JP5247474B2 - Cd44の表面発現を証明する細胞の細胞障害性媒介 - Google Patents
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Description
特許文献1は、患者の腫瘍からの細胞を、患者の細胞又は組織からクローン化できるMHC遺伝子により形質移入するプロセスを開示する。次にこれらの形質移入細胞を使用して患者に予防接種する。
図1は、細胞株PC−3、LnCap及びCCD−27skに対するAR37A335.8ハイブリドーマ上澄みの細胞障害性及び結合レベルの率を比較する。
図2は、細胞障害性検定法における陽性及び陰性対照と対比したAR37A335.8の比較である。
図3は、癌及び正常細胞株へのAR37A335.8及び抗EGFR対照の結合を表す。データを、アイソタイプ対照を越える増加倍数として平均蛍光強度を表して表にまとめる。
図4は、癌及び非癌細胞株に対して向けられたAR37A335.8及び抗EGFR抗体の代表的なFACSヒストグラムを含む。
図5は、予防MDA−MB−231乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対するAR37A335.8の効果を示す。縦破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均+/−SEMを表す。
図6は、予防MDA−MB−231乳癌モデルにおける体重に対するAR37A335.8の効果を示す。データポイントは平均+/−SEMを表す。
図7は、予防SW1116結腸癌モデルにおける腫瘍増殖に対するAR37A335.8の効果を示す。縦破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均+/−SEMを表す。
図8は、予防SW1116結腸癌モデルにおける体重に対するAR37A335.8の効果を示す。データポイントは平均+/−SEMを表す。
図9は、AR37A335.8及びH460−16−2でプローブした、MDA−MB−231細胞の全膜画分(レーン1)及びPC−3の全細胞溶解産物(レーン2)及びCCD−27sk細胞株(レーン3)から得た試料のウエスタンブロットである。
図10は、MDA−MB−231細胞株の全膜画分からの、抗CD44 H460−16−2の免疫沈降により調製された免疫複合体のウエスタンブロットである。ブロットの個別のレーンを、AR37A335.8(レーン1)、H460−16−2(レーン2)又はアイソタイプ対照抗体(レーン3)でプローブした。
図11は、ヒト前立腺腫瘍及び正常組織マイクロアレイに対するH460−16−2結合のまとめである。
図12は、ヒト組織マイクロアレイから、H460−16−2(A)又はアイソタイプ対照抗体(B)で得た前立腺腫瘍組織の結合パターン及びH460−16−2(C)又はアイソタイプ対照抗体(D)で得た正常前立腺組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。H460−16−2は、腫瘍細胞に対して強い陽性染色を示し、正常組織の間質線維芽細胞に対して弱い染色を示した。倍率は200×である。
図13は、ヒト肝腫瘍及び正常組織マイクロアレイに対するH460−16−2結合のまとめである。
図14は、ヒト組織マイクロアレイから、H460−16−2(A)又はアイソタイプ対照抗体(B)で得た肝腫瘍組織の結合パターン及びH460−16−2(C)又はアイソタイプ対照抗体(D)で得た非腫瘍性肝臓組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。H460−16−2は、腫瘍細胞に対して強い陽性染色を示し、非腫瘍性肝臓組織では類洞細胞(黒色矢印)及び浸潤性リンパ球(緑色矢印)の染色に限定された。倍率は200×である。
図15は、TUNEL検定法又はH&E染色により決定された、H460−16−2又は緩衝剤処置後の、MDA−MB−231腫瘍異種移植におけるアポトーシス細胞の数のまとめである。
図16は、H460−16−2mRNAのRT−PCR産物である。軽鎖反応(パネルA)は、MuIgκVL5′−F(レーン1)又はMuIgκVL5′−C(レーン2)順方向プライマーを使用して増幅した。重鎖反応(パネルB)は、MuIgVH5′−A、B、C、D及びF順方向プライマーのミックスを使用して増幅した。両方の軽鎖反応(パネルA、レーン1及び2)は、450bpで強いバンドを示し、また850bpで弱いバンドを示す。450bpバンドは、H460−16−2Vk遺伝子を含む標的バンドである。重鎖反応(パネルB、レーン1)は、500bpで強いバンドを示し、1000bpで弱いバンドを示す。500bpのバンドは、H460−16−2Vh遺伝子に対応する標的バンドである。
図17は、pCR2.1(H460−16−2Vk)で形質転換された大腸菌から単離したEcoR I消化プラスミドである。クローン番号を上側に示す。最初の数字は、使用した順方向プライマーを示し(1はMuIgκVL5′−F、2はMuIgκVL5′−C)、2番目の数字はクローン番号を示す(1〜5)。分子量マーカーを左側に示す。矢印は、所望のH460−16−2Vk挿入の位置を示す。
図18は、pCR2.1(H460−16−2Vh)で形質転換された大腸菌から単離したEcoR I消化プラスミドである。クローン番号を上側に示す。分子量マーカーを左側に示す。クローン1、2、3、4、5及び8は、H460−16−2Vh遺伝子に対応する所望の500bpバンドを示す。
図19は、pCR2.1(H460−16−2Vh)クローンの生配列データである。
図20は、pCR2.1(H460−16−2Vh)で形質転換された大腸菌から単離したEcoR I消化プラスミドである。クローン番号を上側に示す。分子量マーカーを左側に示す。矢印は、所望のH460−16−2Vh挿入の位置を示す。
図21は、pCR2.1(H460−16−2Vk)及びpCR2.1(H460−16−2Vh)クローンの生配列データである。
図22は、pHC−huCg1ベクター(pCH−huIg1とも呼ばれる)の概略プラスミドマップである。ヒトCγ1の定常部領域は、Hind IIIとXho Iの制限部位の間にある。細菌(アンピシリン)及び哺乳類細胞(ネオマイシン)の選択マーカーが示されている。このプラスミドは、G.R.McLeanらにより提供された。
図23はプライマー配列である。
図24は、現存するテンプレートに適切な制限部位を付加した、PCR増幅pCH−huIg1(パネルA、レーン1)、H460−16−2Vk(パネルA、レーン2)、及びH460−16−2Vh(パネルB、レーン1)PCR増幅である。BsiW I部位を、pCH−huIg1ベクターの現存するHind III部位の直ぐ下流に付加した。1100bpバンド(レーン1)は、Hind III部位とXba I部位の間のプラスミドの増幅領域である。Nhe I部位を、H460−16−2Vk遺伝子の5′末端に付加し、Not I部位を3′末端に付加した。Nhe I部位を、遺伝子の5′末端に付加し、BsiW I部位を3′末端に付加した。得られたH460−16−2Vk(パネルA、レーン2)及びH460−16−2Vh(パネルB、レーン1)バンドのサイズは、極めて少数のヌクレオチドしか加えなかったので、元の遺伝子のサイズと同様の約450bpである。
図25は、IgG1のPCR産物(レーン1)及びpCH−huIg1プラスミド(レーン2)のヒト重鎖定常部領域の消化である。パネルAはHind IIIを使用する単一消化である。パネルBは、Hind III及びXho Iを使用する二重消化である。PCR産物(レーン1)のサイズは、極めて少数のヌクレオチドしか消化により除去されなかったので、消化間(パネルA及びB)で変わらず、約1000bpである。pCH−huIg1プラスミド(レーン2)は、Hind IIIにより完全に直線化した(パネルA)。消化PCR産物とサイズが等しいバンドが、およそ1000bpでプラスミド二重消化(レーン2、パネルB)において表れる。これは、新たなBsiW I部位を含むPCR産物に代えられたプラスミドの一部である。
図26は、異なる切断部位でのBsiW I消化pCH−huIg1である。BsiW I制限部位をpCH−huIg1に付加して、H460−16−2(内部Hind III部位を有する)のクローニングを促進した。プラスミドを、改変プラスミドで形質転換した大腸菌細胞から単離し、BsiW Iで消化して、切断部位が組み込まれているかを決定した。クローン番号を、未消化対照プラスミド(クローン#5)であるレーン11の場合を除いて、それぞれのレーンの上に示す。4及び8を除く全てのクローンは消化されると直線化し、これらが新たな切断部位を含むこことが確認される。クローン4及び8は、未切断対照のレーン11と同一であると思われ、これらが新たな切断部位を含まないことを示す。
図27は、pCL−huCkベクターの概略プラスミドマップである。ヒトCkの定常部領域は、Not I制限部位とXho I制限部位の間にある。可変部領域は、Nhe I部位とNot I部位の間にある。細菌(アンピシリン)及び哺乳類細胞(ピューロマイシン)の選択マーカーが示されている。このプラスミドは、G.R.McLeanらにより提供された。
図28は、Bgl II及びNot Iで消化されたpCL−huCk及びH460−16−2Vkである。pCL−huCkプラスミド(レーン1)及びH460−16−2Vk PCR産物(レーン2)を、両方ともBgl II及びNot Iで消化して、クローニングを促進した。消化プラスミド(レーン1)は、プラスミド骨格である大きいバンドとして表れ、H460−16−2Vkに代えられている軽鎖可変部領域である約400bpバンドとして表れる。H460−16−2VkのPCR産物(レーン2)も約400bpで表れ、これは軽鎖可変部領域の予測されるサイズである。
図29は、BsiW I及びNhe Iで消化されたH460−16−2Vh及びpCH−huIg1である。パネルAは、450pbでBsiW I及びNhe Iにより消化されたH460−16−2VhのPCR産物を示す。パネルBは、BsiW I(レーン1)並びにBsiW I及びNhe I(レーン2)で消化されたpCH−huIg1を示す。単一pCH−huIg1消化(パネルB、レーン1)は、大きなバンドとして表れ、二重消化では450bp挿入で大きなバンドとして表れ(パネルB、レーン2)、H460−16−2Vhに代えられている重鎖可変部領域に対応する。
図30は、1%アガロースゲルにかけた、Bgl II及びNot Iで消化されたpCL−huCk(H460−16−2Vk)形質転換大腸菌から単離したプラスミドである。レーン上部の番号はクローン番号を示す。#1を除いた全てのクローンは、H460−16−2Vk遺伝子に対応する所望の約400bp挿入を示す。
図31は、1.2パーセントアガロースゲルにかけた、BsiW I及びNhe Iで消化されたpCH−huIg1(H460−16−2Vh)により形質転換された大腸菌から単離されたプラスミドである。レーン上部の番号はクローン番号を示す。全てのクローンは、H460−16−2Vh遺伝子に対応する所望の約450bp挿入を有する。
図32は、pNEF38発現ベクター(ICOS,Seattle,WA)のプラスミド概略図である。キメラH460−16−2Vk遺伝子を、Mlu I及びXba I制限部位を使用して多重クローニング部位(MCS)にクローンしたこのプラスミドの選択マーカーは、ネオマイシン耐性(NeoR)遺伝子であり、Geneticin(登録商標)(G418硫酸塩)の存在下で増殖する能力を形質移入細胞に提供する。
図33は、pDEF38発現ベクター(ICOS,Seattle,WA)のプラスミド概略図である。キメラH460−16−2Vh遺伝子を、Mlu I及びXba I制限部位を使用して多重クローニング部位(MCS)にクローンしたこのプラスミドの選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子であり、チミジン及びヒポキサンチンの不在下で増殖する能力を形質移入DHFR欠損細胞に提供する。
図34は、それぞれ1.2パーセントと1.0パーセントのアガロースゲルにかけた、制限部位を変えるキメラH460−16−2Vk(パネルA)及びVH(パネルB)PCR産物である。キメラ軽鎖PCR反応(パネルA、レーン1)は、約800bpで単一バンドを生じ、これは軽可変部領域(420bp)と定常部領域(320bp)を組み合わせた予測されるサイズに匹敵する。重鎖PCR反応(パネルB)は、単一の約1500bpバンドを生じ、これは重可変部領域(450bp)と定常部領域(990bp)の両方を組み合わせた予測されるサイズに匹敵する。
図35は、Xba I及びMul Iで消化されたpNEF38(H460−16−2Vk)(パネルA)及びpDEF38(H460−16−2Vh)(パネルB)形質転換大腸菌から単離したプラスミドである。重鎖プラスミド(パネルB)は、また、Xba I、Mul I及びBsiW I(レーン1B、2B、4B及び6B)で三重に消化された。軽鎖プラスミド(パネルA)では、#3を除いて全てのクローンが所望の750bp挿入を有し、それは軽鎖可変部領域及び定常部領域に対応する。重鎖プラスミドではでは、Xba I及びMlu I消化物(パネルB、レーン1A、2A及び6A)は、1500bp挿入を示し、これは重鎖可変部領域及び定常部領域に対応する。Xba I、Mul I及びBsiW Iで消化された重鎖プラスミド(パネルB、レーン1B、2B及び6B)は、1000bp及び500bpでバンドを示し、これらはそれぞれ重鎖定常部領域及び可変部領域に対応する。クローン4(パネルB)は、全く表れず、反応設定に問題があったことを示した。
図36は、pNEF38(H460−16−2Vk)及びpDEF38(H460−16−2Vh)クローンの生配列データである。
図37は、pMPGCR5IgG1−Vk+hH460のマップである。R&BポリA:ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル;phCMV:サイトメガウイルスプロモーター;Ad Tpl;アデノウイルス三者間リーダー;P2(6):cumateトランスアクチベーター(cTA)の結合ドメイン;IgG1−VhH460:H460−16−2の重鎖のコード配列;VkH460;H460−16−2軽鎖のコード配列;BK T3′:BKウイルスの大型T抗原の部分;TK:チミジンキナーゼ;enh MPL:アデノウイルスの主要な後期プロモーターのエンハンサー。
図38は、pMPGCR5B43kのマップである。
図39は、pkCR5B43G3のマップである。
図40は、異なるクローン(レーン1〜6:それぞれ0、25、50、100、150及び200ngのヒトIgG;レーン7:クローン17;レーン8:クローン71:レーン9:クローン80;レーン10:クローン6′;レーン11:クローン47′;レーン12:クローン147′;レーン13:100ngの純粋なH460−16−2;レーン14:10マイクロリットルのハイブリドーマ血清)で産生されたH460−16−2(IgG1アイソタイプ)のウエスタンブロットによる定量化である。
図41は、異なるクローン(レーン1〜5:それぞれ50、100、150、200及び0ngのヒトIgG;レーン6:クローン17;レーン7:クローン71:レーン8:クローン80;レーン9:クローン6′;レーン10:クローン47′;レーン11:クローン147′;レーン12:100ngの、細胞上澄みを有するヒトIgG;レーン13:100ngの純粋なH460−16−2;レーン14:10マイクロリットルのハイブリドーマ血清)で産生されたH460−16−2(IgG1アイソタイプ)のSDS−PAGEによる定量化である。
図42は、pMPGCR5VK+h460−IgG2のマップである。R&BポリA:ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル;phCMV:サイトメガウイルスプロモーター;Ad Tpl;アデノウイルス三者間リーダー;P2(6):cumateトランスアクチベーター(cTA)の結合ドメイン;Vh−H460IgG2:H460−16−2の重鎖のコード配列;Vk−H460;H460−16−2軽鎖のコード配列;BK T:BKウイルスの大型T抗原の部分;TK:チミジンキナーゼ;enh MPL:アデノウイルスの主要な後期プロモーターのエンハンサー。
図43は、H460−16−2のキメラIgG2アイソタイプを作成するのに使用したプライマーのリストである。
図44は、最初の一連のクローニングの後のウエスタンブロットによるH460−16−2のIgG2アイソタイプの発現である。クローンから選択した250000個の細胞を、500マイクロリットルの培地に再懸濁した。37℃で24時間後、10マイクロリットルの上澄みを、HRPに結合した抗ヒト抗体を使用してウエスタンブロットにより分析した。
図45は、異なるサブクローンからの細胞を、5.0×105細胞/mL、37℃で平板培養した。細胞密度が1.5〜2.0×106細胞/mLに達したとき、30℃に移した。30℃で7日間後、指定量の上澄みをSDS−PAGEにより、続いてCoomassie Fluor−Orangeでの染色により分析した。産生された抗体の量(ng/マイクロリットル)を示す。
図46は、MDA−MB−231細胞の全膜画分に対するウエスタンブロッティングによるキメラ(ch)ARH460−16−2−IgG1クローンの特徴決定である。
図47は、MDA−MB−231細胞の全膜画分に対するウエスタンブロッティングによるキメラ(ch)ARH460−16−2−IgG2クローンの特徴決定である。
図48は、CHOcTAクローン6′により産生された抗体の抗体濃縮の、SDS−PAGEによる、続いてCoomassie Fluo−Orange染色による分析である。
図49は、クローン40B7により産生された抗体の抗体濃縮の、SDS−PAGEによる、続いてCoomassie Fluo−Orange染色による分析である。
図50は、ヒト乳癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するH460−16−2、(ch)ARH460−16−2−lgG1及び(ch)ARH460−16−2−IgG2による処置の効果を示す。腫瘍容量は、群平均±SEMとして表す。縦破線は、投与の最初と最後の日を示す。
図51は、研究の期間中の体重に対するモノクローナル抗体による処置の効果を示す。体重は、群平均±SEMとして表す。
図52は、2つの別々の、アネキシンV染色実験で得られたマウス及びキメラH460−16−2抗体の全体的なアポトーシス効果を表す。
2,2′,2″−トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキサン、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol−Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及びドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Aventis,Rhone−Poulenc Rorer,Antony,France);クロラムブシル;ゲムシタビン;6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;シスプラチン及びカルボプラチンのような白金類似体;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP−16);イホスファミド;マイトマイシンC;マイトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;キセローダ;イバントロネート;CPT−11;トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイン酸;エスペラミシン;カペシタビン;及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。また、この定義に含まれるものは、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)−イミダゾール、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン及びトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリンのような抗アンドロゲン、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤である。
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株AR37A335.8
ハイブリドーマ細胞株AR37A335.8を、ブダペスト条約に従って、International Depository Authority of Canada(IDAC),Bureau of Microbiology,Health Canada,1015 Arlington Street,Winnipeg,Manitoba,Canada,R3E 3R2に、受入番号280104−06で2004年1月28日に寄託した。37 CFR 1.808に従って、寄託者は、寄託物質の公共利用性に対して課せられている全ての制限が、特許の付与にあたって変更不能に解除されることを確認する。
抗体産生:
AR37A335.8モノクローナル抗体は、CL−1000フラスコ(BD Biosciences,Oakville,ON)中でハイブリドーマを培養し、収集及び再接種を週に2回することによって産生した。Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences,Baie d’Urfe,QC)による標準的な抗体精製手順に従った。ヒト、脱免疫化されている、ヒト化されている、キメラ化されている又はマウスのモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。
MDA−MB−231細胞によるインビボ腫瘍実験
図5及び6を参照すると、4〜6週齢の雌SCIDマウスに、100マイクロリットルの食塩水中の5百万のヒト乳癌細胞(MDA−MB−231)を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。マウスを無作為に5匹の処置群に2分割した。移植した当日に、20mg/kgのAR37A335.8試験抗体又は緩衝剤対照を、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl及び20mM Na2HPO4を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、300マイクロリットルの容量でそれぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体及び対照試料を、1週間に1回、試験の期間中、合計8用量で同じ方法により投与した。腫瘍増殖を、約7日毎にカリパスで測定した。動物の体重を、この研究の間、1週間に1回記録した。研究の終了時に、全ての動物をCCAC指針に従って安楽死させた。
SW1116細胞によるインビボ腫瘍実験
図7及び8を参照すると、4〜6週齢の雌SCIDマウスに、100マイクロリットルの食塩水中の5百万のヒト結腸癌細胞(SW1116)を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。マウスを無作為に5匹の処置群に2分割した。移植した当日に、20mg/kgのAR37A335.8試験抗体又は緩衝剤対照を、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl及び20mM Na2HPO4を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、300マイクロリットルの容量でそれぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体及び対照試料を、1週間に1回、試験の期間中、合計8用量で同じ方法により投与した。腫瘍増殖を、約7日毎にカリパスで測定した。動物の体重を、この研究の間、1週間に1回記録した。研究の終了時に、全ての動物をCCAC指針に従って安楽死させた。
AR37A335.8と抗CD44 H460−16−2の交差反応性の決定
全膜画分及び全細胞溶解質のウエスタンブロットを、モノクローナル抗体AR37A335.8と、抗CD44モノクローナル抗体H460−16−2でプローブした。簡潔には、培養で増殖したMDA−MB−231細胞から単離した20マイクログラムの全膜画分と、PC−3及びCCD−27sk細胞から調製した40マイクログラムの全細胞溶解質とを、非還元条件下で、10%SDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分析した。PVDF膜へ電気移動した後、ブロットを、ウエスタンブロットの標準プロトコールに従って、抗体AR37A335.8及びH460−16−2でプローブした。モノクローナル抗体AR37A335.8でプローブされたウエスタンブロットによる結果は、抗CD44モノクローナル抗体H460−16−2で得られたものと強く類似していることを明らかにし(図9)、両方の抗体が同じ抗原、すなわちCD44を認識している可能性があることを示唆した。AR37A335.8がCD44分子と交差反応するかを決定するために、これを培養で増殖した細胞の全膜画分からの抗CD44 H460−16−2により得られた免疫沈降複合体のウエスタンブロットでプローブとして使用した。簡潔には、300マイクログラムのMDA−MB−231全膜画分(1mg/mL最終タンパク質濃度)を、H460−16−2結合タンパク質Gセファロースビーズと4℃で2時間インキュベートした。洗浄した後、ビーズを1×非還元SDS−PAGE試料緩衝剤中で沸騰させ、試料を、10%分離用ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分析した。PVDF膜へ電気移動させた後、ブロットの個別のレーンを、標準ウエスタンブロットプロトコールに従って、抗体AR37A335.8、H460−16−2及びIgG1アイソタイプ対照でプローブした。一次抗体は、全て5マイクログラム/mLの濃度で使用した。得られたブロットの画像(図10)は、AR37A335.8とH460−16−2の両方が同じ抗原と交差反応することを示し、したがって、抗体AR37A335.8もCD44分子内に含まれるエピトープを認識することを実証した。
ヒト前立腺腫瘍組織の染色
IHC(免疫組織化学)研究を実施して、ヒト前立腺腫瘍組織へのH460−16−2の結合を更に評価した。更なる実験の条件を決定するために、IHC最適化研究を予め実施した。H460−16−2モノクローナル抗体を、上記に記載したように産生及び精製した。
ヒト肝腫瘍組織の染色
H460−16−2のヒト肝腫瘍組織への結合を更に評価するために、抗体を肝腫瘍組織アレイ(lmgenex,San Diego,CA)で試験した。次の情報をそれぞれの患者から得た:年齢、性別、臓器及び診断。使用された染色手順は実施例6で開示されたものと同一であった。上記に記載したものと同じ陰性対照抗体を使用した。使用した陽性対照抗体は、抗AFP(アルファ1フェトプロテイン;クローンAFP−11、Abeam,Cambridge,MA)であった。抗体は、10マイクログラム/mLの処理濃度で使用した抗AFP以外は、全て5マイクログラム/mLの処理濃度で使用した。
H460−16−2で処置したSCIDマウス由来のMDA−MB−231異種移植腫瘍組織に対するアポトーシス研究
H460−16−2は、予防及び確立MDA−MB−231異種移植モデルにおいてインビボで腫瘍増殖の抑制を生じる能力を示した(S.N.10/603.000に開示されている)。FACSを使用して、H460−16−2は、MDA−MB−231細胞周期に対する効果も実証し、この効果は、アポトーシス細胞数の用量依存的増加をもたらした(S.N.10/810,165に開示されている)。H460−16−2の作用機構を更に解明するために、乳癌の異種移植モデルにおいてインビボで増殖したMDA−MB−231腫瘍におけるアポトーシスに対するH460−16−2処置の効果を調査した。
H460−16−2のキメラ化
1.0 可変部領域遺伝子を配列決定ベクターにクローニングする
抗体キメラの産生を促進するために、重鎖と軽鎖の両方の可変部領域をコードする遺伝子を、別々に、市販の配列決定ベクターpCR2.1にクローンした。
メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を、QuickPrep(商標)Micro mRNA Purification Kit(GE Healthcare,Piscataway,NJ)を使用して、コンフルエントMaster Cell Bank H460−16−2ハイブリドーマ細胞の培養から単離した。mNAを、更なる使用が必要となるまで−80℃で保存した。
別々の反応を実施して、軽及び重鎖可変部領域を増幅した。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)は、mRNAテンプレートから相補的デオキシリボ核酸(cDNA)を合成し、次に、標的遺伝子を特異的に増幅した。
軽及び重鎖精製PCR産物を、TOPO TA Cloning(登録商標)Kit(Invitrogen,Burlington,ON)を使用して、pCR2.1ベクターに別々にクローンした。軽及び重鎖反応は両方とも2マイクロリットルの適切な精製PCR産物を含んだ。プラスミドを、製造者の使用説明書に従って、One Shot(登録商標)MAX Efficiency(商標)DH5α(商標)−T1R大腸菌(Invitrogen,Burlington,ON)に形質転換した。軽及び重鎖形質転換では、両方において、2マイクロリットルの連結反応を使用した。
上記のmRNAを使用して、H460−16−2Vh遺伝子を増幅した。重鎖では、1マイクロリットルのmRNAを65℃で10分間加熱し、次に氷で2分間冷却した。RT−PCR反応は、12.5マイクロリットルの2×RT−PCR反応ミックス(Invitrogen,Burlington,ON)、1マイクロリットルの5pmol/マイクロリットルMuIgVH5′−Aプライマー(Novagen,Mississauga,ON)、1マイクロリットルの10pmol/マイクロリットルMuIgVH5′−Bプライマー(Novagen,Mississauga,ON)、1マイクロリットルの5pmol/マイクロリットルMuIgVH5′−Dプライマー、(Novagen,Mississauga,ON)、1マイクロリットルの5pmol/マイクロリットルMuIgVH5′−Fプライマー(Novagen,Mississauga,ON)、1マイクロリットルの5pmol/マイクロリットルMuIgGVH3′−2プライマー(Novagen,Mississauga,ON)、0.5マイクロリットルのRT/Platinum(登録商標)Taqミックス(Invitrogen,Burlington,ON)、0.4マイクロリットルの50mM MgSO4(Invitrogen,Burlington ON)及び25マイクロリットルまでの水の、Platinum(登録商標)Taq(Invitrogen,Burlington,ON)を有するSuperscript(商標)One−Step RT−PCRを使用して調製した。反応を熱循環器により50℃で40分間、続いて94℃で2分間加熱した。PCR反応を、94℃で30秒間分、55℃で1分間及び72℃で1分間の30サイクルで実施した。最後に、PCR産物を72℃で10分間加熱し、次に4℃で保存した。PCR産物を、製造者の使用説明書に従って、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN,Mississauga,ON)を使用して精製した。
マウス−ヒトIgG1キメラ抗体作成物を作り出すために、マウスH460−16−2可変部領域遺伝子を、ヒト定常部領域遺伝子を含むプラスミドにクローンした。これらのCMVプロモーターベクターをG.R.McLeanらから得た。ベクターは、最初はpHC−huCg1及びpLC−huCkと呼ばれた。本明細書では、pCH−huIg1及びpCL−huCkと呼ぶ。
重鎖CMVプロモーターベクター(pCH−huIg1)のプラスミドマップを図22に提示する。H460−16−2Vh可変部遺伝子を、Nhe I制限部位とHind III制限部位の間にクローンした。H460−16−2Vh遺伝子内の内部Hind III部位のため、ベクターのHind III部位はBsiW Iに変わった。
H460−16−2Vk及びVh遺伝子のpCL−huCk及びpCH−huIg1それぞれへのクローニングを促進するために、制限部位を遺伝子の両方の末端に付加する必要があった。軽鎖では、Bgl II部位を5′末端に付加し、Hing III部位を3′末端に付加した。重鎖では、Nhe I部位を5′末端に付加し、BsiW I部位を3′末端に付加した。これらのPCR反応に使用したプライマーの配列を図23に提示する。pCL−huCk(pLC−huCkとも呼ばれる)のプラスミドマップを図27に提示する。図には表れないが、pCL−huCkベクターにおけるリーダー領域と可変部領域の間にBgl II部位が存在する。
次に、軽鎖(H460−16−2Vk)のマウス可変部領域及びヒト定常部領域をCHEF1発現ベクターpNEF38にクローンし、重鎖(H460−16−2Vh)のマウス可変部領域及びヒト定常部領域をCHEF1発現ベクターpDEF38にクローンした。プラスミドマップを図32及び33に提示する。
CMVプロモーターベクターにおいてCh−ARH460−16−2遺伝子に隣接する制限部位は、CHEF1発現ベクターへのサブクローニングを促進するために、変える必要があった。CMVプロモーター作成物におけるリーダー、可変部及び定常部領域を、所望の制限部位を導入したプライマーを使用してPCR増幅した。プライマー配列を図23に提示する。
残りのPCR産物は、MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN,Mississauga,ON)を使用して精製し、クローニングのために適切な制限酵素によりCHEF1ベクターと共に消化した。反応は、1マイクログラムのDNA(精製Ch−ARH460−16−2Vk PCR産物、精製Ch−ARH460−16−2Vh PCR産物、pNEF38(ICOS,Seattle,WA)又はpDEF38(ICOS,Seattle,WA))、2マイクロリットルの10×NE緩衝剤2(New England Biolabs,Ipswich,MA)、2マイクロリットルの10×BSA(New England Biolabs,Ipswich,MA)、0.2マイクロリットルの20U/マイクロリットルXba I(New England Biolabs,Ipswich,MA)及び20マイクロリットルまでの水を含んだ。反応を、37℃で一晩インキュベートし、次に0.8マイクロリットルの1M Tris−HCl、pH7.4、1.0マイクロリットルの1M NaCl及び0.4マイクロリットルの10U/マイクロリットルMul I(New England Biolabs,Ipswich,MA)を加え、37℃で6時間更にインキュベートした。消化PCR産物を、MinElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN,Mississauga,ON)を使用して精製し、消化ベクターを、QIAEX II Reaction Cleanup Kit(QIAGEN,Mississauga,ON)で精製した。
4.1 pMPGCR5IgG1−Vk+hH460の構築
このプラスミドは、cumate誘発性プロモーター(CR5)により調節されるH460−16−2(Ch−ARH460−16−2Vh及びCh−ARH460−16−2Vk)のキメラIgG1アイソタイプの重鎖及び軽鎖を含有する。加えて、このプラスミドは、安定したクローンの選択のためにハイグロマイシンに対する耐性を含む(図37)。このプラスミドは、下記に記載するように、最初に2つの中間体プラスミドを構築することにより産生した。
抗体B43の軽鎖をコードするDNAフラグメントを、BamHIで消化することによって、pMPGCR5B43k(図38)から除去した。末端を平滑化した後、子ウシ腸管ホスファターゼ(CIP)で処理し、ベクターDNAを、pNEF38(Ch−ARH460−16−2Vκ)#4をXba I及びBsiW Iにより消化し、続いてT4DNAポリメラーゼにより処理して末端を平滑化することによって得られた、軽鎖をコードするDNAフラグメントと連結した。
B43の重鎖をコードするDNAフラグメントを、Hind IIIで消化することによって、pKCR5B43G3(図39)から除去した。T4DNAポリメラーゼにより末端を平滑化し、CIPで処理した後、ベクターDNAを、pDEF38(Ch−ARH460−16−2VH)#2をXba I及びPac Iで消化することによって単離された、重鎖をコードするDNAフラグメントと連結した。連結の前に、DNAフラグメントを、T4DNAポリメラーゼで平滑化した。
重鎖発現カセット(プロモーター、コード配列、ポリAシグナル)を、AscIで消化することによりpCR5IgGlVhH460AscIから切断し、pMPGCR5VkH460AscIdのAscI部位に挿入し、それを、連結する前にCIPで処理することによって脱リン酸化した。得られた作成物(pMPGCR5IgG1−Vk+hH460)のマップを図37に表す。
CHO−SF(a)のバイアルをGibco BRL(Burlington,ON)から得て、4mMのL−グルタミンを補充したCD−CHO培地(Gibco BRL,Burlington,ON)において2000年5月に解凍した。細胞を、4mMのL−グルタミンを補充したCD−CHO培地で10日間増殖させ、90%ウシ胎児血清(Hyclone,Logan,UT)及び10%DMSOで冷凍保存液を作成した。cumateトランスアクチベーター(cTA)を安定して発現するCHOcTA細胞は、CHO−SF(a)細胞を、製造者の推奨に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen,Burlington,ON)を使用して直線化pMPG−BFP/CMV−cTA/tk−neoで形質移入することによって、生成した。3日後、形質移入細胞を、G418(1.2mg/mL)の存在下でインキュベートし、4週間後、G418耐性細胞のプールをpAdCR5GFPqで形質移入した。2日後、GFPを最も多く発現している細胞を、EPICS TM V(Model 752;Beckman−Coulter,Hialeah,FL)マルチパラメーターレーザーフローサイトメーター及び細胞分類装置で分類し、1.2mg/mLのG418の存在下で1ウエルあたり1個の細胞の密度で96ウエルプレートに移した。コンフルエントクローンを取り出し、拡大し、細胞により合成されたcTAの量を、CR5プロモーターにより調節されているアデノウイルスベクター発現GFP(AdCR5GFPq)で感染した24時間後、Coulter EPICS Tm XIフローサイトメーター(Beckman−Coulter,Hialeah,FL)を使用したフローサイトメトリーによりGFPの強度を測定することによって、間接的に決定した。2回目のクローニングは、AdCR5GFPqにより形質導入した後で最も蛍光性があったクローンからの個別の細胞を、細胞マイクロマニピュレーターを使用して96ウエルプレートに移動することによって実施した(Caron他,2000)。細胞をG418の不在下で増殖させ、コンフルエントコロニーを取り出し、拡大した。これらの細胞により産生されたcTAの量を、AdCR5GFPqで感染した後に産生されたGFPqの強度を測定するフローサイトメトリーにより、間接的に評価した。最も高い生産性のサブクローンのうちの1つ(CHOcTA−5F−1)を拡大した。小規模の細胞バンクを生成し、液体窒素に冷凍して保持した。
6.1 pMPGCR5VK+h460−IgG2の構築
このプラスミドは、cumate誘発性プロモーター(CR5)により調節されるH460−16−2のキメラIgG2アイソタイプの重鎖及び軽鎖を含有する。加えて、このプラスミドは、安定したクローンの選択のためにハイグロマイシンに対する耐性を含む(図42)。このプラスミドは、下記に記載する、幾つかのPCR及びサブクローニング工程を介して産生した。
H460−16−2の軽鎖の可変部領域をコードするDNAフラグメント(PCR B)は、プラスミドpVkH460−16−2#1−1と、プライマーARvarlc及びjctvar−k#3(図43)とを使用して、PCRにより単離した。IgGのヒトカッパ軽鎖の定常部領域をコードするDNAフラグメント(PCR A)は、プラスミドpMPGB43kと、プライマーARkappa及びjctk−var#3(図43)とを使用して、PCRにより単離した。可変部領域は、テンプレートとしてフラグメントPCR B及びPCR Aと、プライマーArvarlc及びARカッパとを使用して、PCRにより定常部領域と組み立てた。得られたDNAフラグメント(PCR C)を、BamH Iで消化し、B43軽鎖を除去するためにBamH Iで予め消化されているpMPGCR5B43k(図38)に連結した。連結する前に、直線化ベクターを、子ウシ腸管ホスファターゼ(CIP)で処理することにより脱リン酸化した。得られたベクターを、pMPGCR5VkH460kozと呼んだ。完全軽鎖を配列決定のために送った。コザック配列内の置換変異を除いて、予測されるヌクレオチド配列が得られた。この置換変異は、両方のプラスミドをKpnIにより消化し、正常なDNAフラグメントを一緒に連結することによって、pMPGCR5vKH460kozの可変部領域をpMPGCR5kH460wrongjct(下記を参照すること)の可変部領域に取り替えることで修正した。得られたプラスミドを、pMPGCR5VkH460と呼び、軽鎖のヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。
このプラスミドは、可変部領域と定常部領域の間に異なる接合部を有するH460−16−2のキメラ軽鎖を含有する。このプラスミドを構築するために、H460−16−2の軽鎖の可変部領域をコードするDNAフラグメント(PCR B1)は、プラスミドpVkH460−16−2#1−1と、プライマーARvarlc及びARjctvar−k(図30)とを使用して、PCRにより単離した。IgGのヒトカッパ軽鎖の定常部領域をコードするDNAフラグメント(PCR A1)は、プラスミドpMPGB43kと、プライマーARkappa及びARjctvar−k(図43)とを使用して、PcRにより単離した。可変部領域は、テンプレートとしてフラグメントPCR B1及びPCR A1と、プライマーArvarlc及びARカッパとを使用して、PCRにより定常部領域を用いて組み立てた。次に、得られたDNAフラグメント(PCR C1)を、BamH Iで消化し、B43軽鎖を除去するためにBamH Iで予め消化されているpMPGCR5B43k(図38)に連結した。連結する前に、ベクターをCIPで処理することにより脱リン酸化した。得られたベクターを、pMPGCR5VkH460wrongjctkozと呼んだ。軽鎖のヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。
H460−16−2の重鎖の可変部領域をコードするDNAフラグメント(PCR D)は、プラスミドpVhH460−16−2#3と、プライマーARigg2varlc及びARhvarswa(図43)とを使用して、PCRにより単離した。PCR産物をApaIで消化し、ヒトIgG2の定常部領域をコードする4.6kb DNAフラグメントに連結した。このベクターは、pkHc(BRI,NRC,Montreal Qc)をApaIで消化し、続いてCIPで処理することによって得た。得られたプラスミドを、pKIgG2−VhH460と呼んだ。
重鎖発現カセット(プロモーター、コード配列、ポリAシグナル)を、AscIで消化することによりpKCR5IgG2VhH460から切断し、pMPGCR5VkH460のAscI部位に挿入し、それを、連結する前にCIPで処理することによって脱リン酸化した。重鎖及び軽鎖の完全ヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。得られた作成物(pMPGCR5VK+h460−IgG2)のマップを図42に表す。
血清無含有既知組成培地で増殖させたCHO−cTA(クローン10−9)細胞を、キメラIgG2抗体pMPGCR5VK+h460−IgG2(図42)を発現するプラスミドで形質移入し、安定したクローンを、ハイグロマイシンの存在下で生成した。374個のクローンをELISAによりIgG2抗体の発現について分析した。80個のクローンが抗体の発現において陽性であった。58個の最も生産的なクローンにより分泌された抗体の量を、ウエスタンブロット又はSDS−PAGEにより分析した(図44)。最も生産的なクローンは、37℃で5〜10pg/細胞/日を産生した。6個のクローンは、クローン40、50、51、52、54及び56であった。
クローン40、50、51、54及び56を、選択圧の不在下でマイクロマニピュレーターを使用してサブクローンした(クローン1個あたり約50個の細胞)。51個のサブクローンの産生レベルを、ウエスタンブロット分析又はSDS−PAGEにより、続いてCoomassie Fluo−Orange染色により試験した(図45)最も生産的なサブクローンは以下であり、37℃で産生された抗体の量を括弧内に示す:40F8(11)、40B7(7)、56B9(7)、40F7(7)、56E9(5)、40E11(5)、40D9(6)、56B8(6)、56F11(4)及び54E10(3)。
キメラIgG1及びIgG2クローンのそれぞれの上澄みを、ウエスタンブロットプローブとして使用して、マウス抗体H460−16−2の標的抗原(CD44)を検出することができるIgGが存在するかを決定した。MDA−MB−231ヒト乳癌細胞の全膜画分の300マイクログラムを含む試料を、沸騰させ、SDS−PAGE(分取ゲル、10%アクリルアミド)/ウエスタンイムノブロッティングにより分析した。ウエスタンブロットを、ウエスタンブロッティングの標準的手順に従って、細胞培養上澄み(TBST中の10%スキムミルクを有する)の1:2希釈によりプローブした。
キメラIgG1クローン6′は、SDS−PAGE分析によると最も多く分泌するクローンであると思われ、ウエスタンブロットにおいて、MDA−MB−231細胞の膜調製物に対するマウスH460−16−2と同様に結合すると思われる。したがって、クローン6′を、30℃で振とうフラスコ中のバッチ培養に抗体を産生するために使用した。バッチ中の抗体濃度を、SDS−PAGEにより、続いてCoomassie Fluo−Orange染色により評価した(図48)。異なるバッチの容量及び抗体濃度は以下である:バッチsuper22Nov:1.6L、150mg/L;バッチN3:.65L、200mg/L;バッチN4:.65L、100mg/L、並びにバッチN5及びN6:.8L、200 mg/L。クローン6′を今後のキメラIgG1研究の全てにおいて使用し、(ch)ARH460−16−2−IgG1と呼ぶ。
MDA−MB−231細胞によるインビボ腫瘍実験
図50及び51を参照すると、4〜6週齢の雌SCIDマウスに、100マイクロリットルの食塩水中の5百万のヒト乳癌細胞(MDA−MB−231)を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。腫瘍の増殖をカリパスで毎週測定した。コホートの大部分が移植後35日目に91mm3(55〜143のmm3範囲)の平均腫瘍容量に達したとき、マウスを腫瘍サイズによってブロックに分けた。ブロックのマウスを、それぞれの群における平均腫瘍容量が互いに有意に異ならないように、4つの処置群(1群あたり10匹)に無作為に割り当てた。H460−16−2、(ch)ARH460−16−2−IgG1、(ch)ARH460−16−2−IgG2試験抗体又は緩衝剤対照を、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl及び20mM Na2HPO4を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後の300マイクロリットルの容量の15mg/kgの抗体を投与することによって、それぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体を、1週間に3回で合計10用量を同じ方法により移植後57日目まで投与した。腫瘍増殖を、約7日毎で移植後62日目まで又は個々の動物がCCAC終点に達するまで、カリパスにより測定した。動物の体重を、この研究の間、1週間に1回記録した。研究の終了時に、全ての動物をCCAC指針に従って安楽死させた。
H460−16−2、(ch)ARH460−16−2−IgG1及び(ch)ARH460−16−2IgG2で処理したMDA−MB231細胞のアネキシン−V染色
アネキシン−V染色は、キメラ型のH460−16−2がMDA−MB−231ヒト乳癌細胞株においてマウスの対応物と同様にアポトーシスを誘発することができるかを決定するために実施した。MDA−MB−231細胞を、H460−16−2、(ch)ARH460−16−2−IgG1又は(ch)ARH460−16−2−IgG2により、0.25、2.5及び20マイクログラム/mLで24時間処理した。各抗体を、同一の濃度で試験した適切なアイソタイプ対照(1B7.11、抗−TNP、マウスIgG1、カッパ、社内で産生;ヒト骨髄腫IgG1、k、Sigma,Oakville,ON;ヒト骨髄腫IgG2、k、Sigma,Oakville,ON)と共に三重に試験した。未処理試料を陰性対照として含め、カンプトテシン(Biovision;Exton,PA)を陽性対照として含めた。蛍光測定ビーズ(BD Bioscience,Oakville,ON)を使用して、FACS器具を蛍光複合体の光学的こぼれについて補正した。次に、細胞をアネキシン−V及び7AADで染色し、FACSArrayに1時間以内にかけた。
Claims (4)
- 受入番号280104−06でIDACに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体。
- ヒト化されている、請求項1記載の抗体。
- キメラ化されている、請求項1記載の抗体。
- 受入番号280104−06でIDACに寄託されている単離クローン。
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