CN101389658A - 显示cd59表面表达的细胞的细胞毒性介导 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，尤其涉及显示CD59表面表达的肿瘤细胞的细胞毒性的介导；最尤其涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)作为起始细胞毒性反应的手段的用途，所述CDMAB任选地与一种或者多种化疗剂联用。本发明还涉及利用本发明CDMAB的结合分析。

Description

显示CD59表面表达的细胞的细胞毒性介导
发明领域
本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，尤其涉及肿瘤细胞的细胞毒性的介导；最尤其涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)作为起始细胞毒性反应的手段的用途，所述CDMAB任选地与一种或者多种化疗剂联用。本发明还涉及利用本发明CDMAB的结合分析。
发明背景
CD59是18-20 kDa糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的膜糖蛋白。它最初分离自人红细胞表面，作为补体激活的抑制剂。随后发现数种抗体以CD59作为靶标，所述抗体被制备用于增强补体-介导的裂解。它们各自独立的制备导致CD59的多种名称，包括MEM-43抗原、反应性裂解的膜抑制剂(MIRL)、H19、膜攻击复合物-抑制因子(MACIF)、分子量20,000的同源限制因子(HRF20)和保护素(Walsh，Tone et al.，1992)。
已经通过氨基酸分析和NMR对CD59抗原进行了充分表征。它由128个氨基酸组成，其中前25个包括信号序列。存在10个半胱氨酸残基，这造成紧密折叠的分子。已知18位的天门冬酰胺残基是N-糖基化的，而77位的天门冬酰胺残基与GPI锚定蛋白连接。C端残基表现出GPI-锚定蛋白的特点(Davies和Lachmann 1993)。
最初在人红细胞表面发现了CD59，但CD59是广泛表达的分子。从流式细胞术、免疫组织化学和Northern印迹分析收集的关于细胞分布的大量资料显示在许多类型的细胞和组织中的表达，包括造血细胞，例如，血小板，白细胞和成纤维细胞，以及红细胞(Meri，Waldmann et al.，1991)。在遍及身体的血管和导管内皮中CD59是丰富的，尤其在肾，支气管，胰腺，皮肤表皮以及胆腺和唾液腺中(Meri，Waldmann et al.，1991)。肺，肝，胎盘，甲状腺和精子中已经显示有表达(Davies和Lachmann 1993)。在唾液，尿液，泪，汗，脑脊液，母乳，羊水和精液浆中已经检测到CD59的可溶形式(Davies和Lachmann 1993)。可溶性CD59的起源还有待于确定；它是否是分泌的、是否通过磷脂酶切割或者通过其他方式从细胞脱落仍然是未知的(Davies和Lachmann 1993)。看起来在许多B细胞株，CNS组织，肝实质和朗格汉斯胰岛中都没有CD59(Meri，Waldmann et al.，1991)。
尽管CD59在正常细胞和组织中广泛表达，它还在恶性肿瘤中广泛表达。有证据表明与正常组织相比，在某些类型的癌症中CD59的表达增加，并且表达水平与肿瘤的分化阶段有关。在甲状腺，前列腺，乳房，卵巢，肺，结肠直肠，胰腺，胃，肾和皮肤癌以及恶性神经胶质瘤，白血病和淋巴瘤中已经报道了中等到高水平的CD59表达(Fishelson，Doninet al.，2003)。
已知CD59抑制补体激活后的膜攻击复合物(MAC)形成。MAC形成是补体级联的最终事件之一，在细胞膜上形成小孔，这最终导致细胞的破坏。CD59结合C5b-8，干扰C9分子的后续聚合和MAC形成。其他补体抑制蛋白例如1型补体受体(CR1；CD35)，膜辅助因子蛋白(MCP；CD46)和衰变加速因子(DAF；CD55)在补体级联的更早期起作用。补体激活导致靶细胞的破坏或者细胞活化，其募集白细胞、收缩周围平滑肌并增加血管可渗透性。补体激活还在抗体-依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)和补体-依赖的细胞介导的细胞毒(CDCC)中起作用。补体激活导致炎性反应，如果调节不好可能损害靶组织。CD59和其他补体抑制蛋白防止补体级联活化导致的自体组织损伤。已有假说认为补体抑制蛋白例如CD59的过表达可能有助于增强对恶性肿瘤经常获得的补体激活的抗性(Jarvis，Li etal.，1997)。如果是这种情况，用针对补体抑制蛋白的单克隆抗体治疗可以克服这种抗性，使肿瘤对免疫治疗或者其他治疗方法更具应答性。
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是罕见的影响造血干细胞的遗传性症状，产生对补体攻击异常敏感的细胞(Davies和Lachmann 1993)。症状包括慢性溶血，贫血和血栓形成(Sugita和Masuho 1995)。受PNH影响的细胞缺乏GPI-锚定蛋白，所述细胞包括红细胞，粒细胞，单核细胞，血小板以及有时包括淋巴细胞，(Davies和Lachmann 1993)。受影响的细胞缺少乙酰胆碱酯酶，LFA-3，HUPAR和补体调节蛋白CD35、CD46、CD55和CD59(Davies和Lachmann 1993)。只有单个完全缺失CD59的表达但不缺失其他补体调节GPI-锚定蛋白的表达的个体的报告病例。该缺陷与PNH-样症状例如溶血性贫血和血栓形成有关(Davies和Lachmann 1993)。尽管存在与CD59功能缺失有关的不良作用，但该个体证明完全丧失是非致死性的。当面临治疗癌症的艰巨任务时，溶血副作用是可以接受的待克服的障碍。
CD59基因之一被敲除的小鼠模型也证明CD59缺陷在体内是非致死性的。小鼠表达两种形式的CD59，即CD59a和CD59b。CD59a广泛地表达于多种小鼠组织，包括血细胞，而只在睾丸中鉴定出CD59b的表达。Miwa et al.制备了CD59a-缺陷小鼠以便评价体内CD59保护红细胞免受自发补体攻击的作用。他们报道说敲除小鼠发育和生长正常，没有任何溶血性贫血的迹象，并且血红蛋白水平没有显著升高。尽管红细胞对通过注射眼镜蛇毒因子(CVF)诱导的补体攻击更敏感，但与野生型相比，自发补体攻击导致的红细胞清除没有显著升高(Miwa，Zhou et al.，2002)。
在大鼠中已经鉴定出称为大鼠抑制蛋白(RIP)的21-kDa膜糖蛋白。RIP在C5b-8期或者之后抑制MAC组装，通过磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C从大鼠红细胞释放。这些因子，连同N末端序列，提示RIP是人CD59的大鼠同源物。将6D1的F(ab′)2片段，即针对大鼠RIP的小鼠单克隆抗体，向一组雄性Wistar大鼠给药。在同一研究中，还给药5I2的片段，即针对不同的大鼠膜-结合的补体调节蛋白的抗体。注射6D1片段后未观察到心率或者血压的变化。在肺、心和肝中检测到片段结合。唯一观察到的效果是白细胞计数的小量增加和红细胞计数的下降；血小板数目没有变化。相反，注射5I2片段导致血压的快速增加，白细胞和血小板的快速减少，以及注射后多达2小时的红细胞的连续增加(Matsuo，Ichida etal.，1994)。
嵌合单克隆抗体利妥昔单抗(Rituximab)(美罗华(Rituxan)，Genentech，San Francisco，CA)针对CD20抗原，已经被批准用于非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的治疗。许多CD20+的患者对治疗无反应，有反应的大部分患者最终对治疗产生抗性。为了克服这种抗性，已经对使用抗CD59抗体来增加CDCC进行了研究。体外在补体存在的条件下对美罗华治疗有抗性的NHL和MM细胞系表达CD59，而对相同处理敏感的NHL和MM细胞系不表达CD59。将一种抗性细胞系与抗CD59抗体(YTH53.1)预孵育使所述细胞对利妥昔单抗和人补体的治疗敏感。在分离自患者的肿瘤中显示CD59的高表达水平，所述患者是CD20+的但用利妥昔单抗治疗后仍有疾病进展(Treon，Emmanouilides et al.，2005)。
已经利用三维微型肿瘤球(MTS)对乳腺癌(T47D)和卵巢畸胎癌(PA-1)中的体外CD59抗体YTH53.1活性进行了评价。MTS是在培养物中生长的多细胞聚集物，代表比单层或者悬浮培养物更接近于体内观察到的模型。该小组先前的工作已经显示生长为MTS的PA-1细胞比在悬浮液生长的PA-1细胞对补体裂解更具抗性。为了评价这种抗性是否可以被克服，通过铬释放分析测量细胞毒性，在用生物素化的YTH53.1预处理MTS后利用摄取碘化丙啶(PI)显示细胞损坏。生物素化后所述抗体保留其对CD59的亲和力，但失去活化经典补体途径的能力。抗乳腺癌细胞的兔抗人多克隆抗体(S2)用于活化所述经典途径。与YTH53.1的过夜孵育导致所述MTS的完全浸润，铬释放分析显示在YTH53.1、S2和人补体存在的条件下，1小时到2小时停滞期后33％的细胞被杀伤。电子显微镜检查显示用YTH53.1、S2和人补体孵育后，平均T47D肿瘤体积减小28％。PI孵育后的荧光显微镜检查显示YTH53.1、S2和人补体孵育后T47D和PA-1MTS上数层细胞死亡。这些结果结合在一起表明抗CD59抗体可以在体外增加补体介导的肿瘤细胞裂解(Hakulinen和Meri 1998)。
另一个小组发现在体外用CD59抗体YTH53.1处理可以克服对补体介导的人转移性前列腺腺癌细胞系DU145和PC3裂解的抗性。铬释放分析用于测量YTH53.1和生物素化的YTH53.1存在或者不存在的条件下的细胞死亡。没有CD59抗体，两种细胞系对补体介导的裂解具有完全抗性。用YTH53.1处理部分克服了这种抗性，杀伤56％的PC3细胞和34％的DU145细胞。用生物素化的YTH53.1处理克服抗性的程度要低一些；47％的PC3和20％的DU145细胞被杀伤。相对于DU145，PC3增加的灵敏度可能归因于PC3增加的CD59表达。天然和生物素化抗体的差异作用证明补体经典途径的活化和CD59中和的结合的作用，因为生物素化的抗体可能不活化经典途径(Jarvis，Li et al.，1997)。抗体的大部分活性可能归因于补体抑制的阻断(CD59的中和)，因为通过经典途径增强补体活化只增加少量的活性(例如，对PC3细胞，生物素化的YTH53.1是47％，相对地YTH53.1是56％)(Jarvis，Li et al.，1997)。迄今为止，一直没有抗CD59抗体YTH53.1的体内分析。没有任何关于任意抗CD59抗体在临床前癌症模型中显示体内治疗功效的报告。
用作癌症疗法的单克隆抗体：每个显示癌症的个体都是独特的，就像人的身份不同一样其癌症也不同于其他癌症。尽管这样，现有疗法在相同阶段用相同方式治疗患有相同类型癌症的所有患者。这些患者中的至少30％在一线治疗中失败，从而导致额外的疗程以及治疗失败、转移和最终死亡的可能性增加。优良的治疗方法应该是对于特定个体的个体化疗法。现有唯一的个体化疗法是手术。化疗和放疗无法针对患者量体裁衣，而手术本身在大部分情况下不足以产生疗效。
随着单克隆抗体的出现，开发个体化疗法的可能性变得更加现实，因为每种抗体可以针对单一表位。此外，有可能制备抗体的组合，所述组合针对表位的集合，所述集合唯一地限定出特定个体的肿瘤。
在意识到癌性细胞和正常细胞之间的显著差异是癌性细胞包含对转化细胞特异的抗原后，科学界长期以来认为可以将单克隆抗体设计为通过特异结合这些癌症抗原特异的靶向转化细胞；因此相信单克隆抗体可以用作消灭癌细胞的“魔力子弹”。但是，现在已经广泛意识到没有单一的单克隆抗体可以在癌症的所有情况下起作用，并且单克隆抗体作为类可以被用作靶向癌症治疗。根据即将公开的本发明的教导而分离的单克隆抗体已经显示以有益于患者的方式调节癌性疾病过程，例如通过减轻肿瘤负荷，所述分离的单克隆抗体在本文将多样地称为癌性疾病调节抗体(CDMAB)或者“抗癌症”抗体。
目前，通常供癌症患者选择的治疗方法很少。癌症疗法的组合方法改善了全世界的存活和患病率。但是，对于特定个体，这些改善的统计数据不一定和他们个人状况的改善必然相关。
因此，如果有方法学能够使医师独立于相同群组中的其他患者来治疗每种肿瘤，那么将允许用仅仅针对那个人疗法的独特方法。理论上这种疗法过程将提高治愈率，产生更好的结果，从而满足长期感受到的需要。
过去，多克隆抗体已经被用于人类癌症的治疗，但只取得了有限的成功。已经用人血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但很少获得持久的症状缓解或者应答。此外，与化疗相比，缺乏重现性，也没有额外的益处。诸如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌的实体瘤也已经用人血液、黑猩猩血清、人血浆和马血清进行治疗，但是相应的结果是不可预见和无效的。
对于实体瘤有很多单克隆抗体的临床试验。在20世纪80年代，利用抗特异抗原或者基于组织选择性的抗体对人乳腺癌进行了至少4次临床试验，在至少47例患者中只产生了1例应答者。直至1998年，才有成功的临床试验，该试验联用了人源化抗Her2/neu抗体(赫赛汀
Figure A200780006609D00091
)和顺铂。在这次试验中，评价了37例患者的应答，其中大约1/4具有部分应答率(partial response rate)，另外1/4具有轻微或者稳定的疾病进展。应答者中的中位进展时间(median time to progression)为8.4个月，中位应答持续时间(median response duration)为5.3个月。
1998年赫赛汀被批准与泰素
Figure A200780006609D00092
一线联用。临床研究结果显示，与只接受泰素(3个月)的组相比，接受抗体疗法加泰素(6.9个月)的患者的中位疾病进展时间增加。中位存活时间也有轻微的增加；赫赛汀加泰素治疗方式为22个月，泰素单独治疗方式为18个月。此外，所述抗体加泰素联合组与单独的泰素相比，完全(8％对2％)和部分应答者(34％对15％)的数目均有所增加。但是，用赫赛汀和泰素治疗相对于单用泰素治疗导致更高的心脏毒发病率(分别为13％对1％)。并且，赫赛汀疗法只对过表达(通过免疫组织化学(IHC)分析来测定)人表皮生长因子受体2(Her2/neu)的患者和大约25％的患有转移性乳腺癌的患者有效，所述人表皮生长因子受体2是目前还没有已知功能或者生物上重要配体的受体。因此，对于患有乳腺癌的患者来说仍然存在远远没有得到满足的需要。甚至那些从赫赛汀治疗获益的患者依然需要化疗，因此仍然(至少在一定程度上)不得不面对这种治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验涉及同时抗糖蛋白和糖脂靶的抗体。对腺癌具有一定特异性诸如17-1A的抗体，已经进行了超过60例患者的2期临床试验，其中仅有1例患者有部分应答。在其他试验中，在使用另外的环磷酰胺的实验步骤的52例患者中，使用17-1A仅产生1例完全应答和2例轻微应答。迄今为止，17-1A的III期临床试验没有证明其作为III期结肠癌辅助疗法的改善功效。使用最初批准用于成像的人源化鼠单克隆抗体也没有产生肿瘤消退。
近期才在使用单克隆抗体的结肠直肠癌临床研究中得到一些阳性结果。2004年，爱必妥
Figure A200780006609D00101
被批准用于表达EGFR的转移性结肠直肠癌患者的二线治疗，所述患者对基于依立替康(irinotecan)的化疗是耐受的。双臂II期临床研究和单臂研究的结果表明，爱必妥与依立替康联用的应答率分别为23％和15％，中位疾病进展时间分别为4.1个月和6.5个月。相同双臂II期临床研究和另一单臂研究的结果表明，单用爱必妥治疗的应答率分别为11％和9％，中位疾病进展时间分别为1.5个月和4.2个月。
因此，爱必妥与依立替康联合治疗在瑞士和美国，以及爱必妥单独治疗在美国，都已经被批准作为依立替康一线疗法失败的结肠癌患者的二线治疗。因此，类似赫赛汀，在瑞士的治疗只被批准作为单克隆抗体和化疗的联用。此外，在瑞士和美国的治疗只是被批准作为患者的二线疗法。2004年，阿瓦斯丁
Figure A200780006609D00102
也被批准与静脉内基于5-氟尿嘧啶的化疗联用作为转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果证明，用阿瓦斯丁加5-氟尿嘧啶治疗的患者比单独用5-氟尿嘧啶治疗的患者的中位存活时间延长(分别为20个月对16个月)。但是，还是和赫赛汀和爱必妥一样，治疗只被批准作为与单克隆抗体和化疗的联用。
对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌也继续存在差的结果。近期对于非小细胞肺癌最有希望的的结果来自II期临床试验，其中治疗涉及偶联到细胞杀伤药物阿霉素的单克隆抗体(SGN-15；dox-BR96，抗-Sialyl-LeX)与化疗剂泰素帝(Taxotere)联用。泰素帝是唯一经FDA批准用于肺癌二线治疗的化疗剂。原始数据显示相对于单用泰素帝，总体存活率提高。该研究招募的62例患者中，2/3接受SGN-15与泰素帝联用，而剩余的1/3接受单独的泰素帝。对于接受SGN-15与泰素帝联用的患者，中位总体存活时间为7.3个月，与之相对，接受单独的泰素帝的患者为5.9个月。接受SNG-15加泰素帝的患者在1年和18个月时的总体存活率分别为29％和18％，与之相比，接受单独的泰素帝的患者分别为24％和8％。已计划进一步的临床试验。
临床前，对于黑素瘤使用单克隆抗体只获得某种有限的成功。这些抗体中几乎没有进行到临床试验阶段，到目前为止没有一个被批准或者在III期临床试验中被证明为有利结果。
缺乏对明确促进疾病发病机理的30,000种已知基因的产物中的相关靶标的鉴定，阻碍了用于治疗疾病的新药的发现。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶标经常被选出，就因为它们在肿瘤细胞中过表达。然后，筛选如此鉴定的靶标与大量化合物的相互作用。对于可能的抗体疗法，这些候选化合物一般衍生自单克隆抗体生成的传统方法，所述方法如Kohler和Milstein规定的基本原则(1975，Nature，256，495-497，Kohler和Milstein)所述。从用抗原(例如全细胞，细胞部分，纯化抗原)免疫的小鼠收集脾细胞，并与永生化杂交瘤伴侣融合。对所获杂交瘤细胞进行筛选，选取分泌与所述靶标结合最紧密的抗体的杂交瘤。利用这些方法制备并根据针对癌细胞的治疗性和诊断性抗体的亲和力选择到了许多所述抗体，包括赫赛汀和利妥昔单抗。这种策略的缺点是双重的。首先，关于组织特异性致癌过程知识的匮乏和所获过分简单化的方法，限制了对于治疗性或者诊断性抗体结合的合适靶标的选择，所述方法例如利用过表达选择，借此来鉴定这些靶标。其次，以下假设不一定总是正确的，即通常与受体以最大亲和力结合的药物分子起始或者抑制信号的可能性最高。
尽管在乳腺癌和结肠癌的治疗中取得了一些进展，但对作为单一药剂或者协同治疗的有效抗体疗法的鉴定和开发已经不足以应对所有类型的癌症。
现有专利：
美国第5,750,102号专利公开了方法，其中用MHC基因转染患者的肿瘤细胞，该基因可从患者的组织或细胞中克隆。然后用这些转染的细胞免疫患者。
美国专利4,861,581公开了方法，其包括以下步骤：获取单克隆抗体，该抗体对哺乳动物肿瘤细胞和正常细胞的细胞内成分是特异的，对细胞外成分没有特异性；标记单克隆抗体；将该标记的抗体与哺乳动物的组织接触，该哺乳动物已接受杀伤肿瘤细胞的治疗；及，通过测量该标记抗体与退化的肿瘤细胞的细胞内成分的结合来确定治疗的有效性。在制备针对人类细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认识到肿瘤细胞是这类抗原的方便来源。
美国专利5,171,665提供了新型抗体及其制备方法。具体的，该专利教导单克隆抗体的制备，该抗体与人类肿瘤(例如肠和肺的肿瘤)相关的蛋白抗原强烈结合，而与正常细胞的结合弱得多。
美国专利5,484,596提供了癌症治疗的方法，其包括：手术切除人癌症患者的肿瘤；处理肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射肿瘤细胞，使其能成活但不致瘤；用这些细胞来制备抑制原发性肿瘤复发，同时抑制肿瘤转移的患者疫苗。该专利教导可与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发。如在第4栏，第45行等处提到的，专利权所有人在研发单克隆抗体中应用了自体肿瘤细胞，该单克隆抗体对人类肿瘤表现出活性特异的免疫治疗。
美国专利5,693,763教导人类癌细胞的糖蛋白抗原特性且不依赖于来源的上皮组织。
美国专利5,783,186涉及诱导表达Her2的细胞凋亡的抗-Her2抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞系，用该抗体治疗癌症的方法和包括所述抗体在内的药物组合。
美国专利5,849,876描述了产生单克隆抗体的新的杂交瘤细胞系，该抗体是针对从肿瘤细胞和非肿瘤细胞来源纯化的粘液素抗原。
美国专利5,869,268公开了生成产生特异针对所需抗原的人类淋巴细胞的方法，制备单克隆抗体的方法及该方法制备的单抗。该专利特别涉及用于癌症诊断和治疗的抗-HD人类单克隆抗体的制备。
美国专利5,869,045涉及与人类癌细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的作用机制是双重的，因为该分子可与人类癌细胞表面的细胞膜抗原反应，而且该抗体可进一步内化入癌细胞内，随后是结合，这对形成抗体-药物，抗体-毒素的偶联物尤其有用。未经修饰的抗体在特定浓度下，也表现出细胞毒性质。
美国专利5,780,033公开了用于肿瘤治疗和预防的自身抗体的使用。不过，这种抗体是来自老年哺乳动物的抗核自身抗体。这里，自身抗体是指一种存在于免疫系统的天然抗体。因为自身抗体来自“老年哺乳动物”，所以就不要求自身抗体必须来自受治患者。除此之外，该专利公开了来自成年哺乳动物的天然单克隆抗核自身抗体及产生单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。
美国专利申请20050032128A1公开了抗糖基化CD59抗体在糖尿病治疗中的用途。
发明概述
本发明人此前已被授予了“个体化患者特异性抗癌抗体”的美国专利6,180,357，该专利涉及选择个体化定制抗癌抗体的方法，所述抗体可用于治疗癌性疾病。本领域公知可以改变多肽中的某些氨基酸序列而不会对蛋白质的结构或功能产生显著的影响。在抗体的分子重排中，对骨架区域的核酸或氨基酸序列的修饰通常是可以耐受的。这些修饰包括但不限于取代(优选地是保守取代)、删除或添加。此外，将标准的化疗模式，例如放射性核素，与本发明的CDMAB偶联，从而集中所述化疗剂的应用，在本发明的范围内。CDMAB还可以与毒素、细胞毒性部分、酶(例如生物素偶联酶)或者造血细胞偶联，从而形成抗体偶联物。
本申请使用6,180,357专利中教导的制备患者特异性抗癌抗体的方法，以分离杂交瘤细胞系，所述细胞系编码癌性疾病调节单克隆抗体。这些抗体可以被制备为特异性地针对一种肿瘤，由此使得癌症疗法的个体化成为可能。在本申请上下文中，具有细胞杀伤(细胞毒性的)或细胞生长抑制(抑制细胞生长的)性质的抗癌抗体在下文将被称作细胞毒性的。这些抗体可用于帮助癌症的分期和诊断，并且可用于治疗肿瘤转移。还可以通过预防性治疗利用这些抗体预防癌症。与如传统药物发现规范产生的抗体不同，利用这种方式产生的抗体可以靶向于之前未显示参与恶性组织的生长和/或存活的分子和通路。此外，这些抗体的结合亲和力满足细胞毒性事件起始的要求，所述事件不一定需要更强的亲和力相互作用。
个体化抗癌治疗的前景将给患者的治疗方式带来改变。可能出现的临床情景是在肿瘤出现时获取并保存肿瘤样品。通过这个样品，可以用一组已经存在的癌性疾病调节抗体检测肿瘤的类型。患者将会按常规分期但是提供的抗体可以用于对患者进一步的分期。可以用存在的抗体立即对患者进行治疗，可以使用本文概述的方法或通过使用结合本文公开的筛选方法的噬菌体展示文库制备对肿瘤具有特异性的抗体组。将生成的所有抗体加入抗癌抗体文库，因为其它肿瘤可能与正在接受治疗的肿瘤具有一些相同的表位。如本方法产生的抗体可用于治疗任意数量患者的癌性疾病，所述患者具有结合这些抗体的癌症。
除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的疗法作为多模式治疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对非癌性细胞是相对无毒的事实使高剂量的待用抗体的组合成为可能，所述组合或者单独使用，或者与常规疗法联用。高治疗指数还允许按短时量程重复治疗，这将降低治疗抗性细胞出现的可能性。
如果患者耐受治疗的初始阶段或发生转移，可以重复产生肿瘤特异性抗体的过程用于再治疗。此外，可以将抗癌抗体与从该患者获得的红血细胞偶联并回输用于转移的治疗。对转移性癌症很少有有效的治疗且转移通常预示着导致死亡的不良结果。但是，转移性癌症常常是充分血管化的且红血细胞对抗癌抗体的递送具有在肿瘤部位聚集抗体的作用。甚至在转移前，大部分癌细胞的存活依赖于宿主的血液供应，与血红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤也是有效的。可选择地，抗体可以与其它造血细胞偶联，所述细胞例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞等等。
有5类抗体且各类抗体与由其重链赋予的功能关联。一般认为由裸抗体杀伤癌细胞是由抗体依赖的细胞的细胞毒性或补体依赖的细胞毒性介导的。例如鼠IgM以及IgG2a抗体可以通过与补体系统中的C-1成分结合激活人的补体，由此激活补体活化的经典途径，该途径可导致肿瘤裂解。对于人抗体，最有效的补体激活抗体一般为IgM和IgG1。鼠IgG2a和IgG3同种型抗体有效募集具有Fc受体的细胞毒性细胞，由此造成单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤。人的IgG1和IgG3同种型抗体均介导ADCC。
抗体介导的癌症杀伤的另一个可能机制可能通过抗体的使用，所述抗体能够催化细胞膜及其结合的糖蛋白或糖脂中的多种化学键的水解，即所谓的催化抗体。
有另外三种抗体介导的癌细胞杀伤机制。第一种机制是将抗体用作疫苗以诱导机体产生针对驻留于癌细胞的推定抗原的免疫反应。第二种机制是将抗体用于靶向生长受体并干扰它们的功能或者下调该受体以有效地使其功能丧失。第三种机制是这类抗体对细胞表面部分直接结合的作用，这可以导致直接的细胞死亡，例如死亡受体的结合，所述死亡受体例如TRAIL R1或者TRAIL R2，或是与诸如αVβ3等的整合素分子结合。
癌症药物的临床应用基于该药物在可接受的风险范围下对患者的有益效果。在癌症治疗中，存活率通常是最重要的获益目标，但是除了延长生命外，还存在大量其他公认的益处。治疗对存活率没有负面影响的这些其他益处包括症状的减轻、防止负面事件、延长复发或者无疾病存活的时间和延长进展时间。这些标准被普遍接受，像美国食品药品管理局(F.D.A.)等管理机构批准产生这些益处的药物(Hirschfeld et al.，CriticalReviews in Oncology/Hematolgy 42：137-1432002)。除了这些标准外，还充分意识到还有其他指标可以预示这些类型的益处。部分地，美国F.D.A.授予的快速审批程序确认了存在很可能预测患者获益的替代指标。到2003年末，有16种药物被这种程序批准，其中4种已经进入全面审批，即，后续研究已证明如替代指标所预示的直接患者获益。确定对实体瘤的药物作用的一个重要指标是通过测量对治疗的反应来评价肿瘤负荷(Therasse et al.，Journal of the National Cancer Institute 92(3)：205-2162000)。这种评价的临床标准(RECIST标准)已经由实体瘤反应评价标准工作组(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group)公布，所述工作组由国际癌症专家组成。正如RECIST标准的客观疗效显示的，与适当的对照组相比，对肿瘤负荷有确切作用的药物易于最终对患者产生直接的益处。通常，能够更直接地评价和记录临床前设置的肿瘤负荷。因为临床前研究可以转化成临床设置，所以在临床前模型中延长患者存活率的药物应该有最大的预期临床效用。与临床治疗产生的积极作用相似，在临床前设置中减轻肿瘤负担的药物也对疾病有明显的直接影响。尽管延长生存时间是癌症药物治疗结果中最关注的临床结果，但仍有其他有临床作用的益处，显然，降低肿瘤负荷也能导致直接的益处，并具有临床作用，其与疾病进展的延迟、生存时间的延长或两者都有关系(Eckhardtetal.Developmental Therapeutics：Successes and Failures ofClinical Trial Designs of Targeted Compounds(发展的治疗学：靶化合物的临床试验设计的成功与失败)；ASCO Educational Book，39th AnnualMeeting，2003，pages 209-219)。基本上利用US 6,180,357的方法，并且如美国专利6,794,494，S.N.10/994,664，S.N.11/067,366和临时S.N.60/548,667所公开(其中每个的内容通过引用并入本文)，用来自人结肠(10A304.7)或者前列腺(AR36A36.11.1)肿瘤组织的细胞免疫小鼠后获得小鼠单克隆抗体10A304.7和AR36A36.11.1。10A304.7和AR36A36.11.1抗原在来自不同组织起源的广泛人细胞系的细胞表面表达。在体外乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MB-231)和MCF-7，结肠癌细胞系SW1116，前列腺癌细胞系PC-3和卵巢癌细胞系OVCAR-3对10A304.7的细胞毒作用敏感。在体外前列腺癌细胞系LnCap对AR36A36.11.1的细胞毒作用敏感。
通过证明10A304.7细胞毒体内抗肿瘤活性进一步扩展了其体外抗乳腺癌细胞的结果(如S.N.10/994,664所公开)。在人乳腺癌的体内模型中10A304.7预防肿瘤生长并降低肿瘤负荷。移植后第56天，即最后一次治疗给药后6天，10A304.7治疗组的平均肿瘤体积是同种型对照治疗组肿瘤体积的1％(p＝0.0003，t-检验)。在整个研究中没有毒性的临床迹象。每周测量的体重是健康的替代指标。在治疗期末的各组之间的体重没有显著差异(p＝0.3512，t-检验)。因此在人乳腺癌异种移植模型中10A304.7是良好耐受的并降低肿瘤负荷。
通过证明AR36A36.11.1细胞毒体内抗肿瘤进一步扩展其体外抗前列腺癌细胞的结果(如S.N.11/067,366所公开)。在人前列腺癌的体内预防模型中AR36A36.11.1预防肿瘤生长并降低肿瘤负荷。移植后第41天，即最后一次治疗给药后5天，AR36A36.11.1治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液对照治疗组肿瘤体积的14％(p＝0.0009，t-检验)。在PC-3前列腺癌异种移植模型中，体重可用作疾病进展的替代指标(Wang et al.，Int J Cancer，2003)。研究结束时(第41天)，对照动物显示体重相对于研究开始时降低27％。相反，用AR36A36.11.1治疗的组比对照组具有明显更高的体重(p＝0.017)。总的说来，AR36A36.11.1治疗组只丢失其体重的6％，比缓冲液对照组丢失的27％少很多。因此，在人前列腺癌异种移植模型中，AR36A36.11.1是良好耐受的并降低肿瘤负荷和恶病质。
除了AR36A36.11.1抗前列腺癌作用之外，在体内预防肿瘤模型中AR36A36.11.1显示抗SW1116结肠癌细胞的抗肿瘤活性(如S.N.11/067,366所公开)。移植后第55天，即最后一次治疗给药后5天，AR36A36.1554.51治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液对照治疗组肿瘤体积的51％(p＝0.0055，t-检验)。在整个研究中没有毒性的临床迹象。每周测量的体重是健康和生长迟缓的替代指标。在治疗期末的各组之间的体重没有显著差异(p＝0.4409，t-检验)。因此，在人结肠癌异种移植模型中，AR36A36.11.1是良好耐受的并降低肿瘤负荷。
此外，在体内预防肿瘤模型中AR36A36.11.1显示抗MDA-MB-231(MB-231)乳腺癌的抗肿瘤活性(如S.N.11/067,366所公开)。AR36A36.11.1完全预防肿瘤生长并降低肿瘤负荷。移植后第56天，即最后一次治疗给药后6天，AR36A36.11.1治疗组的平均肿瘤体积是同种型对照治疗组肿瘤体积的0％(p＝0.0002，t-检验)。在整个研究中没有毒性的临床迹象。每周测量的体重是健康和生长迟缓的替代指标。在治疗期末的各组之间的体重没有显著差异(p＝0.0676，t-检验)。因此，在人乳腺癌异种移植模型中，AR36A36.11.1是良好耐受的并降低肿瘤负荷。
此外，在建立的体内肿瘤模型中，AR36A36.11.1显示抗MB-231乳腺癌的抗肿瘤活性(如S.N.11/067,366所公开)。在这种建立的人乳腺癌体内模型中，AR36A36.11.1预防肿瘤生长并降低肿瘤负荷。移植后第83天，即最后一次治疗给药后2天，AR36A36.11.1治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液对照治疗组肿瘤体积的46％(p＝0.0038，t-检验)。这相当于32％的平均T/C。在整个研究中没有毒性的临床迹象。每周测量的体重是健康和生长迟缓的替代指标。在治疗期末的各组之间的体重没有显著差异(p＝0.6493，t-检验)。
总体来说，该数据证明10A304.7和AR36A36.11.1抗原是癌症相关抗原并在人癌细胞中表达，是一种病理相关的癌症靶标。
本发明描述了10A304.7和AR36A36.11.1的开发和使用，其通过专利US6,180,357描述的方法而开发并通过细胞毒性分析中其对动物模型中非建立的和建立的肿瘤生长的作用而鉴定。本发明代表了癌症治疗领域的进展，因为它第一次描述了与靶分子CD59上存在的一个或多个表位特异结合的试剂，所述试剂具有抗恶性肿瘤细胞而不是抗正常细胞的体外细胞毒性质，其在人类癌症的体内模型中还直接介导肿瘤生长的抑制。这是涉及任意其他先前描述的抗CD59抗体的进展，因为没有一种显示具有相似的性质。另一个进展是在抗癌症抗体文库中包含这些抗体，这将提高通过确定不同抗癌抗体的合适组合，靶向表达不同抗原标志物的肿瘤的可能性，以找到最有效的靶向和抑制所述肿瘤的生长发育。
总而言之，本发明教导了10A304.7和AR36A36.11.1抗原作为治疗剂靶标的用途，当其被给药时能够降低哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，还能够导致被治疗哺乳动物的存活延长。本发明还教导了CDMAB(10A304.7和AR36A36.11.1)和它们的衍生物，其配体，例如其细胞的细胞毒诱导配体，和其抗原结合片段的用途，来靶向它们的抗原以预防和降低哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，并延长具有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的存活。此外，本发明还教导了在癌性细胞中检测10A304.7和AR36A36.11.1抗原的用途，其可用于诊断、疗法预测和具有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的预后。
因此，本发明的目的是利用产生抗癌性细胞的癌性疾病调节抗体(CDMAB)的方法来分离杂交瘤细胞系和相应的由所述杂交瘤细胞系编码的分离的单克隆抗体和其抗原结合片段，所述癌性细胞来自特定个体或者一种或者多种特定癌细胞系，CDMAB对癌细胞是细胞毒性的但同时对非癌性细胞相对无毒。
本发明的另一个目的是教导癌性疾病调节抗体，其配体和其抗原结合片段。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过抗体依赖的细胞毒性介导。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过补体依赖的细胞毒性介导。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性是它们催化细胞化学键水解的能力的功能。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，其可用于癌症诊断、预后和监视的结合分析中。
本发明其他的目的和优点通过本发明下述的说明、举例和一些实施方式的描述将变得明显。
附图简述
图1是细胞毒性分析中10A304.7对阳性和阴性对照的比较。
图2.用AR36A36.11.1(栏 A)和10A304.7(栏 B)作为探针的MDA-MB-231膜蛋白的Western印迹。分子量标志物标在左侧。
图3.用10A304.7(栏 A)、AR36A36.11.1(栏 B)、IgG2a同种型对照(8A304.7，栏C)和IgG2b同种型对照(8B1B.1，栏D)作为探针的Western印迹。道1至4是用10A304.7(道1)、AR36A36.11.1(道2)、IgG2a同种型对照(8A304.7，道3)和IgG2b同种型对照(8B1B.1，道4)免疫沉淀的MDA-MB-231膜。道5是MDA-MB-231膜蛋白，道6是去糖基化的MDA-MB-231膜蛋白，其利用PNGase F、唾液酸酶A、o-聚糖酶、β(1-4)半乳糖苷酶和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶去糖基化。分子量标志物标在左侧。
图4.用AR36A36.11.1(道 1)和IgG2a同种型对照(道 2)免疫沉淀的MDA-MB-231膜的胶体蓝染色(栏 A)和Western印迹(栏 B)。分子量标志物标在左侧。
图5.用10A304.7(栏 A)、AR36A36.11.1(栏 B)、小鼠抗人CD59(MEM-43，栏C)和IgG2a同种型对照(8A3B.6，栏 D)作为探针，用小鼠抗人CD59(MEM-43，道 1)、AR36A36.11.1(道 2)和IgG2a同种型对照(8A3B.6，道3)免疫沉淀的MDA-MB-231膜蛋白的Western印迹。分子量标志物标在左侧。
图6A-图6C是人正常组织微阵列中10A304.7和AR36A36.11.1对阳性和阴性对照的比较。
图7.代表性微观图，所述图显示从正常人组织微阵列获得的正常人子宫内膜/分泌组织中与10A304.7(A)或者AR36A36.11.1(B)或者抗肌动蛋白(C)或者阴性同种型对照(D)的结合模式。10A304.7显示阴性染色而AR36A36.11.1显示对血管内皮的弱阳性染色(参见箭头)。放大率是200×。
图8A-图8C是人多种肿瘤组织微阵列中10A304.7和AR36A36.11.1对阳性和阴性对照的比较。
图9.代表性微观图，所述图显示从人多种肿瘤组织微阵列获得的肝胆管癌组织中与10A304.7(A)或者AR36A36.11.1(B)或者抗肌动蛋白(C)或者阴性同种型对照(D)的结合模式。10A304.7和AR36A36.11.1显示对肿瘤细胞的阳性染色。放大率是200×。
图10是10A304.7在人肝肿瘤和正常组织微阵列中的结合概述。
图11.代表性微观图，所述图显示从人组织微阵列获得的肝细胞癌组织中与10A304.7(A)或者同种型对照抗体(B)和非肿瘤肝组织中与10A304.7(C)或者同种型对照抗体(D)的结合模式。10A304.7显示对肿瘤细胞的强阳性染色和对正常组织的阴性染色。放大率是200×。
发明详述
下面用于概述、描述、实施例和权利要求书中的字词或短语通常都有其指定的含义。
术语“抗体”使用其最广泛的涵义，且特别包括，例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体，脱免疫的、鼠科的、嵌合的或人源化的抗体)、携带有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体、抗体的免疫偶联物和抗体片段(见下文)。
本文使用的术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，也就是说，包括这群抗体的单个抗体是相同的，除了可以少量存在的可能的自然变异。单克隆抗体针对单一抗原部位是高度特异性的。而且，与包含针对不同决定基(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一的决定基。除了特异性之外，单克隆抗体在合成方面也是有优势的，其合成可以不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆的”指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，而不能解释为需要通过任何特定方法的抗体产生。例如，本文使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”也可以从噬菌体抗体文库中分离，使用的技术在例如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al，J.MoI.Biol，222：581-597(1991)中描述过。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区域或其可变区。抗体片段的实例包括非全长的抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；微型双功能抗体(diabodies)；线形抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整”抗体指不但包含轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2、CH3，还包含结合抗原的可变区的抗体。恒定结构域可以是天然序列的恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列的变体。优选地，完整抗体有一个或多个效应功能。
依据完整抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以分为不同的“种类”。主要有五类完整的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同种类抗体对应的重链恒定区分别被称为α，δ，∈，γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的三维空间结构和亚结构是公知的。
抗体“效应功能”指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或氨基酸序列变体的Fc区)的生物活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后导致该靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。关于造血细胞FcR表达的总结见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)464页的表3。为了测定目标分子的ADCC活性，可以进行例如美国专利5,500,362或5,821,337描述的体外ADCC活性分析。用于这类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选择地或附加地，目标分子的ADCC活性可以在体内评价，例如在诸如Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中。
“效应细胞”指表达一种或多种FcR、执行效应功能的白细胞。优选地，这些细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源中分离，例如从本文中描述的血液或PBMC中分离。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合于抗体Fe区的受体。优选的FcR是天然序列的人类FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体(γ受体)的受体，并包括FcγRI、FcγRII和Fcγ RIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和可选择的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，两者的氨基酸序列相似，主要不同在于其胞浆结构域。激活性受体FcγRIIA在其胞浆结构域含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞浆结构域含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见综述M.inDaёron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)。FcR综述于Ravetch andKinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capeletal.，Immunomethods4：25-34(1994)和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。本发明中的术语“FcR”包括将来要被鉴定的FcR在内的其他FcR。该术语也包括负责将母体的IgG转运到胎儿体内的新生受体，FcRn(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kimetal.，Eur.J.Immunol.24：2429(1994))。
“补体依赖性细胞毒性作用”或“CDC”指分子在补体存在下，裂解靶细胞的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(Clq)与交联了关联抗原的分子(比如，抗体)的结合而起始。为了评价补体激活，可以进行如Gazzano-Santoro etal.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中描述的CDC分析。
术语“可变的”指可变结构域某些部分的序列在抗体间高度不同，并用于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变化并不是均匀分布在抗体的可变结构域内。在轻链和重链的可变结构域内，变化集中在所谓的高度可变区的三个区域内。可变结构域内更加高度保守的部分被称为骨架区(FR)。每个天然的重链和轻链可变结构域，包含主要采用β-片层构型的四个FR，其由三个高度可变区连接在一起，形成环状连接，在一些情况下形成部分>片层结构。每条链的高度可变区由FR以密切靠近的方式结合一起，并与其他链的高度可变区一起，有助于抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat et al，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，5th Ed.Public HealthService，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，而是呈现各种效应功能，例如参与抗体在抗体依赖性的细胞毒效应(ADCC)中的作用。
本文使用的术语“高度可变区”指抗体上负责与抗原结合的氨基酸残基。高度可变区通常包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域的氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变结构域的氨基酸残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabatet al，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))和/或“高变环”区的那些残基(例如轻链可变结构域的残基2632(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.MoI.Biol.196：901-917(1987))。“骨架区”或“FR”残基指除了本文定义的高变区残基之外的那些可变区的残基。木瓜蛋白酶水解抗体产生了两个相同的被称为“Fab”片段的抗原结合片段和一个残余的“Fc”片段，每个“Fab”片段都有单一的抗原结合部位，“Fc”片段的名称反映了其易结晶的能力。抗体经胃蛋白酶处理后，产生F(ab′)2片段，其有两个抗原结合部位，仍能够与抗原交联。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此区域由以非共价键的方式紧密结合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体构成。以这种每个可变结构域的三个高变区相互作用的构型决定VH-VL二聚体表面的抗原结合部位。六个高变区域共同赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，即便单一的可变结构域(或只含有三个抗原特异性高变区的一半的Fv)仍能够识别和结合抗原，虽然比完整结合位点的亲和性低。Fab片段也含有轻链恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同在于重链CH1结构域的羧基末端多了几个氨基酸残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本文中指代Fab′，其中恒定结构域的半胱氨酸残基至少携带一个游离的硫基。最初的F(ab′)2抗体片段以Fab′片段对产生，之间有铰链的半胱氨酸。其他的抗体片段的化学偶联也是公知的。
来自任一脊椎动物的抗体的“轻链”都可以归于两种截然不同的所谓κ和λ链中的一种，K和λ链的分类基于其恒定结构域的氨基酸序列。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一的多肽链上。优选地，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽连接子，使scFv形成适于抗原结合的结构。关于scFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994)。
术语“双功能抗体(Diabodies)”指带有两个抗原结合位点的小型抗体片段，其在相同多肽链上(VH-VL)含有与轻链可变结构域(VL)结合的重链可变结构域(VH)。使用连接子，该连接子过短不能在同一条链上使两个结构域成对，这些结构域被迫与另一条链上的互补结构域配对，由此产生了两个抗原结合位点。例如在EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger etal.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中对于双功能抗体作了更详细的描述。
“分离”抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或恢复的抗体。其天然环境下的污染成分是指干扰抗体诊断或治疗性用途的物质，可能包括酶、激素和其它的蛋白质或非蛋白质溶质。因为抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在，所以分离抗体包括重组细胞内部的原位抗体。但是，通常分离抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。
“结合”目的抗原(例如，CD59抗原)的抗体是指能够对该抗原有充分亲和力的抗体，以致该抗体在靶向表达该抗原的细胞时，可以作为治疗或诊断试剂。如果抗体是结合CD59的抗体，那么它通常会优先结合CD59，而不是其它受体，这不包括偶然的结合，诸如非特异性的Fc接触或与其他抗原共有的翻译后修饰成分结合，该抗体不会与其他蛋白有明显的相互作用。检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，可包括但并不局限于诸如FACS、细胞ELISA和Western印迹等分析。
如本文使用的，“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”的表述可以交替使用，所有这些用法都包括其子代。也可以理解为由于人为的或非人为的突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化细胞内筛选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。在上下文中，将清楚地有意使用不同的指代。
“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)靶向的病理状态或病症。需要治疗的个体不仅包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体，还包括那些已经存在所述病症的个体。因此，本文中欲被治疗的哺乳动物可已经被诊断为患有该病症或可倾向于或易感于该病症。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长或死亡不受调控。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些肿瘤更多具体的实例包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌的胃癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝脏癌症，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺肿瘤，肾癌，前列腺癌，外阴肿瘤，甲状腺癌，肝癌，肛癌，阴茎癌，还有头颈部癌。
“化疗剂”是可用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括：诸如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化剂；例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、乌瑞替派(uredopa)的氮丙啶类；包括六甲蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙烯亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamine)；如瘤可宁(chlorambucil)、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀(uracil mustard)等氮芥类药物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀等硝脲类(nitrosureas)；如阿克拉霉素类、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里刹霉素、洋红霉素、碳霉素(carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、灰霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星类的抗生素；甲氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)类抗代谢类药；如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸拟似物；如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫米嘌呤、硫鸟嘌呤类嘌呤类似物；如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮等男性激素类药物；如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺类药物；如亚叶酸等叶酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；
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雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2＂-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(＂Ara-C＂)；环磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(泰素，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(泰素帝，Aventis，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)等紫杉烷类；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；如顺铂和卡铂等铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春碱；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；esperamicins；卡培他滨；以及上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素类药物也包括在本定义内，像抗雌激素药物，例如，包括它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷诺昔芬、LY117018、奥那司酮、托瑞米芬(法乐通)；抗雄激素物质，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林；以及上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。
用于治疗目的的“哺乳动物”指任何一种可归于哺乳类的动物，包括人类、小鼠、免疫缺陷鼠或裸鼠或品系小鼠、家畜和农场动物及动物园内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。优选地，本文的哺乳动物指人类。
“寡核苷酸”指短长度、单链或双链多聚脱氧核苷酸，其可利用已知的方法化学合成(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学，利用例如发表于1988年5月4日的EP 266,032描述的固相技术；或利用Froehler etal，Nucl.Acids Res.，14：5399-5407，1986描述的脱氧核苷H-磷酸盐中间物)，然后用聚丙烯酰胺凝胶纯化。
除非另外指出，当在本文使用时，术语“CD59”是指哺乳动物糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的膜糖蛋白，其还称为MEM-43抗原，反应性裂解的膜抑制剂(MIRL)，H19，膜攻击复合物-抑制因子(MACIF)，分子量20,000的同源限制因子(HRF20)和保护素(Walsh，Tone et al.1992)。
“嵌合”抗体指免疫球蛋白，其部分重链和/或轻链与来源于特定种属或属于特定抗体种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，同时链上余下序列与来源于另一种属或属于另一种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，此外还指这些抗体的片段，只要这些片段能够表现出所需的生物活性(美国专利4,816,567和Morrison et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA，81：6851-6855(1984))。
非人类(例如鼠科)抗体的“人源化”形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab′，F(ab)2或抗体的其他抗原结合序列)，其包含来源自非人免疫球蛋白的最小序列。在绝大多数情况下，人源化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中，所述受者抗体的互补决定区(CDR)的残基被诸如具有所需的特异性、亲和力、能力的小鼠、大鼠或兔等的非人类抗体(供者抗体)的CDR的残基所替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人类FR残基所替代。此外，人源化抗体可以包括既不在受者抗体也不在引入的CDR或FR序列的残基。这些修饰进一步改善和优化了抗体的性能。通常，人源化抗体包括至少一个，通常是两个可变区的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应非人类免疫球蛋白的CDR区，且全部或基本上全部的FR残基是人类免疫球蛋白共有序列的FR残基。人源化抗体也最适宜包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人类免疫球蛋白的恒定区。
“脱免疫化”抗体是对给定的物种没有免疫原性或免疫原性较差的免疫球蛋白。通过改造抗体的结构可以实现脱免疫化。任何本领域技术人员公知的脱免疫化技术都可以使用。例如，在发表于2000年6月15日的WO 00/34317中，描述了一项使抗体脱免疫原性的适当的技术。
“同源性”被定义为比对序列和必要时引入间隔，以实现最大百分比同源性后，氨基酸序列变体中相同残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。
本说明书自始至终，将杂交瘤细胞系以及从其产生的分离的单克隆抗体，通过其内部命名而分别称作10A304.7或AR36A36.11.1，或者通过保藏命名，分别称作ATCC PTA-5065或IDAC280104-02。
本文使用的“配体”包含对靶抗原显示结合特异性的部分，其可以是完整的抗体分子和至少具有抗原结合区或者其部分(即，抗体分子的可变部分)的任意分子，例如，Fv分子，Fab分子，Fab′分子，F(ab′)2分子，双特异抗体，融合蛋白，或者任意遗传工程化分子，所述分子特异识别并结合与分离的单克隆抗体结合的抗原，所述单克隆抗体由命名为ATCCPTA-5065或者IDAC 280104-02(ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02抗原)的杂交瘤细胞系产生。
本文使用的“抗原结合区”表示识别靶抗原的分子的部分。
本文使用的“竞争性抑制”表示能够识别并结合决定簇位点，在常规抗体相互竞争分析中，由命名为ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(ATCC PTA-5065或者IDAC280104-02抗体)针对所述决定簇位点(Belanger L.，Sylvestre C.and DufourD.(1973)，Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitiveand sandwich procedures(竞争和夹心法的甲胎蛋白的酶联免疫测定).Clinica Chimica Acta 48，15)。
本文使用的“靶抗原”是ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02抗原或者其部分。
如本文所用，“免疫偶联物”指以化学或生物学方式与细胞毒素、放射性试剂、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂结合的诸如抗体的任何分子或配体。该抗体可以在所述分子的任一部位与细胞毒素、放射性试剂、抗肿瘤药或治疗剂连接，只要它能够与其靶标结合。免疫偶联物的实例包括抗体毒素化学偶联物和抗体-毒素融合蛋白。
如本文所用，“融合蛋白”指任一嵌合蛋白，其中，抗原结合区与例如毒素、酶或蛋白药物的生物活性分子连接。
为了更充分理解本文中描述的发明，进行下述说明。
本发明提供配体(即，ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02配体)，其特异识别并结合ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02抗原。
本发明的配体可以采用任何形式，只要它具有抗原结合区，所述抗原结合区竞争性抑制杂交瘤ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02产生的单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异结合。因此，与ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02抗体具有相同结合特异性的任意重组蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗体与诸如淋巴因子或者肿瘤抑制生长因子的另一蛋白结合)也属于本发明的范围。
在本发明的一种实施方案中，所述配体是ATCC PTA-5065或者IDAC280104-02抗体。
在其他实施方案中，所述配体是抗原结合片段，其可以是具有ATCCPTA-5065或者IDAC 280104-02抗体的抗原-结合区的Fv分子(例如单链Fv分子)，Fab分子，Fab′分子，F(ab′)2分子，融合蛋白，双特异抗体，异种抗体或者任意重组分子。本发明的配体针对ATCC PTA-5065或者IDAC280104-02单克隆抗体针对的表位。
本发明的配体可以被修饰，即，通过分子内的氨基酸修饰，从而产生衍生物分子。化学修饰也是可能的。
衍生物分子将保留所述多肽的功能性性质，即，具有这类取代的分子将仍然允许所述多肽与ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02抗原或者其部分结合。
这些氨基酸取代包括在本领域中公知的“保守”氨基酸取代，但并不局限于此。
举例来说，某些被称为“保守氨基酸取代”的氨基酸取代能够在蛋白中经常出现，但并不改变该蛋白的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。
这些改变包括任一异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)取代任何其他的疏水氨基酸；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。其他的取代也可被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境和其在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可经常互换，丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的甲硫氨酸(M)可经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常互换，其发生部位氨基酸残基的明显特征是其带电，这两种氨基酸残基的不同pK的差别并不明显。在特定情境下，仍有其他的一些变化可以被认为是“保守的”。
给定一种抗体，本领域普通技术人员可以生成竞争性抑制配体，例如竞争性抗体，其可识别相同的表位(Belanger et al.，1973)。一种方法是用表达该抗体识别抗原的免疫原产生免疫。该样品可以包括组织、分离的蛋白或细胞系，但并不局限于这些。可以用竞争性分析筛选产生的杂交瘤，该分析能鉴定抑制所检测抗体结合的抗体，所述分析例如ELISA、FACS或免疫沉淀。另一种方法可以利用噬菌体展示文库，淘选识别所述抗原的抗体(Rubinstein et al.，2003)。在任一情况下，杂交瘤的选择都是基于它们的竞争过原抗体与其靶抗原的结合的能力。因此，这些杂交瘤的特征是识别与所述原抗体相同的抗原，并且这些杂交瘤将更为特异地识别同样的表位。
实施例1
体外细胞毒性
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培养杂交瘤来产生10A304.7单克隆抗体，每周两次收集和再接种。然后是利用蛋白G琼脂糖凝胶4速流(Protein G Sepharose 4 Fast Flow)(Amersham Biosciences，Baie ，QC)的标准抗体纯化操作。利用人源化、嵌合或者鼠的单克隆抗体在本发明的范围内。
细胞毒性分析中，10A304.7与大量阳性(抗-EGFR抗体(C225，IgG1，κ，5微克/mL，Cedarlane，Hornby，ON；抗-FAS，IgM，κ，10微克/mL，eBiosciences，San Diego，CA)、放线菌酮(CHX，0.5微摩尔，Sigma，Oakville，ON)和NaN3(0.1％，Sigma，Oakville，ON))对照，和阴性同种型对照8B1B.1(抗蓝舌病病毒，内部纯化)，以及缓冲液稀释对照进行比较(图1)。在两种胰腺癌细胞系(BxPC-3，PL45)中评定10微克/mL的10A304.7和同种型对照抗体。两种细胞系均获自ATCC(Manassas，VA)。钙黄绿素AM获自Molecular Probes(Eugene，OR)。按照下面列出的变化根据制造商的说明书进行分析。所述分析前将细胞以预定的合适密度进行接种。2天后，将100微升纯化的抗体或者对照稀释进培养基，然后转移到所述细胞板，在5％CO2培养箱中孵育5天。然后将板翻转倒空，吸干。通过多通道挤瓶将室温下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每个孔中，敲3次，翻转倒空，然后吸干。将用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的50微升荧光钙黄绿素染料添加到每个孔中，在5％CO2培养箱中37℃孵育30分钟。Perkin-Elmer HTS7000荧光读板机读板，数据用Microsoft Excel进行分析，结果列表于图1。每种抗体得到5至50的分数，其基于按一式三份测试的4个实验所观察到的平均细胞毒性，以及得到25至100的分数，其基于分析间所观察到的可变性。这两种分数(细胞毒性分数)的总和显示于图1。大于或者等于55的细胞毒性分数被认为对所测试细胞系是阳性的。如美国专利6,794,494先前公开的，10A304.7对BxPC-3细胞系没有细胞毒作用。发现10A304.7抗体对胰腺PL45细胞系具有特异的细胞毒性，超过缓冲液和同种型阴性对照。缓冲液显示没有可测量的细胞毒性。在该特定实验中，8B1B.1同种型对照显示比正常更高的抗PL45细胞系的细胞毒性，这可能是生物分析固有的可变性的函数。尽管所述同种型对照的作用高，但在各实验中10A304.7获得的结果始终更高。这些结果证明10A304.7具有功能特异性，可以靶向于源自人胰腺癌的癌细胞。
实施例2
通过Western印迹对结合蛋白的鉴定
为了鉴定抗体10A304.7和AR36A36.11.1识别的抗原，将表达该抗原的细胞膜进行凝胶电泳并利用Western印迹转移到膜上以确定这些抗体结合的蛋白。
1.膜制备
先前的工作证明10A304.7和AR36A36.11.1均显示抗乳腺癌的效果，如在严重联合免疫缺陷病(SCID)小鼠中作为异种移植物生长的细胞系MDA-MB-231(MB-231)所例证。因此，MB-231膜制品用于抗原鉴定。从MB-231细胞的汇合培养物制备总细胞膜。从细胞团去除培养基，并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗所述细胞。在平台振荡器上用解离缓冲液(Gibco-BRL，Grand Island，NY)37℃解离细胞20分钟。收集细胞，并在4℃900g离心10分钟。离心后，用PBS重悬细胞沉淀，在4℃用900g再离心10分钟以清洗。倒出上清，沉淀保存于-80℃。细胞沉淀以每克细胞3mL缓冲液的比例重悬于匀浆缓冲液中，所述缓冲液包含每50mL 1片的完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合物(Roche，Laval QC)。在冰上利用polytron匀浆器对所述细胞悬液进行匀浆以便裂解细胞。细胞匀浆在4℃15,000g离心10分钟以去除核微粒。收集上清，分到各管中，然后在4℃75,600g离心90分钟。从所述管小心去除上清，每一膜沉淀重悬于大约5mL匀浆缓冲液中。将来自所有管的重悬沉淀合并到1个管中，然后在4℃75,600g离心90分钟。小心从管中去除上清，称重沉淀。向所述沉淀中添加包含1％Triton X-100的增溶缓冲液，比例为每克膜沉淀3mL缓冲液。通过在冰上用平台振荡器在300rpm振动1小时来溶解膜。将所述膜溶液在75,600g离心以沉淀不溶性物质。从管中小心去除包含溶解膜蛋白的上清，分析其蛋白含量，并于-80℃保存。
2.Western印迹
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离膜蛋白。20微克MB-231膜蛋白与非还原SDS-PAGE样品缓冲液混合，一式两份上样于4％-20％梯度SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，Mississauga，ON)的泳道中。在参照泳道跑未染色分子量标志物的样品(Invitrogen，Burlington，ON)。电泳在100V进行10分钟，然后在150V进行直到样品缓冲液的染料前沿跑出凝胶。通过在40V电印迹16小时将蛋白从所述凝胶转移至PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)。转移后，在用溶于包含0.5％吐温-20的Tris-缓冲盐水(TBST)中的5％脱脂乳将膜封闭1小时。用TBST清洗膜3次，然后与稀释在含有5％脱脂乳的TBST中的5微克/mL 10A304.7或者5微克/mL AR36A36.11.1孵育2小时。用TBST清洗3次后，将膜与来自JacksonImmunologicals(West Grove PA)的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠IgG(Fc)孵育。该孵育后用TBST清洗3次，随后与ECL Plus western检测试剂(Amersham Biosciences，Baie ，QC)孵育。将印迹暴露于化学发光胶片(Kodak，Cedex，France)，利用X射线医疗处理机显影。
图2显示AR36A36.11.1(栏A)和10A304.7(栏B)在膜的较低区域强烈结合蛋白。与分子量标准相比，所述抗体结合大约20kDa的蛋白。两种抗体以类似的模式结合MB-231膜。
实施例3
与AR36A36.11.1和10A304.7结合的抗原的交叉免疫沉淀和去糖基化
为了确定与10A304.7和AR36A36.11.1结合的抗原是否相同，将MB-231膜与两种抗体进行交叉免疫沉淀。包括合适的同种型对照(对于IgG2a是8A3B.6，AR36A36.11.1的同种型，以及对于IgG2b是8B1B.1，10A304.7的同种型)以确保任意反应性对功能性抗体均是特异的。
1.免疫沉淀
用0.1M磷酸钠，pH 6.0将200微克的每种抗体稀释到1mL。用1mL0.1M，pH 6.0磷酸钠清洗每种抗体的100微升蛋白G琼脂糖凝胶珠(Amersham Biosciences，Baie ，QC)3次。向等份试样的珠添加稀释的抗体，在室温下通过旋转混合孵育1小时。通过在微量离心机以14,000rpm旋转20秒，然后吸出上清，来去除未结合的抗体。用1mL 0.1M磷酸钠，pH7.4清洗抗体包被的珠3次，然后用1mL 0.2M三乙醇胺，pH8.2清洗2次。用1mL 0.2M三乙醇胺，pH 8.2重悬所述抗体结合的珠，然后通过添加5.2mg二甲基庚二亚胺(Sigma，Oakville，ON)并通过旋转混合孵育1小时进行化学交联。用1.5 mL 50 mM Tris，pH 7.5洗涤抗体交联的珠一次，然后在室温下与1mL 50 mM Tris，pH 7.5通过旋转混合孵育30分钟。用PBS清洗所述珠3次，然后重悬于100微升包含0.02％叠氮钠的磷酸盐缓冲液中，并于4℃保存。
利用如上所述的偶联珠，使用4种抗体中的每一种用于和MB-231膜进行免疫沉淀，所述4种抗体即AR36A36.11.1、10A304.7、8A3B.6和8B1B.1。对于每种抗体，用普通裂解缓冲液(50mM Tris，pH7.4，150mM氯化钠，2mM EDTA，1％Triton X-100，50 mM氟化钠，2 mM原钒酸钠和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合物)将200微克MB-231膜制品稀释到1mL。对于每种抗体，向稀释的MB-231膜中添加50微克抗体-偶联珠，通过旋转翻滚在4℃孵育2小时。免疫复合物结合的珠用普通裂解缓冲液清洗3次，用PBS清洗1次。用磷酸盐缓冲液重悬免疫复合物结合的珠，并保存于4℃以备随时使用。
2.去糖基化
为了测试碳水化合物基团对AR36A36.11.1和10A304.7的抗原结合的作用，MB-231膜被去糖基化。按照制造商的说明书，100微克MB-231膜与来自GLYKO酶消化试剂盒(ProZyme，San Leandro，CA)的PNGase F、唾液酸酶A、o-聚糖酶、β(1-4)半乳糖苷酶和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶在非还原条件下孵育。另外100微克等份试样的MB-231膜只与去糖基化缓冲液孵育，以作为糖基化对照反应。
3.Western印迹
10A304.7、AR36A36.11.1、IgG2a同种型和IgG2b同种型免疫沉淀的MB-231膜以及糖基化和去糖基化的MB-231膜，与非还原性SDS-PAGE样品缓冲液合并，并上样于一式四份的12％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，Mississauga，ON)。未染色的分子量标志物上样于参照泳道。膜通过SDS-PAGE分离，然后是如实施例2所述的Western印迹。图3显示10A304.7(栏A)、AR36A36.11.1(栏B)、IgG2a同种型对照(栏C)和IgG2b同种型对照(栏D)与用10304.7免疫沉淀的MB-231膜(道1)、用AR36A36.11.1免疫沉淀的MB-231膜(道2)、用IgG2a同种型对照免疫沉淀的MB-231膜(道3)、用IgG2b同种型对照免疫沉淀的MB-231膜(道4)、MB-231糖基化膜(道5)和MB-231去糖基化膜(道6)的结合。在所有泳道栏A和栏B具有相同的结合，表明AR36A36.11.1和10A304.7识别相同的抗原。只有在利用10A304.7和AR36A36.11.1作为探针的时候(分别为栏A和栏B)，用10A304.7和AR36A36.11.1免疫沉淀的MB-231膜20kDa区域(分别为道1和道2)才出现大的弥散，而利用同种型对照作为探针时(栏C和栏D)不出现，表明该区域的结合对功能性抗体是特异的。当MB-231膜与同种型对照免疫沉淀时(道3和道4)，在所述20kDa区域没有反应性，进一步说明功能性抗体对抗原的特异性。10A304.7和AR36A36.11.1均在糖基化MB-231膜的20kDa区域结合双条带(道5)。当所述膜被去糖基化时(道6)，存在反应性的改变，表明所述抗原是糖基化的，但所述碳水化合物基团不是抗原结合必需的。
实施例4
10A304.7和AR36A36.11.1结合抗原的鉴定
1.免疫沉淀
通过免疫沉淀从MB-231细胞分离AR36A36.11.1结合的抗原。根据实施例3公开的相同操作，相应地放大比例，将1 mL蛋白G琼脂糖凝胶(Amersham Bioscience，Baie ，QC)与2 mg抗体进行交联。AR36A36.11.1和8A3B.6均进行交联。
用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，2 mM原钒酸钠和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合物)将10mg等份试样的MB-231稀释到10mL。添加3mL琼脂糖凝胶4B(Sigma，Oakville，ON)，在4℃通过旋转翻滚孵育2小时。60微升的两种抗体-偶联珠与稀释在0.1M NaH2PO4，pH 7.4的0.5mg/mLBSA在4℃通过旋转翻滚共孵育2小时。用RIPA缓冲液清洗抗体-偶联的珠两次，然后排出。对于免疫沉淀，将预澄清的MB-231膜从琼脂糖凝胶4B珠去除并添加到8A3B.6-偶联珠，在4℃通过旋转翻滚孵育2小时。与同种型对照孵育后，稀释的膜制品与AR36A36.11.1-偶联珠在4℃通过旋转翻滚孵育2小时。然后两等份试样的珠用RIPA缓冲液清洗两次，用PBS清洗一次。
2.SDS-PAGE
免疫沉淀的珠重悬于30微升SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸3分钟，然后冷却到室温。将21微升所述样品上样于12％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，Mississauga，ON)的一个泳道。剩余的7微升上样于另一泳道。凝胶中还包括蛋白标准和预染的分子量标志物(Invitrogen，Burlington，ON)。凝胶在100V跑10分钟，然后在150V进行直到先导染料前沿跑出凝胶。凝胶沿着上样预染分子量标志物的泳道进行切割。上样21微升的凝胶部分用胶体蓝染色，凝胶另一部分转移到PVDF膜用于和AR36A36.11.1的Western印迹，所述印迹按照实施例2公开的操作。
按照制造商的说明书制备胶体蓝染色剂(Invitrogen，Burlington，ON)，将所述凝胶在室温下于所述染料中振摇孵育过夜。将凝胶在水中孵育2小时以去除背景染色。图4显示与AR36A36.11.1(道 1)和8A3B.6IgG2a同种型对照(道2)免疫沉淀的MB-231膜。染色凝胶20kDa处的弱双条带(栏 A，道 1)对应于Western印迹(栏 B，道 1)中观察到的反应性。利用无菌玻璃巴斯德移液管从染色凝胶提取这两条带，以及在凝胶上来自道2的相应区域和用于背景对照而没有上样蛋白的区域。
3.质谱分析
利用凝胶内胰蛋白酶消化试剂盒(Pierce，Rockford，IL)消化提取的凝胶块。每种样品的一部分点样于利用CHCA基质的H4蛋白芯片阵列(Ciphergen，Freemont，CA)。利用蛋白芯片软件(Ciphergen)在CiphergenSELDI/MS上分析所述阵列芯片。来自AR36A36.11.1免疫沉淀物的双条带的底部条带的独特肽峰值是1540.6Da、1649.6Da、1741.6Da、1778.1Da和2015.2Da。利用ProFound肽图数据库(Rockefeller University)，CD59被鉴定为这些肽的来源，其可能性为1.00，估算的Z值为1.92。CD59包含肽1539.6Da、1648.6Da和2014.1Da。
4.确认
为了证实AR36A36.11.1和10A304.7识别的抗原是CD59，将MB-231膜与商业研究的抗CD59抗体进行交叉免疫沉淀。按照实施例3的描述，50微克小鼠抗人CD59克隆MEM-43(IgG2a)(Serotec，Raleigh，NC)与25微升蛋白G琼脂糖凝胶珠进行交联。按照实施例3的描述，3个150微克等份试样的MB-231膜与25微升偶联抗CD59、AR36A36.11.1或者8A3B.6IgG2a同种型对照的珠进行免疫沉淀。将所述珠重悬于45微升PBS，然后添加15微升SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸样品3分钟。冷却到室温后，将样品以每孔15微升上样至4％-20％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，Mississauga，ON)中。如上所述进行电泳和Western印迹。将所述膜与稀释于5％脱脂乳的3.33微克/mL抗CD59(MEM-43)、5微克/mLAR36A36.11.1、5微克/mL 10A304.7或者5微克/mL8A3B.6IgG2a同种型对照孵育2小时。图5显示用10A304.7(栏A)、AR36A36.11.1(栏B)、小鼠抗人CD59(MEM-43，栏C)和IgG2a同种型对照(8A3B.6，栏D)作为探针，与小鼠抗人CD59(MEM-43，道1)、AR36A36.11.1(道2)和IgG2a同种型对照(8A3B.6，道3)免疫沉淀的MDA-MB-231膜蛋白的Western印迹。当所述膜用同种型对照作为探针时(栏D)在更高的分子量区域出现反应性，因此被认为是背景。与10A304.7(栏A)、AR36A36.11.1(栏B)和抗CD59(栏 C)孵育的印迹在所有3条泳道中均具有相同的染色；小分子量条带特异地与用AR36A36.11.1和抗CD59免疫沉淀的膜反应。这证实了10A304.7和AR36A36.11.1识别的抗原是CD59。
实施例5
正常人组织染色
进行IHC研究以表征10A304.7和AR36A36.11.1抗原在人的分布。此前进行IHC优化研究以便确定进一步实验的条件。
组织切片在58℃烘箱中干燥1小时脱蜡，通过将组织切片5次浸泡于染色缸中的二甲苯进行脱蜡，每次4分钟。经过一系列梯度乙醇清洗(100％-75％)处理后，切片在水中重新水合。将载玻片浸泡于pH6的10mM柠檬酸盐缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)中，随后用高、中、低能量设置的微波分别照射载玻片5分钟并最终将其浸没在冷的PBS中。随后将载玻片浸没在3％的过氧化氢溶液中6分钟，用PBS清洗3次，每次5分钟，干燥，并在室温将载玻片用通用封闭液(Dako，Toronto，Ontario)孵育5分钟。用抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)将10A304.7、AR36A36.11.1、单克隆小鼠抗波形蛋白(Dako，Toronto，Ontario)或同种型对照抗体(靶向黑曲霉(Aspergillus Niger)葡萄糖氧化酶，该酶在哺乳动物组织中不存在或无法诱导；Dako，Toronto，Ontario)稀释至工作浓度(每种抗体5μg/ml)并在室温孵育1小时。用PBS清洗所述载玻片3次，每次5分钟。通过与提供的HRP偶联二抗(Dako Envision System，Toronto，Ontario)在室温下30分钟观察/显现一抗的免疫反应性。在该步骤之后，用PBS清洗所述载玻片3次，每次5分钟，随后加入DAB(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako，Toronto，Ontario)生色团底物溶液以在室温免疫过氧化物酶染色10分钟进行颜色反应。用自来水清洗所述载玻片以终止生色反应。用Meyer苏木精(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)复染后，将所述载玻片用梯度乙醇(75％-100％)脱水并用二甲苯清洗。用固定剂(Dako Faramount，Toronto，Ontario)在所述载玻片上盖上盖玻片。使用Axiovert 200(Ziess Canada，Toronto，ON)对载玻片进行显微检查，使用Northern Eclipse成像软件(Mississauga，ON)获取并存储数字图像。由组织病理学家对结果进行读取、评分和解释。
利用人正常器官组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)对59个正常人组织进行抗体的结合。图6显示正常人组织阵列的10A304.7和AR36A36.11.1染色的结果概述。AR36A36.11.1抗体大部分地结合上皮组织(多种器官的血管内皮，皮肤和扁桃体的鳞状上皮，乳房导管上皮，鼻粘膜上皮，唾液腺的腺泡和导管上皮，肝胆管上皮，胰腺的腺泡上皮和朗格尔汉斯小岛，膀胱粘膜上皮和前列腺的腺上皮)。10A304.7抗体显示结合脾淋巴细胞和中性粒细胞，外周神经纤维，血管平滑肌纤维，睾丸的间质(莱迪希)细胞和胎盘的滋养层组织。细胞定位是细胞质和膜的，且具有弥散染色模式。抗体大部分地结合上皮组织(皮肤的皮脂腺，乳房导管上皮，鼻粘膜，唾液腺的腺泡和导管上皮，血管内皮，膀胱粘膜上皮以及前列腺的腺和肌上皮)。所述抗体还显示结合平滑肌纤维和滋养层胎盘组织。10A304.7结合人正常组织的子集，所述组织显示与AR36A36.11.1的结合(图7)。已经证明10A304.7和AR36A36.11.1抗体结合人组织，这与先前关于抗CD59抗体的报告一致。因此，10A304.7和AR36A36.11.1抗体可适用于人。
实施例6
人肿瘤组织染色
为了确定10A304.7或者36A36.11.1抗原是否在人肿瘤组织中表达，在多种人肿瘤组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)上个体地测试所述抗体。为每位患者提供下列信息∶年龄，性别，器官和诊断。使用的染色操作与实施例5中公开的相同。使用与人正常组织阵列中所述相同的阳性和阴性对照抗体。所有抗体在5微克/mL的工作浓度下使用。
如图8所公开，AR36A36.11.1抗体与17/54(32％)的所测试肿瘤结合。所述抗体与2/17的肿瘤强烈结合，与2/17中度结合，与4/17弱结合，以及与9/17疑似结合。所述组织特异性是对肿瘤细胞和基质血管。细胞定位是膜细胞质的，且具有弥散的染色模式。10A304.7抗体与9/54(17％)的所测试肿瘤结合。所述抗体与4/54中度结合，与2/54弱结合，与3/54疑似结合，与任意一种所测试肿瘤都不存在强烈结合。所述组织特异性是对肿瘤细胞和基质血管。细胞定位是膜细胞质的，且具有弥散的染色模式。就像和正常人组织那样，10A304.7抗体与AR36A36.11.1结合的肿瘤的子集结合。
因此，已经证明10A304.7和AR36A36.11.1抗原位于多种肿瘤类型的膜上。这些结果表明10A304.7和AR36A36.11.1抗体具有作为广泛的多种癌症的治疗性药物的潜能，所述癌症包括但不限于皮肤、肝(图9)和胰腺的癌症。
实施例7
人肝肿瘤组织染色
为了进一步评价10A304.7与人肝肿瘤组织的结合，在肝肿瘤组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)上测试抗体。为每位患者提供下列信息：年龄，性别，器官和诊断。使用的染色操作与实施例5中公开的相同。使用与人正常组织阵列中所述相同的阴性对照抗体。使用的阳性对照抗体是抗AFP(α1胎蛋白；克隆AFP-11Abcam，Cambridge，MA)。所有抗体在5微克/mL的工作浓度使用，除了抗AFP在10微克/mL的工作浓度使用。
如图10所公开，10A304.7显示与10/49(20％)肝癌切片的阳性结合，且大部分地结合原发性肝细胞癌。原发性和转移性胆管癌均显示与所述抗体的50％结合。所述组织特异性是对肿瘤细胞和血管内皮。在所述抗体的结合和肿瘤阶段之间没有关系。所述抗体显示与1/9非肿瘤肝组织切片的弱结合，且限于小血管的内皮(图11)。10A304.7抗原看起来在肝肿瘤组织中特异表达。10A304.7因此具有作为用于肝癌治疗的治疗性药物的潜能。
优势证据表明10A304.7和AR36A36.11.1通过CD59上呈现的表位的结合介导抗癌作用。在实施例2至4中已经显示，10A304.7和AR36A36.11.1抗体可用于免疫沉淀来自诸如MDA-MB-231细胞的表达细胞的关联抗原。利用通过但不限于FACS、细胞ELISA或者IHC所说明的技术，还可以显示10A304.7和AR36A36.11.1抗体可用于表达CD59抗原部分的细胞和/或组织的检测，所述抗原部分特异结合该抗体。
因此，利用FACS、细胞ELISA或者IHC分析，可以显示免疫沉淀的10A304.7和AR36A36.11.1抗原可以抑制任一抗体与这类细胞或者组织的结合。此外，就像和10A304.7和AR36A36.11.1抗体那样，其他抗CD59抗体可用于免疫沉淀和分离其他形式的CD59抗原，所述抗原也可用于抑制这些抗体与表达该抗原的细胞或者组织的结合，其利用相同类型的分析。
本说明书中提及的所有专利和公开出版物代表了本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开出版物通过引用的方式并入本文，其引用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。
应该理解，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限定在本文所描述和显示的特定形式或布局。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出多种变化，本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。本领域的技术人员很容易看出使本发明良好地适合实现所描述的目的并获得最终结果和益处，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相关化合物、方法、操作和技术都是优选实施方案中有代表性的，其目的在于示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到包括在本发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的范围所限定。尽管借助特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解所要求保护的本发明并不仅仅局限于这些特定的实施方案。事实上，所描述的实施本发明的一些方式的的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而易见的，均在所附权利要求书的范围内。
Figure A200780006609D00421
Figure A200780006609D00431

Claims (6)

1.能够特异结合人CD59的单克隆抗体或者配体，其中所述单克隆抗体或者其配体与和分离的单克隆抗体相同的人CD59的一个或多个表位反应，所述分离的单克隆抗体获自具有ATCC登录号PTA-5065的杂交瘤细胞系10A304.7；所述单克隆抗体或者配体的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其人CD59靶抗原结合的能力。
2.能够特异结合人CD59的单克隆抗体或者配体，其中所述单克隆抗体或者其配体与和分离的单克隆抗体相同的人CD59的一个或多个表位反应，所述分离的单克隆抗体获自具有IDAC登录号280104-02的杂交瘤细胞系AR36A36.11.1；所述单克隆抗体或者配体的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其人CD59靶抗原结合的能力。
3.识别与分离的单克隆抗体识别的表位相同的表位的单克隆抗体或者配体，所述分离的单克隆抗体由选自具有ATCC登录号PTA-5065的杂交瘤细胞系10A304.7和具有IDAC登录号280104-02的杂交瘤细胞系AR36A36.11.1的杂交瘤产生；所述单克隆抗体或者配体的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其人CD59靶抗原结合的能力。
4.治疗表达人CD59抗原的人癌性肿瘤的方法，所述方法包括：
对患有所述人癌症的个体进行至少一种单克隆抗体或者配体的给药，所述单克隆抗体或者配体识别与分离的单克隆抗体识别的表位相同的一个或多个表位，所述分离的单克隆抗体由选自具有ATCC登录号PTA-5065的杂交瘤细胞系10A304.7和具有IDAC登录号280104-02的杂交瘤细胞系AR36A36.11.1的杂交瘤产生；
其中所述表位的结合可以有效降低肿瘤负荷。
5.治疗表达人CD59抗原的人癌性肿瘤的方法，所述方法包括：
与至少一种化疗剂联用；对患有所述人癌症的个体进行至少一种单克隆抗体或者配体的给药，所述单克隆抗体或者配体识别与分离的单克隆抗体识别的表位相同的一个或多个表位，所述分离的单克隆抗体由选自具有ATCC登录号PTA-5065的杂交瘤细胞系10A304.7和具有IDAC登录号280104-02的杂交瘤细胞系AR36A36.11.1的杂交瘤产生；
其中所述给药可以有效降低肿瘤负荷。
6.确定选自人肿瘤的组织样品中表达CD59表位的癌性细胞存在的结合分析，所述分析包括：
提供来自所述人肿瘤的组织样品；
提供至少一种单克隆抗体或者配体，所述单克隆抗体或者配体识别与分离的单克隆抗体识别的表位相同的一个或多个表位，所述分离的单克隆抗体由选自具有ATCC登录号PTA-5065的杂交瘤细胞系10A304.7和具有IDAC登录号280104-02的杂交瘤细胞系AR36A36.11.1的杂交瘤产生；
将所述至少一种单克隆抗体或者其配体与所述组织样品接触；和
确定所述至少一种单克隆抗体或者其配体与所述组织样品的结合；
从而指示所述癌性细胞在所述组织样品中的存在。
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