CN102778562B - 证明cd44表面表达的细胞的细胞毒性介导 - Google Patents

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Abstract

抗CD44单克隆抗体H460-16-2在癌症肿瘤的诊断和治疗中的应用，以及确定表达与单克隆抗体H460-16-2专一性结合的CD44抗原性基序的细胞的存在的结合分析。作为起始对肿瘤的细胞毒性应答的一种手段，单克隆抗体可以选择性与一或多种化疗试剂结合使用。

Description

证明CD44表面表达的细胞的细胞毒性介导
技术领域
本发明涉及癌症疾病的诊断和治疗，尤其涉及肿瘤细胞的细胞毒性的介导；且最尤其涉及癌症疾病改善抗体(CDMAB)作为一种起始细胞毒性应答的手段的应用，该应用可选择地与一或多种化疗试剂结合。本发明进一步地涉及利用本发明的CDMAB的结合分析。 
背景技术
人白血细胞的单克隆抗体的制备导致了CD44抗原的发现；单链透明质酸(HA)结合糖蛋白在广泛的正常组织和所有类型的造血细胞上表达。其起初与淋巴细胞的激活和归巢相关。当前，其推定的生理学作用还包括炎症基因的激活、细胞周期的调节、细胞增殖的诱导、分化和发育的诱导、细胞骨架重组和细胞迁移以及细胞存活/抵抗凋亡的诱导。 
在人体中，CD44的单基因拷贝位于染色体11的短臂，11p13上。该基因包含19个外显子；前5个是恒定的，随后的9个是可变的，紧接的3个是恒定的，且最后的2个是可变的。差异剪接可以造成超过1000种不同的异构体。然而，目前仅已识别了数十种天然发生的变体。 
CD44标准糖蛋白由N-末端胞外(包括20个氨基酸的引导序列和近膜区(85个氨基酸))结构域(270个氨基酸)、跨膜区(21个氨基酸)和胞质尾巴(72个氨基酸)组成。胞外区还包含在N-末端的连接部分(link module)。该区域有92个氨基酸的长度且显示出与其它HA结合连接蛋白的同源性。在鼠型和人型CD44之间存在很高的同源 性。蛋白的变体形式被插入外显子5的羧基末端且在表达时位于胞外部分。 
CD44的血清可溶形式也天然地发生且能够通过终止密码子(在可变区内)或蛋白水解活性产生。通过各种刺激包括TNF-α对细胞的激活造成CD44受体的脱落(shedding)。在肿瘤细胞中也观察到受体的脱落且该脱落可导致CD44在人血清中的浓度增加多达10倍。CD44的高血清浓度暗示着恶性肿瘤(卵巢癌除外)。 
CD44的标准形式以大约37kD的分子量存在。翻译后修饰将分子量增加至80-90kD。这些修饰包括氨基末端胞外结构域在天冬氨酸残基上的N-连接糖基化、在胞外结构域的羧基末端的丝氨酸/苏氨酸残基上的O-连接糖基化以及添加的粘多糖。剪接变体的大小可以在80-250kD之间变化。 
HA，一种哺乳动物胞外基质(ECM)中的聚糖，被认为是CD44主要的配体。然而，也已经发现CD44与诸如胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等蛋白结合。在HA结合和糖基化之间似乎存在关联。无活性的CD44(不结合HA)具有最高的糖基化水平，有活性的CD44(结合HA)糖基化水平最低而可诱导的CD44(除非被细胞因子、单克隆抗体、生长因子等激活，否则不与HA结合或很微弱地与HA结合)的糖基化水平在活性和无活性形式之间。 
CD44通过信号转导通路能够介导其的一些功能，这些通路依赖于细胞的相互作用、刺激以及环境。这样的一些通路包括NFκB信号级联(涉及炎症反应)、Ras-MAPK信号转导通路(涉及细胞周期和增殖的激活)、Rho蛋白家族(涉及细胞骨架重组和细胞迁移)以及PI3-K相关信号通路(涉及细胞存活)。上述所有的功能与肿瘤疾病的发生和发展密切相关。CD44也被暗示通过各种额外的机理在癌症中发生作用。这些机理包括CD44细胞表面的细胞表面蛋白聚糖将生长因子、 化学因子和细胞因子呈现给恶性肿瘤中的受体。同样的，在CD44-HA复合物内化后由溶酶体透明质酸酶进行的HA的胞内降解也潜在地增加了肿瘤入侵和通过ECM的血管新生诱导的可能性。此外，已经显示存活或凋亡信号的传递通过标准或可变CD44受体发生。CD44也被暗示涉及细胞分化和迁移。这些机理中的很多但非全部是环境和细胞依赖性的且一些机理产生了不同的发现。因此，在得出任何结论之前需要更多的研究。 
为了证实CD44在癌症中潜在的功能作用，进行了CD44的表达研究以确定受体的差异性表达是否与疾病的进程相关。然而，在大部分的肿瘤类型中观察到不一致的现象，且这可能是由于研究人员之间在试剂、技术、病理学评分和细胞类型上的差异的混和造成的。肾细胞癌和非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤似乎是例外，因为具有CD44高表达肿瘤的患者一致地比低或无CD44表达的患者存活时间短。 
由于其与癌症的关联，CD44已经成为发展抗癌治疗的靶点。关于CD44的标准或变体形式是否是肿瘤进程所必需的仍然存在争论。两种观点都有体内动物数据支持，同样的，这可能是肿瘤类型甚至是细胞类型依赖的。不同的治疗手段已包括可溶CD44蛋白、透明质酸合成酶cDNA、透明质酸酶的注射，反义CD44和CD44专一性抗体的使用。各种手段已经实现了一定程度的成功由此为抗CD44癌症治疗提供了支持。 
实验中已经产生了变体和标准CD44的专一性单克隆抗体，但绝大部分这样的抗体除了与它们识别的CD44类型专一性地结合外，没有固有的生物学活性。然而，存在某些抗体具有体外活性或体内活性，但通常没有兼具这两种活性。已经显示一些抗CD44抗体介导细胞事件。例如，针对人红血球Lutheran抗原CD44标准型的小鼠抗体A3D8显示增强CD2(9-1抗体)和CD3(OKT3抗体)介导的T细胞激活； 另一种抗CD44抗体具有相似的效应。A3D8也诱导IL-1从单核细胞的释放和IL-2从T淋巴细胞的释放。有趣的是，A3D8与药物如柔红霉素、米托蒽醌和依托泊甙结合使用通过消除第二信使神经酰胺的产生抑制了HL60和NB4AML细胞中的凋亡诱导。没有固有活性且靶向CD44的相似抗原决定簇的J173抗体未抑制药物诱导的凋亡。靶向CD44的85-110KD和200KD形式的NIH44-1抗体通过一通路增强了T细胞的增殖，作者推断该通路为CD44的交联或聚集。综上所述，没有证据说明诸如这些抗体适合作为癌症治疗，因为它们抑或不针对癌症(例如激活淋巴细胞)，抑或诱导细胞增殖，或者在与细胞毒性试剂一同使用时抑制癌细胞的药物诱导死亡。 
一些抗CD44抗体已被描述，这些抗体证实了体内的抗肿瘤效应。抗体1.1ASML，一种靶向CD44的v6变体的小鼠抗大鼠IgG1抗体，已经显示降低了大鼠胰腺癌BSp73ASML的淋巴结和肺转移。治疗后的动物的存活随之提高。该抗体仅当在淋巴结定植(colonization)之前给药有效，且据推断其干扰淋巴结中的细胞增殖。在体外，该抗体对肿瘤细胞没有直接的细胞毒性，且抗体没有提高补体介导细胞毒性或免疫效应细胞功能。没有说明该抗体针对人细胞的应用。 
Breyer等说明了一种商业可获取的抗CD44s抗体在破坏原位移植大鼠的神经胶母细胞瘤的进程中的应用。将大鼠神经胶母细胞瘤细胞系C6植入额叶，一周后通过脑内注射用抗体对大鼠进行3次治疗。和缓冲液或同型对照治疗后的大鼠相比，治疗后的大鼠证实了降低的肿瘤生长以及更高的体重。在体外，该抗体能够抑制细胞对由基质成分包被的盖玻片的粘附，但对细胞没有直接的细胞毒性效应。该抗体没有对人细胞进行测试。 
进行了比较抗CD44s抗体(IM7.8.1)和CD44v10抗体(K926)功效的研究。将表达两种CD44异构体的高度转移的小鼠黑素瘤细胞 系B16F10静脉内植入小鼠。两天后，在研究期间每三天给予抗体。两种抗体在肺转移的数量上均造成了大于50％的显著降低；在两种抗体的功效之间没有显著的差别。抗体在体外不影响增殖，且作者Zawadzki等推测肿瘤生长的抑制是因为抗体阻断了CD44和其配体的相互作用。在使用IM-7.8.1的另一研究中，Zahalka等证实了该抗体及其F(ab’)2片段能够阻断小鼠T细胞淋巴瘤LB对淋巴结的浸润。这赋予了小鼠显著的存活益处。Wallach-Dayan等显示用CD44v4-v10转染不会自发形成肿瘤的LB-TRs小鼠淋巴瘤导致其具有形成肿瘤的能力。IM-7.8.1的给药和同型对照抗体相比降低了移植后转染细胞的肿瘤体积。这些实验没有一个证实了该抗体在人体中的应用。 
GKW.A3，小鼠的IgG2a，对人CD44具有专一性且在SCID小鼠模型中防止了人黑素瘤异种移植物的形成和转移。将该抗体与转移性人细胞系SMMU-2混和并随后皮下注射。治疗在随后的3周内持续。4周后，相比于未治疗动物的100％，10只小鼠中仅1只在注射位点形成了肿瘤。该抗体的F(ab’)2片段证实了对肿瘤形成相同的抑制，暗示该行为机理不依赖于补体或抗体依赖性细胞毒性。如果在第一次抗体注射前一周注射肿瘤细胞，有80％的动物在原始位点形成肿瘤。然而，注意到存活时间仍然显著增长了。尽管延迟的抗体给药对原发瘤的形成没有效应，其完全地防止了在未治疗动物中出现的肺、肾、肾上腺、肝和腹膜的转移。在体外，该抗体对细胞系没有任何直接的细胞毒性或干扰SMMU-2细胞的增殖，且似乎通过影响转移或生长对肿瘤的形成产生主要的效应。该抗体的一个需要注意的特征是其识别CD44的所有异构体，这暗示着其在治疗应用中有限的可能性。 
Strobel等说明了抗CD44抗体(克隆515)在小鼠异种移植模型中抑制人卵巢癌细胞腹膜移植的应用。在抗CD44抗体或对照抗体的存在下，将人卵巢细胞系36M2腹腔内植入小鼠，且在随后的20天中进 行治疗。5周后，在抗体治疗组的腹膜腔中有显著更少的节结(nodules)。来自抗CD44和对照治疗组的节结具有相同的大小，暗示着一旦细胞被移植，抗体对肿瘤的生长没有效应。当细胞被皮下植入时，对肿瘤生长也没有效应，意味着该抗体本身没有抗增殖或细胞毒性效应。此外，抗体在体外对细胞生长没有效应。 
VFF-18，也被称作BIWA 1，是对CD44的v6变体具有高度亲和性的抗体，其对该多肽的360-370区域具有专一性。在对12个患者进行的1期临床试验中，该抗体已被用作99m锝标记偶联物。对该抗体的安全性以及在患有头部和颈部鳞状细胞癌的患者中的靶向潜能进行了测试。在注射40小时后，注射剂量的14％被肿瘤吸收，且在其它器官包括肾、脾和骨髓中具有最少的积聚。高度选择性的肿瘤结合暗示着该抗体在发射免疫治疗中的作用，尽管该抗体异常高的亲和力阻止其对肿瘤深层的穿透力。进一步限制BIWA 1应用的是小鼠抗体的免疫原性(12名患者中的11个产生了人抗鼠抗体(HAMA))、在肿瘤中的不均匀积聚以及抗体—可溶CD44复合物的形成。WO 02/094879公开了VFF-18的人源化形式，其被设计用于克服HAMA反应，被命名为BIWA 4。据发现，BIWA 4和VFF-18母抗体相比，其抗原结合亲和力显著降低。意外的是，更低亲和力的BIWA 4抗体比更高亲和力的BIWA 8人源化VFF-18抗体具有较高的肿瘤吸收特征。在33名患者的1期临床试验中对99m锝标记的和186铼标记的BIWA 4抗体进行评价以确定安全性、耐受能力、肿瘤积聚和186铼标记BIWA4的最大耐受剂量。99mTc标记BIWA 4中似乎存在肿瘤相关的吸收。在186Re标记BIWA 4的所有剂量中没有观察到肿瘤的应答，尽管一些具有稳定的病情；剂量限制毒性发生在60mCi/m2。存在50-65％的不良事件发生率，33名患者中的12位被认为发生了严重的不良事件(血小板减少、白血球减少以及发热)，且均接受186Re标记BIWA 4治疗的6名 患者在治疗期间死亡或因为疾病恶化随后死亡。2名患者产生了人抗人抗体(HAHA)。在20名患者中进行了186Re标记BIWA 4的1期剂量递增试验。观察到口腔粘膜炎和剂量限制血小板减少和白血球减少；一名患者产生了HAHA反应。在以60mCi/m2的最高剂量治疗的5名患者中观察到稳定的病情。尽管在获得功效的安全性和耐受能力上被认为可以接受，这些研究相比于临床研究中其它非放射性同位素偶联的生物学治疗具有更高的不良事件发生率。美国专利申请2003/0103985公开了用于肿瘤治疗的与maytansinoid偶联的VFF-18人源化形式，被命名为BIWI 1。人源化VFF 18抗体BIWA 4，在与一毒素偶联时，即BIWI 1，被发现在人外阴皮肤癌、咽喉鳞状细胞癌或乳腺癌的小鼠模型中具有显著的抗肿瘤效应。未偶联的形式BIWA 4没有抗肿瘤活性，且偶联形式BIWI 1没有在人体中的安全性或功效的证据。 
Mab U36通过UM-SCC-22B人下咽骨癌细胞免疫和癌及组织专一性选择产生的小鼠IgG1抗体。通过cDNA克隆和序列分析进行的抗原表征将角质细胞专一性的CD44剪接变体表元(epican)的v6结构域识别为Mab U36的靶点。免疫组织化学研究显示该抗原决定簇限于细胞膜上。此外，Mab U36对94％的头部和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)发生了强标记，且在这些肿瘤中细胞染色不均一。10名患者的99mTc标记Mab U36研究显示该抗体对HNSCC癌症的选择性积聚(2天内20.4+/-12.4％的注射剂量/kg)；没有不良反应的报道但2名患者产生了HAMA。在放射性碘的小鼠Mab U36的研究中，在18名患者中有3例HAMA以及HNSCC的选择性均匀吸收。为了降低Mab U36的抗原性以及降低HAMA的发生率，构建了嵌合抗体。嵌合或原始的小鼠Mab U36均没有ADCC活性。没有Mab U36天然功能活性的证据。186Re标记的嵌合Mab U36被用于确定Mab U36作为治疗试剂的应用。在该 1期剂量递增试验中，13名患者接受了99mTc标记的嵌合Mab U36的尝试剂量和随后的186Re标记嵌合Mab U36。没有急性不良事件的报道但随后的治疗中观察到3名患者中的2名有剂量限制髓毒性(1.5GBq/m2)，且观察到1名接受最大耐受剂量(1.0GBq/m2)治疗的患者血小板减少。尽管对肿瘤体积有某些效应，这些效应没有满足对治疗产生客观应答的标准。186Re标记嵌合Mab U36的进一步的研究采用使用粒细胞群落刺激因子刺激的全血回输的策略将最大耐受活性加倍至2.8Gy。在对患有头部和颈部各种肿瘤的9名患者的该研究中，3名因为药物相关贫血需要输血。其它毒性包括3级髓毒性和2级粘膜炎。尽管在5名患者中实现了3-5个月的稳定病情，没有客观肿瘤应答的报道。因此，可以看出尽管Mab U36是高度专一的抗体，其要求放射免疫偶联物以实现抗癌效应的缺点限制了其用途，因为其与获得临床效应相关的治疗相关联的毒性。 
总之，已经显示，CD44v6(1.1ASML)和CD44v10(K926)单克隆抗体在用转移型胰腺癌注射的大鼠或在用恶性黑素瘤注射的小鼠中分别降低了转移活性。另一种抗CD44v6抗体(VFF-18及其衍生物)仅在与maytansinoid或放射性同位素偶联时具有抗肿瘤活性。抗标准CD44单克隆抗体也已经显示抑制大鼠神经胶母细胞瘤的脑内进程(抗CD44)、小鼠T细胞淋巴瘤的淋巴结侵入(IM-7.8.1)以及抑制人卵巢癌细胞在裸鼠中的移植(克隆515)、小鼠黑素瘤细胞系的肺转移(IM-7.8.1)以及在SCID小鼠中人黑素瘤细胞的转移(GKW.A3)。放射性同位素偶联的Mab U36抗CD44v6抗体及其衍生物在临床试验中具有抗肿瘤活性并伴随着显著的毒性。尽管这些结果是鼓舞人心的且支持将抗CD44单克隆抗体发展成为潜在的癌症治疗法，它们说明了对人体癌症有限的效应、安全性或适用性。 
因此，如果分离出一种抗体成分，该成分介导癌细胞的细胞毒性，作为其与所述细胞上的CD44细胞表面表达相互吸引的功能，将会实现有价值的诊断和治疗方式。 
现有专利： 
美国专利号5,750,102公开了一种工艺，其中使用从患者细胞或组织克隆的MHC基因转染来自患者肿瘤的细胞。随后使用这些转染的细胞对患者进行预防接种。 
美国专利号4,861,581公开了一种工艺，其包括步骤有：获得对哺乳动物的癌细胞和正常细胞的胞内成分具有专一性但对胞外成分没有专一性的单克隆抗体，标记该单克隆抗体，将标记的抗体与已经接受治疗哺乳动物的组织接触以杀死肿瘤细胞，并且通过测定标记的抗体与退化的肿瘤细胞的胞内成分的结合确定治疗的效力。在制备靶向人胞内抗原的抗体中，专利权人认识到恶性细胞代表了这些抗原的便捷来源。 
美国专利号5,171,665提供了一新颖的抗体及其制备方法。特别地，该专利指导了单克隆抗体的形成，该抗体具有与人肿瘤相关蛋白抗原紧密结合的性质，例如结肠癌和肺癌，而与正常细胞以低得多的水平发生结合。 
美国专利号5,484,596提供了癌症治疗的方法，包括从人癌症患者体内手术去除肿瘤组织，处理肿瘤组织获得肿瘤细胞，照射肿瘤细胞使其存活但非肿瘤原性并使用这些细胞为患者制备疫苗，该疫苗能够抑制原发瘤的复发并同时抑制转移。该专利指导了与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发。如第4列，第45行及以后所述的，专利权人将内源性肿瘤细胞用于单克隆抗体的开发，呈现了人肿瘤的活性专一性免疫疗法。 
美国专利号5,693,763指导了人癌的特征性的糖蛋白抗原且其不依赖于来源的上皮组织。 
美国专利号5,783,186提出了诱导Her2表达细胞凋亡的抗Her2抗体，生成抗体的杂交瘤细胞系，用抗体和含有所述抗体的药物组合物治疗癌症的方法。 
美国专利号5,849,876描述了新的杂交瘤细胞系，该细胞系可生成从肿瘤和非肿瘤组织源中纯化出的粘蛋白抗原的单克隆抗体。 
美国专利号5,869,268提出了人淋巴细胞的生成方法，该淋巴细胞产生专一针对目标抗原的抗体，生产单克隆抗体的方法以及用这种方法生产的单克隆抗体。该专利特别提到一种抗HD人单克隆抗体的制备，该抗体可用于癌症的诊断和治疗。 
美国专利号5,869,045涉及与人体癌症细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的功能机制是双重的，分子与人癌表面上的细胞膜抗原反应，进一步地抗体在结合之后能够内化进癌细胞，使它们特别适于形成抗体—药物和抗体—毒素偶联物。在特定浓度下未修饰的抗体同样具有明显的细胞毒性。 
美国专利号5,780,033公开了自身抗体在肿瘤治疗和预防中的应用。但是，该抗体是源自老年哺乳动物的抗细胞核自身抗体。在该例中，自身抗体据称是免疫系统中发现的一类天然抗体。因为自身抗体来自“老年哺乳动物”，因此不要求自身抗体真正来自接受治疗的患者。此外该专利公开了老年哺乳动物中的天然和单克隆抗核自身抗体，以及制备单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。 
美国专利号5,916,561公开了靶向CD44基因变体外显子v6的专一性抗体VFF-18及其变体。该抗体相对于其它同类抗体有所改进，因为其识别人CD44v6变体而不识别大鼠的CD44v6变体。此外，该抗 体公开了对于CD44v6表达的诊断分析。对于该抗体没有公开任何体外或体内的功能。 
美国专利号5,616,468公开了单克隆抗体Var3.1，该抗体针对包含由人的CD44基因的外显子6A编码的序列的合成肽制备。特别地，该抗体与人CD44的90kD形式不发生结合且可以与Hermes-3抗体相区别。提供了检测CD44的v6变体的方法以及根据该抗原对恶性转化进行筛选和分析的方法。还提供了根据检测血清中的抗原筛选炎症疾病的方法。 
美国专利号5,879,898公开了与人CD44变体6的129bp的外显子结合的专一性抗体，该外显子产生43个氨基酸的肽。该单克隆抗体可由若干杂交瘤细胞系制备：MAK<CD44>M-1.1.12、MAK<CD44>M-2.42.3、MAK<CD44>M-4.3.16。该抗体从一融合蛋白产生，该蛋白包含新CD44v6氨基酸序列的至少一个六肽。此外，公开了用于检测外显子6变体的免疫分析，该分析可被用作癌症的诊断。值得注意地，没有公开该抗体的体外或体内功能。 
美国专利号5,942,417公开了编码类CD44多肽的多核苷酸以及使用该多核苷酸及其变体制备重组蛋白的方法。该专利权利要求了这些多肽的抗体但没有具体实施例也没有分泌这些抗体的保藏的克隆。Northern印记法证实该多核苷酸在一些类型的组织中出现，但没有该多核苷酸翻译和表达的相应证据。因此，没有证据说明针对该多核苷酸的基因产物制备了抗体，且这些抗体是否具有体外或体内功能，以及它们是否与人癌症疾病相关。 
美国专利号5,885,575公开了与CD44的变体抗原决定簇反应的抗体以及通过使用该抗体识别该变体的方法。从大鼠细胞中分离出编码该变体的分离的多核苷酸，且靶向该变体的抗体mAb1.1ASML识别分子量为120kD、150kD、180kD和200kD的蛋白。单克隆抗体1.lASML 的给药延缓了大鼠BSp73ASML在同基因大鼠中的生长和转移。值得注意地，正如其缺乏对LCLC97人大细胞肺癌的活性所证实的，1.1ASML不识别人肿瘤。从LCLC97中分离出人的同源体但没有制备出识别该同源体的等价抗体。由此，尽管制备了对大鼠CD44的变体具有专一性的抗体且该抗体显示影响大鼠肿瘤的生长和转移，没有证据说明该抗体对人肿瘤具有效应。更具体地，该发明人指出该抗体不识别人癌症。 
发明内容
本发明的发明者此前已被授予名为“个别患者特异性抗癌抗体(Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies)”的美国专利6,180,357，该专利提出了选择用于治疗癌症疾病的个别定制的抗癌抗体的方法。为了本文的目的，术语“抗体”和“单克隆抗体”(mAb)可交替使用来指：杂交瘤(例如鼠或人的)生成的完整的免疫球蛋白、免疫偶联物和由免疫球蛋白衍生出的合适的免疫球蛋白片段和重组蛋白，如嵌合的和人源化免疫球蛋白、F(ab’)和F(ab’)2片段、单链抗体、重组免疫球蛋白可变区(Fv)s、融合蛋白等。本领域充分已知可以变化多肽中的一些氨基酸序列而不会对蛋白质的结构或功能产生显著的影响。在抗体的分子重排中，对骨架区域的核酸或氨基酸序列的修改通常是可以接受的。这些修改包括但不限于取代(优选地是保守取代)、删除或增加。此外，将标准的化疗模式例如放射核与本发明的CDMAB偶联由此关注所述化疗的应用也在本发明的范围内。CDMAB还可以与毒素、细胞毒性基序(moiety)、酶如生物素偶联酶或造血细胞偶联。 
本申请基本使用‘357专利中指导的制备患者专一性抗癌抗体的方法分离杂交瘤细胞系，这些细胞系编码癌症疾病改善单克隆抗体。这些抗体可以专一性地针对一种肿瘤制备，由此使得癌症治疗的个性化 成为可能。在本申请全文中，具有细胞杀死(细胞毒性的)或细胞生长抑制(抑制细胞生长的)性质的抗癌抗体在此后将被称作细胞毒性的。这些抗体可用于帮助癌症的定级和诊断，也可用于治疗肿瘤转移及原发瘤。 
个性化抗癌治疗的前景将给患者的管理方式带来改变。可能出现的临床情景是在肿瘤出现时获取并储存肿瘤样品。通过这个样品，可以用一组既存的癌症疾病改善抗体检测肿瘤的类型。患者将会按常规定级但是适用的抗体可以用于对患者进一步的定级。可以用存在的抗体立即对患者进行治疗，且/或可以使用在此概述的方法或通过噬菌体表面展示文库结合在此公开的筛选方法制备一组对肿瘤具有专一性的抗体。将生成的所有抗体加入抗癌抗体文库，因为其它肿瘤可能与正在接受治疗的肿瘤存在部分相同的抗原决定簇。根据本方法生产的抗体可用于治疗任意数量患者的癌症疾病，如果这些患者的癌症可以与这些抗体结合。 
基本使用美国专利6,180,357的方法，在用患者肺肿瘤活检细胞使小鼠免疫之后，获得小鼠单克隆抗体H460-16-2。H460-16-2抗原在来自不同组织的广泛的人细胞系的细胞表面表达。乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MB-231)和皮肤癌细胞A2058是体外对H460-16-2细胞毒性效应敏感的细胞系。 
在细胞培养中H460-16-2对MB-231细胞的细胞毒性结果通过在其被移植进小鼠时对这些细胞的抗肿瘤活性得以进一步延伸(如S.N.10/603,000中公开的)。临床前异种移植肿瘤模型被认为是治疗功效的有效预测。 
在人乳腺癌的预防性体内模型中，在治疗期间，H460-16-2治疗比同型对照抗体显著更有效地(p＜0.0001)抑制肿瘤生长，同型对照抗体在结构和大小上与H460-16-2相同但不能结合MB-231细胞。在治疗期 结束时，接受H460-16-2的小鼠其肿瘤生长只有对照组的1.3％。在治疗后的后续期间，H460-16-2的治疗效应继续维持，且直到测量期结束，治疗组的平均肿瘤体积一直显著地小于对照组。使用存活作为抗体功效的衡量指标，据估计在治疗后的70天，H460-16-2治疗组中的死亡风险是抗体缓冲液对照组的大约71％(p＝0.028)。这些数据说明H460-16-2治疗与对照治疗组相比具有存活益处。由于没有诱导任何毒性迹象，包括体重降低和临床痛苦，H460-16-2治疗似乎是安全的。因此，H460-16-2治疗是有效的，因为在完善的人乳腺癌模型中它与对照治疗组相比延缓了肿瘤的生长并提高了存活。 
此外，H460-16-2在成熟体内肿瘤的模型中证明了对MB-231细胞的抗肿瘤活性(如S.N.10/603,000中描述的)。将H460-16-2的治疗和标准化疗药物顺铂进行了比较，比较显示顺铂和H460-16-2治疗组和接受抗体稀释缓冲液或同型对照抗体治疗的组相比具有显著小的平均肿瘤体积(p＜0.001)。H460-16-2治疗介导了大约为顺铂化疗2/3的肿瘤抑制但没有顺铂治疗中观察到的显著的(19.2％)体重降低(p＜0.003)和临床痛苦，包括在顺铂治疗中观察到的2例治疗相关的死亡。H460-16-2的抗肿瘤活性及其最小化的毒性使其成为一种具有吸引力的抗癌治疗试剂。 
在治疗后阶段，H460-16-2显示了显著的存活益处(p＜0.02)，因为在治疗后的＞70天，H460-16-2组的死亡风险大约是同型对照抗体组的一半。观察到的存活益处持续到治疗后的120天，其时相比于67％的H460-16-2治疗组，100％的同型对照和顺铂治疗小鼠死亡。和同型对照抗体组相比，通过以26％的比例延缓肿瘤生长，H460-16-2维持对肿瘤的抑制。在治疗后的31天，H460-16-2通过以相对于同型对照组48％的比例减慢肿瘤生长从而限制肿瘤体积，这和在治疗结束时观察到的49％的降低相当。在乳腺癌的成熟肿瘤模型中，这些结果意味 着H460-16-2在治疗期以外维持肿瘤抑制的潜力且证明了该抗体在哺乳动物体内降低肿瘤负荷和提高存活的能力。 
为了证实H460-16-2抗原决定簇是药物靶点，此前确定了H460-16-2抗原在正常人体组织中的表达(S.N.10/603,000)。通过与抗CD44抗体(克隆L178)的比较，此项工作得到了延伸。通过H460-16-2的IHC染色，大部分组织又一次无法表达H460-16-2抗原，包括要害器官的细胞，如肝、肾(管状上皮细胞的少量染色除外)、心脏和肺。组织染色的结果意味着H460-16-2呈现对各种细胞类型的受限结合但与浸润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞结合。L178抗体显示了相似的染色模式。然而，注意到一些差别；和H460-16-2相比，L178对淋巴细胞的染色更强且具有更广泛的分布。并且在一个肝脏样品中L178对Kupffer细胞发生了染色而H460-16-2没有。 
H460-16-2抗原的定位及其在乳腺癌患者中的普遍性对评价H460-16-2免疫治疗对患者的益处和设计有效临床实验是重要的。为了弄清H460-16-2抗原在癌症患者乳腺肿瘤中的表达，之前对来自50个乳腺癌患者的肿瘤组织样品中H460-16-2抗原的表达进行了筛选(S.N.10/603,000)。当前的工作将H460-16-2的染色与L178进行比较。当前的研究的结果与之前的结果相似并显示62％的组织样品为H460-16-2抗原染色阳性而76％的乳腺肿瘤组织是L178抗原决定簇阳性的。在患者样品中H460-16-2的表达似乎对癌细胞具有专一性因为染色限制在恶性细胞。相反，H460-16-2对乳腺癌患者10个正常组织样品中的4个发生了染色而L178染色了6个。H460-16-2和L178抗原的乳腺肿瘤表达似乎主要定位在恶性细胞的细胞膜上，使CD44成为具有吸引力的治疗靶点。基于雌激素和孕酮受体在乳腺肿瘤中的表达对H460-16-2的表达进行了进一步的评估，这两种激素受体在乳腺肿瘤的发展、治疗和预后中发挥重要作用。在H460-16-2抗原表达和雌 激素或孕酮受体表达之间没有明显的关联性。当根据肿瘤的阶段或癌症发展的程度分析肿瘤时，再一次地，在H460-16-2抗原表达和肿瘤阶段之间没有清晰的关联。L178获得了相似的结果。 
为了进一步延伸H460-16-2的潜在治疗益处，此前确定了抗原在各种人癌症组织中的频率和定位(S.N.10/603,000)。当前的研究将H460-16-2的染色与克隆L178进行比较。这些肿瘤类型中的大部分对L178抗原也是阳性的。和人乳腺肿瘤组织一样，H460-16-2和L178的定位主要发生在肿瘤细胞的细胞膜上。然而，和H460-16-2相比，L178存在更多的膜定位。同样的，在对于H460-16-2和L178均发生染色的肿瘤类型中，43％的组织对L178抗体显示了更高强度的染色。根据与文献中的IHC数据的比较，似乎没有CD44的形式与在此呈现的IHC数据精确匹配。CD44的标准形式通常在人脑中表达；H460-16-2抗原不表达。靶向全CD44异构体的抗体不对肝(包括Kuppfer细胞)发生染色且对生殖周期的所有阶段的子宫内膜腺阳性染色。H460-16-2抗原清晰地存在于Kuppfer细胞上且仅存在于生殖周期的分泌子宫内膜腺上。H460-16-2抗原消楚地存在于组织巨噬细胞上且仅有变体形式V4/5和V8/9显示了偶尔的巨噬细胞染色。与抗CD44L178相比，观察到的H460-16-2相似但不同的结合模式说明H460-16-2抗原是CD44独特的抗原决定簇。 
如在此概述的，额外的生化数据也说明H460-16-2识别的抗原是CD44的一种形式。这得到了研究的支持，研究显示与CD44反应的单克隆抗体(L178)识别通过免疫沉淀与H460-16-2结合的蛋白。Western印记法也暗示由H460-16-2识别的CD44的抗原决定簇在v6或v10上不存在。H460-16-2抗原决定簇也可由于其是糖和构象依赖性的而被区分，而很多抗CD44抗体是靶向CD44的肽部分的。这些IHC和生化结果证明H460-16-2与CD44抗原的变体结合。由此，多数证据显示 H460-16-2通过与CD44变体上的独特的糖依赖性构象抗原决定簇的连接介导抗癌效应。 
总之，这些数据说明H460-16-2抗原是癌症相关抗原且在人体中表达，并且是病理相关癌症靶点。此外，这些数据还说明H460-16-2抗体与人癌症组织结合，且可被合适地用于诊断、治疗预测或预后的分析。此外，由于该抗原在绝大多数非恶性细胞中没有表达，该抗原的细胞膜定位是细胞癌症状态的指示，且该发现允许该抗原、其基因或衍生物、其蛋白或其衍生物被用于诊断、治疗预测或预后的分析。 
其它涉及抗CD44抗体使用的研究具有H460-16-2所没有呈现的治疗潜力的局限。H460-16-2证实了体外和体内的抗肿瘤活性。此前说明的抗体如MAK<CD44>M-1.1.12、MAK<CD44>M-2.42.3和MAK<CD44>M-4.3.16没有属于它们的体外和体内细胞毒性且VFF-18与Mab U36没有呈现固有的肿瘤细胞毒性。此外，其它呈现了体内肿瘤效应的抗CD44抗体也具有在H460-16-2上不明显的某些局限。例如，ASML1.1、K926、抗CD44s和IM-78.1分别显示了对大鼠、小鼠、异种移植模型中的大鼠和小鼠肿瘤的体内抗肿瘤活性。H460-16-2在人体癌症模型中证实了抗肿瘤活性。H460-16-2也靶向人CD44而抗体如ASML1.1仅识别大鼠CD44。克隆515抗CD44抗体对人卵巢细胞系的腹膜肿瘤移植发生抑制但不防止或抑制肿瘤的生长。H460-16-2在SCID小鼠异种移植模型中能够抑制人乳腺肿瘤的生长。GKW.A3是一种能够在预防性但非成熟肿瘤的模型中抑制小鼠中生长的人转移性黑素瘤的肿瘤生长的抗人CD44单克隆抗体。H460-16-2已在人乳腺癌的预防性和成熟的小鼠异种移植模型中证实了显著的抗肿瘤活性。因此，很明显，H460-16-2和此前说明的抗CD44抗体相比具有更好的抗肿瘤性质。其在SCID小鼠的人乳腺肿瘤上的体外和体内抗肿瘤活性已被证 实并且靶向人CD44。该抗体还在人乳腺癌的预防性和成熟(更临床相关的)模型中呈现了活性。 
总之，本发明指导了H460-16-2抗原作为治疗试剂靶点的应用，该试剂在给药时能够降低哺乳动物体内表达该抗原的癌症的肿瘤负荷并能够导致治疗后的哺乳动物延长的存活。本发明还指导了CDMAB(H460-16-2)及其衍生物在靶向其抗原以降低哺乳动物体内表达该抗原的癌症的肿瘤负荷和延长患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的寿命中的应用。此外，本发明还指导了在癌细胞中检测H460-16-2的用途，其可被用于对患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测和预后。 
如果患者对治疗的初始阶段不敏感或发生转移，可以重复产生肿瘤专一性抗体的过程用于再治疗。此外，可以将抗癌抗体与从患者体内获得的红血细胞偶联并回输用于转移的治疗。对转移性癌症很少有有效的治疗且转移通常预示着不理想的结果导致死亡。但是，转移性癌症常常是充分血管化的且红血细胞对抗癌抗体的运送具有在肿瘤位点聚集抗体的作用。甚至在转移前，大部分癌细胞的存活依赖于宿主的血液供应，与血红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤也是有效的。可替换地，抗体可以与其它造血细胞偶联，例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀手细胞等。 
有5类抗体且各类抗体与一种由其重链赋予的功能关联。一般认为由裸抗体杀死癌细胞由抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)介导。例如小鼠IgM以及IgG2a抗体可以通过与补体系统中的C-1成分结合激活人的补体，由此激活补体活化的经典通路，该通路可导致肿瘤降解。对于人抗体，最有效的补体激活抗体一般为IgM和IgG1。小鼠IgG2a和IgG3同型抗体有效募集具有Fc受体的细胞毒性细胞，由此造成单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和 某些淋巴细胞的杀细胞作用。人的IgG1和IgG3同型抗体均介导ADCC。 
抗体介导的癌症杀死的另一个可能的机制可能通过抗体的应用，这些抗体能够催化细胞膜及其相关糖蛋白或糖脂中的各种化学键的水解，即所谓的催化抗体。 
有另外两种更广为接受的抗体介导癌症细胞杀死机制。第一种机制是将抗体用作疫苗以诱导抗体产生对位于癌细胞上的推定抗原的免疫反应。第二种机制是将抗体用于靶向生长受体并干扰它们的功能或下调受体以有效地使其功能丧失。 
因此，本发明的目的是利用从来自特定个体的细胞中制备癌症疾病改善抗体的方法来分离杂交瘤细胞系和相应的由所述杂交瘤细胞系编码的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段，该疾病改善抗体对癌细胞是细胞毒性的，但同时对非癌细胞相对无毒。 
本发明的另一个目的是指导通过利用分离出的由保藏于ATCC的保藏号为PTA-4621的克隆编码的单克隆抗体或其抗原结合片段来确定表达CD44抗原性基序的细胞的存在的方法，该基序与分离出的由保藏于ATCC的保藏号为PTA-4621的克隆编码的单克隆抗体或其抗原结合片段专一性结合。 
本发明的进一步的目的是指导通过分离出的由保藏于ATCC的保藏号为PTA-4621的克隆编码的单克隆抗体或其抗原结合片段的使用提高癌症疾病患者的存活的方法，该抗体与CD44抗原性基序专一性结合。 
本发明的另一个目的是指导CDMAB及其抗原结合片段。 
本发明的进一步的目的是制备CDMAB，其细胞毒性通过ADCC介导。 
本发明的进一步的目的是制备CDMAB，其细胞毒性通过CDC介导。 
本发明的进一步的目的是制备CDMAB，其细胞毒性是其催化细胞化学键水解能力的一个功能。 
本发明的进一步的目的是制备CDMAB，该抗体在癌症诊断、预后和监测的结合实验中有用。 
通过以下说明，其中通过图解和实施例的方式阐述了本发明的某些具体实施方式，本发明的其它目的和优势将变得明显。 
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在提出要求并支付了必要费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的复印件。 
图1、用H460-16-2作探针的MDA-MB-468细胞膜的Western印记。泳道1：还原条件下分离的膜蛋白。泳道2：非还原条件下分离的膜蛋白。左侧标明了分子量标记。 
图2、用H460-16-2作探针的细胞膜的Western印记。泳道1：MDA-MB-468细胞膜。泳道2：MDA-MB-231细胞膜。左侧标明了分子量标记。 
图3、MDA-MB-468膜蛋白的二维Western印记和SDS-PAGE。板A说明了H460-16-2识别的2个蛋白的位置。板B说明了用同型对照抗体作探针的相似的印记。板C显示了MDA-MB-468膜的SYPRORuby染色胶。箭头表示对应于板A的蛋白质点的位置。 
图4、MDA-MB-231膜蛋白的二维Western印记。由箭头表示了主要的结合蛋白。 
图5、去糖基化对H460-16-2和MDA-MB-231细胞膜结合的影响。板A显示了在Western印记中H460-16-2与未处理的MDA-MB-231细胞膜(泳道2)、糖苷酶(见文)37℃处理24小时的细胞膜(泳道3)、糖苷酶25℃处理24小时的细胞膜(泳道4)的结合。泳道1显示了分子量标签的位置。板B说明了高甘露糖结合外源凝集素GNA与相似印记的结合。 
图6、与H460-16-2免疫沉淀的MDA-MB-231膜蛋白的SDS-PAGE(板A)和Western印记(板B)。泳道1：MDA-MB-231细胞膜总蛋白；泳道2：与H460-16-2免疫沉淀的蛋白。箭头表明80-90kD的H460-16-2结合蛋白。 
图7、用H460-16-2(板A)、抗CD44(克隆L178，板B)和抗HSP90(板C)作探针的蛋白的Western印记。泳道1：MDA-MB-231细胞膜总蛋白；泳道2：与H460-16-2免疫沉淀的蛋白；泳道3：分子量标准。 
图8、用H460-16-2(板A，泳道2)、抗CD44(克隆L178，板B，泳道2)、抗CD44var6(克隆VFF-7，板C，泳道2)和抗CD44var10(克隆VFF-14，图D，泳道2)作探针的蛋白的Western印记。各印记中的泳道1包含分子量标准。 
图9、H460-16-2结合的典型的FACS直方图。直方图呈现了H460-16-2(20μg/mL)、107.3同型对照(20μg/mL)和抗EGFR(5μg/mL)与乳腺癌(MDA-MB-231和MDA-MB-468)和正常(Hs578.Bst和CCD-27sk)细胞系的结合。 
图10、显示H460-16-2(A)和抗CD44(L178)抗体(B)在来自正常人组织阵列的扁桃腺的组织切片上的结合模式的典型显微图。L178比ARH460-16-2对淋巴细胞具有更强且广泛分布的染色，其中染 色更局限在淋巴结的套膜区(mantle zone)(黑箭头)，生发中心染色弱(绿箭头)。放大倍率为200X。 
图11、显示H460-16-2(A)和抗CD44(L178)抗体(B)在来自正常人组织阵列的肝脏的组织切片上的结合模式的典型显微图。L178对肝窦间隙的Kupffer细胞染色(箭头)但H460-16-2没有。放大倍率为200X。 
图12、H460-16-2与乳腺癌肿瘤结合的典型显微图(浸润型导管癌)。图中黄色和橙色的箭头分别指向基质细胞和恶性细胞层。 
图13、显示H460-16-2(A)和抗CD44(L178)抗体(B)在来自人乳腺癌组织阵列的帕哲氏病(paget’s disease)乳腺组织切片上的结合模式的典型显微图。L178对恶性细胞的膜染色(箭头)对比于H460-16-2的阴性染色。放大倍率为200X。 
图14、显示H460-16-2(A)和抗CD44(L178)抗体(B)在来自人多肿瘤组织阵列的子宫颈鳞状细胞癌的组织切片上的结合模式的典型显微图。H460-16-2比L178对恶性细胞发生更强的染色。放大倍率为200X。 
图15、显示H460-16-2(A)和抗CD44(L178)抗体(B)在来自人多肿瘤组织阵列的腺癌的肺组织切片上的结合模式的典型显微图。L178对恶性细胞发生+++记分，相比于H460-16-2的+/-记分。放大倍率为200X。 
具体实施方式
实施例1
通过Western印记法对结合蛋白的识别 
为了识别H460-16-2抗体识别的抗原，对表达该抗原的细胞膜进行凝胶电泳并转移至膜上。使用Western印记法确定该抗体检测到的蛋白。 
1、细胞膜制备 
此前的工作通过FACS证实了H460-16-2与乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MB-231)和MDA-MB-468(MB-468)的结合。因此，从这两个细胞系进行的膜制备被用于抗原的识别。从MB-231或MB-468乳腺癌细胞的铺满培养制备总的细胞膜。从烧瓶中去除培养基并用PBS洗涤细胞3次。在最后一次洗涤后，用消化缓冲液(Gibco-BRL；Grand Island，NY)在37℃将细胞消化5分钟。收集细胞并在4℃下用1200rpm离心10分钟。离心后，将细胞沉淀物重悬在1mL的低渗裂解缓冲液中，该缓冲液包含10μg/mL亮抑酶肽(leupeptin)、10μg/mL抑肽酶(aprotonin)和25μg/mL 4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟。随后使用5轮快速的冻融将细胞裂解。将细胞裂解液在4℃下用9500rpm离心10分钟以去除细胞核碎片。收获上清液并随后在4℃下用75,000xg离心57分钟。小心地从试管中去除上清液并将沉淀重悬于含有1％Triton X-100的0.5至1mL的低渗裂解缓冲液中。随后分析膜的蛋白含量并将膜储存在-80℃。 
2、一维SDS-PAGE 
用一维的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离膜蛋白。将20μg的膜蛋白加入12％的SDS-PAGE胶的泳道中。在参照泳道中跑预染色的分子量标记(Biorad；Mississauga，ON)的样品。在没有二硫苏糖醇(DTT)存在的非还原性条件下通过电泳分离样品。电泳在100V下进行10分钟，随后在150V下进行65分钟。通过在40V进行16小时的电转印将蛋白从胶上转移至PDVF(Millipore；Billerica，MA)膜上。通过注意预染色的标记从胶至膜的完全转移对定量转移进行评估。 
转移后，在含有0.5％Tween的Tris缓冲盐溶液(TBST)中用5％的脱脂奶粉将膜封闭2小时。随后将膜与稀释在含有3％脱脂奶粉的TBST中的2-2.5μg/mL H460-16-2共同放置2小时。在用TBST洗涤3次后，将膜与和来自Jackson Immunologicals(West Grove，PA)的山葵过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗鼠IgG(Fc)共同放置1小时。在该放置后用TBST洗涤3次，随后与HRP底物TMB(来自Vector Laboratories；Burlington，ON的底物试剂盒)共同放置。 
图1显示了所述的Western印记法的结果。H460-16-2清楚地与分离的MB-468膜蛋白(泳道2)的两个分子量(MW)区结合。通过与分子量标准的比较，该抗体结合MW 80-90kD和MW 120-150kD的蛋白质。由抗体H460-16-2识别的抗原决定簇似乎是构象抗原决定簇，因为抗体不能与在DTT存在的还原条件下从胶上转移的点结合(泳道1)。图2比较了H460-16-2与来自MB-468(泳道1)和MB-231(泳道2)的细胞膜的结合。在MB-468膜上，H460-16-2以相等的强度与80-90kD和120-150kD的蛋白发生结合。在MB-231膜上，主要的结合蛋白是80-90kD蛋白，而在120-150kD识别了较弱的结合蛋白。 
3、二维SDS-PAGE 
为了获得结合蛋白更好的分别率，且为了进一步表征蛋白，进行了二维电泳。使用PlusOne 2-D纯化试剂盒(Amersham；Baie D′Urfe，QC)沉淀如上所述制备的总的膜蛋白(75-200μg)，并随后将蛋白重悬于pH范围3-10的包含两性电解质的重水合缓冲液中。将样品离心去除颗粒材料并随后在重水合溶液的存在下加至IPG条带(Amersham；Baie D′Urfe，QC)上。使用以下步骤将蛋白聚焦：重水合16小时；500V，250Vhrs，1000V，500Vhrs；5000V，7500V hrs。随后从条带架上取下条带并浸入SDS-PAGE平衡缓冲液中。15分钟后， 将条带置于8％的胶的顶部并用琼脂糖溶液将其封闭。预染色的MW标记被加样至条带的旁边。电泳在100V下进行10分钟随后在150V进行65分钟。一块胶用10％甲醇/7％乙酸固定30分钟，并随后用荧光染料SYPRO RubyTM(Molecular Probes，Eugene，OR)染色。在UV光下观察蛋白点。从第二和第三块胶，通过在40V的16小时的电转印将蛋白从胶转移至PVDF(Millipore)膜上。通过确定预染色的标记从胶至膜的完全转移评估定量转移。 
转移后，在含有0.5％Tween的Tris缓冲盐溶液(TBST)中用5％的脱脂奶粉将膜封闭2小时。随后将一块膜与稀释在含有3％脱脂奶粉的TBST中的2-2.5μg/mL的H460-16-2共同放置2小时。一块相似的膜与相同浓度的同型对照(小鼠抗苦味酸，IgG1，κ；克隆107.3(BDBiosciences；Oakville，ON))共同放置。在用TBST洗涤3次后，将膜与和来自Jackson Immunologicals(West Grove，PA)的山葵过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗鼠IgG(Fc)共同放置1小时。在该放置后用TBST洗涤3次，随后与HRP底物TMB(来自Vector Laboratories；Burlington，ON的底物试剂盒)共同放置。 
图3a显示了将MB-468膜与H460-16-2共同放置获得的Western印记。观察到两个明显的结合点，其分子量对应于从一维电泳中获得的分子量。观察到的一个点根据MW标准MW在大约80-90kD，且在胶的酸性部分，其估计的pI在3-4。第二个点根据MW标准在MW120-150kD的范围内且具有比80-90kD的蛋白更加碱性的pI。图3b显示了膜与同型对照抗体共同放置获得的Western印记。在该印记中没有可见点，意味着H460-16-2的结合不是因为非专一性的结合。图3c显示了SYPRO RubyTM染色的MB-468膜蛋白的2D胶。注意到当对MB-231膜进行相似了Western印记时，只观察到80-90kD的点(图4)。 
实施例2
确定与H460-16-2结合的抗原的糖基化 
为了确定由抗体H460-16-2识别的抗原是否为糖蛋白，根据生产商手册(DeglycoPro去糖基化试剂盒；Prozyme，San Leandro，CA)将MB-231膜与PNGase F、内切-o-糖苷酶和唾液酸酶A在室温或37℃共同放置24小时。如上所述用1D聚丙烯酰胺凝胶电泳分离膜并随后如上所述用H460-16-2进行Western印记。 
图5中显示了Western印记的结果。在没有用糖苷酶处理的MB-468膜中，H460-16-2识别了预期的85-95kD条带(图5，板A，泳道2)。在用糖苷酶在25℃处理的膜中，该条带有明显的向低分子量的移动(泳道4)。在用糖苷酶在37℃处理的膜中，H460-16-2的结合被消除(泳道3)。为了确定去糖基化的完全性，用高甘露糖结合外源凝集素雪花莲凝集素(GNA)作为探针进行相似的印记。图5，板B中观察的结果说明在25℃的去糖基化是不完全的(泳道4)且在37℃基本完全(泳道3)。因此，在完全去糖基化的条件下，H460-16-2不能与其抗原结合。 
总之，这些结果暗示80-90kD的条带是糖蛋白。此外，这些结果呈现了由H460-16-2识别的抗原决定簇是糖依赖性的证据。 
实施例3
H460-16-2结合的抗原的识别 
1、免疫沉淀 
用pH 6.0的0.1M的磷酸钠缓冲液洗涤1mL的Protein G Dynabeads(DYNAL)3次。将2500μg的H460-16-2加入总体积为500μL的洗涤后的珠子上。将混合物放置并温和混和1小时。去除未结合的 抗体用2.5mL含有0.1％的Tween-20，pH 7.4的0.1M磷酸钠缓冲液将H460-16-2包被的珠子洗涤3次。用5mL pH 8.2的0.2M三乙醇胺将H460-16-2包被的珠子洗涤2次，随后加入5mL。在5mL pH 8.2的含有20mM的二甲基pimelimidate的三乙醇胺的存在下，通过温和混和30分钟将H460-16-2与珠子化学交联。通过加入5mL的pH 7.5的50mM Tris终止反应。在放置15分钟后，用含有0.1％Tween-20的PBS将H460-16-2交联的珠子洗涤3次。通过与pH 3的0.1M柠檬酸盐共同放置3分钟将H460-16-2交联的珠子预洗脱并随后用含有0.1％Tween-20的pH7.4的0.1M磷酸钠缓冲液将珠子洗涤3次。 
在4℃将MB-231细胞的3mg细胞膜总蛋白与H460-16-2化学交联的珠子在含有0.1％Tween-20、5％葡萄糖、5％甘露糖、5％半乳糖和蛋白酶抑制剂的pH 7.4的0.1M磷酸钠缓冲液中共同放置4小时。放置后，用含有150mM NaCl和0.1％Tween-20的PBS将免疫沉淀物洗涤3次。通过将H460-16-2交联的珠子与pH 3的0.1M柠檬酸盐共同放置4分钟将蛋白从珠子上洗脱。将洗脱的蛋白保存在-80℃。将从3mg蛋白中免疫沉淀的蛋白加样至8％非还原性的SDS-PAGE胶的一个泳道中。在参考泳道中跑预染色分子量标记(Biorad；Mississauga，ON)的样品。通过在100V下10分钟，随后150V下65分钟的电泳将样品分离。用SYPRO RubyTM对蛋白染色。 
在平行Western印记中，如前所述从100μg MB-231膜蛋白中免疫沉淀出的蛋白在电泳中分离。通过在40V下电转印16小时将蛋白从胶转移至PVDF(Millipore；Billerica，MA)膜上。通过注意预染色的标记从胶至膜的完全转移评估定量转移。 
转移后，在含有0.5％Tween的Tris缓冲盐溶液(TBST)中用5％的脱脂奶粉将膜封闭2小时。随后将稀释在含有3％脱脂奶粉的TBST中的5μg/mL的H460-16-2作为探针对膜处理2小时。在用TBST 洗涤3次后，将膜与合适的次级抗体：和来自Jackson Immunologicals(West Grove，PA)的山葵过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗鼠IgG(Fc)共同放置1小时。在该放置后用TBST洗涤3次，随后与HRP底物TMB(来自Vector Laboratories；Burlington，ON的底物试剂盒)共同放置。 
图6说明了由H460-16-2免疫沉淀的蛋白获得的胶和印记。在胶上(板A)，在泳道的80-90kD区域有一条带含有免疫沉淀蛋白(见箭头，泳道2)。高分子量条带包含完整的抗体。在样品中没有其它蛋白。在相应的Western印记中(板B)，H460-16-2与免疫沉淀的蛋白强烈反应(泳道2)，具有与在总膜蛋白中观察到的相似的结合图像(泳道1)。 
2、质谱 
用无菌的加样枪枪头切割对应于由H460-16-2免疫沉淀的80-90kD蛋白的胶区域(图6，板A，泳道2)。随后将该胶块用于质谱对蛋白的识别。 
使用胰蛋白酶(ProGest)对样品进行自动的胶内消化且一部分生成的消化上清液被用于MALDI/MS分析。使用ZipTips进行自动点样(ProMS)；从的C18材料上洗脱出肽和基质(α-氰4-羟基肉桂酸)，其制备在60％乙氰、0.2％TFA中。在Micromass Q-Tof2上使用75μmC18柱以200nL/min的流速通过nano LC/MS/MS分析样品。使用MASCOT的本地拷贝搜索MS/MS数据。 
表1中呈现了由LC/MS/MS分析识别的H460-16-2免疫沉淀材料中的蛋白。进行记分，该分数是根据匹配的肽的数目和一致性水平的复合分数(composite score)。 
表1 由H460-16-2对MDA-MB-231细胞膜的免疫沉淀识别的蛋白 
  观察的MW   方法   蛋白质ID   计分   NCBI进入号
  80-90kD   LC/MS/MS   CD44   239   gi/2134882
样品中仅有的蛋白与人CD44，一种在淋巴细胞和多种类型癌细胞的细胞表面存在的80kD的糖蛋白匹配。 
3、确认 
通过确定已知的抗CD44单克隆抗体是否与由H460-16-2免疫沉淀的蛋白反应，对推定抗原进行确认。用一维SDS-PAGE分离总的MB-231膜蛋白和H460-16-2免疫沉淀的蛋白。如上所述进行电泳和Western印记法。将膜与稀释在TBST中的3％的脱脂奶粉中的5-10μg/mlH460-16-2、抗CD44(克隆L178，BD Biosciences，Oakville，ON)或抗HSP90(阴性对照；克隆16F1(Stressgen，Victoria，BC))共同放置2小时。图7显示了上述Western印记法的结果。板A显示了H460-16-2与总的膜蛋白(泳道1)和免疫沉淀的蛋白(泳道2)的结合。主要的结合蛋白在80-90kD的区域，尽管在总的膜蛋白的120-150kD区域也能看见条带。当用L178作探针进行平行的印记时(板B)，可以看见相似的模式。L178和由H460-16-2免疫沉淀的蛋白发生强结合。H460-16-2和L178与总的膜蛋白的结合模式十分相似(板A和B，泳道1)。用阴性对照抗HSP90作探针的平行印记(条C)显示该抗体不与免疫沉淀的材料结合，尽管它与总的膜制备中的明显的90kD蛋白结合。该结果确定了抗CD44与免疫沉淀蛋白的结合是专一性的，且不是因为污染蛋白的存在，因为HSP90是普遍存在的且“伴随的”细胞伴侣蛋白。 
图8呈现了为比较H460-16-2与已知的抗CD44抗体的专一性进行的实验的结果。用电泳分离MDA-MB-231膜并将其如所述转移至PVDF膜。用H460-16-2(板A)、抗CD44(克隆178，BD Biosciences；板B)、抗CD44var6(克隆VFF-7，Bender Medsystems(San Bruno，CA)；板C)以及抗CD44varlO(克隆VFF-14，BenderMedsystems；图D)对膜作探针。H460-16-2和L178与80-90kD和120-150kD蛋白反 应，且在Western印记中具有相同的结合模式。作为对比，对CD44变体6和10具有专一性的抗体呈现了与H460-16-2不同且彼此不同的结合。两种变体抗体与更广泛的蛋白结合，且没有显示与胶的80kD区域的强结合。因此H460-16-2靶向变体6或10不太可能。 
质谱的识别以及使用已知抗体的确认显示H460-16-2的抗原是CD44的一种形式。这和实施例2中的去糖基化实验也是一致的，因为CD44可能包含质量比大约为50％的N-连接糖。这些实验也暗示H460-16-2与CD44的糖依赖性抗原决定簇结合。 
实施例4
根据布达佩斯条约，小鼠杂交瘤细胞系H460-16-2在2002年9月4日保藏于美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，弗吉尼亚马纳萨斯大学大街10801，20110-2209，其保藏号为PTA-4621。根据37CFR1.808，保藏者保证在专利授权后将永久取消被保藏材料在公众使用方面的所有限制。 
抗体制备： 
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)里培养杂交瘤制备H460-16-2单克隆抗体，每周两次进行收集和重新接种以及Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)的标准抗体纯化步骤。使用人的、人源化的、嵌合的或小鼠的单克隆抗体在本发明的范围内。在细胞毒性分析中将H460-16-2与一些阳性(抗Fas(EOS9.1，IgM，κ，10μg/mL，eBioscience；San Diego，CA)、抗H er2/neu(IgG1，κ，10μg/mL，Inter Medico；Markham，ON)、抗EGFR(C225，IgG1，κ，5μg/mL，Cedarlane；Hornby，ON)、环己酰亚胺(100μM，Sigma；Oakville，ON)，NaN3(0.1％，Sigma；Oakville，ON))和阴性(107.3(抗TNP，IgGl，κ，20μg/mL，BD Biosciences；Oakville，ON)、G155-178 (抗TNP，IgG2a，κ，20μg/mL，BD Biosciences；Oakville，ON)、MPC-11(抗原专一性未知，IgG2b，κ，20，μg/mL，BD Biosciences；Oakville，ON)、J606(抗聚果糖，IgG3，κ，20μg/mL，BD Biosciences；Oakville，ON)、IgG缓冲液(2％))对照进行了比较(表3)。乳腺癌(MB-231、MB-468)、黑素瘤(A2058、A375)、结肠癌(HT-29)、肺癌(NCI-H460、A549)、卵巢癌(OVCAR-3)、前列腺癌(PC-3)和非癌(CCD-27sk、Hs578.Bst、Hs888.Lu)细胞系被用于测试(全部来自ATCC，马纳萨斯，VA)。活/死细胞毒性分析据自Molecular Probes(Eugene，OR)。根据生产商指导以及以下列举的变化进行分析。在分析前以事先确定的合适的细胞密度将细胞分板。2天后，将100μl纯化的抗体稀释在培养基中并随后转移至细胞培养板中并在5％CO2培养箱中培养5天。通过倾倒和吸干将板清空。用多通道洗瓶将含有MgCl2和CaCl2的室温DPBS分配至各孔中，轻敲3次，通过倾倒和吸干将板清空。在各孔中加入50μl稀释于含有MgCl2和CaCl2的DPBS中的荧光活/死染料并于37℃在5％CO2培养箱中培养30分钟。在Perkin-Elmer HTS7000荧光平板读取器中读取板的读数，数据用Microsoft Excel进行分析并将结果制成表2。数据代表了4个实验3次重复的平均值并用以下方式定性表示：4/4实验结果均大于极限细胞毒性(+++)，3/4实验大于极限细胞毒性(++)，2/4实验大于极限细胞毒性(+)。表2中未标记的细胞表示不一致的或小于极限细胞毒性的反应。H460-16-2抗体在A2058黑素瘤和MB-231乳腺癌细胞中产生选择性细胞毒性，而对剩下的癌细胞没有产生细胞毒性，说明其对癌细胞的专一性细胞毒性的性质。重要地，分离出的抗体对一些非癌细胞如CCD-27sk、Hs578.Bst或Hs888.Lu没有毒性。化学细胞毒性试剂诱导了它们预期的细胞毒性而考虑到生物细胞实验的局限性，使用的其它几个抗体同样实现了预期的效应。 
Figure GDA00002041915900321
制备用于FACS的细胞时，首先用DPBS(不含Ca++和Mg++)洗涤单层细胞。随后在37℃使用细胞消化液(Invitrogen)将细胞从细胞培养板上解离。在经过离心和收集后，用含有MgCl2、CaCl2和25％胎牛血清的DPBS(洗涤培养基)在4℃将细胞重悬并计数、分至合适的细胞密度、离心沉淀细胞并将细胞重悬于含有20μg/ml测试抗体(H460-16-2)或对照抗体(同型对照、抗Her2/neu或抗EGFR)的染色培养基(含有MgCl2和CaCl2和2％胎牛血清的DPBS)中，在冰上放置30分钟。在加入Alexa Fluor 488-偶联次级抗体之前，用洗涤培养基洗涤细胞一次。随后将染色培养基中的Alexa Fluor 488-偶联抗体加入20分钟。最后一次洗涤细胞并将其重悬于含有1μg/ml的碘化丙啶的染色培养基中。使用CellQuest软件(BD Biosciences)在FACScan上运行样品进行细胞的流式细胞计数分析。通过调节FSC和SSC检测仪的电压和振幅增益设置细胞的前散射光(FSC)和侧散射光(SSC)。运行用纯的同型对照抗体及随后用Alexa Fluor 488-偶联次级抗体染色的细胞对3个荧光通道(FL1、FL2和FL3)的检测仪进行校准使得细胞具有均一的峰且荧光强度的中值大约为1-5个单位。通过FSC选通和碘化丙啶排除获得活细胞。对于每个样品，大约获得10,000个活细胞用于分析，分析结果在表3中呈现。 
表3中列出了超过同型对照的平均荧光强度增加倍数且定性地表示如下：小于5(-)；5到50(+)；50到100(++)； 
表3：FACS分析 
100以上(+++)；括号中是染色细胞的百分比。H460-16-2抗体的典型直方图在图9中呈现且证明了结合的特征，包括在某些情况下的双峰。H460-16-2对一些癌细胞类型包括黑素瘤和乳腺癌细胞的结合超过同型对照100倍；对肺、结肠、前列腺和卵巢癌细胞的结合是同型对照的5-100倍。存在H460-16-2抗体与非癌细胞的结合，但是这样的结合不产生细胞毒性。这是证据说明结合不必然预示着抗体与其同类抗原连接的结果，这是一个非显而易见的发现。这暗示在不同细胞中抗体连接的背景而非仅仅抗体结合是细胞毒性的决定因素。 
实施例5
正常人组织染色 
此前进行了IHC研究用于表征H460-16-2在人体中的分布(S.N.10/603,000)。目前的研究将H460-16-2和靶向CD44的抗体(L178)进行比较，因为如此前生化方法确定的，H460-16-2抗原可能是CD44标准形式的一种癌症变体。使用人正常器官组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)进行抗体与59个正常人组织的结合。所有的初级抗体(H460-16-2；L178抗CD44(也被认作抗HCAM，BD PharMingen，Oakville，ON)；和小鼠IgG1阴性对照(Dako，Toronto，ON))在抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，ON)中稀释至5μg/ml的浓度(在此前的优化步骤中被发现是最优浓度)。阴性对照抗体已由生产商显示对所有哺乳动物组织呈阴性。IHC步骤如下。 
组织切片在58℃烘箱中干燥1小时脱腊，通过将切片5次浸泡于 Coplin罐中的二甲苯进行脱腊，每次浸泡4分钟。在经过一系列梯度乙醇清洗(100％-75％)处理后，切片在水中重新水合。将载玻片浸泡于pH 6的10mM柠檬酸盐缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)中，随后用高、中、低强度的微波分别照射载玻片5分钟并最终将其浸没在冷的PBS中。随后将载玻片浸没在3％的过氧化氢溶液中6分钟，用PBS 冲洗3次，每次5分钟，干燥，在室温将载玻片用Universal封闭液(Dako，Toronto，Ontario)孵育5分钟。用抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)将H460-16-2、L178或同型对照抗体(靶向黑曲霉葡萄糖氧化酶的抗体，该酶在哺乳动物组织中不存在或无法诱导，Dako，Toronto，Ontario)稀释至工作浓度(每种抗体5μg/ml)并在室温放置1小时。用PBS冲洗载玻片3次，每次5分钟。通过与提供的HRP偶联次级抗体(Dako Envision System，Toronto，Ontario)在室温放置30分钟观察/显现初级抗体的免疫活性。在该步骤之后用PBS冲洗载玻片3次，每次5分钟，随后加入用于免疫过氧化物酶染色的DAB(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸，Dako，Toronto，Ontario)显色底物溶液在室温放置10分钟进行显色反应。用自来水冲洗载玻片中止显色反应。用Meyer’s苏木精(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)复染后，载玻片用梯度乙醇(75-100％)脱水并用二甲苯清洗。用封片胶(Dako Faramount，Toronto，Ontario)在载玻片上盖上盖玻片。使用Axiovert 200(Zeiss Canada，Toronto，ON)对载玻片进行显微观察，使用Northern Eclipse成像软件(Mississauga，ON)获取并存储数字图像。由病理学家对结果进行读取、评分和解释。 
表4呈现了H460-16-2和L178抗CD44对正常人组织阵列染色的结果的总结。用H460-16-2对组织的染色与此前说明的很相似(S.N.10/603,000)。应当再一次注意到该抗原在要害器官的细胞上一般不存在，包括肝、肾、心脏和肺。H460-16-2抗体与巨噬细胞和淋巴细胞结 合，在这些切片中在某些器官观察到它们的存在。然而，L178抗CD44具有更广泛的分布和对淋巴细胞更强的染色(图10)。 
对H460-16-2阳性的组织通常对L178抗CD44也是阳性的(有时强度更大)。对H460-16-2阴性的组织通常也是L178抗CD44阴性的，尽管存在一些例外，如肝的一个样品(图11)和食道。这些结果说明H460-16-2与L178抗CD44抗体识别的组织中的一个略小的子集结合且在组织中其染色的强度有时也是略弱的。这些结果显示H460-16-2抗原没有广泛表达在正常组织上，且该抗体与人体中有限数量的组织专一性地结合。该结果还支持生化数据，因为H460-16-2靶向CD44的抗原决定簇，尽管它是靶向与这些IHC研究中使用的L178识别的抗原决定簇有微弱不同的变体。 
表4；人正常组织上L178抗CD44和H460-16-2的IHC比较 
缩写：*：原始着色的基底层；**：内源性细胞质色素/背景染色；***：胃窦(不是胃体)；****：仅为卵巢基质；SMF：平滑肌纤维，NR：切片没有代表性；CS：切片完全脱落，PS：切片部分脱落。 
  切片号   器官   抗CD44   H460-16-2   同型对照
  1   *皮肤   +++所有表皮层的角质细胞、成纤维细胞、血管的SMF   ++所有表皮层的角质细胞、成纤维细胞   -
  2   *皮肤   +++所有表皮层的角质细胞，成纤维细胞   ++所有表皮层的角质细胞、成纤维细胞   -
  3   皮下脂肪   -   -   -
  4   乳腺   +/导管上皮、肌上皮&成纤维细胞   +肌上皮   -
  5   乳腺   ++肌上皮&成纤维细胞   +++肌上皮&成纤维细胞   -
  6   脾   +++主要在动脉周围区域的淋巴细胞   ++主要在动脉周围区域的淋巴细胞   -
  7   脾   +++主要在动脉周围区域的淋巴细胞   +++主要在动脉周围区域的淋巴细胞   -
  8   淋巴结   +++淋巴细胞   +淋巴细胞   -
  9   淋巴结   -   -   -
  10   骨骼肌   +/-血管   +/-血管   -
  11   鼻腔   -NR   CS   CS
  12   肺   +++巨噬细胞&成纤维细胞   ++巨噬细胞   -
  13   肺   +++肺泡细胞、淋巴细胞&巨噬细胞   +++淋巴细胞&巨噬细胞   -
  14   支气管   -NR   -NR   -NR
  15   心脏   **-   **-   **-
  16   唾液腺   +++腺泡&导管上皮、+外周神经   ++腺泡&导管上皮、+外周神经   -
  17   肝   +++Kupffer细胞   +++Kupffer细胞   -
  18   肝   +++Kupffer细胞   +++Kupffer细胞   -
  19   肝   ++Kupffer细胞   -   -
  20   胆囊   +++粘膜上皮、淋巴细胞、成纤维细胞&SMF   +粘膜上皮、+++淋巴细胞   -
  21   胰腺   +腺泡上皮   +腺泡上皮   -
  22   胰腺   +++腺泡上皮   ++腺泡上皮   -
  23   扁桃腺   +++淋巴结的所有淋巴细胞   ++主要在套膜区的淋巴细胞   -
  24   食道   +基底层的鳞状上皮、成纤维细胞   -   -
  25   食道   +++基底层的鳞状上皮&成纤维细胞   +++基底层的鳞状上皮&成纤维细胞   -
  26   ***胃体   +++腺体基底部分的消化腺上皮&淋巴细胞   ++腺体基底部分的消化腺上皮、+++淋巴细胞   -
  27   ***胃体   +++腺体基底部分的消化腺上皮&淋巴细胞   +/-腺体基底部分的消化腺上皮、+++淋巴细胞   -
  28   胃窦   +++淋巴细胞&成纤维细胞   +++淋巴细胞&成纤维细胞   -
  29   胃平滑肌   ++血管&成纤维细胞   ++血管&成纤维细胞   -
  30   十二指肠   +++腺体深部的腺上皮&淋巴细胞   +/-腺体深部的腺上皮、++淋巴细胞   -
  31   小肠   +/-腺体深部的腺上皮、+++固有层的淋巴细胞   ++固有层的淋巴细胞   -
  32   小肠   +++主要在套膜区的淋巴细胞   +++主要在套膜区的淋巴细胞   -
  33   阑尾   ++腺上皮、+++淋巴细胞   +/-粘膜上皮、+++淋巴细胞   -
  34   结肠   +/-腺上皮、+++淋巴细胞、SMF&神经节细胞   +++淋巴细胞   -
  35   结肠   +++淋巴细胞、神经节细胞&血管内皮细胞   +++固有层&淋巴结套膜区的淋巴细胞   -
  36   直肠   +++淋巴细胞&成纤维细胞   +++淋巴细胞&成纤维细胞   -
  37   肾皮质   ++血管内皮细胞&肾间质成纤维细胞   +/-肾间质成纤维细胞   -
  38   肾皮质   +/-管状上皮&肾间质成纤维细胞   +/-管状上皮&肾间质成纤维细胞   -
  39   肾髓质   +SMF&成纤维细胞   +/-SMF&成纤维细胞   -
  40   膀胱   +++表面移行性上皮、淋巴细胞&巨噬细胞   +/-移行性上皮、++淋巴细胞&巨噬细胞   -
  41   前列腺   +++肌上皮   +/-管状上皮、+++肌上皮   -
  42   前列腺   +++肌上皮&成纤维细胞   ++肌上皮   -
  43   精囊腺   +/-粘膜上皮、++外肌层的外部纵向SMF   +/-粘膜上皮、++外肌层的外部纵向SMF   -
  44   睾丸   +/-间质血管&成纤维细胞   +/-间质成纤维细胞   -
  45   子宫内膜，生殖的   +++基质成纤维细胞   ++基质成纤维细胞   -
  46   子宫内膜，分泌的   +++腺上皮&基质   ++腺上皮&基质   -
  47   子宫肌层   +++SMF&成纤维细胞   +++SMF   -
  48   子宫颈   +++深层的鳞状上皮&成纤维细胞   +++深层的鳞状上皮&成纤维细胞   -
  49   输卵管   +成纤维细胞&SMF   +成纤维细胞&SMF   -
  50   ***卵巢   +/血管的SMF   +/-血管的SMF   -
  51   胎盘绒毛   ++血管内皮   ++血管内皮   -
  52   胎盘绒毛   ++血管内皮   +/-成纤维细胞   -
  53   脐带   -   -   -
  54   肾上腺   **+/-   **+/-   **+/-
  55   甲状腺   +/-血管&滤泡旁细胞   +/-血管&滤泡旁细胞   -
  56   胸腺   +淋巴细胞   +/-淋巴细胞   -PS
  57   脑白质   -   -   -
  58   脑灰质   -   -   -
  59   小脑   -   -   -
实施例6
人乳腺肿瘤组织染色 
此前进行了IHC研究以确定H460-16-2抗原与人乳腺癌的癌症相关性以及H460-16-2是否可能识别人体癌症(S.N.10/603,000)。目前，对L178抗CD44染色和靶向一种哺乳动物组织中不存在或无法诱导的酶，黑曲霉葡萄糖氧化酶的抗体(阴性对照)进行比较。使用了乳腺癌组织阵列(Imgenex Corporation，San Diego，CA)，该阵列衍生自50名乳腺癌患者和来自乳腺癌患者的非肿瘤乳腺组织的9个样品。为各患者提供了以下信息：年龄、性别、美国癌症联合委员会(AJCC)肿瘤阶段、淋巴结、雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)状况。遵照实施例5中的IHC步骤。所有抗体在5μg/ml的工作浓度下使用。 
表5和6分别提供了H460-16-2和L178抗CD44抗体对乳腺癌组织阵列染色的总结。各阵列包含来自50名个体患者的肿瘤组织。总体上，相比于CD44的76％，测试的50名患者中的62％是H460-16-2抗原阳性的。在H460-16-2和L178抗CD44同时对相同的组织发生染色的情形中，43％的样品的L178抗CD44染色强度高于H460-16-2。对于H460-16-2和CD44抗原，乳腺癌患者的10个正常乳腺组织样品中分别仅有4例和6例呈阳性。在雌激素和孕酮受体状态之间没有明显的相关性。也没有出现更高肿瘤阶段具有H460-16-2和CD44抗原的更高阳性表达的趋势。 
表5：H460-16-2的人乳腺肿瘤IHC总结 
Figure GDA00002041915900381
表6：抗CD44(L178)的人乳腺肿瘤IHC总结 
Figure GDA00002041915900382
如图12中所示，和正常细胞相比，H460-16-2染色对癌细胞是专一性的，图12中基质细胞明显阴性且恶性细胞层是高度阳性的。观察到的H460-16-2抗原的细胞定位模式在大多数情况下局限在细胞膜。L 178CD44抗体对更多的乳腺癌样品发生染色且和H460-16-2相比显示了细胞膜相对于细胞质更高程度的定位(表7)。L178抗CD44还对帕哲氏疾病的恶性细胞发生染色，而H460-16-2没有染色(图13)。L178抗CD44对H460-16-2染色的乳腺癌患者的正常组织的相同样品进行了染色(还多了一例H460-16-2样品中部分脱落的样品)。这些结果暗示H460-16-2抗原可能被大约三分之二的乳腺癌患者表达。染色模式显示在患者样品中，抗体对恶性细胞是高度专一性的，且 H460-16-2抗原定位在细胞膜由此使其成为吸引人的可制药靶点。H460-16-2相对于L178抗CD44抗体的相似但更局限的染色再一次说明H460-16-2抗原决定簇是CD44更局限的变体的可能性。 
  切片号   性别   年龄   诊断   抗CD44   H460-16-2   同型对照
  1   女   28   浸润型导管癌   +/-   +/-   -
  2   女   71   实体乳头状癌   ++M   +/-   -
  3   女   26   浸润型导管癌   +/-   -   -
  4   女   43   浸润型导管癌   +/-   -   -
  5   女   39   浸润型导管癌   +/-   +/-肿瘤&坏死区   -
  6   女   46   原位导管癌   +/-   -   -
    女   47   浸润型导管癌   +++M   +++M   -
  8   男   67   浸润型导管癌   -肿瘤，+仅基质   -   -
  9   女   33   浸润型导管癌   -肿瘤，++仅基质   -肿瘤，++基质   -
  10   女   47   浸润型导管癌   +/-   +/-   -
  11   女   49   入侵型小叶癌   -肿瘤，++浸润型淋巴细胞   -   -
  12   女   46   浸润型导管癌   ++M   +/-   -
  13   女   39   浸润型导管癌   +/-   -   -
  14   女   43   浸润型导管癌   +MC   +/-   -
  15   女   54   浸润型导管癌   -肿瘤，+基质   +/-   -
  16   女   58   浸润型导管癌   ++M肿瘤，+++基质   +MC肿瘤，++坏死区   -
  17   女   37   浸润型导管癌   -肿瘤，+基质   +/-   -
  18   女   43   浸润型导管癌   ++M肿瘤，+++基质   +MC肿瘤，+++基质   -
  19   女   51   浸润型导管癌   +++M   ++M   -
  20   女   80   髓样癌   +++M   +++MC   -
  21   女   36   浸润型导管癌   +++M   +++M   -
  22   女   59   浸润型导管癌   +/-肿瘤，++基质   +/-肿瘤，++基质   -
  23   女   34   原位导管癌   +/-   +/-肿瘤&坏死区   -
  24   女   54   浸润型导管癌   +/-   +/-   -
  25   女   47   浸润型导管癌   +++M   +/-   -
  26   女   53   浸润型导管癌   +肿瘤，+++基质   +肿瘤，++基质   -
  27   女   59   浸润型导管癌   +/肿瘤，+++淋巴细胞   +/-肿瘤，+++淋巴细胞   -
  28   女   60   印戒细胞癌   -肿瘤，+/-基质   -   -
  29   女   37   浸润型导管癌   +/-   +/-   -
  30   女   46   浸润型导管癌   ++肿瘤，+++浸润型淋巴细胞   +/-肿瘤&基质   -
  31   女   35   浸润型导管癌   +/-   -   -
  32   女   47   浸润型导管癌   -肿瘤，++坏死细胞   -肿瘤，+/-坏死细胞   -
  33   女   54   浸润型导管癌   +/-肿瘤&基质   -   -
  34   女   47   浸润型导管癌   +++M   +++M   -
  35   女   41   浸润型导管癌   -   -   -
  36   女   38   浸润型导管癌   ++M   +/-   -
  37   女   55   浸润型导管癌   -肿瘤，+/-基质   -   -
  38   女   65   浸润型导管癌   -肿瘤，++基质   +/-基质   -
  39   男   66   浸润型导管癌   -   -   -
  40   女   44   浸润型导管癌   +/-   -肿瘤，+浸润型淋巴细胞   -
  41   女   52   淋巴结转移型癌   +/-肿瘤，+++浸润型淋巴细胞   +/-肿瘤&基质   -
  42   女   32   淋巴结转移型癌   +/-   -   -
  43   女   58   淋巴结转移型癌   ++M   +MC   -
  44   女   52   淋巴结转移型癌   -   -   -
  45   女   58   淋巴结转移型癌   +/-   +/-   -
  46   女   38   淋巴结转移型癌   +/肿瘤，+++浸润型淋巴细胞   -肿瘤，+淋巴细胞   -
  47   女   45   淋巴结转移型癌   +++M   +MC   -
  48   女   45   淋巴结转移型癌   +M   +/-   -
  49   女   29   淋巴结转移型癌   +++M   +++M   -
  50   女   61   淋巴结转移型癌   +/-肿瘤，++基质   +/-肿瘤，++基质   -
  *51   女   46   乳头癌   +++角化细胞   ++角化细胞   -
  *52   女   47   乳头癌   +/-肿瘤细胞   -   -
  *53   女   40   正常乳腺   -   -   -
  *54   女   43   正常乳腺   ++肌上皮   ++肌上皮   -
  *55   女   40   正常乳腺   ++肌上皮   ++肌上皮   -
  *56   女   40   正常乳腺   +++肌上皮&成纤维细胞   +/-肌上皮&成纤维细胞   -
  *57   女   45   正常乳腺   -   -   -
  *58   女   44   正常乳腺   -   -   -
  *59   女   37   正常乳腺   -   -   -
  60   女   51   正常乳腺   ++E62上皮&成纤维细胞   -PS   -
表7：人肿瘤和正常乳腺组织上的L178抗CD44和H460-16-2的IHC比较 
缩写：*：乳腺癌患者的非肿瘤乳腺组织，PS：切片部分脱落；M：细胞膜染色；C：细胞质染色。 
实施例7
人肿瘤组织染色 
为确定H460-16-2抗原是否在除了乳腺癌以外的其它人癌症组织上表达，此前在多种人肿瘤组织阵列上使用了H460-16-2(S.N.10/603,000；Imgenex，San Diego，CA)。在进一步的研究中，将H460-16-2的染色模式和L178抗CD44进行了比较。为各患者提供了以下信息：年龄、性别、器官和诊断。使用的染色步骤和实施例5中概述的步骤相同。使用了与人乳腺肿瘤组织阵列中所述的相同的阴性对照抗体。所有抗体在5μg/mL的工作浓度下使用。 
如表8中罗列的，H460-16-2对乳腺以外的一些不同的人癌症发生染色，该结果与此前说明的结果一致(S.N.10/603,000)。如同乳腺癌中观察到的，H460-16-2染色定位在细胞膜上(图14)且在一些癌症中也定位在癌细胞的细胞质中。L178抗CD44抗体具有较细胞质染色更强的细胞膜染色且再一次地比H460-16-2中观察到的具有更高比例的肿瘤组织染色阳性和更高的染色强度(图15)。 
  切片号   年龄   性别   器官   诊断   抗CD44   H460-16-2   同型对照
  1   59   男   皮肤   恶性黑素瘤   +++M   +++M   -
  2   25   女   皮肤   SSC   +/-   -   -
  3   50   女   乳腺   浸润型导管癌   +++肿瘤&基质   +肿瘤，+++基质   -
  4   57   女   乳腺   入侵型乳头状癌   +/-肿瘤&基质   +/-肿瘤&基质   -
  5   35   女   乳腺   浸润型小叶癌   +M   +/-   -
  6   40   男   淋巴结   恶性淋巴瘤，immunoplastic   +++M   +++M   -
  7   58   男   淋巴结   来自胃的转移型腺癌   +++M   +/-   -
  8   53   女   骨   骨肉瘤   +++M   +M/C   -
  9   26   男   骨   巨细胞肿瘤   ++M   +M/C   -
  10   40   男   骨   软骨肉瘤   CS   CS   CS
  11   51   女   软组织   脂肪肉瘤   -   -   -
  12   47   女   软组织   神经纤维瘤   ++M/C   +M/C   -
  13   74   男   鼻腔   内翻性乳头状癌   +++M   ++M   -
  14   57   男   喉   SCC   +++M   +++M   -
  15   60   男   肺   腺癌   +++M   +/-   -
  16   51   女   肺   SCC   +++M   +++M/C   -
  17   68   女   肺   腺癌   ++M   +/-   -
  18   60   男   肺   小细胞癌   +/-坏死区   +/-   -
  19   88   女   舌   SCC   +++M   +++M   -*
  20   34   女   腮腺   多型性腺瘤   ++M/C   -   -
  21   50   女   腮腺   华生氏瘤   +++M/C   +++M/C   -
  22   40   女   腮腺   多型性腺瘤   +++M   ++M/C   -
  23   56   男   颌下腺   唾液导管瘤   +/-   -   -
  24   69   男   肝   胆管细胞肝癌   +/-肿瘤，++基质   +/-   -
  25   51   男   肝   转移型胃癌   -肿瘤，+++坏死区   -   -
  26   64   女   肝   HCC   +/-肿瘤，++胞外分泌物   +/-肿瘤，++胞外分泌物   -
  27   62   女   胆囊   腺癌   +++肿瘤   ++肿瘤&淋巴细胞   -
  28   64   女   胰腺   腺癌   ++M   ++M/C   -
  29   68   男   食道   SCC   ++M   +/-   -
  30   73   男   胃   腺癌，弱分化的   +/-肿瘤，++基质   +M/C肿瘤&基质   -
  31   63   男   胃   腺癌，中度分化的   +/-肿瘤，+++浸润型淋巴细胞   ++M/C   -
  32   59   女   胃   印戒细胞癌   +++M   ++M/C   -
  33   62   男   胃   恶性淋巴瘤   +++M   +++M/C   -*
  34   51   男   胃   交界性胃瘤   +/-基质   -   -
  35   42   男   小肠   恶性胃瘤   ++M   -   -
  36   52   女   阑尾   pseuomyxomaperitonia   PS，+++浸润型淋巴细胞   -   -
  37   53   男   结肠   腺癌   +M/C肿瘤&基质   +M/C   -
  38   67   男   直肠   腺癌   +/-   ++M   -
  39   75   女   肾   移行细胞癌   ++M   +M/C   -
  40   54   女   肾   肾细胞癌   +++M   +/-   -
  41   75   女   肾   肾细胞癌   +/-   +/-   -
  42   65   男   膀胱   弱分化癌   +++浸润型淋巴细胞   ++M/C   -
  43   67   男   膀胱   移行细胞癌，高度   +/-基质   -   -
  44   62   男   前列腺   腺癌   +++M   +++M   -*
  45   30   男   睾丸   精母细胞瘤   +/-肿瘤，+++基质   +/-   -
  46   68   女   子宫   子宫内膜腺癌   ++主要是基质   ++主要是基质   -
  47   57   女   子宫   leimyosacoma   ++C   +PS   -
  48   45   女   子宫   平滑肌瘤   ++C   +C   -
  49   63   女   子宫颈   SCC   +++M   +++M   -
  50   12   女   卵巢   内胚窦瘤   +/-   -   -
  51   33   女   卵巢   粘液腺癌   +M/C   -   -
  52   70   女   卵巢   纤维卵巢膜瘤   -   -   -
  53   67   女   肾上腺   皮质癌   -   -   -*
  54   61   女   肾上腺   pheohromcytoma   -   -   -
  55   54   男   甲状腺   乳头状癌   ++M   ++M/C   -
  56   58   女   甲状腺   最小入侵性滤泡癌   +++M   ++M   -
  57   74   男   胸腺   胸腺瘤   ++MC   +/-   -
  58   66   女   脑   脑膜瘤   +/-   -   -
  59   62   男   脑   多形性恶性胶质瘤   +++M   +++M   -
表8：在多种人肿瘤类型上L178抗CD44和H460-16-2的IHC的比较 
缩写：M：细胞膜染色，C：细胞质染色，*：背景染色，CS：切片完全脱落，PS：切片部分脱落，F：切片被折叠，SSC：鳞状细胞癌，HCC：肝细胞癌。 
因此，似乎H460-16-2抗原不仅在乳腺癌的细胞膜上发现而且在各种肿瘤类型的细胞膜上发现。这些结果说明在除了乳腺以外的广泛的肿瘤类型中具有作为治疗药物的潜力。再一次地，和L178抗CD44相比相似但不同的染色模式暗示H460-16-2识别存在于CD44变体上的抗原决定簇。 
绝大多数的证据显示H460-16-2通过与CD44变体上的糖依赖性构象抗原决定簇的连接介导抗癌效应。在实施例3中已经显示，H460-16-2抗体可被用于从诸如MB-231细胞的表达细胞上免疫沉淀其同类抗原。进一步地，可以显示H460-16-2抗体可被用于检测表达与该抗体专一性结合的CD44抗原性基序的细胞和/或组织，使用列举的但不限于FACS、细胞ELISA或IHC的技术。 
因此，可以显示使用如FACS、细胞ELISA或IHC分析，免疫沉淀的H460-16-2抗原可以抑制H460-16-2与这些细胞或组织的结合。进一步地，如同H460-16-2抗体，其它抗CD44抗体可被用于免疫沉淀和分离其它形式的CD44抗原，且使用相同类型的分析，这些抗原可被用于抑制这些抗体与表达这些抗原的细胞或组织的结合。还可以显示如果使用能够识别CD44的所有形式的抗CD44抗体(即全CD44抗体)分离其同类抗原，那么该抗原也可以抑制H460-16-2抗原与表达该抗原的细胞或组织的结合，由此也证明H460-16-2与表达该抗原的细胞和组织上的CD44的抗原决定簇的结合。可替换地，在分析如竞争性结合实验、ELISA、细胞ELISA、FACS等两种抗体均存在的分析中进行H460-16-2和全CD44抗体的比较也能证明H460-16-2与表达抗原的细胞和组织上的CD44的抗原决定簇结合。 
本说明书中的所有专利和公开物对于本发明所属技术领域的技术人员具有说明性。所有的专利和公开物在此以相同程度被参考引用，就如同各独立的公开物被专门且个别地说明在此参考引用一样。 
应当明白的是尽管说明了本发明的特定形式，发明不限于在此描述和显示的特定形式或各部分的排列。对于本领域的技术人员而言，显然可以在不背离本发明的范围的情况下进行各种修改，并且不应当认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。本领域的技术人员将容易地认识到当前发明非常适于实现目标并获得所述的及发明本身所固有的结果和益处。在此描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物学相关化合物、方法、步骤和技术是当前优选具体实施方式的代表，可以被效仿而不应对范围发生限制。遵照本发明的精神和所附权利要求书的范围定义，本领域技术人员可以对发明进行修改和其它使用。虽然本发明结合特定的优选具体实施方式进行了说明，应当明白如同权利要求的一样，发明不应不恰当地受到这些特定具体实施方式的限制。事实上，对于本领域的技术人员显而易见的对实现此发明的上述模式的各种修改都应该包含在随后的权利要求书的范围内。 

Claims (13)

1.保藏于ATCC的保藏号为PTA-4621的克隆编码的单克隆抗体用于体外鉴定表达CD44抗原部分的细胞的应用，其中所述抗原部分特征在于被具有所述单克隆抗体的鉴定特征的抗体所结合。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述CD44是人CD44。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述人CD44是具有NCBI登录号gi|2134882的CD44。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中所述细胞是肿瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其中所述肿瘤细胞是皮肤、乳腺、淋巴结、骨、软组织、鼻腔、喉、肺、舌、腮腺、肝、胆囊、胰腺、食管、胃、结肠、直肠、肾、膀胱、前列腺、睾丸、子宫、子宫颈、甲状腺、胸腺或脑细胞。
6.由保藏于ATCC的保藏号为PTA-4621的克隆编码的单克隆抗体在制备用于鉴定对由保藏于ATCC的保藏号为PTA-4621的克隆编码的单克隆抗体的细胞毒性敏感的人肿瘤细胞的试剂中的应用，其中表达CD44的人肿瘤通过使用由保藏于ATCC的保藏号为PTA-4621的克隆编码的单克隆抗体鉴定。
7.根据权利要求6所述的应用，其中所述CD44是具有NCBI登录号gi|2134882的CD44。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其中所述肿瘤是皮肤、乳腺、淋巴结、骨、软组织、鼻腔、喉、肺、舌、腮腺、肝、胆囊、胰、食管、胃、结肠、直肠、肾、膀胱、前列腺、睾丸、子宫、子宫颈、甲状腺、胸腺或脑肿瘤。
9.确定表达CD44抗原部分的人细胞的存在的测定法，其包括：
提供由保藏于ATCC的PTA-4621的克隆编码的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段；
将所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样品接触；和
确定所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样品的结合；
由此确定表达CD44抗原部分的细胞的存在，
其中所述抗原部分特征在于被具有所述单克隆抗体的鉴定特征的抗体所结合。
10.根据权利要求9所述的测定法，其中所述CD44是人CD44。
11.根据权利要求10所述的测定法，其中所述人CD44是具有NCBI登录号gi|2134882的CD44。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的测定法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
13.根据权利要求12所述的测定法，其中所述肿瘤细胞是皮肤、乳腺、淋巴结、骨、软组织、鼻腔、喉、肺、舌、腮腺、肝、胆囊、胰、食管、胃、结肠、直肠、肾、膀胱、前列腺、睾丸、子宫、子宫颈、甲状腺、胸腺或脑细胞。
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