 2000-09-12 2006-09-05 Purdue Research Foundation EphA2 monoclonal antibodies and methods of making and using same
EP2314686B2 (en) 2000-10-06 2023-06-21 Kyowa Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
US7408041B2 (en) * 2000-12-08 2008-08-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
JPWO2003085119A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物のＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合活性を高める方法
CA2485373A1 (en) 2002-05-10 2003-11-20 Medimmune, Inc. Epha2 monoclonal antibodies and methods of use thereof
WO2004014292A2 (en) 2002-05-10 2004-02-19 Purdue Research Foundation EphA2 AGONISTIC MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
WO2004013093A2 (en) 2002-08-02 2004-02-12 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
US7390898B2 (en) 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
EP3502133A1 (en) 2002-09-27 2019-06-26 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
KR20050059332A (ko) 2002-11-07 2005-06-17 이뮤노젠 아이엔씨 항-씨디33 항체와 이를 이용한 급성 골수성 백혈병의치료방법
US20040223970A1 (en) * 2003-02-28 2004-11-11 Daniel Afar Antibodies against SLC15A2 and uses thereof
US20050281828A1 (en) * 2003-03-04 2005-12-22 Bowdish Katherine S Method of treating autoimmune disease by inducing antigen presentation by tolerance inducing antigen presenting cells
CA2930485C (en) * 2003-05-14 2018-04-10 Immunogen, Inc. Maytansinoid-antibody conjugate compositions
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
WO2005010049A2 (en) * 2003-07-09 2005-02-03 Eli Lilly And Company Tgf-beta1 ligands
JPWO2005035741A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
CA2543318C (en) * 2003-10-22 2013-01-08 B. Rao Vishnuvajjala Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
JP5166861B2 (ja) 2004-03-09 2013-03-21 スピロゲン リミティッド ピロロベンゾジアゼピン
EP1753463A2 (en) * 2004-06-01 2007-02-21 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
US7541330B2 (en) * 2004-06-15 2009-06-02 Kosan Biosciences Incorporated Conjugates with reduced adverse systemic effects
BRPI0510674A (pt) 2004-07-15 2007-12-26 Xencor Inc variantes fc otimizadas
US20060223147A1 (en) 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
US7659374B2 (en) 2004-08-16 2010-02-09 Medimmune, Llc Eph receptor Fc variants with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
EP1871808A2 (en) 2005-03-31 2008-01-02 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
JP2009506790A (ja) 2005-09-07 2009-02-19 メディミューン，エルエルシー 毒素とコンジュゲートしたｅｐｈ受容体抗体
DK1931709T3 (en) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc FC VARIETIES WITH OPTIMIZED FC RECEPTOR BINDING PROPERTIES
ES2374964T3 (es) 2006-01-25 2012-02-23 Sanofi Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina.
EP1832577A1 (en) 2006-03-07 2007-09-12 Sanofi-Aventis Improved prodrugs of CC-1065 analogs
USRE47123E1 (en) 2006-07-18 2018-11-13 Sanofi EPHA2 receptor antagonist antibodies
US7840452B2 (en) * 2006-08-30 2010-11-23 International Business Machines Corporation Application, method and process for managing part exchangeability across functional boundaries
PE20090993A1 (es) 2007-08-29 2009-07-08 Sanofi Aventis Anticuerpos anti-cxcr5 humanizados y derivados de los mismos
AR078470A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004092343A2 (en) * 2003-04-11 2004-10-28 Medimmune, Inc. Epha2, hypoproliferative cell disorders and epithelial and endothelial reconstitution
WO2004101764A2 (en) * 2003-05-13 2004-11-25 Chiron Corporation Methods of modulating metastasis and skeletal related events resulting from metastases
WO2006047637A1 (en) * 2004-10-27 2006-05-04 Medimmune, Inc. Use of modulators of epha2 and ephrina1 for the treatment and prevention of infections
WO2006084226A2 (en) * 2005-02-04 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to epha2 and methods of use thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARLES-KINCH KELLY ET AL.: "Antibody targeting of the EphA2 tyrosine kinase inhibits malignant cell behavior". CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, BALTIMORE, MD, US, vol. 62, no. 10, 15 May 2002 (2002-05-15), pages 2840-2847, XP002309753 ISSN: 0008-5472 the whole document *
DATABASE MEDLINE [Online] US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM), BETHESDA, MD, US; April 2006 (2006-04), BURKHARDT M. ET AL.: "Cytoplasmic overexpression of ALCAM is prognostic of disease progression in breast cancer". XP002415898 Database accession no. NLM16484444 abstract *
DOBRZANSKI PAWEL ET AL.: "Antiangiogenic and antitumor efficacy of EphA2 receptor antagonist". CANCER RESEARCH 1 FEB 2004, vol. 64, no. 3, 1 February 2004 (2004-02-01), pages 910-919, XP002415896 ISSN: 0008-5472 abstract *
LANDEN C.N. ET AL.: "EPHA2 AS A TARGET FOR OVARIAN CANCER THERAPY''. EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC TARGETS, ASHLEY PUBLICATIONS, LONDON, GB, vol. 9, no. 6, December 2005 (2005-12), pages 1179-1187, XP008072982 ISSN: 1472-8222 the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0714871A2 (pt) 2013-05-07
WO2008010101A8 (en) 2009-03-26
US20100047257A1 (en) 2010-02-25
US8992912B2 (en) 2015-03-31
IL243376A0 (en) 2016-02-29
MA30634B1 (fr) 2009-08-03
UY30492A1 (es) 2008-02-29
US20130302316A1 (en) 2013-11-14
PE20120431A1 (es) 2012-05-04
ECSP099074A (es) 2009-02-27
CL2007002085A1 (es) 2008-04-18
ES2673822T3 (es) 2018-06-25
EP2044122B1 (en) 2018-03-28
AR061911A1 (es) 2008-10-01
CN101622276B (zh) 2015-04-22
CA2658276A1 (en) 2008-01-24
EA200970130A1 (ru) 2009-06-30
SV2009003151A (es) 2010-01-21
NO20090758L (no) 2009-03-17
US20150274824A1 (en) 2015-10-01
JP5622390B2 (ja) 2014-11-12
WO2008010101A3 (en) 2008-07-17
JP2009543575A (ja) 2009-12-10
WO2008010101A2 (en) 2008-01-24
AU2007274738B2 (en) 2013-11-28
TW200821329A (en) 2008-05-16
JP2014221757A (ja) 2014-11-27
CO6160239A2 (es) 2010-05-20
GT200900002A (es) 2010-11-03
NZ574215A (en) 2012-07-27
AU2007274738A1 (en) 2008-01-24
MY157757A (en) 2016-07-15
IL196470A (en) 2016-07-31
NI200900005A (es) 2010-01-26
WO2008010101A9 (en) 2009-01-29
USRE47123E1 (en) 2018-11-13
IL196470A0 (en) 2011-08-01
ME00581B (me) 2011-12-20
CR10558A (es) 2010-09-13
MX2009000709A (es) 2009-02-04
EP2044122A2 (en) 2009-04-08
KR20090059110A (ko) 2009-06-10
KR101528939B1 (ko) 2015-06-15
TN2009000007A1 (en) 2010-08-19
CL2012001387A1 (es) 2012-09-28
US8460667B2 (en) 2013-06-11
PE20080430A1 (es) 2008-05-19
ZA200900545B (en) 2010-03-31
ME00581A (en) 2011-12-20
CN101622276A (zh) 2010-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020324B1 (ru) АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ ЭФРИНА EphA2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ES2726754T3 (es) Nuevos anticuerpos anti-CD38 para el tratamiento del cáncer
JP5643619B2 (ja) Ｃａ６抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法
CA2667502A1 (en) Methods for improving antibody production
AU2018279056A1 (en) Novel anti-cd38 antibodies for the treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU