ES2261230T3 - Tratamiento de la enfermedad metastasica. - Google Patents
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Abstract
Uso de un agonista de EphA2 seleccionado entre (i) un compuesto que comprende un dominio extracelular de la efrina A1 y (ii) un anticuerpo específico contra un epítopo extracelular de EphA2 con al menos una actividad biológica para reducir la invasión metastásica o la proliferación de un tumor, para reducir la metástasis de las células metastásicas, para dificultar la proliferación de las células metastásicas, para aumentar el contenido de fosfotirosina de EphA2 en las células metastásicas y/o para reducir la invasividad de las células metastásicas en comparación con células metastásicas no tratadas, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor o cáncer metastásico en mamíferos, que incluye una población de células que sobreexpresan la tirosina
Description
Tratamiento de la enfermedad metastásica.
La presente invención se refiere al uso de una
tirosina quinasa de células epiteliales que se sobreexpresa en
células tumorales metastásicas como la diana para el tratamiento de
la enfermedad metastásica. Más especialmente, esta invención se
refiere al uso de compuestos que interaccionan con, y alteran la
expresión de la tirosina quinasa de células epiteliales.
El cáncer es una enfermedad por una transducción
de señales aberrante. Las formas más peligrosas de cáncer son
células malignas que metastatizan a puntos distantes del cuerpo. Las
células metastásicas han adquirido la capacidad de desprenderse del
tumor primario, trasladarse a puntos distantes y colonizar
microambientes distantes y extraños. La metástasis de células
cancerosas requiere la capacidad celular de 1) separarse de un
tumor primario, 2) migrar e invadir a través de los tejidos locales,
3) trasladarse a puntos distantes del cuerpo (por medio de la linfa
o la sangre), 4) colonizar un punto extraño y 5) crecer y sobrevivir
en este ambiente extraño. Todos estos comportamientos están ligados
a las adhesiones celulares. Las adhesiones celulares controlan las
interacciones físicas de las células con su microambiente. Las
adhesiones celulares también inician las señales que dictan el
crecimiento, muerte y diferenciación de las células tumorales. A
nivel celular, las células metastásicas han superado las
restricciones de crecimiento celular y migración que resultan de
las conexiones físicas y las señales transmitidas por los contactos
célula-célula. Frecuentemente las células malignas
presentan un aumento de las interacciones con proteínas de la matriz
extracelular (MEC) circundante que proporcionan conexiones y señales
que estimulan varios aspectos de la metástasis.
Los niveles de fosforilación de tirosina de las
proteínas regulan un equilibrio entre las adhesiones
célula-célula y célula-MEC en las
células epiteliales. Una elevada actividad de la tirosina quinasa
debilita los contactos célula-célula y estimula las
adhesiones MEC. Se cree que una alteración en los niveles de
fosforilación de tirosina es importante para la invasividad de las
células tumorales. La fosforilación de tirosinas se controla por las
tirosina quinasas de la membrana celular y se sabe que en las
células cancerosas metastásicas se produce un aumento de la
expresión de las tirosina quinasas.
EphA2 es un receptor tirosina quinasa de 130 kDa
que se expresa en los epitelios adultos. EphA2, un miembro de la
familia Eph de tirosina quinasas conocidas como efrinas, es un
receptor tirosina quinasa transmembránico con un ligando unido a la
célula. Se ha encontrado que la expresión de EphA2 está alterada en
muchas células metastásicas, incluyendo tumores de pulmón, mama,
colon y próstata. Adicionalmente, en las células metastásicas está
alterada la distribución y/o fosforilación de EphA2. Además, las
células que han sido transformadas para sobreexpresar EphA2
demuestran un crecimiento maligno y la estimulación de EphA2 es
suficiente para revocar el crecimiento maligno y la invasividad.
EphA2 es una poderosa oncoproteína. La presente invención se dirige
a los usos como se describen en este documento, que utilizan EphA2
como diana para el tratamiento de cánceres metastásicos.
Un enfoque para la terapia del cáncer es la
administración de anticuerpos preformados contra antígenos tumorales
predeterminados. Este proceso se conoce como tratamiento de
anticuerpos pasivo. Un ejemplo de tratamiento de anticuerpos pasivo
es el uso de Herceptin® para el tratamiento del cáncer de mama.
Herceptin® es una forma humanizada de un anticuerpo monoclonal
murino específico para el dominio extracelular de Her2/Neu. La base
para el tratamiento con Herceptin® es que el 25-30%
de los cánceres de mama metastásicos sobreexpresan el receptor
tirosina quinasa Her2/Neu. Herceptin® se ha tolerado bien en ensayos
clínicos y es muy prometedor para el mantenimiento y regresión del
cáncer de mama metastásico.
Una inmunoterapia pasiva efectiva para el
tratamiento de tumores requiere el aislamiento y preparación de un
anticuerpo que: 1) tiene como diana un antígeno que se sobreexpresa
en tumores metastásicos; 2) tiene como diana un epítopo extracelular
de dicho antígeno; 3) no muestra reacciones cruzadas con ningún otro
antígeno en la circulación de un paciente; y 4) muestra actividad
tumoricida o tumorestática.
En una realización preferida, esta invención se
refiere a la selección y al uso de anticuerpos específicos contra
un epítopo extracelular de EphA2. El uso de esta invención incluye
la preparación, selección y uso de anticuerpos específicos contra
EphA2 para la terapia del cáncer.
Otro enfoque para el tratamiento del cáncer es
el uso de agonistas para estimular la expresión. Por ejemplo,
EphrinA1-F_{c}, el dominio extracelular de la
efrina A1 ligado a la cadena pesada de la inmunoglobulina (véase
Miao, H., y col., EphA2 kinase associates with focal adhesion kinase
and upon activation, inhibits integrin-mediated
cell adhesion and migration, Nature Cell Biol 2,
62-69 (2000)), puede usarse para aumentar el
contenido de fosfotirosina de EphA2. Por tanto, en otra realización
preferida, esta invención se refiere al uso de agonistas para
alterar la expresión de EphA2 en células metastásicas, como se
describe en este documento.
Por tanto, esta invención se dirige al uso de
agonistas para alterar la expresión de EphA2, como se describe en
este documento. EphA2 puede servir de diana usando formas
artificiales o híbridas de la proteína, inhibitores de proteínas,
oligonucleótidos antisentido o inhibidores de moléculas pequeñas.
Además, aunque una realización preferida se dirige al uso de
anticuerpos monoclonales, los anticuerpos policlonales, artificiales
e híbridos se conocen en la materia. Deberá entenderse que el uso de
técnicas conocidas en la materia para utilizar EphA2 como diana se
encuentran dentro del ámbito de esta invención.
Un aspecto de esta invención es el uso de un
agonista de EphA2 seleccionado entre (i) un compuesto que comprende
un dominio extracelular de la efrina A1 y (ii) un anticuerpo
específico contra un epítopo extracelular de EphA2 con al menos una
actividad biológica para reducir la invasión metastásica o la
proliferación de un tumor, para reducir la metástasis de las células
metastásicas, para dificultar la proliferación de las células
metastásicas, para aumentar el contenido de fosfotirosina de EphA2
en las células metastásicas y/o para reducir la invasividad de las
células metastásicas en comparación con células metastásicas no
tratadas, para la preparación de una composición farmacéutica para
el tratamiento de un tumor o cáncer metastásico en mamíferos, que
incluye una población de células que sobreexpresan la tirosina
quinasa EphA2.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de un agonista de EphA2 seleccionado entre (i) un compuesto que
comprende un dominio extracelular de la efrina A1 y (ii) un
anticuerpo específico contra un epítopo extracelular de EphA2, para
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor
metastásico que comprende una población de células que sobreexpresan
EphA2.
Otro aspecto más de la presente invención es el
uso de un agonista de EphA2 seleccionado entre (i) un compuesto que
comprende un dominio extracelular de la efrina A1 y (ii) un
anticuerpo específico contra un epítopo extracelular de EphA2, para
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente
con un cáncer metastásico o potencialmente metastásico que comprende
una población de células que sobreexpresan EphA2.
Por consiguiente, un paciente con un tumor
metastásico que sobreexpresa EphA2 puede tratarse con los usos como
se describen en este documento. El uso comprende la administración
al paciente de una cantidad terapéutica de un compuesto como se
describe en este documento, que se une a un epítopo extracelular de
EphA2. En una realización preferida el compuesto es un
anticuerpo.
También se describe un procedimiento para la
producción de anticuerpos que inhiben la proliferación tumoral
metastásica mediante su unión específica a un epítopo extracelular
de EphA2. Este procedimiento incluye la inyección de proteínas con
tirosinas fosforiladas en los ganglios linfáticos de un mamífero, la
recolección de los ganglios linfáticos, la fusión de las células de
los ganglios linfáticos con células de mieloma para formar
hibridomas y la selección de los hibridomas que producen anticuerpos
específicos para EphA2.
Otras características adicionales de esta
invención se harán evidentes para los expertos en la materia al
considerar la siguiente descripción detallada de las realizaciones
preferidas que ilustran el mejor modo de llevar a cabo la invención
como se percibe en este momento.
La figura 1 es una visión de conjunto del
procedimiento RIMMS, mediante el que se generan los anticuerpos de
esta invención;
la figura 2A-C muestra una serie
de inmunotransferencias que muestran la expresión de EphA2 en líneas
celulares humanas;
la figura 2A es una inmunotransferencia que
muestra la expresión de EphA2 en varias líneas celulares humanas de
cáncer de próstata;
la figura 2B es similar a la figura 2A, excepto
porque muestra la expresión de EphA2 en una línea celular epitelial
prostática humana y la expresión en la línea celular después de su
transformación por el oncogén K-Ras o por
irradiación con rayos X;
la figura 2C es similar a 2B, excepto porque
muestra la expresión de EphA2 en otra línea celular epitelial
prostática humana y la expresión en la línea celular después de su
transformación por el oncogén K-Ras o por
irradiación con rayos X;
la figura 3 es similar a la figura 2, excepto
porque muestra la expresión de EphA2 en células cancerosas
prostáticas caninas; y
la figura 4 muestra la representación gráfica de
la unión de anticuerpo prevista frente a la densidad celular en un
procedimiento de cribado de anticuerpos específicos para un epítopo
extracelular de EphA2.
EphA2 se expresa de forma diferente en células
normales y metastásicas. En células epiteliales normales de mama y
próstata hay un enriquecimiento de EphA2 en los puntos de adhesión
celular. Por el contrario, en células metastásicas de próstata,
EphA2 se encuentra distribuido dispersamente y en células
metastásicas de cáncer de mama, EphA2 está redistribuido en las
ondulaciones de la membrana. También se sabe que la expresión de
EphA2 está alterada en tumores malignos de pulmón y colon y se cree
que una expresión alterada de EphA2 tiene lugar en otros tipos de
metástasis, especialmente en tumores malignos epiteliales. Por lo
tanto, las técnicas diseñadas para alterar la expresión de EphA2
pueden explotarse para diagnosticar y tratar la enfermedad
metastásica.
En una realización preferida se han aislado
anticuerpos específicos para proteínas con tirosinas fosforiladas en
células cancerosas y se han usado contra células cancerosas como
diana en una inmunoterapia pasiva. Este enfoque se basa en el hecho
de que muchas tirosina quinasas, por ejemplo Her2/Neu, son
expresadas por oncogenes y por tanto se sobreexpresan en células
cancerosas. La presente invención se dirige al uso de anticuerpos
capaces de reconocer y unirse específicamente a epítopos
extracelulares de la tirosina quinasa EphA2. Los anticuerpos son
producidos por hibridomas seleccionados, que a su vez son el
producto de la fusión de células de mieloma con las células de
ganglios linfáticos recolectados de animales sometidos a un
protocolo de inoculación específico, diseñado para una mayor
sensibilidad y diversidad de los hibridomas de respuesta.
Para producir estos hibridomas, proteínas con
tirosinas fosforiladas se aislaron a partir de células epiteliales
humanas transformadas por Ras mediante cromatografía de afinidad,
usando anticuerpos existentes específicos contra fosfotirosina. Las
proteínas con tirosinas fosforiladas se usan entonces como
inmunógeno para producir anticuerpos monoclonales según el
procedimiento ilustrado en la figura 1. Se inyectan pequeñas dosis
de las proteínas con tirosinas fosforiladas proximal a los ganglios
linfáticos de un mamífero, cada dos días por un período de diez días
(la estrategia RIMMS). Se aislan entonces las células B de los
ganglios linfáticos hinchados y se fusionan con células de mieloma
que sobreexpresan Bcl-2, para minimizar la apoptosis
después de la fusión. Este procedimiento tiene como resultado una
mayor diversidad, especificidad y rentabilidad de la producción de
hibridomas. Los hibridomas se criban para identificar aquellos que
producen anticuerpos que distinguen las células malignas de las
células cancerosas
normales.
normales.
Se han seleccionado hibridomas que producen
anticuerpos específicos contra EphA2. El uso de la técnica RIMMS ha
dado como resultado la producción de una multiplicidad de hibridomas
que producen anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a
EphA2. Hasta la fecha se han identificado al menos 450 hibridomas
que producen anticuerpos capaces de distinguir las células malignas
de las células cancerosas normales. De los cuatro primeros de estos
hibridomas que se han caracterizado, dos reconocen epítopos
independientes en EphA2. El primero, D7, produce un anticuerpo que
reconoce un epítopo intracelular. El segundo, B2D6, produce un
anticuerpo que se une específicamente a un epítopo extracelular de
EphA2, una característica que permite su uso efectivo para el
diagnóstico y tratamiento de tumores metastásicos seleccionados.
Aunque la estrategia RIMMS ha demostrado ser
valiosa en la producción de anticuerpos específicos contra EphA2,
otras técnicas se conocen en la materia para la producción de
anticuerpos contra un antígeno específico y estas técnicas se
encuentran dentro del ámbito de esta invención.
El uso de anticuerpos para detectar la presencia
o sobreexpresión de una proteína específica es conocido en la
materia. Dado que EphA2 se sobreexpresa en células metastásicas, los
anticuerpos específicos contra EphA2 de esta invención pueden usarse
para detectar esta sobreexpresión y, por tanto, para detectar la
enfermedad metastásica. Tales técnicas incluyen, pero no están
limitadas a, ensayos de inmunotransferencia, precipitación,
aglutinación y ELISA. Estas técnicas son bien conocidas en la
materia. Además, la especificidad contra epítopos extracelulares de
los anticuerpos específicos contra EphA2 de esta invención puede
explotarse para detectar cambios en la localización de EphA2
asociados con la metástasis. En células epiteliales normales de
mama y próstata, hay un enriquecimiento de EphA2 en los puntos de
adhesión celular, mientras que en las células metastásicas la
distribución de EphA2 está alterada. En células metastásicas de
próstata, EphA2 se encuentra distribuido dispersamente y en células
metastásicas de cáncer de mama EphA2 está redistribuido en las
ondulaciones de la membrana. También se sabe que la expresión de
EphA2 está alterada en tumores malignos de pulmón y colon y se cree
que una expresión alterada de EphA2 tiene lugar en otros tipos de
metástasis, especialmente en tumores malignos epiteliales. Técnicas
tales como tinción inmunohistológica o microscopía de
inmunofluorescencia son bien conocidas en la materia y pueden usarse
para visualizar la distribución de EphA2. Véase por ejemplo la
patente de EE.UU. nº 5514554. Para detectar la sobreexpresión o la
distribución alterada de EphA2, los anticuerpos específicos contra
EphA2 pueden marcarse covalentemente o no covalentemente con
cualquiera de una serie de marcadores detectables conocidos, como
sustancias fluorescentes o radiactivas, como se conoce en la
materia. Alternativamente, un anticuerpo secundario específico para
los anticuerpos de esta invención se marca con un marcador
detectable conocido y se usa para detectar los anticuerpos
específicos contra EphA2 en las técnicas anteriores. Por lo tanto,
los anticuerpos de esta invención proporcionan procedimientos para
detectar la transformación metastásica.
La presente invención también emplea anticuerpos
específicos para un epítopo extracelular de EphA2 en usos
terapéuticos, como se describe en este documento. Cunado se usa para
terapia in vivo, ha de administrarse al paciente una
composición farmacéutica como se describe en conexión con los usos
de la presente invención. Esta composición comprende anticuerpos
específicos contra EphA2 en cantidades terapéuticamente efectivas en
un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización
preferida, los anticuerpos específicos contra EphA2 han sido
"humanizados". Los anticuerpos humanizados incluyen
"anticuerpos quiméricos" producidos mediante el empalme de los
genes de un anticuerpo de ratón (u otro mamífero) de la
especificidad antigénica apropiada, junto con los genes de una
molécula de anticuerpo humano de la actividad biológica apropiada.
Tales técnicas son conocidas en la materia. Véase por ejemplo la
patente de EE.UU. nº 5811098. Además de anticuerpos pueden emplearse
ligandos naturales o artificiales, péptidos, antisentido, análogos
de ATP u otras moléculas pequeñas capaces de utilizar
específicamente EphA2 como diana.
Un ejemplo de otro modo de utilizar EphA2 como
diana es el uso de efrinas para activar o inhibir EphA2. Por
ejemplo, EphrinA1-F_{c}, el dominio extracelular
de la efrina A1 unido a la cadena pesada de la inmunoglobulina,
aumenta el contenido de fosfotirosina de EphA2.
EphrinA1-F_{c} revoca el comportamiento maligno de
las células transformadas por EphA2. Por tanto, otra realización
preferida de esta invención es el uso de efrina o de una forma
híbrida de efrina para la preparación de una composición
farmacéutica como se describe en este documento, que se ha de
administrar en una cantidad terapéutica.
Cantidades terapéuticas son cantidades que
eliminan o reducen la carga tumoral del paciente, o que evitan o
reducen la proliferación de células metastásicas. La dosis dependerá
de numerosos parámetros, incluyendo la naturaleza del tumor, el
historial del paciente, el estado del paciente, el posible uso
conjunto de otros agentes oncolíticos y los procedimientos de
administración. Los procedimientos de administración incluyen la
inyección (por ejemplo, parenteral, subcutánea, intravenosa,
intraperitoneal, etc.), mediante la cual se suministran los
anticuerpos en un vehículo no tóxico farmacéuticamente aceptable,
como agua, disolución salina, disolución de Ringer, disolución de
dextrosa, albúmina de suero humano al 5%, aceites fijos, oleato de
etilo o liposomas. Las dosis típicas pueden variar desde
aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 20 mg/kg, y más
especialmente desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10
mg/kg. Otros procedimientos de administración incluyen la vía oral y
transdérmica. Vehículos aceptables para la ingestión oral de acuerdo
con la presente invención pueden formularse usando técnicas
reconocidas en la materia en vehículos líquidos farmacéuticamente
aceptables o en combinación con vehículos sólidos farmacéuticamente
aceptables en la forma de pastillas, cápsulas, comprimidos o gel.
Otros procedimientos de administración y dosis efectivos pueden
determinarse mediante experimentos de rutina y se encuentran dentro
del ámbito de esta invención.
Los usos terapéuticos que emplean anticuerpos
específicos contra EphA2 pueden combinarse con quimioterapia,
cirugía y radioterapia, dependiendo del tipo de tumor, el estado del
paciente, otros aspectos de salud y una diversidad de factores. Los
procedimientos pueden incluir también inmunoconjugados para la
terapia dirigida mediada por inmunotoxinas, en la que los
anticuerpos de esta invención están conjugados covalentemente o no
covalentemente con varios agentes citotóxicos, aumentando aún más la
toxicidad para las células diana. Véase por ejemplo la patente de
EE.UU. nº 5872223. Tales agentes incluyen varias toxinas bacterianas
(por ejemplo la exotoxina de Pseudomonas), la cadena A de la
ricina, daunorubicina, metotrexato e inhibidores de ribosomas (por
ejemplo tricosantina). Además, los anticuerpos de esta invención
pueden marcarse con emisores alfa, beta o emisores de electrones
Auger, lo que resulta en inmunoconjugados para la radioterapia
dirigida.
Por tanto, los anticuerpos específicos contra
EphA2 pueden usarse en una diversidad de usos para el tratamiento de
la enfermedad metastásica.
Se cribaron hibridomas siguiendo la estrategia
RIMMS, usando proteínas con tirosinas fosforiladas de células
epiteliales humanas transformadas por Ras, y se aisló un anticuerpo
específico para EphA2. Este anticuerpo se usó para evaluar los
niveles de expresión de EphA2 en células epiteliales prostáticas no
transformadas y en células tumorales prostáticas. En las células
epiteliales prostáticas no transformadas se encontraron bajos
niveles de expresión de EphA2, pero esta expresión de EphA2 mostró
un enriquecimiento en los puntos de contacto
célula-célula e interaccionó con el ligando unido a
la célula. En comparación con las células no transformadas, dos
características distinguen EphA2 en las células metastásicas de
cáncer de próstata: 1) EphA2 se sobreexpresa; 2) EphA2 está
distribuido dispersamente y no parece interaccionar con el ligando.
Para confirmar estos datos se llevaron a cabo inmunotransferencias
usando los anticuerpos específicos contra EphA2. La sobreexpresión
de EphA2 en células de cáncer de próstata humana (LNCAP, DU145, PC3)
se correlaciona directamente con su invasividad in vitro e
in vivo. De las tres líneas ensayadas, LNCAP es la menos
agresiva, DU145 es más agresiva y PC3 es la más agresiva. Como se
observa en la figura 2, las células DU145 muestran mayores niveles
de expresión de EphA2 que LNCAP y las células PC3 muestran aún
mayores niveles de expresión de EphA2. De forma similar, como se
muestra en las figuras 2B y 2C, la expresión de EphA2 se encuentra
elevada en las variantes de células epiteliales prostáticas humanas
transformadas por el oncogén K-Ras o por irradiación
con rayos X. Los tres carriles en la figura 2B muestran las células
epiteliales prostáticas "normales" MCL y líneas celulares
transformadas por K-Ras o rayos X derivadas de las
mismas. De forma similar, los tres carriles de la figura 2C muestran
las células epiteliales prostáticas "normales" 267B1 y líneas
celulares transformadas por K-Ras o rayos X
derivadas de las mismas. Como se observa en las figuras 2B y 2C,
todas las líneas transformadas mostraron niveles elevados de EphA2.
La figura 3 muestra inmunotransferencias similares, excepto por el
uso de líneas celulares de cáncer de próstata de perros. Como se
muestra en la figura 3, de forma coherente con los resultados de las
células humanas, EphA2 se sobreexpresa en células metastásicas de
carcinoma prostático derivadas de perros con cáncer de próstata
espontáneo.
Las líneas celulares metastásicas de próstata
pueden subdividirse en tres categorías: 1) células derivadas de
tumores de próstata primarios; 2) células derivadas de metástasis de
poca capacidad metastásica in vivo; 3) células derivadas de
metástasis de alta capacidad metastásica in vivo. Las
inmunotransferencias usando anticuerpos específicos contra EphA2 han
revelado que la expresión de EphA2 se encuentra elevada en todas las
células derivadas de metástasis, siendo la expresión de EphA2 máxima
en las células que retienen el potencial metastásico in vivo
(evaluado usando modelos de ratones atímicos). De forma interesante,
los estudios con B2D6 han mostrado que EphA2 se sobreexpresa en las
células de metástasis de cáncer de próstata en comparación con las
líneas establecidas a partir del tumor primario del mismo paciente.
En conjunto, todos estos resultados revelan una sobreexpresión de
EphA2 en las células metastásicas de tumor de próstata.
Se han encontrado pautas similares de expresión
de EphA2 con células de cáncer de mama. En las células epiteliales
mamarias normales hay un enriquecimiento de EphA2 en las conexiones
célula-célula. En contraste, las células de cáncer
de mama no metastásicas no expresan EphA2, mientras que las células
metastásicas de cáncer de mama sobreexpresan EphA2. En las células
metastásicas de cáncer de mama, EphA2 está redistribuido en las
ondulaciones de la membrana y, por tanto, está disponible para la
unión a anticuerpos.
La sobreexpresión de EphA2 hace las células
metastásicas susceptibles para una destrucción selectiva mediada
por anticuerpos con los presentes anticuerpos específicos para un
epítopo extracelular de EphA2. Aunque que las células normales
expresan EphA2, se cree que la unión al ligando o el agrupamiento en
los puntos de contacto célula-célula bloquea los
epítopos extracelulares en las células normales y las hace
inaccesibles a los anticuerpos específicos para un epítopo
extracelular de EphA2. Se cree que la selectividad tumoral de los
anticuerpos de la presente invención rivaliza con, o incluso supera
a la de Herceptin® en la utilización del cáncer metastásico como
diana.
La sobreexpresión de EphA2 ofrece una base para
la utilización de células cancerosas metastásicas como diana para
anticuerpos específicos contra EphA2. Los anticuerpos específicos
para un epítopo extracelular de EphA2, como los producidos por el
hibridoma B2D6, pueden usarse para alterar selectivamente (respecto
a las células normales) los comportamientos proliferativos o
invasivos de las células cancerosas metastásicas. Tanto en la
transformación derivada de metástasis como en la transformación
inducida en el laboratorio, la sobreexpresión de EphA2 se
correlaciona con la invasividad, mientras que las células no
invasivas tienen niveles inferiores de expresión de EphA2.
Para medir el efecto de B2D6 sobre el
crecimiento celular, se incuban las células con B2D6 purificado y se
mide la proliferación celular contando las células
microscópicamente (usando un hemocitómetro) y midiendo la síntesis
de ADN. Por ejemplo, el medio de crecimiento normal se suplementa
con B2D6 y BrdU y se mide la incorporación de BrdU durante las
cuatro horas siguientes. Para medir los efectos de B2D6 durante
períodos más largos, las muestras se cuentan a intervalos de 24
horas, añadiendo BrdU al medio de cultivo en las cuatro horas de
incubación finales. Como una tercera medida del crecimiento celular
se determina el efecto de B2D6 sobre el crecimiento de células
metastásicas en agar blando. Se usan ensayos de siembra en placa de
agar blando, en los que 2x10^{4} células metastásicas se siembran
en placa sobre agar en presencia o ausencia de B2D6
(0-10 nM) y se evalúa después el crecimiento de
colonias a intervalos de tres días.
Se cree que B2D6 disminuye el crecimiento de las
células metastásicas. Los resultados preliminares revelan que B2D6
agrega EphA2 y bloquea aproximadamente el 50% del crecimiento de las
células metastásicas de cáncer de mama (que también sobreexpresan
EphA2) en las primeras cuatro horas de incubación. Aunque EphA2 no
presenta fosforilación de tirosinas en las células metastásicas de
cáncer de mama, la fosforilación de tirosinas se restablece en estas
células tratadas con B2D6. Por tanto, se cree que B2D6 restablece la
función normal de EphA2.
Se están realizando estudios adicionales con
células de cáncer de próstata para determinar si incubaciones
durante más tiempo con B2D6 inhiben aún más el crecimiento celular
metastásico. Las células epiteliales no transformadas expresan
algún EphA2, aunque mucho menos que las células metastásicas y es
posible cierta toxicidad sobre dichas células no transformadas. Los
niveles de dosis mínimas efectivas y máximas no tóxicas de
anticuerpos, de acuerdo con un aspecto de esta invención, pueden
identificarse mediante experimentos de rutina, pero preferentemente,
las dosis típicas variarán entre aproximadamente 0,1 hasta
aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del paciente. La dosis
preferida dependerá de numerosos parámetros, incluyendo la
naturaleza del tumor, el historial del paciente, el estado del
paciente, el posible uso conjunto de otros agentes oncolíticos y los
procedimientos de administración. Los niveles de anticuerpos que
mejor discriminen entre células normales y metastásicas se usarán
para el tratamiento de tumores metastásicos que sobreexpresan las
proteínas EphA2.
Resultados preliminares demuestran que los
anticuerpos contra EphA2 dificultan el crecimiento celular
metastásico. Para medir la citotoxicidad dirigida por anticuerpos,
preferentemente se llevan a cabo versiones no radiactivas de ensayos
de liberación de ^{51}Cr usando células diana (células epiteliales
prostáticas normales o metastásicas) marcadas con cloruro de europio
(EuCl_{3}) y ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA). Después de
eliminar por lavado el Eu^{3+} no incorporado se incuban
naftoiltrifluoroacetona (NTA) y óxido de trioctilfosfina con los
agentes citolíticos y los sobrenadantes de los ensayos. La
luminiscencia del complejo ternario resultante (Eu^{3+}/NTA/óxido
de trioctilfosfina) se mide usando un lector de fluorescencia para
microplacas. Se ha descrito que la sensibilidad de este ensayo de
liberación de Eu^{3+} para la citolisis mediada por el complemento
es cinco veces mejor que los ensayos de liberación de ^{51}Cr.
Para determinar la lisis específica, se lisan muestras paralelas de
forma hipotónica mediante la adición de agua destilada. Muestras sin
tratar y anticuerpos del mismo isotipo sirven como controles
negativos.
Para establecer un modelo in vitro de la
muerte mediada por el complemento, las células se marcan con B2D6 y
se exponen a sueros que no han sido inactivados por calor. Para la
citoxicidad celular dependiente de anticuerpos ("CCDA"), tanto
las células de próstata control como las células de próstata
tratadas con B2D6 se incuban con células mononucleares de sangre
periférica (CMSP; relación E/D 10:1).
Se cree que tanto el complemento como la CCDA
estimulan la destrucción específica de las metástasis. La dosis de
anticuerpos puede variarse para establecer las medidas de DL_{50}
para las células metastásicas y normales. Las concentraciones de
anticuerpos que maximizan la destrucción específica de las células
metastásicas (PC3, 267-Ras, 267-X),
mientras que minimizan la muerte de los epitelios prostáticos no
transformados (267, MLC) se determinan mediante experimentos de
rutina. Además, la CCDA puede combinarse con el complemento para
estimular aún más la destrucción de los tumores mediante el
tratamiento de las muestras con el factor de necrosis tumoral (TNF).
Existe evidencia de que TNF potencia la destrucción de las células
tumorales por los anticuerpos específicos contra EGFR y Her2. Se
supone que la humanización de los anticuerpos de esta invención
proporcionará mejores resultados para el complemento o la CCDA.
Se cree que B2D6 mata las células tumorales por
medio de la cascada del complemento o de CCDA. Sin embargo, la
conjugación covalente o no covalente de los presentes anticuerpos
con agentes citotóxicos reconocidos en la materia puede estimular
aún más la toxicidad para las células diana. Ejemplos de toxinas
apropiadas para inmunoconjugación incluyen la exotoxina de
Pseudomonas o la cadena A de la ricina.
Los presentes anticuerpos contra EphA2,
especialmente aquellos producidos por el hibridoma B2D6, son
efectivos en el bloqueo del crecimiento y la invasividad de las
células de cáncer de próstata in vivo. La eficacia de B2D6 en
el bloqueo del crecimiento de tumores primarios de próstata usando
implantaciones subcutáneas de las células tumorales PC3 en ratones
se determina mediante el uso de modelos subcutáneos. Las ventajas
primarias de los modelos subcutáneos son la facilidad de la
implantación y de la posterior monitorización del tamaño del tumor.
Una cantidad de 5x10^{5} células PC3 se inocula subcutáneamente en
el tórax craneolateral derecho (axila) usando técnica aséptica. Los
tumores se miden cada 3-4 días usando calibradores
vernier hasta que alcanzan un volumen de 0,2-0,3
cm^{3}. En este momento los ratones se dividen en cuatro grupos (8
a 10 animales en cada uno): grupo 1 (control vehículo), los grupos
2-4 se tratan con 0,1, 1,0 ó 10 mg/kg de B2D6,
administrado por vía intraperitoneal dos veces a la semana. Los
ratones se monitorizan entonces cada tres días para medir el volumen
del tumor (con calibres vernier), el peso corporal y la duración de
la vida. Después de no más de 60 días tras la implantación, se
sacrifican los animales y se llevan a cabo evaluaciones post
mortem de la tumorogénesis, incluyendo la medida y el peso de
los tumores implantados y de los ganglios linfáticos proximales, la
evaluación macroscópica de los tejidos blandos para la detección de
tumores (ganglios linfáticos y pulmón) y la fijación en formalina de
los tumores y tejidos primarios. Los tejidos se evalúan por
inmunohistoquímica, usando D7 (otro anticuerpo específico contra
EphA2 que es adecuado para inmunohistoquímica) para determinar el
nivel de expresión de EphA2 en los tumores. En particular, se
estudian las células tumorales que escapan al tratamiento con B2D6
para determinar si presentan bajos niveles de expresión de EphA2.
Además se correlaciona la expresión de EphA2 en los animales
individuales con la invasividad de los tumores.
Como controles negativos de diana para la
especificidad se llevan a cabo estudios paralelos con las células
DU145, que expresan niveles muy bajos de EphA2. Mientras que se cree
que el crecimiento de los tumores PC3 es sensible a B2D6, se cree
que los tumores causados por DU145 son insensibles. La significación
estadística de la inhibición de la tumorigenicidad por B2D6, la
frecuencia metastásica total y la frecuencia de metástasis distantes
se analiza usando paquetes estadísticos computerizados (PC/SAS
versión 6.04), considerando diferencias significativas si
p<0,05.
p<0,05.
Aunque la implantación subcutánea es un
procedimiento popular y valioso para establecer un modelo del
crecimiento de las células tumorales, diferencias entre el
microambiente de la piel y de la próstata pueden causar diferencias
bastante dramáticas en el comportamiento celular. Por ejemplo, las
células PC3 metastatizan raramente cuando se implantan
subcutáneamente, mientras que la implantación intraprostática
(ortotópica) facilita la metástasis. Por tanto, las células PC3 se
implantan en la próstata mediante la exposición de dicha próstata
por medio de una laparotomía y la inoculación de las células
tumorales en la glándula de la próstata usando un microscopio
quirúrgico. Después de siete días, los ratones comienzan a recibir
el tratamiento con B2D6, como se ha descrito anteriormente, y los
animales se sacrifican no más tarde de 60 días después de la
implantación (o si los animales están moribundos). Los tumores se
palpan a intervalos de 3-5 días, momentos en los que
se recogen datos sobre el tamaño del tumor, el peso del animal y la
supervivencia. También se llevan a cabo evaluaciones post
mortem como se ha descrito anteriormente, poniendo énfasis en el
efecto de B2D6 sobre el potencial metastásico (en los pulmones y en
los ganglios linfáticos regionales). Se cree que B2D6 bloquea el
tumor primario y el potencial metastásico de las células PC3 de
manera dependiente de la dosis.
Para minimizar la identificación de los efectos
específicos de la cepa o del clon, pueden emplearse análisis
idénticos usando otros sistemas modelo. Por ejemplo, los efectos de
B2D6 sobre el crecimiento o metástasis de tumores causados por la
implantación de las líneas celulares epiteliales prostáticas humanas
267B1 transformadas por K-Ras o rayos X pueden
compararse con los efectos sobre las líneas MLC.
Aunque la sobreexpresión de EphA2 en células
metastásicas de cáncer de próstata ofrece un grado de selectividad
comparable a Herceptin® en cáncer de mama, se cree que las
propiedades únicas de EphA2 permiten una selectividad aún mayor al
utilizarlo como diana. En particular, EphA2 está fuertemente
concentrado en los contactos célula-célula en la
superficie de los epitelios no transformados, mientras que EphA2
está distribuido dispersamente en las células metastásicas. Por
tanto, es probable que algunos epítopos de EphA2 sean accesibles en
las metástasis pero estén protegidos por el ligando en los epitelios
prostáticos normales. Se seleccionan los anticuerpos contra EphA2
que ofrecen las discriminación óptima entre epitelios prostáticos
normales y metastásicos.
La serie de anticuerpos generados previamente se
criba en función de los epítopos de EphA2 que se encuentran en la
superficie celular. La expresión de EphA2 en una diversidad de
células "normales" (por ejemplo 267B o MLC) y células
metastásicas (células PC3) se compara usando citometría de flujo.
Por ejemplo, mocapas confluentes de células normales y metastásicas
se marcan con B2D6. Para asegurar que se seleccionan los anticuerpos
específicos para epítopos inaccesibles en células normales pero
accesibles en células metastásicas, se seleccionan los anticuerpos
cuya unión disminuye en las células normales al aumentar la densidad
celular, pero cuya unión se mantiene constante en las células
metastásicas, como se muestra en la figura 4. Después del marcado
con anticuerpos secundarios con fluoresceína, se evalúa la expresión
de EphA2 usando citometría de flujo. Se seleccionan los anticuerpos
que mejor distinguen entre las células normales y las metastásicas.
La especificidad para EphA2 se confirma por medio de
inmunotransferencia y estudios de inmunoprecipitación. Entonces, los
anticuerpos que muestran la mejor selectividad se humanizan usando
técnicas reconocidas en la materia.
Para evaluar las consecuencias de la
sobreexpresión de EphA2, se transfectaron células
MCF-10A con ADNc de EphA2 humano (EphA2) o con un
vector control (vector). Después de establecer cultivos de células
MCF-10A con una expresión estable de EphA2, la
evaluación microscópica reveló diferencias en su morfología celular
en comparación con las células control transfectadas con el vector
(no se muestra). Las células MCF-10A no
transformadas presentan una morfología epitelial e interaccionan
entre sí, incluso a baja densidad celular. En contraste, las células
MCF-10A que sobreexpresan EphA2 (MCF^{EphA2})
adoptan una morfología similar a fibroblastos y no forman contactos
célula-célula, incluso a alta densidad celular. Como
confirmación de que la morfología mesenquimática no representa una
variación clonal, una muestra independiente de células
MCF-10A transfectadas con ADNc de EphA2 produjo
idénticos resultados.
Las adhesiones célula-MEC se
evaluaron incubando las células en MEC a 37ºC durante 30 minutos
antes de un lavado vigoroso para eliminar las células adheridas
débilmente. Estos ensayos revelaron un incremento de 24 veces en
las uniones con MEC en las células MCF^{EphA2} respecto a los
controles transfectados con el vector (P<4x10^{-4}). Las
adhesiones célula-célula se ensayaron incubando las
células en suspensión y contando el tamaño medio de las colonias de
células. Mientras que las células MCF-10A
transfectadas por el vector interaccionan entre sí en colonias con
un tamaño medio de 4,1 células, el tamaño medio de las colonias de
las células MCF^{EphA2} se reduce a 1,3 células
(P<3x10^{-5}).
Dado que los contactos estables
célula-célula causan un enriquecimiento de EphA2 en
los puntos de contacto célula-célula, la
localización subcelular de EphA2 se evaluó por inmunotinción con
anticuerpos específicos. El EphA2 de las células
MCF-10A no transformadas se limitó a una línea
estrecha donde las células adyacentes estaban en contacto directo,
con poca tinción de la membrana que no estaba en contacto con las
células vecinas. En contraste, la pauta de tinción de EphA2 en las
células MCF^{EphA2} fue dispersa, con poca tinción de los
contactos célula-célula.
La falta de EphA2 en los contactos
célula-célula en las células MCF^{EphA2} fue
intrigante, dado que EphA2 es estimulado por ligandos anclados a la
membrana celular. Para medir la estimulación de EphA2 se midió el
contenido de fosfotirosina en EphA2 inmunoprecipitado, mediante
análisis de inmunotransferencia con anticuerpos específicos contra
fosfotirosina. Mientras que el EphA2 presentó forforilación de
tirosinas en las células MCF-10A transfectadas por
el vector, EphA2 no presentó fosforilación de tirosinas en las
células MCF^{EphA2}. El contenido reducido de fosfotirosina se
confirmó usando múltiples anticuerpos contra EphA2 en
inmunoprecipitación (D7, B2D6) y diferentes anticuerpos específicos
contra fosfotirosina (4G10, PY20) en análisis de
inmunotransferencia.
La transformación maligna se estudió in
vitro, y se encontró que las células MCF^{EphA2} podían
colonizar agar blando. Mientras que las células
MCF-10A transfectadas con el vector formaron 0,3
colonias por campo de alta magnificación, las células MCF^{EphA2}
presentaron un aumento del crecimiento de colonias en agar blando,
con una media de 3,0 colonias por campo de alta magnificación
(P<3x10^{-7}). Se dejaron interaccionar con Matrigel
(Collaborative, Bedford, MA) células MCF-10A con
vector y células MCF-10A que sobreexpresaban EphA2.
Las células MCF-10A no transformadas se organizaron
rápidamente en colonias esféricas al cultivarlas en Matrigel,
mientras que las células MCF^{EphA2} adoptaron una organización
estrellada, indistinguible del comportamiento de las células
metastásicas (por ejemplo
MDA-MB-231,
MDA-MB-435).
Dado que los análisis de transformación in
vitro no siempre predicen el potencial tumorigénico in
vivo, se implantaron células MCF-10A control o
células MCF-10A que sobreexpresaban EphA2 en ratones
atímicos (nu/nu). La inyección subcutánea de las células
MCF^{EphA2} causó la formación de tumores palpables en cuatro días
en 19 ratones de 19. El volumen medio de los tumores resultantes se
relacionó con el número de células implantadas y alcanzó una media
de 300 mm^{3} (para muestras inyectadas con 5x10^{6} células)
en 10 días (tabla I). La necropsia reveló que los tumores se
encontraban firmemente unidos al músculo axilar subyacente y
rodeados de tejido fibroso. Histológicamente, las células
neoplásicas fueron invasivas y estaban asociadas con el tejido
conectivo fibroso. Estas células neoplásicas mostraron un
pleomorfismo citoplásmico y nuclear moderado y formaron estructuras
diplásicas tubulares y secretoras. En experimentos de control, las
células transfectadas con el ADN del vector no pudieron crecer en
ratones atímicos (0 de 13; tabla I) y la necropsia no identificó
ningún crecimiento o invasión de estas células.
Dado que los mayores niveles de EphA2 se
encontraron sistemáticamente en células de cáncer de mama que eran
metastásicas in vivo, se inyectaron 1x10^{6} células
control o células MCF^{EphA2} en la vena de la cola de ratones
atímicos. Al cabo de siete días, la necropsis reveló micrometástasis
en los vasos mayores en el pulmón, en 2 de los 4 ratones inyectados
con las células MCF^{EphA2} (tabla I). En general se encontró que
las metástasis ocluían los vasos sanguíneos mayores pero sin romper
la pared del vaso. La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos
contra citoqueratina confirmó la naturaleza epitelial del trombo y
la falta de tinción de antitrombina reveló que el trombo no
representaba un producto anormal o atípico de las células
endoteliales. No se observó una colonización del pulmón en los
ratones que habían sido inyectados con las células
MCF-10A control (tabla I).
Para analizar si EphA2 puede ser estimulado por
un agonista, las células MCF^{EphA2} se suspendieron en agar
blando en presencia o ausencia de 0,5 mg/ml de
EphrinA1-F_{c}. EphrinA1-F_{c}
aumentó el contenido de fosfotirosina de EphA2 y en las células
tratadas con EphrinA1-F_{c} la formación de
colonias en agar blando se redujo en el 49%, en relación con los
controles tratados con el vehículo (P<5x10^{-6}). Para
analizar si la estimulación de EphA2 podría alterar el
comportamiento de las células en Matrigel, las células MCF^{EphA2}
se trataron con 0,5 mg/ml de EphrinA1-F_{c}, lo
que restableció un fenotipo esférico comparable al de las células
MCF-10A no transformadas. Por tanto, la estimulación
de EphA2 revoca los efectos de la sobreexpresión de EphA2. A pesar
de su incapacidad para interaccionar con sus ligandos endógenos, el
EphA2 en las células MCF^{EphA2} respondió a estímulos
exógenos.
Aunque la invención se ha descrito en detalle
con referencia a las realizaciones preferidas, existen variaciones y
modificaciones dentro del ámbito y espíritu de la invención como se
describe y define en las reivindicaciones siguientes.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Formulario pasa a página
siguiente)
Claims (18)
1. Uso de un agonista de EphA2 seleccionado
entre (i) un compuesto que comprende un dominio extracelular de la
efrina A1 y (ii) un anticuerpo específico contra un epítopo
extracelular de EphA2 con al menos una actividad biológica para
reducir la invasión metastásica o la proliferación de un tumor, para
reducir la metástasis de las células metastásicas, para dificultar
la proliferación de las células metastásicas, para aumentar el
contenido de fosfotirosina de EphA2 en las células metastásicas y/o
para reducir la invasividad de las células metastásicas en
comparación con células metastásicas no tratadas, para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
un tumor o cáncer metastásico en mamíferos, que incluye una
población de células que sobreexpresan la tirosina quinasa
EphA2.
2. Uso de un agonista de EphA2 seleccionado
entre (i) un compuesto que comprende un dominio extracelular de la
efrina A1 y (ii) un anticuerpo específico contra un epítopo
extracelular de EphA2, para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento de un tumor metastásico que comprende una población
de células que sobreexpresan EphA2.
3. Uso de un agonista de EphA2 seleccionado
entre (i) un compuesto que comprende un dominio extracelular de la
efrina A1 y (ii) un anticuerpo específico contra un epítopo
extracelular de EphA2, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de un paciente con un cáncer metastásico o
potencialmente metastásico que comprende una población de células
que sobreexpresan EphA2.
4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde el agonista de EphA2 comprende un
anticuerpo.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde el agonista de EphA2 comprende un anticuerpo
monoclonal.
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde el agonista de EphA2 comprende un anticuerpo
con especificidad para un epítopo extracelular de EphA2.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde el agonista de EphA2 comprende un anticuerpo
que se une selectivamente a células metastásicas.
8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en donde el agonista de EphA2 comprende un anticuerpo
conjugado con un agente citotóxico.
9. El uso de la reivindicación 8, en donde el
agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en una
toxina bacteriana, la cadena A de la ricina, daunorubicina,
metotrexato, un inhibidor de ribosomas y un radioisótopo.
10. El uso de la reivindicación 9, en donde el
agente citotóxico es un radioisótopo seleccionado del grupo que
consiste en un emisor alfa, un emisor beta y un emisor de electrones
Auger.
11. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el agonista de EphA2 comprende una
efrina que afecta a la fosforilación de EphA2.
12. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el agonista de EphA2 comprende un
péptido.
13. El uso de la reivindicación 12, en donde el
agonista de EphA2 comprende una secuencia peptídica que define un
dominio extracelular de la efrina A1.
14. El uso de la reivindicación 13, en donde la
secuencia peptídica se encuentra ligada a una segunda secuencia
peptídica que define la cadena pesada de la inmunoglobulina.
15. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el agonista de EphA2 comprende un
oligonucleótido antisentido que afecta a la expresión de EphA2.
16. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la población de células forma al
menos una porción de un tumor canceroso seleccionado del grupo que
consiste en tumores cancerosos de mama, próstata, pulmón y
colon.
17. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la población de células comprende
células seleccionadas del grupo que consiste en células de cáncer de
mama, células de cáncer de próstata, células de cáncer de pulmón y
células de cáncer de colon.
18. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde las células que sobreexpresan EphA2
son células epiteliales.
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|---|---|---|---|
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