CN101432307B - 显示cd44表面表达的细胞的细胞毒性介导 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，具体涉及显示CD44表面表达的肿瘤细胞的细胞毒性介导；最具体涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)作为起始细胞毒性反应的手段的用途，所述CDMAB任选地与一种或者多种化疗剂联用。本发明还涉及利用本发明CDMAB的结合分析。

Description

显示CD44表面表达的细胞的细胞毒性介导
发明领域
本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，具体涉及肿瘤细胞的细胞毒性的介导；最具体地涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)作为起始细胞毒性反应的手段的用途，所述CDMAB任选地与一种或者多种化疗剂联用。本发明还涉及利用本发明CDMAB的结合分析。
发明背景
癌症中的CD44：抗人白细胞的单克隆抗体的培养导致了CD44抗原的发现；单链透明质酸(HA)结合糖蛋白在广泛的正常组织和所有类型的造血细胞上表达。其起初与淋巴细胞的激活和归巢相联系。当前，其推定的生理学作用还包括炎症基因的激活、细胞周期的调节、细胞增殖的诱导、分化和发育的诱导、细胞骨架重组的诱导和细胞迁移以及细胞存活/抵抗凋亡。
在人体中，CD44的单基因拷贝位于染色体11的短臂，11p13上。该基因包含19个外显子；前5个是恒定的，接下来的9个是可变的，随后的3个是恒定的，最后的2个是可变的。差异剪接可以造成超过1000种不同的亚型。然而，目前仅已鉴定出几十种天然存在的变体。
CD44标准糖蛋白由N-末端胞外(包括20个氨基酸的前导序列和近膜区(85个氨基酸))结构域(270个氨基酸)、跨膜区(21个氨基酸)和胞质尾巴(72个氨基酸)组成。胞外区还包含位于N-末端的连接模块。该区域有92个氨基酸的长度且显示出与其它HA结合连接蛋白的同源性。在鼠型和人型CD44之间存在很高的同源性。该蛋白的变体形式被插入外显子5的羧基末端且在表达时位于胞外。
CD44的血清可溶形式也是天然存在的，且能够通过终止密码子(在可变区内)或蛋白水解活性产生。通过各种刺激包括TNF-α对细胞的激活造成CD44受体的脱落。在肿瘤细胞中也观察到受体的脱落，且该脱落可导致CD44在人血清中的浓度增加多达10倍。CD44的高血清浓度暗示着恶性肿瘤(卵巢癌除外)。
CD44的标准形式以大约37kD的分子量存在。翻译后修饰将分子量增加至80-90kD。这些修饰包括氨基末端胞外结构域在天冬氨酸残基上的N-连接糖基化、在胞外结构域的羧基末端的丝氨酸/苏氨酸残基上的O-连接糖基化以及添加的粘多糖。剪接变体的大小可以为80-250kD。
HA，一种位于哺乳动物胞外基质(ECM)中的聚糖，被认为是主要的CD44配体。然而，也已经发现CD44与诸如胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等蛋白结合。HA结合和糖基化之间看起来存在关联。无活性的CD44(不结合HA)具有最高的糖基化水平，有活性的CD44(结合HA)糖基化水平最低而可诱导的CD44(除非被细胞因子、单克隆抗体、生长因子等激活，否则不与HA结合或很微弱地与HA结合)的糖基化水平在活性和无活性形式之间。
CD44通过信号转导通路能够介导其的一些功能，这些通路依赖于细胞的相互作用、刺激以及环境。这样的一些通路包括NFκB信号级联(涉及炎症反应)、Ras-MAPK信号转导通路(涉及细胞周期和增殖的激活)、Rho蛋白家族(涉及细胞骨架重组和细胞迁移)以及PI3-K相关信号通路(涉及细胞存活)。上述所有的功能与肿瘤疾病的发生和发展密切相关。CD44也被暗示通过各种额外的机理在癌症中发生作用。这些机理包括CD44细胞表面的细胞表面蛋白聚糖将生长因子、趋化因子和细胞因子呈递给涉及恶性肿瘤的受体。同样的，在CD44-HA复合物内化后由溶酶体透明质酸酶进行的HA的胞内降解也潜在地增加了肿瘤入侵和通过ECM诱导血管生成的可能性。此外，已经显示存活或凋亡信号的传递通过标准或可变CD44受体发生。CD44也被暗示涉及细胞分化和迁移。这些机理中的很多但非全部是环境和细胞依赖性的且一些机理产生了不同的发现。因此，在得出任何结论之前需要更多的研究。
为了证实CD44在癌症中潜在的功能作用，进行了CD44的表达研究以确定受体的差异性表达是否与疾病的进程相关。然而，在大部分的肿瘤类型中观察到不一致的现象，且这可能是由于研究人员之间在试剂的组和、技术、病理学评分和细胞类型上的差异造成的。肾细胞癌和非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤看起来是例外，因为具有高CD44表达肿瘤的患者始终比那些低CD44表达或无CD44表达的对应患者存活时间短。
由于其与癌症相关，CD44已经成为抗癌治疗研发的靶点。CD44的标准形式还是变体形式是肿瘤进程所必需的仍然存在争论。两种观点都有体内动物数据支持，同样的，这可能是肿瘤类型甚至是细胞类型依赖的。不同的治疗手段已包括可溶CD44蛋白、透明质酸合成酶cDNA、透明质酸酶的注射，反义CD44和CD44特异性抗体的使用。各种手段已经实现了一定程度的成功，由此为抗CD44癌症治疗提供了支持。
实验中已经产生了变体和标准CD44的特异性单克隆抗体，但绝大部分这样的抗体除了与它们识别的CD44类型特异性地结合外，没有固有的生物学活性。然而，存在某些抗体具有体外活性或体内活性，但通常没有兼具这两种活性。已经显示一些抗-CD44抗体介导细胞事件。例如，针对人红血球Lutheran抗原CD44标准型的小鼠抗体A3D8显示增强CD2(9-1抗体)和CD3(OKT3抗体)介导的T细胞激活；另一种抗-CD44抗体具有相似的效应。A3D8也诱导IL-1从单核细胞的释放和IL-2从T淋巴细胞的释放。有趣的是，A3D8与诸如柔红霉素、米托蒽醌和依托泊甙的药物结合使用，通过消除第二信使神经酰胺的产生抑制了HL60和NB4AML细胞中的凋亡诱导。没有固有活性且靶向CD44的相似表位的J173抗体未抑制药物诱导的凋亡。靶向CD44的85-110KD和200KD形式的NIH44-1抗体通过一通路增强了T细胞的增殖，作者推断该通路为CD44的交联或聚集。综上所述，没有证据说明诸如这些的抗体适合作为癌症治疗剂使用，因为它们抑或不针对癌症(例如激活淋巴细胞)、诱导细胞增殖，或者在与细胞毒性试剂一同使用时抑制癌细胞的药物诱导死亡。
一些抗-CD44抗体已被描述，这些抗体证实了体内的抗肿瘤效应。抗体1.1ASML，一种靶向CD44的v6变体的小鼠IgG1，已经显示降低了大鼠胰腺癌BSp73ASML的淋巴结和肺转移。治疗后的动物的存活随之提高。该抗体仅当在淋巴结定植之前给药有效，且据推断其干扰淋巴结中的细胞增殖。在体外，该抗体对肿瘤细胞没有直接的细胞毒性，且抗体没有提高补体介导细胞毒性或免疫效应细胞功能。没有说明该抗体针对人细胞的应用。
Breyer等说明了一种商业可获取的抗CD44s抗体在破坏原位移植大鼠的恶性胶质瘤的进程中的应用。将大鼠恶性胶质瘤细胞系C6植入额叶，一周后通过脑内注射用抗体对大鼠进行3次治疗。和缓冲液或同型对照治疗后的大鼠相比，治疗后的大鼠证实了降低的肿瘤生长以及更高的体重。在体外，该抗体能够抑制细胞对由胞外基质成分包被的盖玻片的粘附，但对细胞没有直接的细胞毒性效应。该抗体没有对人细胞进行测试。
进行了比较抗CD44s抗体(IM7.8.1)和CD44v10抗体(K926)功效的研究。将表达两种CD44亚型的高度转移的小鼠黑素瘤细胞系B16F10静脉内植入小鼠。两天后，在研究期间每三天给予抗体。两种抗体在肺转移的数量上均造成了大于50％的显著降低；在两种抗体的功效之间没有显著的差别。抗体在体外不影响增殖，且作者Zawadzki等推测肿瘤生长的抑制是因为抗体阻断了CD44和其配体的相互作用。在使用IM-7.8.1的另一研究中，Zahalka等证实了该抗体及其F(ab’)2片段能够阻断小鼠T细胞淋巴瘤LB对淋巴结的浸润。这赋予了小鼠显著的存活益处。Wallach-Dayan等显示用CD44v4-v10转染不会自发形成肿瘤的LB-TRs小鼠淋巴瘤导致其具有形成肿瘤的能力。IM-7.8.1的给药和同型对照抗体相比降低了移植后转染细胞的肿瘤大小。这些实验没有一个证实了该抗体在人体中的应用。
GKW.A3，一种小鼠IgG2a，对人CD44具有特异性且在SCID小鼠中防止了人黑素瘤异种移植物的形成和转移。将该抗体与转移性人细胞系SMMU-2混和并随后皮下注射。治疗在随后的3周内持续。4周后，10只小鼠中仅1只在注射位点形成了肿瘤，而未治疗动物全部生成肿瘤。该抗体的F(ab’)2片段证实了对肿瘤形成相同的抑制，暗示该行为机理不依赖于补体或抗体依赖性细胞毒性。如果在第一次抗体注射前一周注射肿瘤细胞，有80％的动物在原发部位形成肿瘤。然而，注意到存活时间仍然显著增长了。尽管延迟的抗体给药对原发瘤的形成没有效应，其完全地防止了在未治疗动物中出现的肺、肾、肾上腺、肝和腹膜的转移。在体外，该抗体对细胞系没有任何直接的细胞毒性且其不干扰SMMU-2细胞的增殖，看起来通过影响转移或生长对肿瘤的形成产生主要的效应。该抗体的一个需要注意的特征是其识别CD44的所有亚型，这暗示着其在治疗应用中有限的可能性。
Strobel等说明了抗-CD44抗体(克隆515)在小鼠异种移植模型中抑制人卵巢癌细胞腹膜移植的应用。在抗CD44抗体或对照抗体的存在下，将人卵巢细胞系36M2腹腔内植入小鼠，且在随后的20天中进行治疗。5周后，在抗体治疗组的腹膜腔中有显著更少的节结。来自抗-CD44和对照治疗组的节结具有相同的大小，暗示着一旦细胞被移植，抗体对肿瘤的生长没有效应。当细胞被皮下植入时，对肿瘤生长也没有效应，意味着该抗体本身没有抗增殖或细胞毒性效应。此外，抗体在体外对细胞生长没有效应。
VFF-18，也被称作BIWA1，是对CD44的v6变体具有高度亲和性的抗体，其对该多肽的360-370区域具有特异性。在对12例患者进行的I期临床试验中，该抗体已被用作99m锝标记偶联物。在患有头部和颈部鳞状细胞癌的患者中对该抗体的安全性以及靶向潜能进行了测试。在注射40小时后，注射剂量的14％被肿瘤吸收，且在其它器官包括肾、脾和骨髓中具有最少的积聚。高度选择性的肿瘤结合暗示着该抗体在放射免疫治疗中的作用，尽管该抗体异常高的亲和力阻止其对肿瘤深层的穿透力。进一步限制BIWA1应用的是小鼠抗体的免疫原性(12例患者中的11例产生了人抗-鼠抗体(HAMA))、遍及肿瘤的异源性积聚以及抗体-可溶CD44复合物的形成。WO02/094879公开了VFF-18的人源化形式，其被设计用于克服HAMA反应，被命名为BIWA4。据发现，BIWA4和VFF18抗体相比，其抗原结合亲和力显著降低。意外的是，更低亲和力的BIWA4抗体比更高亲和力的BIWA8人源化VFF-18抗体具有较高的肿瘤吸收特征。在33名患者的1期临床试验中对99m锝标记的和186铼标记的BIWA4抗体进行评价以确定安全性、耐受能力、肿瘤积聚和186铼标记BIWA4的最大耐受剂量。99mTc标记的BIWA4中显示存在肿瘤相关的吸收。在186Re标记的BIWA4所有剂量中没有观察到肿瘤的应答，尽管一些具有稳定的病情；剂量限制毒性发生在60mCi/m2。存在50-65％的不良事件发生率，33例患者中的12例被认为发生了严重的不良事件(血小板减少、白血球减少以及发热)，且均接受186Re标记的BIWA4治疗的6例患者由于疾病恶化在治疗期间死亡或随访中死亡。2例患者产生了人抗-人抗体(HAHA)。在20名患者中进行了186Re标记的BIWA4I期剂量递增试验。观察到口腔粘膜炎和剂量限制血小板减少和白血球减少；一例患者产生了HAHA反应。在以60mCi/m2的最高剂量治疗的5例患者中观察到稳定的病情。尽管在获得功效的安全性和耐受能力上被认为可以接受，这些研究相比于临床研究中其它非放射性同位素偶联的生物学治疗具有更高的不良事件发生率。美国专利申请US2003/0103985公开了用于肿瘤治疗的与美登醇偶联的VFF-18人源化形式，被命名为BIWI1。人源化VFF18抗体BIWA4，在与毒素偶联时，即BIWI1，被发现在人外阴皮肤癌、咽喉鳞状细胞癌或乳腺癌的小鼠模型中具有显著的抗肿瘤效应。未偶联的形式BIWA4没有抗肿瘤作用，且偶联形式BIWI1没有在人体中的安全性或功效的证据。
Mab U36是通过UM-SCC-22B人下咽骨癌细胞免疫和癌及组织特异性选择产生的小鼠IgG1抗体。通过cDNA克隆和序列分析进行的抗原表征将角质细胞特异性的CD44剪接变体表元(epican)的v6结构域识别为Mab U36的靶点。免疫组织化学研究显示该表位限于细胞膜上。此外，Mab U36对94％的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)发生了强标记，且在这些肿瘤中细胞染色不均一。10例患者的99mTc标记的Mab U36研究显示该抗体对HNSCC癌症的选择性积聚(2天内20.4+/-12.4％的注射剂量/kg)；没有不良反应的报道，2例患者产生了HAMA。在放射性碘化的小鼠MabU36的研究中，在18例患者中有3例HAMA以及HNSCC的选择性均匀吸收。为了降低Mab U36的抗原性以及降低HAMA的发生率，构建了嵌合抗体。嵌合或原始的小鼠Mab U36均没有ADCC活性。没有Mab U36天然功能活性的证据。186Re标记的嵌合Mab U36被用于确定Mab U36作为治疗试剂的应用。在该I期剂量递增试验中，13例者接受了99mTc标记的嵌合Mab U36的试验剂量和随后的186Re标记的嵌合Mab U36。没有急性不良事件的报道但随后的治疗中观察到3例患者中的2例有剂量限制髓毒性(1.5GBq/m2)，且观察到1例接受最大耐受剂量(1.0GBq/m2)治疗的患者血小板减少。尽管对肿瘤大小有某些效应，这些效应没有满足对治疗产生客观应答的标准。186Re标记的嵌合Mab U36的进一步的研究采用使用粒细胞群落刺激因子刺激的全血回输的策略将最大耐受活性加倍至2.8Gy。在对患有头部和颈部各种肿瘤的9例患者的该研究中，3例因为药物相关贫血需要输血。其它毒性包括3级髓毒性和2级粘膜炎。尽管在5例患者中实现了3-5个月的稳定病情，但没有客观肿瘤应答的报道。因此，可以看出尽管Mab U36是高度特异性的抗体，其要求放射免疫偶联物以实现抗癌效应的缺点限制了其用途，因为其与获得临床效应相关的治疗有伴随的毒性。
总之，已经显示，CD44v6(1.1ASML)和CD44v10(K926)单克隆抗体在用转移型胰腺癌注射的大鼠或在用恶性黑素瘤注射的小鼠中分别降低了转移活性。另一种抗-CD44v6抗体(VFF-18及其衍生物)仅在与美登醇或放射性同位素偶联时具有抗肿瘤活性。抗-标准CD44单克隆抗体也已经显示抑制大鼠恶性胶质瘤的脑内进程(抗-CD44)、小鼠T细胞淋巴瘤的淋巴结侵入(IM-7.8.1)以及抑制人卵巢癌细胞在裸鼠中的移植(克隆515)、小鼠黑素瘤细胞系的肺转移(IM-7.8.1)以及在SCID小鼠中人黑素瘤细胞的转移(GKW.A3)。放射性同位素偶联的Mab U36抗-CD44v6抗体及其衍生物在临床试验中具有抗肿瘤活性并伴随着显著的毒性。尽管这些结果是鼓舞人心的且支持将抗-CD44单克隆抗体发展成为潜在的癌症治疗法，它们说明了对人体癌症有限的效应、安全性或适用性。
因此，如果分离出一种抗体成分，该成分介导癌细胞的细胞毒性，作为其与所述细胞上的CD44细胞表面表达相互吸引的功能，将会实现有价值的诊断和治疗方式。
用作癌症疗法的单克隆抗体：每个显示癌症的个体都是独特的，就像人的身份不同一样其癌症也不同于其他癌症。尽管这样，现有疗法在相同阶段用相同方式治疗患有相同类型癌症的所有患者。这些患者中的至少30％在一线治疗中失败，从而导致额外的疗程以及治疗失败、转移和最终死亡的可能性增加。优良的治疗方法应该是对于特定个体的个体化疗法。现有唯一的个体化疗法是手术。化疗和放疗无法针对患者量体裁衣，而手术本身在大部分情况下不足以产生疗效。
随着单克隆抗体的出现，开发个体化疗法的可能性变得更加现实，因为每种抗体可以针对单一表位。此外，有可能制备抗体的组合，所述组合针对表位的集合，所述集合唯一地限定出特定个体的肿瘤。
在意识到癌性细胞和正常细胞之间的显著差异是癌性细胞包含对转化细胞特异的抗原后，科学界长期以来认为可以将单克隆抗体设计为通过特异结合这些癌症抗原特异的靶向转化细胞；因此相信单克隆抗体可以用作消灭癌细胞的“魔力子弹”。但是，现在已经广泛意识到没有单一的单克隆抗体可以在癌症的所有情况下起作用，并且单克隆抗体作为类可以被用作靶向癌症治疗。根据即将公开的本发明的教导而分离的单克隆抗体已经显示以有益于患者的方式调节癌性疾病过程，例如通过减轻肿瘤负荷，所述分离的单克隆抗体在本文将多样地称为癌性疾病调节抗体(CDMAB)或者“抗癌症”抗体。
目前，通常供癌症患者选择的治疗方法很少。癌症疗法的组合方法改善了全世界的存活和患病率。但是，对于特定个体，这些改善的统计数据不一定和他们个人状况的改善必然相关。
因此，如果有方法学能够使医师独立于相同群组中的其他患者来治疗每种肿瘤，那么将允许用仅仅针对那个人疗法的独特方法。理论上这种疗法过程将提高治愈率，产生更好的结果，从而满足长期感受到的需要。
过去，多克隆抗体已经被用于人类癌症的治疗，但只取得了有限的成功。已经用人血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但很少获得持久的症状缓解或者应答。此外，与化疗相比，缺乏重现性，也没有额外的益处。诸如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌的实体瘤也已经用人血液、黑猩猩血清、人血浆和马血清进行治疗，但是相应的结果是不可预见和无效的。
对于实体瘤有很多单克隆抗体的临床试验。在20世纪80年代，利用抗特异抗原或者基于组织选择性的抗体对人乳腺癌进行了至少4次临床试验，在至少47例患者中只产生了1例应答者。直至1998年，才有成功的临床试验，该试验联用了人源化抗-Her2/neu抗体(赫赛汀(
Figure G2007800154239D0008164726QIETU
))和顺铂。在这次试验中，评价了37例患者的应答，其中大约1/4具有部分应答率，另外1/4具有轻微或者稳定的疾病进展。应答者中的中位进展时间(median time to progression)为8.4个月，中位应答持续时间(median response duration)为5.3个月。
1998年赫赛汀被批准与泰素(
Figure G2007800154239D0009164739QIETU
)一线联用。临床研究结果显示，与只接受泰素(3个月)的组相比，接受抗体疗法加泰素(6.9个月)的患者的中位疾病进展时间增加。中位存活时间也有轻微的增加；赫赛汀加泰素治疗方式为22个月，泰素单独治疗方式为18个月。此外，所述抗体加泰素联合组与单独的泰素相比，完全(8％对2％)和部分应答者(34％对15％)的数目均有所增加。但是，用赫赛汀和泰素治疗相对于单用泰素治疗导致更高的心脏毒发病率(分别为13％对1％)。并且，赫赛汀疗法只对过表达(通过免疫组织化学(IHC)分析来测定)人表皮生长因子受体2(Her2/neu)的患者和大约25％的患有转移性乳腺癌的患者有效，所述人表皮生长因子受体2是目前还没有已知功能或者生物上重要配体的受体。因此，对于患有乳腺癌的患者来说仍然存在远远没有得到满足的需要。甚至那些从赫赛汀治疗获益的患者依然需要化疗，因此仍然(至少在一定程度上)不得不面对这种治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验涉及同时抗糖蛋白和糖脂靶的抗体。对腺癌具有一定特异性的诸如17-1A的抗体，已经进行了超过60例患者的2期临床试验，其中仅有1例患者有部分应答。在其他试验中，在使用另外的环磷酰胺的实验方案的52例患者中，使用17-1A仅产生1例完全应答和2例轻微应答。迄今为止，17-1A的III期临床试验没有证明其作为III期结肠癌辅助疗法的改善功效。使用最初批准用于成像的人源化鼠单克隆抗体也没有产生肿瘤消退。
近期才在使用单克隆抗体的结肠直肠癌临床研究中得到一些阳性结果。2004年，爱必妥(
Figure G2007800154239D0009164802QIETU
)被批准用于表达EGFR的转移性结肠直肠癌患者的二线治疗，所述患者对基于依立替康(irinotecan)的化疗是耐受的。双臂II期临床研究和单臂研究的结果表明，爱必妥与依立替康联用的应答率分别为23％和15％，中位疾病进展时间分别为4.1个月和6.5个月。相同双臂II期临床研究和另一单臂研究的结果表明，单用爱必妥治疗的应答率分别为11％和9％，中位疾病进展时间分别为1.5个月和4.2个月。
因此，爱必妥与依立替康联合治疗在瑞士和美国，以及爱必妥单独治疗在美国，都已经被批准作为依立替康一线疗法失败的结肠癌患者的二线治疗。因此，类似赫赛汀，在瑞士的治疗只被批准作为单克隆抗体和化疗的联用。此外，在瑞士和美国的治疗只是被批准作为患者的二线疗法。2004年，阿瓦斯丁
Figure G2007800154239D00101
也被批准与静脉内基于5-氟尿嘧啶的化疗联用作为转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果证明，用阿瓦斯丁加5-氟尿嘧啶治疗的患者比单独用5-氟尿嘧啶治疗的患者的中位存活时间延长(分别为20个月对16个月)。但是，还是和赫赛汀和爱必妥一样，治疗只被批准作为与单克隆抗体和化疗的联用。
对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌也继续存在差的结果。近期对于非小细胞肺癌最有希望的的结果来自II期临床试验，其中治疗涉及偶联到细胞杀伤药物阿霉素的单克隆抗体(SGN-15；dox-BR96，抗-Sialyl-LeX)与化疗剂泰素帝(Taxotere)联用。泰素帝是唯一经FDA批准用于肺癌二线治疗的化疗剂。原始数据显示相对于单用泰素帝，总体存活率提高。该研究招募的62例患者中，2/3接受SGN-15与泰素帝联用，而剩余的1/3接受单独的泰素帝。对于接受SGN-15与泰素帝联用的患者，中位总体存活时间为7.3个月，与之相对，接受单独的泰素帝的患者为5.9个月。接受SNG-15加泰素帝的患者在1年和18个月时的总体存活率分别为29％和18％，与之相比，接受单独的泰素帝的患者分别为24％和8％。已计划进一步的临床试验。
临床前，对于黑素瘤使用单克隆抗体只获得某种有限的成功。这些抗体中几乎没有进行到临床试验阶段，到目前为止没有一个被批准或者在III期临床试验中被证明为有利结果。
缺乏对明确促进疾病发病机理的30,000种已知基因的产物中的相关靶标的鉴定，阻碍了用于治疗疾病的新药的发现。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶标经常被选出，就因为它们在肿瘤细胞中过表达。然后，筛选如此鉴定的靶标与大量化合物的相互作用。对于可能的抗体疗法，这些候选化合物一般衍生自单克隆抗体生成的传统方法，所述方法如Kohler和Milstein规定的基本原则(1975，Nature，256，495-497，Kohler和Milstein)所述。从用抗原(例如全细胞，细胞部分，纯化抗原)免疫的小鼠收集脾细胞，并与永生化杂交瘤伴侣融合。对所获杂交瘤细胞进行筛选，选取分泌与所述靶标结合最紧密的抗体的杂交瘤。利用这些方法制备、并根据它们的亲和力选择到了许多针对癌细胞的治疗性和诊断性抗体抗体，包括赫赛汀和利妥昔单抗。这种策略的缺点是双重的。首先，关于组织特异性致癌过程认识的匮乏和由此产生的鉴定这些靶标的过分简单的方法(诸如通过过表达来筛选)，限制了对于治疗性或者诊断性抗体结合的合适靶标的选择。其次，以下假设不一定总是正确的，即通常与受体以最大亲和力结合的药物分子起始或者抑制信号的可能性最高。
尽管在乳腺癌和结肠癌的治疗中取得了一些进展，但对作为单一药剂或者协同治疗的有效抗体疗法的鉴定和开发已经不足以应对所有类型的癌症。
现有专利：
美国第5,750,102号专利公开了方法，其中用MHC基因转染患者的肿瘤细胞，该基因可从患者的组织或细胞中克隆。然后用这些转染的细胞接种患者。
美国专利4,861,581公开了方法，其包括以下步骤：获取单克隆抗体，该抗体对哺乳动物肿瘤细胞和正常细胞的细胞内成分是特异的，对细胞外成分没有特异性；标记单克隆抗体；将该标记的抗体与哺乳动物的组织接触，该哺乳动物已接受杀伤肿瘤细胞的治疗；及，通过测量该标记抗体与退化的肿瘤细胞的细胞内成分的结合来确定治疗的有效性。在制备针对人类细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认识到肿瘤细胞是这类抗原的方便来源。
美国专利5,171,665提供了新型抗体及其制备方法。具体的，该专利教导单克隆抗体的制备，该抗体具有与人类肿瘤(例如肠和肺的肿瘤)相关的蛋白抗原强烈结合的特性，而与正常细胞的结合程度弱得多。
美国专利5,484,596提供了癌症治疗的方法，其包括：手术切除人类癌症患者的肿瘤；处理肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射肿瘤细胞，使其能成活但不致瘤；用这些细胞来制备抑制原发性肿瘤复发，同时抑制肿瘤转移的患者疫苗。该专利教导可与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发。如在第4栏，第45行等处提到的，专利权所有人在研发单克隆抗体中应用了自体肿瘤细胞，该单克隆抗体对人类肿瘤表现出活性特异的免疫治疗。
美国专利5,693,763教导人类癌细胞的糖蛋白抗原特性且不依赖于来源的上皮组织。
美国专利5,783,186涉及诱导表达Her2的细胞凋亡的抗-Her2抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞系，用该抗体和包括所述抗体在内的药物组合物治疗癌症的方法。
美国专利5,849,876描述了产生单克隆抗体的新的杂交瘤细胞系，该抗体是针对从肿瘤细胞和非肿瘤细胞来源纯化的粘液素抗原。
美国专利5,869,268公开了生成产生特异针对所需抗原的人类淋巴细胞的方法，制备单克隆抗体的方法及该方法制备的单抗。该专利特别涉及用于癌症诊断和治疗的抗-HD人类单克隆抗体的制备。
美国专利5,869,045涉及与人类癌细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的作用机制是双重的，因为该分子可与人类癌细胞表面的细胞膜抗原反应，而且该抗体可进一步内化入癌细胞内，随后结合，使它们对形成抗体-药物和抗体-毒素的偶联物尤其有用。未经修饰的抗体在特定浓度下，也表现出细胞毒性质。
美国专利5,780,033公开了用于肿瘤治疗和预防的自身抗体的使用。不过，这种抗体是来自老年哺乳动物的抗核自身抗体。这里，自身抗体是指一种存在于免疫系统的天然抗体。因为自身抗体来自“老年哺乳动物”，所以就不要求自身抗体真正来自受治患者。除此之外，该专利公开了来自老年哺乳动物的天然单克隆抗核自身抗体及产生单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。
美国专利5,916,561公开了靶向CD44基因变体外显子v6的特异性抗体VFF-18及其变体。该抗体是对比较抗体的改进，因为其识别人CD44v6变体而不识别大鼠的CD44v6变体。此外，该抗体公开了对于CD44v6表达的诊断分析。对于该抗体没有公开任何体外或体内的功能。
美国专利5,616,468公开了单克隆抗体Var3.1，该抗体针对包含由人的CD44基因的外显子6A编码的序列的合成肽制备。特别地，该抗体与人CD44的90kD形式不发生结合且可以与Hermes-3抗体相区别。提供了检测CD44的v6变体的方法以及根据该抗原对恶性转化进行筛选和分析的方法。还提供了根据检测血清中的抗原筛选炎症疾病的方法。
美国专利5,879,898公开了与人CD44变体6的129bp的外显子结合的特异性抗体，该外显子产生43个氨基酸的肽。该单克隆抗体可由若干杂交瘤细胞系制备：MAK<CD44>M-1.1.12、MAK<CD44>M-2.42.3、MAK<CD44>M-4.3.16。该抗体从一融合蛋白产生，该蛋白包含新CD44v6氨基酸序列的至少一个六肽。此外，公开了用于检测外显子6变体的免疫分析，该分析可被用作癌症的诊断。值得注意地，没有公开该抗体的体外或体内功能。
美国专利5,942,417公开了编码CD44样多肽的多核苷酸，以及使用该多核苷酸及其变体制备重组蛋白的方法。这些多肽的抗体被要求保护，但没有具体实施例，也没有分泌这些抗体的保藏的克隆。Northern印记法证实该多核苷酸在一些类型的组织中出现，但没有该多核苷酸翻译和表达的相应证据。因此，没有证据说明针对该多核苷酸的基因产物制备了抗体，且这些抗体是否具有体外或体内功能，以及它们是否与人类癌症疾病相关。
美国专利5,885,575公开了与CD44的变体表位反应的抗体，以及通过使用该抗体识别该变体的方法。从大鼠细胞中分离出编码该变体的分离的多核苷酸，且靶向该变体的抗体mAb1.1ASML识别分子量为120kD、150kD、180kD和200kD的蛋白。单克隆抗体1.1ASML的给药延缓了大鼠BSp73ASML在同基因大鼠中的生长和转移。值得注意地，正如其缺乏对LCLC97人大细胞肺癌的活性所证实的，1.1ASML不识别人类肿瘤。从LCLC97中分离出人的同源物，但没有制备出识别该同源物的等价抗体。由此，尽管制备了对大鼠CD44的变体具有特异性的抗体且该抗体显示影响大鼠肿瘤的生长和转移，没有证据说明该抗体对人类肿瘤具有效应。更具体地，该发明人指出该抗体不识别人类癌症。
发明概述
本发明人此前已被授予了“个体化患者特异性抗癌抗体”的美国专利6，180，357，该专利涉及选择个体化定制抗癌抗体的方法，所述抗体可用于治疗癌性疾病。本领域公知可以改变多肽中的某些氨基酸序列而不会对蛋白质的结构或功能产生显著的影响。在抗体的分子重排中，对骨架区域的核酸或氨基酸序列的修饰通常是可以耐受的。这些修饰包括但不限于取代(优选地是保守取代)、删除或添加。此外，将标准的化疗模式，例如放射性核素，与本发明的CDMAB偶联，从而集中所述化疗剂的应用，在本发明的范围内。CDMAB还可以与毒素、细胞毒性部分、酶(例如生物素偶联酶)或者造血细胞偶联，从而形成抗体偶联物。
本申请使用6,180,357专利中教导的制备患者特异性抗癌抗体的方法，以分离杂交瘤细胞系，所述细胞系编码癌性疾病调节单克隆抗体。这些抗体可以被制备为特异性地针对一个肿瘤，由此使得癌症疗法的个性化成为可能。在本申请上下文中，具有细胞杀伤(细胞毒性的)或细胞生长抑制(抑制细胞生长的)性质的抗癌抗体在下文将被称作细胞毒性的。这些抗体可用于帮助癌症的分期和诊断，并且可用于治疗肿瘤转移。还可以通过预防性治疗利用这些抗体预防癌症。与传统药物发现模式下产生的抗体不同，利用这种方式产生的抗体可以靶向于之前未显示参与恶性组织的生长和/或存活的分子和通路。此外，这些抗体的结合亲和力满足细胞毒性事件起始的要求，所述事件不一定需要更强的亲和力相互作用。
个体化抗癌治疗的前景将给患者的治疗方式带来改变。可能出现的临床情景是在肿瘤出现时获取并保存肿瘤样品。通过这个样品，可以从预存在的癌性疾病调节抗体组中对该肿瘤分型。对患者进行常规分期，但是提供的抗体可以用于对患者进一步的分期。可以用现有的抗体立即对患者进行治疗，可以使用本文概述的方法或通过使用结合本文公开的筛选方法的噬菌体展示文库制备对肿瘤具有特异性的抗体组。将生成的所有抗体加入抗癌抗体文库，因为其它肿瘤可能与正在接受治疗的肿瘤具有一些相同的表位。如本方法产生的抗体可用于治疗任意数量患者的癌性疾病，所述患者具有结合这些抗体的癌症。
除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的疗法作为多模式治疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对非癌性细胞是相对无毒的事实允许使用高剂量抗体的组合，或者单独使用，或者与常规疗法联用。高治疗指数还允许按短时量程重复治疗，这将降低治疗抗性细胞出现的可能性。
如果患者耐受治疗的初始阶段或发生转移，可以重复产生肿瘤特异性抗体的过程用于再治疗。此外，可以将抗癌抗体与从该患者获得的红血细胞偶联并回输用于转移的治疗。对转移性癌症很少有有效的治疗且转移通常预示着导致死亡的不良结果。但是，转移性癌症常常是充分血管化的，且红细胞对抗癌抗体的递送具有在肿瘤部位聚集抗体的作用。甚至在转移前，大部分癌细胞的存活依赖于宿主的血液供应，与红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤也是有效的。可选择地，抗体可以与其它造血细胞偶联，所述细胞例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等等。
有5类抗体，且各类抗体与由其重链赋予的功能关联。一般认为，裸抗体的癌细胞杀伤是由抗体依赖的细胞的细胞毒性或补体依赖的细胞毒性介导的。例如鼠IgM以及IgG2a抗体可以通过与补体系统中的C-1成分结合激活人的补体，由此激活补体活化的经典途径，该途径可导致肿瘤裂解。对于人抗体，最有效的补体激活抗体一般为IgM和IgG1。鼠IgG2a和IgG3同种型抗体有效募集具有Fc受体的细胞毒性细胞，由此造成单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤。人的IgG1和IgG3同种型抗体均介导ADCC。
抗体介导的癌症杀伤的另一个可能机制可能通过抗体的使用，所述抗体能够催化细胞膜及其结合的糖蛋白或糖脂中的多种化学键的水解，即所谓的催化抗体。
有另外三种抗体介导的癌细胞杀伤机制。第一种机制是将抗体用作疫苗以诱导机体产生针对驻留于癌细胞的推定抗原的免疫反应。第二种机制是将抗体用于靶向生长受体并干扰它们的功能或者下调该受体以有效地使其功能丧失。第三种机制是这类抗体对细胞表面部分直接结合的作用，这可以导致直接的细胞死亡，例如死亡受体的结合，所述死亡受体例如TRAIL R1或者TRAIL R2，或是诸如αVβ3等的整合素分子的结合。
癌症药物的临床应用基于该药物在可接受的风险范围下对患者的有益效果。在癌症治疗中，存活率通常是最重要的获益目标，但是除了延长生命外，还存在大量其他公认的益处。治疗对存活率没有负面影响的情况下，这些其他益处包括症状的减轻、防止负面事件、延长复发或者无疾病存活的时间和延长进展时间。这些标准被普遍接受，像美国食品药品管理局(F.D.A.)等管理机构批准产生这些益处的药物(Hirschfeld et al.，Critical Reviews in Oncology/Hematolgy42：137-1432002)。除了这些标准外，还充分意识到还有其他指标可以预示这些类型的益处。部分地，美国F.D.A.授予的快速审批程序确认了存在很可能预测患者获益的替代品。到2003年末，有16种药物被这种程序批准，其中4种已经进入完全审批，即，后续研究已证明如替代指标所预示的直接患者获益。确定对实体瘤的药物作用的一个重要指标是通过测量对治疗的反应来评价肿瘤负荷(Therasse et al.，Journal of the National Cancer Institute92(3)：205-2162000)。这种评价的临床标准(RECIST标准)已经由实体瘤反应评价标准工作组(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors WorkingGroup)公布，所述工作组由国际癌症专家组成。正如RECIST标准的客观疗效显示的，与适当的对照组相比，对肿瘤负荷有确切作用的药物易于最终对患者产生直接的益处。通常，能够更直接地评价和记录临床前设置的肿瘤负荷。因为临床前研究可以转化成临床设置，所以在临床前模型中延长患者存活率的药物应该有最大的预期临床效用。与临床治疗产生的积极作用相似，在临床前设置中减轻肿瘤负荷的药物也对疾病有明显的直接影响。尽管延长生存时间是癌症药物治疗结果中最关注的临床结果，但仍有其他有临床作用的益处，显然，降低肿瘤负荷也能导致直接的益处，并具有临床作用，其与疾病进展的延迟、生存时间的延长或两者都有关系(Eckhardt et al.Developmental Therapeutics：Successes andFailures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds(发展的治疗学：靶化合物的临床试验设计的成功与失败)；ASCO Educational Book，39thAnnual Meeting，2003，pages209-219)。
基本使用US6,180,357的方法，在用患者肺肿瘤活检细胞使小鼠免疫之后，获得小鼠单克隆抗体H460-16-2。H460-16-2抗原在来自不同组织的广泛的人细胞系的细胞表面表达。乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MB-231)和皮肤癌细胞系A2058是体外对H460-16-2细胞毒性效应敏感的细胞系。
H460-16-2对培养的MB-231细胞的细胞毒性结果，通过在其被移植进小鼠时对这些癌细胞的抗肿瘤活性得以进一步扩大(如S.N.10/603,000中公开的)。临床前异种移植肿瘤模型被认为是治疗功效的有效预测。
在人乳腺癌的预防性体内模型中，在治疗期间，H460-16-2治疗比同型对照抗体显著更有效地(p<0.0001)抑制肿瘤生长。在治疗期结束时，接受H460-16-2的小鼠其肿瘤生长只有对照组的1.3％。在治疗后的随访期间，H460-16-2的治疗效应继续维持，治疗组的平均肿瘤体积继续显著地小于对照组，直到测量期结束。使用存活作为抗体功效的衡量指标，据估计在治疗后的70天，H460-16-2治疗组中的死亡风险是抗体缓冲液对照组的大约71％(p＝0.028)。这些数据说明H460-16-2治疗与对照治疗组相比具有存活益处。由于没有诱导任何毒性迹象，包括体重降低和临床痛苦，H460-16-2治疗看起来是安全的。因此，H460-16-2治疗是有效的，因为在完善的人乳腺癌模型中它与对照治疗组相比延缓了肿瘤的生长并提高了存活。
此外，H460-16-2在确立的体内肿瘤模型中证明了对MB-231细胞的抗肿瘤活性(如S.N.10/603,000中描述的)。将H460-16-2的治疗和标准化疗药物顺铂进行了比较，比较显示顺铂和H460-16-2治疗组相比于接受抗体稀释缓冲液或同型对照抗体治疗的组，具有显著小的平均肿瘤体积(p<0.001)。H460-16-2治疗介导了大约为顺铂化疗2/3的肿瘤抑制，但没有顺铂治疗中观察到的显著的(19.2％)体重降低(p<0.003)和临床痛苦，包括在顺铂治疗中观察到的2例治疗相关的死亡。H460-16-2的抗肿瘤活性及其最小化的毒性使其成为一种具有吸引力的抗癌治疗剂。
在治疗后阶段，H460-16-2显示了显著的存活益处(p<0.02)，因为在治疗后70天以后，H460-16-2组的死亡风险大约是同型对照抗体组的一半。观察到的存活益处持续到治疗后的120天，其中同型对照和顺铂治疗的小鼠100％死亡，而H460-16-2治疗组的死亡率为67％。H460-16-2通过延缓肿瘤生长维持对肿瘤的抑制，和同型对照抗体组相比延缓了26％。在治疗后的31天，H460-16-2通过减慢肿瘤生长从而限制肿瘤大小，与同型对照组相比减少48％，这和在治疗结束时观察到的49％的降低相当。在乳腺癌的确立的肿瘤模型中，这些结果意味着H460-16-2在超出治疗期以后维持肿瘤抑制的潜力，且证明了该抗体在哺乳动物中降低肿瘤负荷和提高存活的能力。
除了在确立的乳腺癌体内肿瘤模型中显示的有益效果，H460-16-2与化疗药物(顺铂)联合治疗在确立的体内前列腺癌模型中也具有抗PC-3细胞的抗肿瘤活性(如S.N.10/810,165所公开)。利用配对t-检验，在治疗周期后不久H460-16-2加顺铂的治疗在抑制肿瘤生长方面比缓冲液对照(p<0.0001)、单独的顺铂治疗(p＝0.004)或者单独的H460-16-2治疗(p<0.0001)显著更为有效。在疗程结束时，给予H460-16-2加顺铂的小鼠生长的肿瘤只有缓冲液对照组的28.5％。对于PC-3SCID异种移植模型，体重可以用作疾病进展的替代指标。所有组的小鼠都经历严重的体重减轻。该研究中，所有组的小鼠在疗程结束时体重减轻大约23％至35％。使用H460-16-2治疗的组显示最小程度的体重减轻(21.7％)。治疗后第48天，与缓冲液对照相比，与H460-16-2和顺铂的治疗有关的体重减轻没有显著的增加(p＝0.5042)。因此，H460-16-2加顺铂治疗是有效的，因为与同种型对照治疗组相比，其在已建立的人前列腺癌模型中延缓肿瘤生长。
为了证实H460-16-2表位是药物靶点，此前确定了H460-16-2抗原在正常人体组织中的表达(S.N.10/603,000)。通过与抗-CD44抗体、克隆L178(如S.N.10/647,818所公开)和克隆BU75(如S.N.10/810,165所公开))的比较，此项工作得到了扩展。通过H460-16-2的IHC染色，大部分组织未能表达H460-16-2抗原，包括重要器官的细胞，如肝、肾(管状上皮细胞的少量染色除外)、心脏和肺。组织染色的结果表明H460-16-2显示了对各种细胞类型的受限结合，但显示对侵润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞的结合。BU75抗体显示类似的染色模式。但是，存在至少一个值得注意的差异：与H460-16-2相比，BU75对淋巴细胞的染色更强。
H460-16-1抗原的定位及其在人群例如乳腺癌患者中普遍性的测定，在评价H460-16-2的治疗用途和设计有效的临床试验中非常重要。为了阐明H460-16-2抗原在癌症患者乳腺肿瘤中的表达，之前对来自50例乳腺癌患者的肿瘤组织样品中H460-16-2抗原的表达进行了筛选(S.N.10/603,000)，并与L178(S.N.10/647,818)、BU75(S.N.10/810,165)和抗-Her2抗体c-erbB-2(S.N.10/810,165)进行了比较。这些研究的结果是相似的，并显示62％的组织样品为H460-16-2抗原染色阳性而73％的乳腺肿瘤组织是BU75表位阳性的。患者样品中H460-16-2的表达显示对癌细胞的特异性，因为染色限于恶性细胞。H460-16-2染色了来自乳腺癌患者的10个正常组织样品中的4个，而BU75染色了8个。H460-16-2和BU75抗原的乳腺肿瘤表达看起来主要定位于恶性细胞的细胞膜，这使CD44成为治疗上引人注目的靶标。基于荷尔蒙雌激素和黄体酮受体在乳腺肿瘤中的表达对H460-16-2表达做了进一步评价，所述受体在乳腺肿瘤的发展、治疗和预后中发挥重要作用。H460-16-2抗原的表达与雌激素或者黄体酮受体的表达之间没有明显的相关性。当根据肿瘤的阶段或者癌症进展的程度分析肿瘤时，H460-16-2抗原表达和肿瘤阶段之间仍然没有明显的相关性。使用BU75获得了类似的结果。与c-erbB-2相比，H460-16-2显示完全不同的染色模式，其中52％的H460-16-2抗原阳性的乳腺肿瘤组织样品是Her2表达阴性的，表明仍然尚未得到满足的乳腺癌患者对靶向治疗的需要。在对H460-16-2和Her2都呈阳性的乳腺肿瘤组织切片之间存在染色强度的差异。c-erbB-2抗体还阳性染色了一个正常乳腺组织切片。
为了进一步拓展H460-16-2的潜在治疗益处，先前确定了抗原在各种人类癌症组织中的频率和定位(S.N.10/603,000)???并与克隆L178进行了比较(S.N.10/647,818)。这些肿瘤类型中的大部分对L178抗原也是阳性的。和人乳腺肿瘤组织一样，H460-16-2和L178的定位主要发生在肿瘤细胞的细胞膜上。但是，和H460-16-2抗体相比，L178基本上更多的定位于膜。并且，在对于II460-16-2和L178均发生染色的肿瘤类型中，43％的组织对L178抗体显示了更高强度的染色。
根据与文献中IHC数据的比较，表明没有CD44的形式与此处显示的IHC数据精确匹配。CD44的标准形式通常在人脑中表达；而H460-16-2抗原不是这样。靶向pan-CD44亚型的抗体不对肝(包括Kuppfer细胞)发生染色，并且对生殖周期的所有阶段的子宫内膜腺阳性染色。H460-16-2抗原清晰地存在于Kuppfer细胞上，并且只存在于生殖周期的分泌子宫内膜腺上。H460-16-2抗原清楚地存在于组织巨噬细胞上，并且只有变体形式V4/5和V8/9显示了偶尔的巨噬细胞染色。与抗-CD44L178和现在的BU75相比，观察到的H460-16-2相似但不同的结合模式说明H460-16-2抗原是CD44独特的表位。
如先前所公开的(S.N.10/647,818)，其他的生化数据也说明H460-16-2识别的抗原是CD44的形式之一。这得到了下述研究的支持，所述研究显示与CD44反应的单克隆抗体(L178)识别通过免疫沉淀与H460-16-2结合的蛋白。Western印迹研究也表明H460-16-2识别的CD44的表位在v6或v10上不存在。H460-16-2表位也可按照是糖和构象依赖性的而被区分，而很多抗CD44抗体是靶向CD44的肽部分。这些IHC和生化结果证明H460-16-2与CD44抗原的变体结合。因此优势证据显示H460-16-2通过与CD44变体上独特的糖依赖性构象表位的连接介导抗癌作用。为了本发明的目的，所述表位定义为“CD44抗原性部分”，其特征为与杂交瘤细胞系H460-16-2编码的单克隆抗体、其抗原结合片段或者其抗体偶联物相结合的能力。
为了进一步阐明H460-16-2抗癌作用的机制，进行透明质酸(HA)结合分析(如S.N.10/810,165所公开)。已经确定抑制50％的MDA-MB-231细胞与HA的粘附需要平均浓度为1.87(+/-1.01)微克/mL的H460-16-2。这些结果表明H460-16-2与CD44上负责结合HA的区域至少发生部分相互作用，因此能够利用通过血管发生的下调或者利用ECM的肿瘤入侵的下调来介导其抗癌作用。
除HA结合分析外，进行细胞周期实验以便确定H460-16-2的体外和体内抗癌作用是否归因于细胞周期的调节(如S.N.10/810,165所公开)。在使用20μg/mL的H460-16-224小时后，与同种型对照相比，MDA-MB-231凋亡细胞的数目增加。这种作用看起来也是剂量依赖性的。因此，H460-16-2的效果也可能全部或者部分归因于其凋亡诱导能力。
总体来说，该数据表明H460-16-2抗原是癌症相关抗原并在人体中表达，是一种病理相关的癌症靶标。此外，该数据还证明了H460-16-2抗体与人类癌症组织的结合，并可以适用于可以是诊断、治疗预测或者预后的分析。另外，因为在大部分非恶性细胞中缺乏该抗原的表达，该抗原的细胞膜定位指示了细胞的癌症状态，该发现允许该抗原、其基因或者衍生物、其蛋白或者其变体用于可以是诊断、治疗预测或者预后的分析。
其它涉及抗CD44抗体使用的研究具有H460-16-2所没有表现的治疗潜力的限制。H460-16-2证实了体外和体内的抗肿瘤活性。此前说明的抗体如MAK<CD44>M-1.1.12、MAK<CD44>M-2.42.3和MAK<CD44>M-4.3.16没有属于它们的体外和体内细胞毒性，且VFF-18与Mab U36没有表现固有的肿瘤细胞毒性。此外，其它表现了体内肿瘤效应的抗-CD44抗体也具有某些H460-16-2所没有的限制。例如，ASML1.1、K926、抗-CD44s和IM-78.1分别显示了对大鼠、小鼠、异种移植模型中的大鼠和小鼠肿瘤的体内抗肿瘤活性。H460-16-2在人体癌症模型中证实了抗肿瘤活性。H460-16-2也靶向人CD44，而抗体如ASML1.1只识别大鼠CD44。克隆515抗CD44抗体对人卵巢细胞系的腹膜肿瘤移植发生抑制但不防止或抑制肿瘤的生长。H460-16-2在SCID小鼠异种移植模型中能够抑制人乳腺肿瘤的生长。GKW.A3是一种抗-人CD44单克隆抗体，能够在预防性但非已确立的模型中抑制小鼠中生长的人转移性黑素瘤的肿瘤生长。H460-16-2已在预防性和已确立的人乳腺癌小鼠异种移植模型中证实了显著的抗肿瘤活性。因此，很明显，H460-16-2和此前说明的抗-CD44抗体相比具有更好的抗肿瘤性质。其在SCID小鼠的人乳腺肿瘤上的体外和体内抗肿瘤活性已被证实并且靶向人CD44。该抗体还在人乳腺癌的预防性和已确立(更加临床相关的)模型中显示了活性，并且它还与顺铂在人前列腺癌的已确立模型中显示了活性。
总而言之，本发明教导了H460-16-2抗原作为治疗剂靶标的用途，当其被给药时能够降低哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷(因此延缓疾病进展)，还能够导致被治疗哺乳动物的存活延长。本发明还教导了CDMAB(H460-16-2)和它的衍生物的用途：靶向它的抗原以降低哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，并延长具有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的存活。此外，本发明还教导了在结合其抗原后，H460-16-2能够干扰癌细胞与透明质酸相互作用的能力，且能造成癌细胞经受凋亡。此外，本发明还教导了在癌性细胞中检测H460-16-2抗原的用途，其可用于具有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、疗法预测和预后。
本发明描述了按照专利US6,180,357中描述的方法研发的H460-16-2的发展和用途，并通过其在细胞毒性测定、动物模型中未确立和已确立的肿瘤生长以及在延长癌性疾病患者存活时间中的作用来进行鉴定。本发明还描述了通过专利US6,180,357描述的方法研发的AR37A335.8的发展和用途，并在细胞毒性测定和动物模型肿瘤生长的预防性阻止中鉴定其作用。本发明代表了癌症治疗领域的进展，因为它第一次描述了与靶分子CD44上存在的一个或者多个表位特异结合的裸抗体，所述抗体还具有抗恶性肿瘤细胞而不是正常细胞的体外细胞毒性质，并且所述抗体在人类癌症的体内模型中还直接介导肿瘤生长的抑制和存活的延长。这是涉及任意其他先前描述的抗-CD44抗体的进展，因为没有一种显示具有相似的性质。它还提供了本领域内的进展，因为其首次清楚证明了CD44直接参与某些类型肿瘤的生长和发展相关的事件。它还代表了癌症疗法的进展，因为其具有在人类患者中表现类似抗癌性质的潜力。另一个进展是在抗癌症抗体文库中包含这些抗体，这将通过确定不同抗癌抗体的合适组合，提高靶向表达不同抗原标志物的肿瘤的可能性，以便最有效的靶向和抑制所述肿瘤的生长和发展。
总而言之，本发明教导了H460-16-2抗原作为治疗剂靶标的用途，当其被给药时能够降低哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，还能够导致被治疗哺乳动物的存活延长本发明还教导了CDMAB(H460-16-2和AR37A335.8)和它们的衍生物、其配体和抗原结合片段的用途：靶向它们的抗原以降低哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，并延长具有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的存活。此外，本发明还教导了在癌性细胞中检测H460-16-2和AR37A335.8抗原的用途，所述用途可用于具有表达该抗原的肿瘤哺的乳动物的诊断、治疗预测和预后。
因此，本发明的目的是利用产生培养的抗癌性细胞的癌性疾病调节抗体(CDMAB)的方法来分离杂交瘤细胞系和相应的由所述杂交瘤细胞系编码的分离的单克隆抗体和其抗原结合片段，所述癌性细胞来自特定个体或者一种或者多种特定癌细胞系，其中CDMAB对癌细胞是细胞毒性的但同时对非癌性细胞相对无毒。
本发明的另一个目的是教导癌性疾病调节抗体，其配体和其抗原结合片段。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体和配体，其细胞毒性通过抗体依赖的细胞毒性介导。
本发明的另一个目的还是产生癌性疾病调节抗体和配体，其细胞毒性通过补体依赖的细胞毒性介导。
本发明的另一个目的还是产生癌性疾病调节抗体和配体，其细胞毒性是它们催化细胞化学键水解的能力的功能。
本发明的另一个目的还是产生癌性疾病调节抗体或配体，其可用于癌症诊断、预后和监测的结合分析中。
本发明其他的目的和优点通过本发明下述的说明、举例和实施例、一些实施方式的描述将变得明显。
附图简述
图1比较了AR37A335.8杂交瘤上清抗细胞系PC-3、LnCap和CCD-27sk的百分比细胞毒性和结合水平。
图2是细胞毒性分析中AR37A335.8与阳性和阴性对照的比较。
图3表示AR37A335.8和抗-EGFR对照对癌症和正常细胞系的结合。数据制成表格，以高于同种型对照的倍数的增加来表示平均荧光强度。
图4包括针对癌和非癌细胞系的AR37A335.8和抗-EGFR抗体的代表性FACS直方图。
图5显示预防性MDA-MB-231乳腺癌模型中AR37A335.8对肿瘤生长的作用。垂直虚线指示抗体施用的时期。数据点表示平均值+/-SEM。
图6显示预防性MDA-MB-231乳腺癌模型中AR37A336.8对体重的作用。数据点表示平均值+/-SEM。
图7显示预防性SW1116结肠癌模型中AR37A337.8对肿瘤生长的作用。垂直虚线指示抗体施用的时期。数据点表示平均值+/-SEM。
图8显示预防性SW1116结肠癌模型中AR38A338.8对体重的作用。数据点表示平均值+/-SEM。
图9.来自MDA-MB-231细胞(泳道1)的全细胞膜部分的样品以及来自PC-3(泳道2)和CCD-27sk(泳道3)细胞系的全细胞裂解产物的样品的Western印迹，用AR37A335.8和H460-16-2作为探针检测。
图10.使用抗-CD44H460-16-2从MDA-MB-231细胞系的全细胞膜部分免测沉淀制备的免疫复合物的Western印迹。印迹的各条泳道分别用AR37A335.8(泳道1)、H460-16-2(泳道2)或者同种型对照抗体(泳道3)作为探针。
图11是人前列腺肿瘤和正常组织微阵列上H460-16-2结合的概要。
图12.显示在人组织微阵列中使用H460-16-2(A)或者同种型对照抗体(B)获得的前列腺肿瘤组织的结合模式、以及使用H460-16-2(C)或者同种型对照抗体(D)获得的正常前列腺组织的结合模式的代表性显微照片。H460-16-2对肿瘤细胞显示强阳性染色，而对正常组织的基质成纤维细胞显示弱染色。放大率是200×。
图13是人肝肿瘤和正常组织微阵列上H460-16-2结合的概要。
图14.显示在人组织微阵列中使用H460-16-2(A)或者同种型对照抗体(B)获得的肝肿瘤组织的结合模式、以及使用H460-16-2(C)或者同种型对照抗体(D)获得的非肿瘤肝组织的结合模式的代表性显微照片。H460-16-2对肿瘤细胞显示强阳性染色，并且染色限于窦内皮细胞(黑色箭头)和非肿瘤肝组织的侵润性淋巴细胞(绿色箭头)。放大率是200×。
图15是H460-16-2或者缓冲液治疗后，通过TUNEL分析或者H&E染色确定的MDA-MB-231肿瘤异种移植物中凋亡细胞数量的概要。
图16.H460-16-2mRNA的RT-PCR产物。轻链反应(图A)利用MuIgκVL5′-F(泳道1)或者MuIgκVL5′-C(泳道2)正向引物进行扩增。重链反应(图B)利用MuIgVH5′-A、B、C、D和F正向引物的混合物进行扩增。两个轻链反应(图A，泳道1和2)均显示450bp处的强条带，以及850bp处的弱条带。450bp条带是包含H460-16-2Vk基因的靶条带。重链反应(图B，泳道1)显示500bp处的强条带和1000bp处的弱条带。500bp处的条带是对应H460-16-2Vh基因的靶条带。
图17.EcoR I消化的质粒所述质粒分离自用pCR2.1(H460-16-2Vk)转化的大肠杆菌(E.coli)。顶部标明克隆编号。第一个数字表示使用的正向引物(MuIgκVL5′-F是1，而MuIgκVL5′-C是2)，第二个数字表示克隆编号(1-5)。分子量标记标在左侧。箭头指明期望的H460-16-2插入物的位置。
图18.EcoR I消化的质粒，所述质粒分离自用pCR2.1(H460-16-2Vh)转化的大肠杆菌。顶部标明克隆编号。分子量标记标在左侧。克隆1、2、3、4、5和8显示对应H460-16-2Vh基因的期望的500bp条带。
图19.pCR2.1(H460-16-2Vh)克隆的原始序列数据。
图20.EcoR I消化的质粒，所述质粒分离自用pCR2.1(H460-16-2Vh)转化的大肠杆菌。顶部标明克隆编号。分子量标记标在左侧。箭头指明期望的H460-16-2Vh插入物的位置。
图21.pCR2.1(H460-16-2Vk)和pCR2.1(H460-16-2Vh)克隆的原始序列数据。
图22.pHC-huCg1载体(也称为pCH-huIg1)的质粒示意图。人Cγ1的恒定区位于Hind III和Xho I限制性位点之间。显示了细菌(氨苄青霉素)和哺乳动物细胞(新霉素)的选择标记物。该质粒由G.R.McLean等提供。
图23.引物序列。
图24.PCR扩增的pCH-huIg1(图A，泳道1)、H460-16-2Vk(图A，泳道2)和H460-16-2Vh(图B，泳道1)。PCR扩增在现有模板中添加合适的限制性酶切位点。紧接在pCH-huIg1载体的现有Hind III位点的下游添加BsiW I位点。1100bp条带(泳道1)是位于Hind III和Xba I位点之间的质粒扩增区。在H460-16-2Vk基因的5′端添加Nhe I位点，3′端添加Not I位点。在该基因的5′端添加Nhe I位点，3′端添加BsiW I位点。所获H460-16-2Vk(图A，泳道2)和H460-16-2Vh(图B，泳道1)条带的大小与原来基因(约450bp)的大小相似，因为几乎没有添加核苷酸。
图25.人IgG1重链恒定区PCR产物(泳道1)和pCH-hulg1质粒(泳道2)的消化。图A是利用Hind III的单一消化。图B是利用Hind III和XhoI的双重消化。两种消化之间(图A和B)PCR产物的大小(泳道1)仍保持约1000bp不变，因为消化几乎没有去除核苷酸。pCH-huIg1质粒(泳道2)被Hind III完全线性化(图A)。在质粒双重消化中出现与PRC消化产物大小相等的条带(泳道2，图B)，约为1000bp。这是将用PCR产物替换的质粒部分，其包含新的BsiW I位点。
图26.BsiW I用改变的切割位点消化pCH-huIg1。给pCH-huIg1添加BsiW I限制性位点以促进H460-16-2(其包含一个内部的Hind III位点)的克隆。从改变的质粒转化的大肠杆菌细胞分离质粒，并用BsiW I消化以确定是否并入了切割位点。除了泳道11外，在每条泳道标明克隆编号，所述泳道11是未消化的对照质粒(克隆#5)。除了4和8外的所有克隆在消化时被线性化，这证实它们包含新的切割位点。克隆4和8表现的与未切割对照的泳道11一样，表明它们不包含新的切割位点。
图27.pCL-huCk载体的质粒示意图。人Ck的恒定区位于Not I和Xho I限制性位点之间。可变区位于Nhe I和Not I位点之间。显示了细菌(氨苄青霉素)和哺乳动物细胞(嘌呤霉素)的选择标记物。该质粒由G.R.McLean等提供。
图28.Bg1II和Not I消化的pCL-huCk和H460-16-2Vk。pCL-huCk质粒(泳道1)和H460-16-2Vk PCR产物(泳道2)用Bg1II和Not I消化以有利于克隆。消化的质粒(泳道1)表现为一条大分子量条带，该条带是质粒骨架，以及一条大约400bp的条带，该条带是将被H460-16-2Vk替换的轻链可变区。H460-16-2Vk PCR产物(泳道2)也表现为约400bp，这是轻链可变区的预期大小。
图29.BsiW I和Nhe I消化的H460-16-2Vh和pCH-huIg1。图A显示450bp处的BsiW I和Nhe I消化的H460-16-2Vh PCR产物。图B显示用BsiW I(泳道1)消化以及用BsiW I和Nhe I(泳道2)消化的pCH-huIg1。单一pCH-huIg1消化(图B，泳道1)表现为大分子量条带，而在双重消化中是具有450bp插入物的大分子量条带(图B，泳道2)，其对应将被H460-16-2Vh替换的重链可变区。
图30.Bgl II和Not I消化的质粒在1％琼脂糖凝胶中电泳，所述质粒从pCL-huCk(H460-16-2Vk)转化的大肠杆菌分离。泳道上方的数字标明克隆编号。除了#1之外的所有克隆显示对应H460-16-2Vk基因的期望的约400bp插入物。
图31.BsiW I和NheI消化的质粒在1.2％琼脂糖凝胶中电泳，所述质粒从用pCH-huIg1(H460-16-2Vh)转化的大肠杆菌分离。泳道上方的数字标明克隆编号。所有克隆具有对应H460-16-2Vh基因的期望的450bp插入物。
图32.pNEF38表达载体(ICOS，Seattle，WA)的质粒示意图。利用MluI和Xba I限制性酶切位点，嵌合H460-16-2Vk基因被克隆入多克隆位点(MCS)。该质粒的选择标记物是新霉素抗性(NeoR)基因，其使转染细胞具有在(G418硫酸盐)存在条件下生长的能力。
图33.pDEF38表达载体(ICOS，Seattle，WA)的质粒示意图。利用MluI和Xba I限制性位点，嵌合H460-16-2Vh基因被克隆入多克隆位点(MCS)。该质粒的选择标记物是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，其使转染的DHFR缺陷细胞具有在缺乏胸腺嘧啶核苷和次黄嘌呤的条件下生长的能力。
图34.改变限制性位点的H460-16-2Vk(图A)和VH(图B)PCR产物分别在1.2％和1.0％琼脂糖凝胶中电泳。嵌合轻链PCR反应(图A，泳道1)在约800bp产生一条单一条带，其对应轻链可变区(420bp)和恒定区(320bp)组合的预期大小。重链PCR反应(图B)在约1500bp产生一条单一条带，其对应重链可变区(450bp)和恒定区(990bp)两者的预期大小。
图35.Xba I和Mul I消化的质粒所述质粒从pNEF38(H460-16-2Vk)(图A)和pDEF38(H460-16-2Vh)(图B)转化的大肠杆菌分离。重链质粒(图B)还用Xba I、Mul I和BsiW I三重消化(泳道1B、2B、4B和6B)。对于轻链质粒(图A)，除了#3外的所有克隆都具有期望的750bp插入物，其对应轻链可变区和恒定区。对于重链质粒，Xba I和Mlu I消化物(图B，泳道1A、2A和6A)显示1500bp的插入物，其对应重链可变区和恒定区。Xba I、Mlu I和BsiW I消化的重链质粒(图B，泳道1B、2B和6B)在1000bp和500bp处显示条带，其分别对应重链恒定区和可变区。克隆4(图B)根本不显示条带，标明反应设置存在问题。
图36.pNEF38(H460-16-2Vk)和pDEF38(H460-16-2Vh)克隆的原始序列数据。
图37.pMPGCR5IgG1-Vk+hH460的图谱。R&B poly A：兔β-球蛋白聚腺苷酰作用信号；phCMV：巨细胞病毒启动子；Ad Tp1：腺病毒三联前导序列；P2(6)：cumate反式激活因子(cTA)的结合结构域；IgG1-VhH460：H460-16-2重链的编码序列；VkH460：H460-16-2轻链的编码序列。BK T3′：BK病毒的大T抗原部分；TK：胸苷激酶；enh MPL：腺病毒主要晚期启动子的增强子。
图38.pMPGCR5B43k的图谱。
图39.pkCR5B43G3的图谱。
图40.通过Western印迹对不同克隆产生的H460-16-2(IgG1同种型)的定量(泳道1-6：分别为0、25、50、100、150和200ng的人IgG；泳道7：克隆17；泳道8：克隆71；泳道9：克隆80；泳道10：克隆6’；泳道11：克隆47’；泳道12：克隆147’；泳道13：100ng纯的H460-16-2；泳道14：10微升杂交瘤血清)。
图41.通过SDS-PAGE对不同克隆产生的H460-16-2(IgG1同种型)的定量(泳道1-5：分别为50、100、150、200和0ng的人IgG；泳道6：克隆17；泳道7：克隆71；泳道8：克隆80；泳道9：克隆6’；泳道10：克隆47’；泳道11：克隆147’；泳道12：100ng细胞上清中的人IgG；泳道13：100ng纯的H460-16-2；泳道14：10微升杂交瘤血清)。
图42.pMPGCR5VK+h460-IgG2的图谱。R&B poly A：兔β-球蛋白聚腺苷酰作用信号；phCMV：巨细胞病毒启动子；Ad Tp1：腺病毒三联前导序列；P2(6)：cumate反式激活因子(cTA)的结合结构域；Vh-H460IgG2：H460-16-2重链的编码序列；Vk-H460：H460-16-2轻链的编码序列。BK T：BK病毒的大T抗原部分；TK：胸苷激酶；enh MPL：腺病毒主要晚期启动子的增强子。
图43.用于构建H460-16-2的嵌合IgG2同种型的引物列表。
图44.第一轮克隆后，western印迹检测的H460-16-2的IgG2同种型的表达。来源于筛选所得克隆的250000个细胞重悬于500微升培养基。置于37℃24小时后，利用偶联HRP的抗人抗体通过western印迹分析10微升上清。
图45.在37℃将来源于不同亚克隆的细胞以5.0×105细胞/mL涂板。当细胞密度达到1.5至2.0×106细胞/mL时，它们被转移到30℃。置于30℃7天后，通过SDS-PAGE继之以考马斯Fluor-Orange染色来分析指定量的上清量。显示了产生的抗体量(ng/微升)。
图46.通过对MDA-MB-231细胞全细胞膜部分的Western印迹，对嵌合(ch)ARH460-16-2-IgG1克隆的表征。
图47.通过对MDA-MB-231细胞全细胞膜部分的Western印迹，对嵌合(ch)ARH460-16-2-IgG2克隆的表征。
图48.通过SDS-PAGE继之以考马斯Fluo-Orange染料的染色，对CHOcTA克隆6’产生抗体的抗体浓度的分析。
图49.通过SDS-PAGE继之以考马斯Fluo-Orange染料的染色，对克隆40B7产生抗体的抗体浓度的分析。
图50显示人乳腺癌的小鼠模型中，H460-16-2、(ch)ARH460-16-2-IgG1和(ch)ARH460-16-2-IgG2治疗对肿瘤生长的作用。肿瘤体积表示为组平均值±SEM。垂直虚线指示给药的第一天和最后一天。
图51显示研究期间单克隆抗体治疗对体重的影响。体重表示为组平均值±SEM。
图52显示两个独立的膜联蛋白-V染色实验中获得的鼠和嵌合H460-16-2抗体的总凋亡作用。
发明详述
下面用于概述、描述、实施例和权利要求书中的字词或短语通常都有其指定的含义。
术语“抗体”使用其最广泛的涵义，且特别包括，例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体，脱免疫的、鼠的、嵌合的或人源化的抗体)、携带有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体、抗体的免疫偶联物和抗体片段(见下文)。
本文使用的术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，也就是说，包括这群抗体的单个抗体是相同的，除了可以少量存在的可能的自然发生的变异。单克隆抗体针对单一抗原部位是高度特异性的。而且，与包含针对不同决定基(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一的决定基。除了特异性之外，单克隆抗体在合成方面也是有优势的，其合成可以不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆的”指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，而不能解释为需要通过任何特定方法的抗体产生。例如，本文使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”也可以从噬菌体抗体文库中分离，使用的技术在例如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)中描述过。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区域或其可变区。抗体片段的实例包括非全长的抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双功能抗体(diabodies)；线形抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整”抗体指不但包含轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2、CH3，还包含结合抗原的可变区的抗体。恒定结构域可以是天然序列的恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列的变体。优选地，完整抗体有一个或多个效应功能。
依据完整抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以分为不同的“种类”。主要有五类完整的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同种类抗体对应的重链恒定区分别被称为α，δ，ε，γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的三维空间结构和亚结构是公知的。
抗体“效应功能”指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或氨基酸序列变体的Fc区)的生物活性。抗体效应功能的实例包括Clq结合；补体依赖的细胞毒性作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后导致该靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。关于造血细胞FcR表达的总结见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)第464页的表3。为了测定目标分子的ADCC活性，可以进行例如美国专利5,500,362或5,821,337描述的体外ADCC活性分析。用于这类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地或附加地，目标分子的ADCC活性可以在体内评价，例如在诸如Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中。
“效应细胞”指表达一种或多种FcR、执行效应功能的白细胞。优选地，这些细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源中分离，例如从本文中描述的血液或PBMC中分离。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合于抗体Fe区的受体。优选的FcR是天然序列的人类FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体(γ受体)的受体，并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和可选择的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，两者的氨基酸序列相似，主要不同在于其胞浆结构域。激活性受体FcγRIIA在其胞浆结构域含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞浆结构域含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见综述M.in 
Figure G2007800154239D0031165641QIETU
，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)。FcR综述于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)；Capel et al.，Immunomethods4：25-34(1994)和deHaas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。本发明中的术语“FcR”包括将来要被鉴定的FcR在内的其他FcR。该术语也包括负责将母体的IgG转运到胎儿体内的新生受体，FcRn(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，Eur.J.Immunol.24：2429(1994))。
“补体依赖性细胞毒性作用”或“CDC”指分子在补体存在下，裂解靶细胞的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(Clq)与交联了同源抗原的分子(比如，抗体)的结合而起始。为了评价补体激活，可以进行如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods202：163(1996)中描述的CDC分析。
术语“可变的”指可变结构域某些部分的序列在抗体间高度不同，并用于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变化并不是均匀分布在抗体的可变结构域内。在轻链和重链的可变结构域内，变化集中在所谓的高度可变区的三个区域内。可变结构域内更加高度保守的部分被称为骨架区(FR)。每个天然的重链和轻链可变结构域，包含主要采用β-片层构型的四个FR，其由三个高度可变区连接在一起，形成环状连接，在一些情况下形成部分>片层结构。每条链的高度可变区由FR以密切靠近的方式结合一起，并与其他链的高度可变区一起，有助于抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat et al，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现各种效应功能，例如参与抗体在抗体依赖性的细胞毒效应(ADCC)中的作用。
本文使用的术语“高度可变区”指抗体上负责与抗原结合的氨基酸残基。高度可变区通常包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域的氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变结构域的氨基酸残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))和/或“高变环”区的那些残基(例如轻链可变结构域的残基2632(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.MoI.Biol.196：901-917(1987))。“骨架区”或“FR”残基指除了本文定义的高变区残基之外的那些可变区的残基。木瓜蛋白酶水解抗体产生了两个相同的被称为“Fab”片段的抗原结合片段和一个残余的“Fc”片段，每个“Fab”片段都有单一的抗原结合部位，“Fc”片段的名称反映了其易结晶的能力。抗体经胃蛋白酶处理后，产生F(ab′)2片段，其有两个抗原结合部位，仍能够与抗原交联。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此区域由以非共价键的方式紧密结合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体构成。以这种每个可变结构域的三个高变区相互作用的构型决定VH-VL二聚体表面的抗原结合部位。六个高变区域共同赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，即便单一的可变结构域(或只含有三个抗原特异性高变区的一半的Fv)仍能够识别和结合抗原，虽然比完整结合位点的亲和性低。Fab片段也含有轻链恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同在于重链CH1结构域的羧基末端多了几个氨基酸残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本文中指代Fab′，其中恒定结构域的半胱氨酸残基至少携带一个游离的硫基。最初的F(ab′)2抗体片段以Fab′片段对产生，之间有铰链的半胱氨酸。其他的抗体片段的化学偶联也是公知的。
来自任意脊椎动物的抗体的“轻链”都可以归于两种截然不同的所谓κ和λ链中的一种，κ和λ链的分类基于其恒定结构域的氨基酸序列。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一的多肽链上。优选地，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽连接子，使scFv形成适于抗原结合的结构。关于scFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994)。
术语“双功能抗体(Diabodies)”指带有两个抗原结合位点的小型抗体片段，其在相同多肽链上(VH-VL)含有与轻链可变结构域(VL)结合的重链可变结构域(VH)。使用连接子，该连接子过短不能在同一条链上使两个结构域成对，这些结构域被迫与另一条链上的互补结构域配对，由此产生了两个抗原结合位点。例如在EP404，097；WO93/11161；和Hollinger etal.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)中对于双功能抗体作了更详细的描述。
“分离”抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗体。其天然环境下的污染成分是指干扰抗体诊断或治疗性用途的物质，可能包括酶、激素和其它的蛋白质或非蛋白质溶质。因为抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在，所以分离抗体包括重组细胞内部的原位抗体。但是，通常分离抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。
“结合”目的抗原(例如，CD44抗原部分)的抗体是指能够对该抗原部分有充分亲和力的抗体，以致该抗体在靶向表达该抗原的细胞时，可以作为治疗剂。如果抗体是结合CD44抗原部分的抗体，那么它通常会优先结合CD44抗原部分，而不是其它受体，这不包括诸如非特异性的Fc接触的偶然结合或与其他抗原共有的翻译后修饰成分结合，该抗体不会与其他蛋白有明显的相互作用。检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，可包括但并不局限于诸如FACS、细胞ELISA和Western印迹等分析。
如本文使用的，“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”的表述可以交替使用，所有这些用法都包括其子代。也可以理解为由于人为的或非人为的突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化细胞内筛选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。在上下文中，将清楚地有意使用不同的指代。
“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)靶向的病理状态或病症。需要治疗的个体不仅包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体，还包括那些已经存在所述病症的个体。因此，本文中欲被治疗的哺乳动物可已经被诊断为患有该病症或可倾向于或易感于该病症。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长或死亡不受调控。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症更多具体的实例包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌的胃癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝脏癌症，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺肿瘤，肾癌，前列腺癌，外阴肿瘤，甲状腺癌，肝癌，肛癌，阴茎癌，还有头颈部癌。
“化疗剂”是可用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括：诸如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化剂；例如白消安(husulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、乌瑞替派(uredopa)的氮丙啶类；包括六甲蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙烯亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamine)；如瘤可宁(chlorambucil)、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀(uracil mustard)等氮芥类药物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀等硝脲类(nitrosureas)；如阿克拉霉素类、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里刹霉素、洋红霉素、碳霉素(camomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、灰霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星类的抗生素；甲氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)类抗代谢类药；如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸拟似物；如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫米嘌呤、硫鸟嘌呤类嘌呤类似物；如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮等男性激素类药物；如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺类药物；如亚叶酸等叶酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；
Figure G2007800154239D0035170430QIETU
；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2＂-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(＂Ara-C＂)；环磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(泰素，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(泰素帝，Aventis，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)等紫杉烷类；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；如顺铂和卡铂等铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春碱；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；esperamicins；卡培他滨；以及上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素类药物也包括在本定义内，像抗雌激素药物，例如，包括它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷诺昔芬、LY117018、奥那司酮、托瑞米芬(法乐通)；抗雄激素物质，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林；以及上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。
用于治疗目的的“哺乳动物”指任何一种可归于哺乳类的动物，包括人类、小鼠、免疫缺陷鼠或裸鼠或品系小鼠、家畜和农场动物及动物园内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。优选地，本文的哺乳动物指人类。
“寡核苷酸”指短长度、单链或双链多聚脱氧核苷酸，其可利用已知的方法化学合成(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学)，利用例如发表于1988年5月4日的EP266,032描述的固相技术；或利用Froehler et al，Nucl.Acids Res.，14：5399-5407，1986描述的脱氧核苷H-磷酸盐中间物。然后用聚丙烯酰胺凝胶纯化。
除非另外指出，当在本文使用时，术语“CD44抗原部分”是指单链透明质酸(HA)结合糖蛋白，其还称为透明质酸受体、H-CAM、gp85和Hermes。
诱导“凋亡”的抗体是诱导程序化细胞死亡的抗体，所述程序化细胞死亡由膜联蛋白V的结合、DNA的断裂、细胞皱缩、内质网扩张、细胞破碎和/或膜囊(称为凋亡体)的形成来确定。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其部分重链和/或轻链与来自特定种属或者属于特定抗体种类或者亚类的抗体的对应序列相同或者同源，同时链上余下序列与来源于另一种属或者属于另一种类或者亚类的抗体的对应序列相同或者同源，此外还指这些抗体的片段，只要这些片段能够表现出所需的生物活性(美国专利4,816,567和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab′，F(ab)2或抗体的其他抗原结合序列)，其包含来源自非人免疫球蛋白的最小序列。在绝大多数情况下，人源化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中，所述受者抗体的互补决定区(CDR)的残基被诸如具有所需的特异性、亲和力、能力的小鼠、大鼠或兔等的非人类抗体(供者抗体)的CDR的残基所替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人类FR残基所替代。此外，人源化抗体可以包括既不在受者抗体也不在引入的CDR或FR序列的残基。这些修饰进一步改善和优化了抗体的性能。通常，人源化抗体包括至少一个，通常是两个可变区的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应非人类免疫球蛋白的CDR区，且全部或基本上全部的FR残基是人类免疫球蛋白共有序列的FR残基。人源化抗体也最适宜包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人类免疫球蛋白的恒定区。
“脱免疫化”抗体是对给定的物种没有免疫原性或免疫原性较差的免疫球蛋白。通过改造抗体的结构可以实现脱免疫化。任何本领域技术人员公知的脱免疫化技术都可以使用。例如，在发表于2000年6月15日的WO00/34317中，描述了一项使抗体脱免疫原性的适当的技术。
“同源性”被定义为比对序列和必要时引入间隔，以实现最大百分比同源性后，氨基酸序列变体中相同残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。
本说明书自始至终，将杂交瘤细胞系以及从其产生的分离的单克隆抗体，通过其固有命名法而分别称作H460-16-2和AR37A335.8，或者用保藏命名，分别称作ATCC保藏号PTA-4621或者IDAC280104-06。
本文使用的“配体”包含对靶抗原显示结合特异性的部分，其可以是完整的抗体分子和至少具有抗原结合区或者其部分(即，抗体分子的可变部分)的任意分子，例如，Fv分子，Fab分子，Fab′分子，F(ab′)2分子，双特异抗体，融合蛋白，或者任意遗传工程化分子，所述分子特异识别并结合与分离的单克隆抗体结合的抗原，所述单克隆抗体由命名为ATCC保藏号PTA-4621或者IDAC280104-06(ATCC PTA-4621或者IDAC280104-06抗原)的杂交瘤细胞系产生。
本文使用的“抗原结合区”表示识别靶抗原的分子的部分。
本文使用的“竞争性抑制”表示能够识别并结合决定簇位点，在常规抗体相互竞争分析中，由命名为PTA-4621或者IDAC280104-06的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(PTA-4621或者IDAC280104-06抗体)针对所述决定簇位点(Belanger L.，Sylvestre C.and Dufour D.(1973)，Enzymelinked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwichprocedures(竞争和夹心法的甲胎蛋白的酶联免疫测定).Clinica ChimicaActa48，15)。
本文使用的“靶抗原”是PTA-4621或者IDAC280104-06抗原或者其部分。
如本文所用，“免疫偶联物”指以化学或生物学方式与细胞毒素、放射性试剂、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂结合的诸如抗体的任何分子或配体。该抗体可以在所述分子的任一部位与细胞毒素、放射性试剂、抗肿瘤药或治疗剂连接，只要它能够与其靶标结合。免疫偶联物的实例包括抗体毒素化学偶联物和抗体-毒素融合蛋白。
如本文所用，“融合蛋白”指任一嵌合蛋白，其中，抗原结合区与例如毒素、酶或蛋白药物的生物活性分子连接。
为了更充分理解本文中描述的发明，进行下述说明。
本发明提供配体(即，PTA-4621或者IDAC280104-06配体)，其特异识别并结合PTA-4621或者IDAC280104-06抗原。
本发明的配体可以采用任何形式，只要它具有抗原结合区，所述抗原结合区竞争性抑制杂交瘤PTA-4621或者IDAC280104-06产生的单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异结合。因此，与IDAC280104-06抗体具有相同结合特异性的任意重组蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗体与诸如淋巴因子或者肿瘤抑制生长因子的另一蛋白结合)也属于本发明的范围。
在本发明的一个实施方案中，所述配体是PTA-4621或者IDAC280104-06抗体。
在其他实施方案中，所述配体是抗原结合片段，其可以是具有PTA-4621或者IDAC280104-06抗体的抗原-结合区的Fv分子(例如单链Fv分子)、Fab分子、Fab′分子、F(ab′)2分子、融合蛋白、双特异抗体、异种抗体或者任意重组分子。本发明的配体针对PTA-4621或者IDAC280104-06单克隆抗体针对的表位。
本发明的配体可以被修饰，即，通过分子内的氨基酸修饰，从而产生衍生物分子。化学修饰也是可能的。
衍生物分子将保留所述多肽的功能性性质，即，具有这类取代的分子将仍然允许所述多肽与PTA-4621或者IDAC280104-06抗原或者其部分结合。
这些氨基酸取代包括在本领域中公知的“保守”氨基酸取代，但并不局限于此。
举例来说，某些被称为“保守氨基酸取代”的氨基酸取代能够在蛋白中经常出现，但并不改变该蛋白的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。
这些改变包括任一异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)取代任何其他的疏水氨基酸；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。其他的取代也可被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境和其在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可经常互换，丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的甲硫氨酸(M)可经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常互换，其发生部位氨基酸残基的明显特征是其带电，这两种氨基酸残基的不同pK的差别并不明显。在特定情境下，仍有其他的一些变化可以被认为是“保守的”。
给定一种抗体，本领域普通技术人员可以生成竞争性抑制配体，例如竞争性抗体，其可识别相同的表位(Belanger et al.，1973)。一种方法是用表达该抗体识别抗原的免疫原产生免疫。该样品可以包括组织、分离的蛋白或细胞系，但并不局限于这些。可以用竞争性分析筛选产生的杂交瘤，该分析能鉴定抑制所检测抗体结合的抗体，所述分析例如ELISA、FACS或免疫沉淀。另一种方法可以利用噬菌体展示文库，淘选识别所述抗原的抗体(Rubinstein et al.，2003)。在任一情况下，杂交瘤的选择都是基于它们的竞争过原抗体与其靶抗原的结合的能力。因此，这些杂交瘤的特征是识别与所述原抗体相同的抗原，并且这些杂交瘤将更为特异地识别同样的表位。
实施例1
杂交瘤制备-杂交瘤细胞系AR37A335.8
依据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系AR37A335.8于2004年1月28日保藏于加拿大国际微生物保藏单位(IDAC)，位于加拿大马尼托巴省R3E3R2温尼伯市阿林顿街道1015的加拿大卫生部微生物局，保藏号为280104-06。依据37CFR1.808的规定，保藏者保证在专利授权时将不可撤销地取消对公众获取该保藏材料的所有限制。
为了制备产生抗癌抗体AR37A335.8的杂交瘤，在PBS中制备新鲜的PC-3前列腺癌细胞系的单细胞悬液，所述PC-3前列腺癌细胞系已经在SCID小鼠中生长为实体瘤。将IMMUNEASYTM(Qiagen，Venlo，Netherlands)佐剂轻轻混合后备用。通过皮下注射含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂来免疫五到七周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后2和5周，用新鲜制备的含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂腹腔注射加强免疫小鼠。末次免疫后第3天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与NSO-1骨髓瘤细胞伴侣融合，制备杂交瘤。检测杂交瘤亚克隆融合的上清。
为了检测杂交瘤分泌的抗体是IgG，还是IgM同种型，进行ELISA分析。将4℃包被缓冲液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.2-9.6)中的浓度为2.4μg/ml的山羊抗小鼠的IgG+IgM(H+L)，按100μl/孔加入ELISA板过夜。该ELISA板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween)洗三次。按100μl/孔加入封闭缓冲液(5％奶洗涤缓冲液)，室温1小时，随后用洗涤缓冲液洗三次。按100μl/孔加入杂交瘤上清，将该板室温孵育1小时。该板用洗涤缓冲液洗三次，按100μl/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣根过氧化物酶偶联物的1/100,000稀释液(用含5％奶的PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤缓冲液洗三次。按100μl/孔加入TMB溶液，室温孵育1-3分钟。按100μl/孔加入2M H2SO4，终止颜色反应，用Pcrkin-Elmr HTS7000读板仪在450nm处读板。如图1所示，AR37A335.8杂交瘤主要分泌IgG同种型抗体。
为了确定杂交瘤细胞分泌抗体的亚类，使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(GE Healthcare，Piscataway，NJ)进行分型实验。向检测管中添加包含抗体的杂交瘤上清(用TBS-T1:10稀释)，所述检测管包含载有对不同类型肽链特异的山羊抗体的分型检测条。将检测管摇动15分钟。边摇动边用TBS-T清洗检测条两次，每次5分钟。向检测管中添加过氧化物酶标记的、种特异性的抗小鼠抗体(用TBS-T1:500稀释)15分钟以测定与检测条上山羊抗体结合的单克隆抗体。边摇动边用TBS-T再清洗检测条两次，每次5分钟。然后利用过氧化物酶底物系统检测与检测条结合的过氧化物酶标记抗体。在10mL冰乙醇中溶解一颗4-氯-1-萘酚的30mg片剂，并在50mL TBS中稀释一滴过氧化氢溶液(30％v/v)。这两种溶液仅在使用前直接混合，边搅拌边向分型检测条中添加3mL15分钟。然后倒掉底物溶液，边搅拌边用5mL蒸馏水清洗检测条三次。然后从检测管中取出分型检测条并分析结果。抗癌抗体AR37A335.8是IgG2b，λ同种型。
经过一轮有限稀释，在细胞ELISA分析中，检测杂交瘤上清中与靶细胞结合的抗体。检测了2种前列腺癌细胞系，和1种人正常皮肤细胞系：分别是PC-3、LnCap和CCD-27sk。涂板的细胞在使用前先固定。室温下，该板用包含MgCl2和CaCl2的PBS洗涤三次。每孔加PBS稀释的2％多聚甲醛100μl，室温10分钟，然后倒掉。室温下，该板用包含MgCl2和CaCl2的PBS再洗涤三次。每孔加100μl溶于洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween)的5％奶进行封闭，室温1小时。该板用洗涤缓冲液洗三次，按75μl/孔加入杂交瘤上清，室温孵育1小时。用洗涤缓冲液将该板洗三次，按100μl/孔加入辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠的IgG抗体的1/25,000稀释液(用含5％奶的PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤缓冲液洗三次，每孔加入100μl TMB底物，室温孵育1-3分钟。每孔加入100μl2MH2SO4终止反应，用Perkin-Elmer HTS7000读板仪在450nm处读板。如图1列表所示，结果表示为与实验室制备(in-house)的IgG同种型对照相比，高出背景的倍数，事先已经证明该对照不与所检测的细胞系结合。来源于杂交瘤AR37A335.8的抗体显示与前列腺癌细胞系PC-3和皮肤细胞系CCD-27sk的实质结合。AR37A335.8不显示与另一种前列腺癌细胞系LnCap的任意可检测结合。
进行抗体结合试验的同时，在相同细胞系PC-3、LnCap和CCD-27sk中检测了杂交瘤上清的细胞毒性作用。钙黄绿素(calcein)AM购自Molecular Probes(Eugene，OR)。按照下面列出的变化根据制造商的说明书进行分析。所述分析前将细胞以预定的合适密度进行涂板。2天后，将来自杂交瘤微量滴定板的100微升上清转移到细胞板，在5％CO2培养箱中孵育5天。将阳性对照孔吸净，加入100μl叠氮钠(NaN3)或者放线菌酮。经过5天处理后，翻转倒空所述板的液体并吸干。通过多通道挤瓶将室温下包含MgCl2和CaCl2的DPBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲液)分入每个孔中，敲3次，翻转倒空，然后吸干。将用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的50微升荧光钙黄绿素染料添加到每个孔中，在5％CO2培养箱中37℃孵育30分钟。Perkin-Elmer HTS7000荧光读板仪读板，数据用Microsoft Excel进行分析。结果列表于图1。AR37A335.8杂交瘤在LnCap细胞中产生16％的特异细胞毒性，这分别是从阳性对照叠氮钠和放线菌酮得到的细胞毒性的21％和30％。图1的结果表明AR37A335.8的细胞毒性作用不与其对癌细胞类型的结合水平成正比。尽管PC-3细胞中的结合水平更高，但是与PC-3细胞相比，LnCap细胞中产生的细胞毒性水平更高。因此，结合不是必然预示着抗体与其同源抗原连接的结果，而是一种不确定的发现。这表明不同细胞中抗体连接的环境确定细胞毒性，而不仅仅是抗体结合。如图1所示，AR37A335.8在CCD-27sk正常细胞系中不产生细胞毒性。已知的非特异性的细胞毒性剂放线菌酮和NaN3产生了预期的细胞毒性。
实施例2
抗体制备：
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培养杂交瘤来制备AR37A335.8单克隆抗体，每周两次收集和再接种。然后是利用ProteinG Sepharose4Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)的标准抗体纯化步骤。利用人、脱免疫、人源化、嵌合或者鼠的单克隆抗体也在本发明的范围内。
细胞毒性分析中，AR37A335.8与大量阳性(抗-EGFR(C225，IgG1，κ，5微克/mL，Cedarlane，Hornby，ON)、放线菌酮(CHX，0.5微摩尔，Sigma，Oakville，ON)和NaN3(0.1％，Sigma，Oakville，ON))和阴性(MPC-11(抗原特异性未知的，IgG2b，κ，20微克/mL，BD Biosciences，Oakville，ON))对照，以及缓冲液稀释的对照进行比较(图2)。检测结肠(DLD-1和Lovo)、卵巢癌(OVCAR-3)和非癌肺(Hs888.Lu)细胞系(均来自ATCC，Manassas，VA)。钙黄绿素AM购自Molecular Probes(Eugene，OR)。按照下面列出的变化根据制造商的说明书进行分析。所述分析前将细胞以预定的合适密度进行涂板。2天后，将100微升纯化的抗体或者对照用培养基稀释，然后转移到细胞板，在5％CO2培养箱中孵育5天。然后将板翻转倒空，吸干。通过多通道挤瓶将室温下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每个孔中，轻敲3次，翻转倒空，然后吸干。将用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的50μl荧光钙黄绿素染料添加到每个孔中，在5％CO2培养箱中37℃孵育30分钟。Perkin-Elmer HTS7000荧光读板仪读板，数据用Microsoft Excel进行分析，结果列表于图2。每种抗体得到5至50的分数，其基于按一式三份的4个实验观察到的平均细胞毒性，以及得到25至100的分数，其基于分析间所观察到的可变性。这两种分数(细胞毒性分数)的总和显示于图2。大于或者等于55的细胞毒性分数被认为对所测细胞系是阳性的。相对于同种型和缓冲液阴性对照，AR37A335.8抗体在Lovo和DLD-1结肠癌细胞系中产生细胞毒性。AR37A335.8抗体在OVCAR-3卵巢癌细胞系中不产生细胞毒性。重要的是，AR37A335.8不产生抗非癌细胞系Hs888.Lu的特异细胞毒性，表明该抗体是对癌细胞特异的。和预期的一样，化学细胞毒剂诱导其非特异的细胞毒性。
利用流式细胞术(FACS)评价AR37A335.8抗体与上述癌症和正常人细胞系的结合。首先用DPBS(不含Ca++和Mg++)洗涤细胞单层来制备用于FACS的细胞。然后在37℃使用细胞离解缓冲液(INVITROGEN，Burlington，ON)从细胞培养板移出细胞。经离心和收集后，细胞重悬于4℃的包含MgCl2、CaCl2和2％胎牛血清的DPBS(染色培养基)并计数，等分到合适的细胞密度，离心以沉淀所述细胞，并在20μg/mL待测抗体(AR37A335.8)或者对照抗体(同种型对照，抗-EGFR)存在的条件下重悬于4℃的染色培养基，冰上30分钟。在添加Alexa Fluor488偶联的二抗前，用染色培养基洗涤细胞一次。然后添加溶于染色培养基的Alexa Fluor488偶联抗体30分钟。然后最后一次洗涤细胞，重悬于固定培养基(包含1.5％多聚甲醛的染色培养基)。使用CellQuest软件(BD Biosciences，Oakville，ON)在FACScan上运行样品来评价细胞的流式细胞采集。通过调节FSC和SSC检测器上的电压和振幅来设置细胞的前散射(FSC)和侧散射(SSC)。通过使用只用Alexa Fluor488偶联的二抗染色的细胞来调节荧光通道(FITC)的检测器，以便细胞具有一致的峰，且中位荧光强度约为1-5单位。对于每种样品，获得大约10,000个染色的固定细胞用于分析，结果显示于图3。
图3以高于同种型对照的倍增来表示平均荧光强度。AR37A335.8抗体的代表性直方图汇编为图4。AR37A335.8显示结合全部的被测细胞系。这些数据证明AR37A335.8显示功能特异性，因为尽管AR37A335.8与所有被测的癌症类型存在明显的结合，但其只存在与Lovo和DLD-1结肠癌细胞相关的细胞毒性。
实施例3
MDA-MB-231细胞的体内肿瘤实验
参考图5和6，4至6周大的雌性SCID小鼠经颈背皮下注射植入溶于100微升盐水的5百万人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)。将所述小鼠随机分成2个治疗组，每组5只。在植入后当天，每组腹腔内注入稀释后体积为300微升的20mg/kg AR37A335.8测试抗体或者缓冲液对照，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mMNa2HPO4的稀释剂从原液浓度稀释。在整个研究期间以同样方式每周给药一次所述抗体和对照样品，共8次剂量。利用卡钳大约每7天测量一次肿瘤生长。在整个研究期间每周一次记录动物的体重。研究结束时，根据CCAC指南处死所有的动物。
在人乳腺癌的MDA-MB-231体内预防模型中，AR37A335.8显著减少肿瘤生长。移植后第55天，最后一次治疗给药后5天，AR37A335.8治疗组的平均肿瘤体积比缓冲液对照治疗组的肿瘤体积小98.8％(图5)。研究结束时肿瘤体积显著不同于对照的肿瘤体积(p＝0.0064，t-检验)。
在整个研究期间没有临床毒性症状。每周测量一次的体重是健康状况和发育停滞的表征。如图6所示，该研究期间对照和AR37A335.8治疗组的体重增加。
总之，在这种人乳腺癌异种移植模型中，AR37A335.8被良好耐受并且减轻肿瘤负荷。
实施例4
SW1116细胞的体内肿瘤实验
参考图7和8，4至6周大的雌性SCID小鼠经颈背皮下注射植入溶于100微升盐水的5百万人结肠癌细胞(SW1116)。将所述小鼠随机分成2个治疗组，每组5只。在植入后当天，每组腹腔内注入稀释后体积为300微升的20mg/kg AR37A335.8测试抗体或者缓冲液对照，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释剂从原液浓度稀释。在整个研究期间以同样方式每周给药一次所述抗体和对照样品，共8次剂量。利用卡钳大约每7天测量一次肿瘤生长。在整个研究期间每周一次记录动物的体重。研究结束时，根据CCAC指南处死所有的动物。
在人结肠癌的SW1116体内预防模型中，AR37A335.8治疗导致肿瘤生长的抑制。移植后第55天，最后一次治疗给药后5天，AR37A337.8治疗组的平均肿瘤体积比缓冲液对照治疗组的肿瘤体积小48.7％(图7)。AR37A335.8治疗导致肿瘤体积显著小于对照的肿瘤体积(p＝0.0055)。
在整个研究期间没有临床毒性症状。每周测量一次的体重是健康状况和发育停滞的表征。如图8所示，在整个研究期间对照或者AR37A335.8治疗组的体重不降低。在治疗周期结束(第48天)或者治疗后随访结束(第63天)时，两组间的体重也没有差异。
因此在人结肠癌异种移植模型中，AR37A335.8被良好耐受并降低肿瘤负荷。
实施例5
AR37A335.8和抗-CD44H460-16-2之间交叉反应的测定
全细胞膜部分和全细胞裂解产物的Western印迹，利用单克隆抗体AR37A335.8和抗-CD44单克隆抗体H460-16-2作为探针。简单来说，在非还原条件下通过在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳对20微克全细胞膜部分和40微克全细胞裂解产物进行分析，所述全细胞膜部分从培养增殖的MDA-MB-231细胞分离，而全细胞裂解产物从培养增殖的PC-3和CCD-27sk细胞制备。电转到PVDF膜后，所述印迹用抗体AR37A335.8和H460-16-2作为探针检测，然后是Western印迹的标准步骤。利用单克隆抗体AR37A335.8作为探针检测的Western印迹结果与利用抗-CD44单克隆抗体H460-16-2所获结果非常相似(图9)，表明两种抗体可以识别相同的抗原，即CD44。为了确定AR37A335.8是否与CD44分子交叉反应，在免疫沉淀复合物的Western印迹中利用AR37A335.8作为探针检测，所述免疫沉淀复合物利用抗-CD44H460-16-2从培养增殖的细胞的全细胞膜部分获得。简单来说，300微克的MDA-MB-231全细胞膜部分(1mg/mL终蛋白浓度)与H460-16-2偶联的蛋白G Sepharose珠子在4℃孵育2小时。洗涤后珠子在1×非还原性SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸，在10％制备性聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分析样品。在电转移到PVDF膜后，根据标准Western印迹实验步骤，所述印迹上的各条泳道用抗体AR37A335.8、H460-16-2和IgG1同种型对照作为探针检测。所有一抗在5微克/mL的工作浓度下使用。所获印迹的图像(图10)显示AR37A335.8和H460-16-2与相同的抗原交叉反应，因此证明抗体AR37A335.8还识别CD44分子内包含的表位。
实施例6
人前列腺肿瘤组织染色
进行IHC研究以进一步评价H460-16-2与人前列腺肿瘤组织的结合。此前进行IHC优化研究以便确定进一步实验的条件。如上所述产生和纯化H460-16-2单克隆抗体。
利用人前列腺正常和肿瘤组织微阵列(Imgenex，San Diego，CA)进行抗体与53人前列腺肿瘤和3种正常前列腺组织的结合。组织切片在58℃烘箱中干燥1小时脱蜡，通过将组织切片5次浸泡于染色缸中的二甲苯进行脱蜡，每次4分钟。经过一系列梯度乙醇清洗(100％-75％)处理后，切片在水中重新水合。将载玻片浸泡于pH6的10mM柠檬酸盐缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)中，随后用高、中、低能量设置的微波分别照射载玻片5分钟，最终将其浸没在冷的PBS中。随后将载玻片浸没在3％的过氧化氢溶液中6分钟，用PBS清洗3次，每次5分钟，干燥，并在室温用通用封闭液(Dako，Toronto，Ontario)孵育5分钟。用抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)将H460-16-2(单克隆小鼠抗前列腺特异性膜抗原(PSMA；克隆1D11，North West Biotherapeutics，Bothell，WA))或者同种型对照抗体(针对黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖氧化酶，这是一种哺乳动物组织中既不存在又不能诱导的酶Dako，Toronto，Ontario)稀释到其工作浓度(对于每种抗体是5微克/mL，而抗PSMA除外，其被稀释至2微克/mL)，并在室温孵育1小时。用PBS清洗所述载玻片3次，每次5分钟。通过与提供的HRP偶联二抗(Dako Envision System，Toronto，Ontario)在室温下30分钟观察/显现一抗的免疫反应性。在该步骤之后，用PBS清洗所述载玻片3次，每次5分钟，随后加入DAB(3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako，Toronto，Ontario)生色团底物溶液以在室温免疫过氧化物酶染色10分钟进行颜色反应。用自来水清洗所述载玻片以终止生色反应。用Meyer苏木精(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)复染后，将所述载玻片用梯度乙醇(75％-100％)脱水并用二甲苯清洗。用固定剂(DakoFaramount，Toronto，Ontario)在所述载玻片上盖上盖玻片。使用Axiovert200(Ziess Canada，Toronto，ON)对载玻片进行显微检查，使用NorthernEclipse成像软件(Mississauga，ON)获取并存储数字图像。由组织病理学家对结果进行读取、评分和解释。
图11提供人正常和肿瘤前列腺组织阵列的H460-16-2染色结果的概要。从表格来看，19/53(36％)的被测肿瘤是H460-16-2阳性的。H460-16-2对肿瘤细胞和基质成纤维细胞特异。细胞定位主要是膜和质膜的，伴有或者不伴有腔定位。阳性细胞的百分比范围从<10％->50％，表明抗体与肿瘤细胞的异质结合。因为不同肿瘤阶段肿瘤数目的差异(I、II、III和IV期分别是1/1(100％)、4/12(33％)、0/2(0％)和11/33(33％))，不能正确评价抗体结合与肿瘤阶段之间的关系。
与Gleason分数G3-G4(36％)的结合高于与G1-G2(25％)的结合。Gleason分数是前列腺癌的分级系统。Gleason分级系统给组织样品中两个最大癌症区域的每一个指定等级。等级范围从1至5，1是侵袭性最弱的，而5是侵袭性最强的。例如等级3肿瘤很少转移，而对等级4或者等级5来说转移很常见。然后两个等级相加产生Gleason分数。2至4的分数被认为是低等级的；5至7，中间等级；和8至10，高等级。具有低Gleason分数的肿瘤通常生长足够缓慢，以致在患者的一生中可能都不会对其构成显著威胁。
所有3个正常前列腺组织切片对该抗体是阳性的。但是，组织特异性针对肌上皮和基质成纤维细胞，而不是腺上皮。图12证明H460-16-2与被测前列腺肿瘤结合的异质性：10/53、6/53、3/53阳性肿瘤分别属于<10-10％、<50-50％和>50％的类别。作为H460-16-2结合前列腺癌细胞的结果，H460-16-2的治疗益处有可能被延伸至前列腺癌的治疗。
实施例7
人肝肿瘤组织染色
为了进一步鉴定H460-16-2与人肝肿瘤组织的结合，在肝肿瘤组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)中检测该抗体。为每位患者提供下列信息：年龄，性别，器官和诊断。使用的染色步骤与实施例6中公开的相同。如上所述使用相同的阴性对照抗体。使用的阳性对照抗体是抗AFP(α1胎球蛋白；克隆AFP-11，Abeam，Cambridge，MA)。所有抗体在5微克/mL的工作浓度使用，除了抗AFP在10微克/mL的工作浓度使用。
如13所示，H460-16-2抗体显示与21/49(43％)的被测肝癌结合，包括11/37(30％)的原发性肝细胞癌，7/8(88％)的转移性肝细胞癌，1/2(50％)原发性肝胆管型肝癌和2/2(100％)的转移性肝胆管型肝癌。与较早的I和II期相比，该抗体与晚期肿瘤III和IV期的结合显著更高(p＝0.03)[I期，0/2(0％)；II期，2/17(12％)；III期，8/16(50％)和IV期，6/8(75％)]。H460-16-2对肿瘤细胞和侵润性炎性细胞特异。细胞定位主要是膜的。一些肿瘤还显示弥散性的细胞质染色模式。该抗体与9/9的非肿瘤肝组织结合(图14)。但是，所述结合限于窦内皮细胞和侵润性淋巴细胞。H460-16-2抗原看起来在晚期肝肿瘤组织中特异表达。因此H460-16-2具有作为肝癌治疗的治疗性药物的潜能。
实施例8
H460-16-2治疗的来源于SCID小鼠的MDA-MB-231异种移植肿瘤组织的凋亡研究
在预防性和成熟的MDA-MB-231异种移植模型中，H460-16-2显示在体内引起肿瘤生长抑制的能力(如S.N.10/603,000所公开)。利用FACS，H460-16-2还显示对MDA-MB-231细胞周期的作用，这种作用导致凋亡细胞数量的剂量依赖性增加(如S.N.10/810,165所公开)。为了进一步阐明H460-16-2的作用机制，在乳腺癌异种移植模型的体内增殖MDA-MB-231肿瘤中，研究H460-16-2治疗对凋亡的作用。
在人乳腺癌的MDA-MB-231成熟模型中，治疗周期结束时，H460-16-2组中小鼠的平均肿瘤体积是缓冲液对照治疗组体积的68.8％(如实施例10所公开的相似步骤)。治疗结束后两天，每组随机选择4只小鼠，收集肿瘤。收集的肿瘤被一分为二，并用10％缓冲的福尔马林固定。固定后，该组织被进一步修整以获得大约2mm的肿瘤切片用于石蜡包埋。做出适当努力使整个横切面具有肿瘤代表性。所述组织被包埋入石蜡、切片并在载玻片上固定以便在Toronto General Hospital(Toronto，ON)的临床研究实验室染色。
利用来自Chemicon Intrnational(Temecula，CA)的
Figure G2007800154239D00491
加过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒(S7101)评价组织切片中的凋亡。ApopTag试剂盒基于TUNEL分析，并通过评价DNA断裂来检测凋亡。使用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)对所述片段进行地高辛-dNTP的末端标记。利用抗地高辛过氧化物酶试剂检测掺入的地高辛-dNTP。按照该试剂盒提供的手册???上的概要进行下面的实验步骤。利用光学显微镜检查观察ApopTag染色和细胞形态学。对于每个切片，在来自肿瘤活性区的4个独立区域计数被染色的细胞。注意不要集中于肿瘤的坏死区。将4个独立区域的计数加在一起得到代表该切片的总计数。对于每个切片，计数重复3次(每次集中于4个区)。利用3次计数获得的总数获得所述切片的平均值。随后，计算不同治疗组的平均计数。如图15所示，缓冲液对照组的平均总分为31.5(±14.62)个细胞，而H460-16-2治疗组的平均总分为42.5(±3.70)个细胞。因此，利用TUNEL分析确定了H460-16-2治疗具有增加凋亡的趋势。
随后将ApoTag染色肿瘤的连续切片进行H&E染色，并利用形态学标准检查这些切片的凋亡细胞，所述形态学标准例如单细胞缺失、细胞皱缩和染色质凝集成高密度。按照上面关于切片的描述完成符合这些标准的细胞计数，得到治疗组的平均计数。试剂盒中包含阳性对照载玻片(来自泌乳后3-5天的正常啮齿类动物乳腺的组织)，所述阳性对照载玻片随测试载玻片一起染色。如图15所示，缓冲液对照组的平均总分为17(±5.29)个细胞，而H460-16-2治疗组的平均总分为22.5(±4.20)个细胞。因此，利用细胞形态学确定了H460-16-2治疗具有增加凋亡的趋势。
实施例9
H460-16-2的嵌合
1.0可变区基因克隆入测序载体
为了促进抗体嵌合体的产生，编码重链和轻链可变区的基因分别被克隆入商品化测序载体pCR2.1。
1.1mRNA的分离
利用QuickPrepTM微量mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare，Piscataway，NJ)从汇合的Master细胞库H460-16-2杂交瘤细胞中分离信使核糖核酸(mRNA)。mRNA保存在-80℃直到下一步的使用。
1.2可变区基因的RT-PCR扩增
进行独立的反应以扩增轻链和重链可变区。逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)从mRNA模板合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，然后特异扩增靶基因。
对于轻链，1微升mRNA在65℃加热10分钟，然后在冰上冷却。利用SuperscriptTM一步法RT-PCR，用
Figure G2007800154239D00501
Taq(Invitrogen，Burlington，ON)、12.5微升2×RT-PCR反应混合物(Invitrogen，Burlington，ON)、1微升20pmol/微升MuIgκVL5′-F引物(Novagen，Mississauga，ON)、1微升20pmol/微升MuIgκVL3′-1引物(Novagen，Mississauga，ON)、0.5微升RT/Plainum Taq混合物(Invitrogen，Burlington，ON)、0.4微升50mMMgSO4(Invitrogen，Burlington，ON)和水补足25微升准备RT-PCR反应。第二组反应也如上进行准备，除了使用的正向引物是MuIgκVL5′-C引物(Novagen，Mississauga，ON)以替代MuIgκVL5′-F。反应在热循环仪中50℃加热40分钟，继之以94℃2分钟。聚合酶链式反应(PCR)反应进行30个循环：94℃30秒，55℃1分钟和72℃1分钟。最后PCR产物在72℃加热10分钟，然后保存在4℃。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化PCR产物。
对于重链，1微升mRNA在65℃加热10分钟，然后在冰上冷却。利用SuperscriptTM一步法RT-PCR，用
Figure G2007800154239D00511
Taq(Invitrogen，Burlington，ON)、12.5微升2×RT-PCR反应混合物(Invitrogen，Burlington，ON)、1微升5pmol/微升MuIgVH5′-A引物(Novagen，Mississauga，ON)、1微升10pmol/微升MuIgVH5′-B引物(Novagen，Mississauga，ON)、MuIgVH5′-C引物(Novagen，Mississauga，ON)、1微升5pmol/微升MuIgVH5′-D引物(Novagen，Mississauga，ON)、1微升5pmol/微升MuIgVH5′-F引物(Novagen，Mississauga，ON)、1微升5pmol/微升MuIgGVH3′-2引物(Novagen，Mississauga，ON)、0.5微升
Figure G2007800154239D00512
Taq混合物(Invitrogen，Burlington，ON)、0.4微升50mM MgSO4(Invitrogen，Burlington，ON)和水补足25微升准备RT-PCR反应。反应在热循环仪中50℃加热40分钟，继之以94℃2分钟。PCR反应进行30个循环：94℃30秒，55℃1分钟和72℃1分钟。最后PCR产物在72℃加热10分钟，然后保存在4℃。
图16显示RT-PCR反应结果。利用MuIgKVL5′-F(泳道1)或者MuIgκVL5′-C(泳道2)正向引物扩增轻链反应(图A)。重链反应(图B)利用MuIgVH5′-A、B、C、D和F正向引物的混合物进行扩增。两个轻链反应(图A，泳道1和2)均显示450bp处的强条带，以及850bp处的弱条带。450bp条带是包含H460-16-2Vk基因的靶条带。重链反应(图B，泳道1)显示500bp处的强条带和1000bp处的弱条带。500bp处的条带是对应于H460-16-2Vh基因的靶条带。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化所有的PCR产物。
1.3克隆入测序载体
利用TOPO TA 
Figure G2007800154239D0052171632QIETU
试剂盒(Invitrogen，Burlington，ON)将纯化的轻链和重链PCR产物分别克隆入pCR2.1载体。轻链和重链反应均包含2微升适当的纯化PCR产物。按照制造商的说明书，质粒被转化入OneMAX EfficiencyTM DH5αTM-T1R大肠杆菌(Invitrogen，Burlington，ON)。对于轻链和重链转化，均使用2微升的连接反应。
来源于每种反应的30微升转化细胞被涂板于预温的Lennox L肉汤(LB)琼脂(Sigma，Oakville，ON)平板，所述平板包含50微克/mL氨苄青霉素(Sigma，Oakville，ON)和40微升溶于N，N-二甲基甲酰胺(CaledonLaboratories，Georgetown，ON)的40mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal，Caledon Laboratories，Georgetown，ON)。将所述平板倒置，并在37℃孵育过夜。
分别从H460-16-2Vk的每块转化平板挑取5个白色单克隆，从H460-16-2Vh的转化平板挑取10个白色单克隆，并接种4mL包含50微克/mL氨苄青霉素(Sigma，Oakville，ON)的LB肉汤(Sigma，Oakville，ON)。培养物在37℃200rpm振摇条件下生长过夜。利用QIAprep Spin小量制备试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)从各培养物分离质粒。
用EcoR I消化回收的质粒以确定插入物的大小。H460-16-2Vk消化物包含5微升质粒、0.02微升的50U/微升EcoR I(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)、1.5微升的10×缓冲液H(Amersham Biosciences，Baied′Urfe，QC)、1.5微升的0.1％牛血清白蛋白(BSA)和6.98微升的水。H460-16-2Vh消化物包含5微升质粒、0.04微升的50U/微升EcoR I(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)、1.5微升的10×缓冲液H(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)、1.5微升的0.1％BSA(AmershamBiosciences，Baie d′Urfe，QC)和6.96微升的水。质粒在37℃消化1小时。5微升的各消化质粒在1.0％琼脂糖凝胶上电泳。
图17显示用EcoR I消化的pCR2.1(H460-16-2Vk)质粒。顶部标明克隆编号。第一个数字表示使用的正向引物(MuIgKVL5′-F是1，MuIgκVL5′-C是2)，而第二个数字表示克隆编号(1-5)。大约5000bp的大条带是pCR2.1载体骨架。除了2-4以外的所有克隆在500bp均有条带，这是H460-16-2插入物的预期大小(箭头所示)。
图18显示用EcoR I消化的pCR2.1(H460-16-2Vh)质粒。克隆1、2、3、4、5和8显示对应于H460-16-2Vh基因的期望的500bp条带。
一些包含合适大小插入物的质粒(Vk1-1，Vk1-2，Vk1-3，Vk2-1，Vk2-2，Vk2-3，Vh1，Vh4和Vh5)在约克大学的重点分子生物学实验室(York University′s Core Molecular Biology Facility(Toronto，ON))测序。序列显示于图19。在克隆1-1、1-2和1-3中发现了正确的H460-16-2Vk序列。剩余的Vk克隆包含异常的免疫球蛋白基因。克隆1-1(pVkH460-16-2#1-1)被用于嵌合H460-16-2IgG2质粒的构建。所有H460-16-2Vh克隆包含正确的H460-16-2Vh序列。具有正确序列的质粒保存在-30℃以便将来的应用。
1.4H460-16-2VH克隆入测序载体(用于嵌合IgG2的构建)
上述mRNA被用于扩增H460-14-2Vh基因。对于重链，1微升mRNA在65℃加热10分钟，然后在冰上冷却2分钟。利用SuperscriptTM一步法RT-PCR，用
Figure G2007800154239D00531
Taq(Invitrogen，Burlington，ON)、12.5微升的2×RT-PCR反应混合物(Invitrogen，Burlington，ON)、1微升的5pmol/微升MuIgVH5′-A引物(Novagen，Mississauga，ON)、1微升的10pmol/微升MuIgVH5′-B引物(Novagen，Mississauga，ON)、1微升的5pmol/微升MuIgVH5′-D引物(Novagen，Mississauga，ON)、1微升的5pmol/微升MulgVH5′-F引物(Novagen，Mississauga，ON)、1微升的5pmol/微升MuIgGVH3′-2引物(Novagen，Mississauga，ON)、0.5微升RT/Platinum Taq混合物(Invitrogen，Burlington，ON)、0.4微升的50mM MgSO4(Invitrogen，Burlington，ON)和水补足25微升准备RT-PCR反应。反应在热循环仪中50℃加热40分钟，继之以94℃2分钟。PCR反应进行30个循环：94℃30秒，55℃1分钟和72℃1分钟。最后PCR产物在72℃加热10分钟，然后保存在4℃。按照制造商的说明书，利用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化所有的PCR产物。
利用TOPO TA 
Figure G2007800154239D0054171828QIETU
试剂盒(Invitrogen，Burlington，ON)将纯化的重链PCR产物克隆入pCR2.1载体。该反应包含1微升纯化的PCR产物。2微升连接反应物被用于转化OneMAX EfficiencyTM
Figure G2007800154239D00542
大肠杆菌(Invitrogen，Burlington，ON)。30微升转化细胞被涂板于预温的Lennox L肉汤(LB)琼脂(Sigma，Oakville，ON)平板，所述平板包含50微克/mL氨苄青霉素(Sigma，Oakville，ON)和40微升溶于N，N-二甲基甲酰胺(Caledon Laboratories，Georgetown，ON)的40mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal，Caledon Laboratories，Georgetown，ON)。将所述平板倒置，并在37℃孵育过夜。
从H460-16-2VH转化平板挑取10个单克隆，并接种包含50微克/mL氨苄青霉素的4mL LB肉汤。培养物在37℃200rpm振摇条件下生长过夜。按照制造商的说明书，利用QIAprep Spin小量制备试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)从各培养物分离质粒。
用EcoR I消化回收的质粒以确定插入物的大小。H460-16-2Vh消化物包含5微升质粒、0.04微升的50U/微升EcoR I(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)、1.5微升的10×缓冲液H(Amersham Biosciences，Baied′Urfe，QC)、1.5微升的0.1％BSA(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)和6.96微升的水。质粒在37℃消化1小时。5微升的各消化质粒在1.0％琼脂糖凝胶上电泳。
克隆#3和#1看起来具有预期的500bp插入物。从pCR2.1(H460-16-2VH)-转化的大肠杆菌平板再挑取10个克隆，以便获得具有正确插入物的更多克隆。如上所述克隆用于接种LB肉汤。如上所述从培养物分离质粒，然后如上所述用EcoR I消化。
图20显示用EcoR I消化的pCR2.1(H460-16-2Vh)质粒。大约5000bp的大条带是pCR2.1载体骨架。克隆#17在500bp处具有条带，这是H460-16-2VH插入物的预期大小(箭头所示)。
包含合适大小插入物的质粒(Vh#1、Vh#3和Vh#17)在约克大学的重点分子生物学实验室(York University′s Core Molecular Biology Facility(Toronto，ON))测序。序列显示于图21。在克隆3和17中发现了正确的H460-16-2Vh序列。克隆3(pVhH460-16-2#3)被用于嵌合H460-16-2IgG2质粒的构建。具有正确序列的质粒保存在-30℃以便将来的应用。
2.0鼠H460-16-2基因克隆入包含人恒定区基因的CMV启动子载体
为了产生鼠-人IgG1嵌合抗体构建体，鼠H460-16-2可变区基因被克隆入包含人恒定区基因的质粒。这些CMV启动子载体获自G.R.McLean等。所述载体最初被称为pHC-huCg1和pLC-huCk。此处，它们被称为pCH-huIg1和pCL-huCk。
2.1改变pCH-huIg1的限制性酶位点
图22是重链CMV启动子载体(pCH-huIg1)的质粒图。在Nhe I和HindIII限制性位点之间克隆H460-16-2Vh可变基因。由于H460-16-2Vh基因内的内部Hind III位点，载体上的Hind III位点被改变为BsiW I。
在实验室设计PCR引物以促进这种克隆，并通过Gibco BRL(Birlington，ON)合成。引物序列显示于图23。1微升的纯化pCH-huIg1质粒(G.R.McLean，Bronx，NY)与1微升的20pmol/微升pCH-huBsiW I引物、1微升的20pmol/微升BGH引物、0.2微升的50mM MgCl2(Invitrogen，Burlington，ON)和22微升的
Figure G2007800154239D0055171953QIETU
PCR Supermix(Invitrogen，Burlington，ON)混合。所述反应物在热循环仪中94℃孵育5分钟，继之以30个循环：94℃1分钟，58℃1分钟和72℃1分钟。最后，反应物在72℃孵育10分钟，然后保存在4℃。
如图24所示，4微升PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳。图A，泳道1是包含人IgG1重链恒定区的pCH-huIg1质粒的PCR扩增区。在约1100bp处出现一个条带，这是预期的大小。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化剩余的PCR产物。
利用Hind III和Xho I消化纯化的PCR产物和纯化的pCH-huIg1质粒以促进连接。PCR产物消化液包含46微升纯化的PCR产物、6微升的10×缓冲液M(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)、6微升的0.1％BSA(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)和2微升的15U/微升HindIII(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)。所述质粒消化液包含4微升的1.4微克/微升pCH-huIg1，6微升的10×缓冲液M(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)，6微升的0.1％BSA(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)，42微升的水和2微升的15U/微升Hind III(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)。消化液在37℃下孵育2小时。取出一小部分(2微升的PCR产物反应物和3微升的质粒反应物)并保留用于在琼脂糖凝胶上检验消化的进展。向剩余的消化液中添加3.2微升的1M NaCl、2.5微升的1MTris-HCl pH7.4和3微升的8U/微升Xho I(New England Biolabs，Ipswich，MA)。反应物继续在37℃下孵育2小时。从每种消化液中另取出一小部分，并保留用于在琼脂糖凝胶上电泳。
图25显示消化的PCR产物和质粒。不出所料，消化后PCR产物的大小几乎没有变化(图A和B，泳道1)，因为从两个末端只去除了非常少的碱基。所述质粒的单—Hind III消化(图A，泳道2)显示线性化质粒的大小(比分子量标记物大)。Hind III和Xho I双重消化(图B)显示大分子量的质粒骨架和大约1000bp已经被切出的片段，其将被消化的PCR产物替换。剩余的消化PCR产物利用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化，剩余的质粒骨架利用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)从1％琼脂糖凝胶纯化。
按照4:1的摩尔比例连接消化的PCR产物和质粒骨架。该反应包含233ng消化的质粒骨架，162ng消化的PCR产物，4微升的5×连接缓冲液(Gibco BRL，Burlington，ON)，4微升的1U/微升T4DNA连接酶(GibcoBRL，Burlington，ON)和9.33微升的水。所述反应物在16℃孵育过夜，然后置于70℃15分钟以灭活酶。通过在冰上孵育30分钟，42℃2分钟，然后再在冰上5分钟，将2微升的连接反应物转化入50微升的One 
Figure G2007800154239D0056172050QIETU
MAX DH5αTM-T1R大肠杆菌细胞(Invitrogen，Burlington，ON)。添加250微升S.O.C.培养基(Invitrogen，Burlington，ON)，转化细胞在37℃孵育1小时。在预温的包含50微克/mL氨苄青霉素(Sigma，Oakville，ON)的LB琼脂平板(Sigma，Oakville，ON)上涂板100微升细胞，并在37℃孵育过夜。
从转化细胞中挑取10个单菌落，用于接种4mL包含50μg/mL氨苄青霉素(Sigma，Oakville，ON)的LB肉汤(Sigma，Oakville，ON)，并在37℃200rpm振摇条件下孵育过夜。利用QIAprep小量制备试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)从过夜培养物分离质粒。用BsiW I消化分离的质粒以鉴定掺入新的酶切位点的克隆。消化液包含3微升的纯化质粒，2微升的10×NEBuffer2(New England Biolabs，Ipswich，MA)，1微升的3U/微升BsiW I(New England Biolabs，Ipswich，MA)和水补足20微升。如图26所示，消化液在37℃孵育2小时，然后5微升的消化质粒在1％琼脂糖凝胶上电泳。除了4和8外的所有克隆在消化时被线性化，这表明它们掺入了新的BsiW I酶切位点。泳道11显示作为对照环状质粒的克隆5的未消化部分。克隆1、2、5和7在约克大学(York University)(Toronto，ON)测序。全部6个克隆都具有期望的序列，保存在-30℃备用。
2.2ARH460-16-2Vκ和VH基因插入pCL-huCk和pCH-huIgl
为了促进H460-16-2Vk和Vh基因分别克隆入pCL-huCk和pCH-huIg1，在基因的任一端需要添加限制性位点。对于轻链，在5′端添加Bg1II位点，3′端添加Hind III位点。对于重链，在5′端添加Nhe I位点，3′端添加BsiW I位点。图23显示这些PCR反应中使用的引物序列。图27显示pCL-huCk(还称为pLC-huCk)的质粒图。尽管在图中没有出现，但Bgl II位点存在于pCL-huCk载体的前导序列和可变区之间。
对于轻链，1微升的150ng/微升从pCR2.1(H460-16-2Vk)M#1-1(参见上文，M denotes Master细胞库)纯化的质粒与1微升的20pmol/微升H460-16-2Vk5′引物、1微升的20pmol/微升Vk3′NotI、0.2微升的50mMMgCl2(Invitrogen，Burlington，ON)和22微升的
Figure G2007800154239D0057172204QIETU
PCR Supermix(Invitrogen，Burlington，ON)混合。对于重链，1微升的40ng/微升从pCR2.1(H460-16-2Vh)#1(参见上文)纯化的质粒与1微升的25pmol/微升H460-16-2Vh5′NheI引物、1微升的25pmol/微升Vh3′BsiWI引物和47微升的PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen，Burlington，ON)混合。轻链反应在94℃孵育5分钟，然后是30个循环：94℃1分钟，58℃1分钟和72℃1分钟，最后是72℃7分钟。类似地进行重链反应，但退火温度是55℃(替代58℃)。
图24显示每个PCR反应的一部分在1.0％琼脂糖凝胶上电泳。H460-16-2Vk基因(图A，泳道2)表现为接近400bp的条带，这是轻链可变区的预期大小。H460-16-1Vh基因(图B，泳道1)表现为接近450bp的条带，这是重链可变区的预期大小。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化剩余的PCR产物，并用合适的酶消化以便连接入质粒。
对于轻链，pCL-huCk和H460-16-2Vk PCR产物用BglII和Not I消化以有利于克隆。40微升的H460-16-2Vk PCR产物与6微升的10×NEBuffer3(New England Biolabs，Ipswich，MA)、0.6微升的100×BSA(New England Biolabs，Ipswich，MA)、2微升的10U/微升Bgl II(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)、2微升的10U/微升Not I和补足60微升的水混合。对于轻链质粒，准备相同的反应，所述反应包含8微升pCL-huCk(G.R.McLean，Bronx，NY)，而不是PCR产物。两种反应物均在37℃下孵育3小时。如图28所示，一部分被消化的载体和插入物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳。线性化的pCL-huCK载体骨架(泳道1)表现为大条带，而从载体切除的轻链可变区表现为400bp的条带。消化的H460-16-2Vk(泳道2)基因也表现为400bp。剩余的线性化pCL-huCk质粒在1.0％凝胶上电泳，并利用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化剩余消化的H460-16-2Vk PCR产物。
对于重链，利用BsiW I和Nhe I消化具有添加的BsM I位点(参见上文)的pCH-huIg1质粒和H460-16-2Vh PCR产物以有利于克隆。所述质粒反应包含0.7微升的pCH-huIg1(BsiW I)#1DNA，2微升的10×NEBuffer2(New England Biolabs，Ipswich，MA)，0.4微升的10U/微升B siW I(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)和水补足20微升。还准备相同的反应，其包含12.1微升纯化的H460-16-2Vh PCR产物而不是质粒。反应物在55℃孵育过夜，然后从质粒消化物中取出5微升在凝胶上检测。向两种反应物中添加0.2微升的100×BSA(New England Biolabs，Ipswich，MA)和1微升的5U/微升Nhe I(New England Biolabs，Ipswich，MA)，然后在37℃孵育过夜。再取出5微升，用于在凝胶上电泳以检测消化情况。
图29显示1.2％凝胶电泳的消化结果。单一BsiW I消化(图B，泳道1)显示线性化的质粒。双重BsiW I和Nhe I消化(图B，泳道2)显示表现为大分子量条带的质粒骨架和450bp处重链可变区。这条更小的条带将被替换为450bp消化的H460-16-2Vh PCR产物(图A，泳道1)。剩余的消化质粒在1.2％凝胶上电泳并利用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化剩余消化的H460-16-2Vh PCR产物。
消化的H460-16-2Vk PCR产物被连接入线性化的pCL-huCK质粒。220ng消化的pCL-huCK与66ng消化的H460-16-2Vk、4微升的5×连接缓冲液(Gibco BRL，Burlington，ON)、4微升的1U/微升T4DNA连接酶(Gibco BRL，Burlington，ON)和补足20微升的水混合。所述反应物在16℃孵育过夜，然后在70℃孵育10分钟以热灭活酶。通过在冰上孵育30分钟，42℃2分钟，再在冰上5分钟，将2微升的连接反应物转化入50微升的One
Figure G2007800154239D0059172325QIETU
Figure G2007800154239D00591
DH5αTM-T1R大肠杆菌细胞(Invitrogen，Burlington，ON)。添加250微升S.O.C.培养基(Invitrogen，Burlington，ON)，转化细胞在37℃孵育1小时。在预温的包含50微克/mL氨苄青霉素(Sigma，Oakville，ON)的LB琼脂平板(Sigma，Oakville，ON)上涂板30微升细胞，并在37℃孵育过夜。
准备重链连接反应，所述反应包含250ng的消化pCH-huIg1，84ng的消化H460-16-2Vh PCR产物，4微升的5×连接缓冲液(Gibco BRL，Burlington，ON)1微升的1U/微升T4DNA连接酶(Gibco BRL，Burlington，ON)和水补足20微升。所述反应物在16℃孵育过夜，然后在65℃孵育10分钟以热灭活酶。通过在冰上孵育30分钟，42℃2分钟，再在冰上5分钟，将1微升的连接反应物转化入25微升的One
Figure G2007800154239D00592
MAX
Figure G2007800154239D00593
DH5αTM-T1R大肠杆菌细胞(Invitrogen，Burlington，ON)。添加250微升S.O.C.培养基(Invitrogen，Burlington，ON)转化细胞在37℃孵育1小时。在预温的包含50微克/mL氨苄青霉素(Sigma，Oakville，ON)的LB琼脂平板(Sigma，Oakville，ON)上涂板30微升细胞，并在37℃孵育过夜。
从转化的pCL-huCk(H460-16-2Vk)平板挑取8个单菌落，从转化的pCH-huIg1(H460-16-2Vh)平板挑取6个单菌落用于接种4mL包含50微克/mL氨苄青霉素(Sigma，Oakville，ON)的2-YT肉汤(Gibco BRL，Burlington，ON)。利用QIAprep小量制备试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)从过夜培养物分离质粒，并对质粒进行消化以确保插入物的大小正确。准备轻链反应，所述反应包含3微升质粒，1.5微升10×NEBuffer3(New England Biolabs，Ipswich，MA)，0.15微升100×BSA(New EnglandBiolabs，Ipswich.MA)，2微升的10U/微升Bgl IL2微升的10U/微升NotI和9.65微升水，并在37℃孵育3小时。通过将2微升的质粒与2微升的10×NEBuffer2(New England Biolabswith Ipswichwith MA)、0.4微升的10U/微升BsiW I(New England Biolabswith Ipswichwith MA)和补足20微升的水混合，准备重链反应。这些物质在55℃孵育2小时，然后添加2微升的10×BSA(New England Biolabs，Ipswich，MA)和0.8微升的5U/微升Nhe I。反应物继续在37℃下孵育2小时。
图30和31分别显示pCL-huCk(H460-16-2Vk)的pCH-huIg1(H460-16-2Vh)的上述消化结果。除了#1之外的所有轻链克隆(图30)包含对应于H460-16-2Vk基因的目标400bp插入物。所有重链克隆(图31)包含对应于H460-16-2Vh基因的目标450bp插入物。根据这些结果，pCL-huCk(H460-16-2Vk)克隆3、4、6、7和8，以及pCH-huIg1(H460-16-2Vh)克隆4和6在约克大学(Toronto，ON)测序。被测序的全部克隆都具有目标序列，将质粒保存在-80℃备用。
3.0将嵌合的轻链和重链ARH460-16-2克隆入CHEF1表达载体
轻链(H460-16-2Vk)的鼠可变区和人恒定区然后被克隆入CHEF1表达载体pNEF38，重链(H460-16-2Vh)的鼠可变区和人恒定区被克隆入CHEF1表达载体pDEF38。质粒图显示于图32和33。
在该报告的剩余部分，术语Ch-ARH460-16-2Vk是指来源于pCL-huCk质粒的轻链可变H460-16-2基因和人轻链恒定区的组合。术语Ch-ARH460-16-2Vh是指来源于pCH-huIgl质粒的重链可变H460-16-2基因和人重链IgG1区的组合。
3.1将改变的限制性位点克隆入CHEF1载体
CMV启动子载体中Ch-ARH460-16-2侧翼的限制性位点需要改变以促进亚克隆入CHEF1表达载体。利用引入目标限制性位点的引物PCR扩增CMV启动子构建体的前导序列、可变区和恒定区。引物序列显示于图23。
对于轻链，利用1.4微升的73ng/微升pCL-huCk(ARH460-16-2Vk)#3DNA(参见上文)、1.0微升的25pmol/微升pCL-huCK5′MluI引物、1.7微升的15pmol/微升BGH引物和20.9微升的PCR Supermix HighFidelity(Invitrogen，Burlington，ON)准备PCR反应。对于重链，利用0.5微升的0.27微克/微升pCH-huIg1(ARH460-16-2Vh)#4DNA(参见上文)、1.7微升的15pmol/微升Vh5′NheI/MluI引物、1.7微升的15pmol/微升BGH引物和21.1微升的PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen，Burlington，ON)准备PCR反应。重链和轻链反应物在94℃孵育2分钟，分别继之以25或者30个循环：94℃30秒，55℃30秒和68℃2分钟。如图34所示，每个反应各取一部分在琼脂糖凝胶上电泳。Ch-ARH460-16-2Vk PCR产物(图A，泳道1)表现为800bp的条带，这是轻链鼠H460-16-2Vk可变区和人恒定区的预期大小。Ch-ARH460-16-2VhPCR产物(图B，泳道1)在1500bp处出现条带，这是重链鼠H460-16-2Vh可变区和人恒定区的预期大小。
3.2将嵌合H460-16-2基因克隆入CHEF1载体
利用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化剩余的PCR产物，然后与CHEF1载体一起用合适的限制性内切酶消化以便克隆。反应包含1微克的DNA(纯化的Ch-ARH460-16-2Vk PCR产物，纯化的Ch-ARH460-16-2Vh PCR产物，pNEF38(ICOS，Seattle，WA)或者pDEF38(ICOS，Seattle，WA))，2微升的10×NEBuffer2(New EnglandBiolabs，Ipswich，MA)，2微升的10×BSA(New England Biolabs，Ipswich，MA)，0.2微升的20U/微升Xba I(New England Biolabs，Ipswich，MA)和水补足20微升。反应物在37℃孵育过夜，然后添加0.8微升的1MTris-HCl pH7.4、1.0微升的1M NaCl和0.4微升的10U/微升Mlu I(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)，并在37℃孵育6小时。利用MinElute反应提纯试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化消化的PCR产物，并利用QIAEX II反应提纯试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化消化的载体。
按照5:1的摩尔比例将Ch-ARH460-16-2Vk连接入pNEF38。25ng消化的pNEF38与69ng消化的Ch-ARH460-16-2Vk PCR产物、4微升的5×连接缓冲液(Gibco BRL，Burlington，ON)、0.5微升的1U/微升T4DNA连接酶(Gibco BRL，Burlington，ON)和补足20微升的水混合。利用25ng消化的pDEF38和66ng消化的Ch-ARH460-16-2Vh PCR产物准备相同的重链反应。反应物在16℃孵育过夜，然后在65℃孵育10分钟以灭活酶。利用QIAEX II反应提纯试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)纯化所述重链连接反应物。
通过添加3微升的稀释盐溶液(Invitrogen，Burlington，ON)和2微升的连接反应物到50微升的One TOP10ElectrocompTM大肠杆菌(Invitrogen，Mississauga，ON)，将连接反应物转化入大肠杆菌。所述细胞被转移到预冷的1mm比色杯，并在电穿孔仪中充电1700V5毫秒。立即添加1mL的S.O.C.培养基(Invitrogen，Burlington，ON)，然后细胞在37℃200rpm振摇条件下孵育1小时。将200微升的一部分细胞涂板于预温的包含50微克/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，并在37℃孵育过夜
从每个平板挑取6个单菌落，用于接种4mL包含50微克/mL的氨苄青霉素(Sigma Oakville，ON)的2YT肉汤(Invitrogen，Burlington，ON)并在37℃200rpm振摇条件下孵育过夜。利用QIAprep小量制备试剂盒(QIAGEN，Mississauga，ON)从获得的过夜培养物分离质粒。用Xba I和Mlu I消化轻链质粒来鉴定包含正确大小插入物的克隆。消化液包含1微克的质粒DNA，2微升的10×NEBuffer2(New England Biolabs，Ipswich，MA)，2微升的10×BSA(New England Biolabs，Ipswich，MA)，0.2微升的20U/微升Xba I(New England Biolabs，Ipswich，MA)和补足20微升的水。反应物在37℃孵育过夜，然后添加0.8微升的1M Tris-HCl pH7.4、1.0微升的1M NaCl和0.4微升的10U/微升Mlu I(New England Biolabs，Ipswich，MA)，并在37℃孵育6小时。重链质粒用Xba I、Mlu I和HindIII消化。100ng的质粒DNA与2微升的10×NEBuffer2(New EnglandBiolabs，Ipswich，MA)、2微升的10×BSA(New England Biolabs，Ipswich，MA)、0.2微升的20U/μLXba I(New England Biolabs，Ipswich，MA)和补足20微升的水混合。反应物在37℃消化过夜，然后添加0.8μl的1MTris-HCl pH7.4、1μl的1M NaCl和0.4μl的10U/μl Mlu I，并在37℃消化6小时。取出一小部分消化液到凝胶上电泳，并添加2微升的10×NEBuffer2(New England Biolabs，Ipswich，MA)、0.3微升的15U/微升Hind III和7.7微升的水。反应物在37℃下孵育6小时。
如图35所示，在1.2％琼脂糖凝胶上电泳消化的质粒。对于轻链质粒(图A)，除#3外的所有克隆都具有目标750bp插入物，其对应于轻链可变区和恒定区。对于重链质粒，Xba I和Mlu I消化物(图B，泳道1A、2A和6A)显示1500bp的插入物，其对应于重链可变区和恒定区。Xba I、Mlu I和BsiW I消化的重链质粒(图B，泳道1B、2B和6B)在1000bp和500bp处显示条带，其分别对应于重链恒定区和可变区。克隆4(图B)根本不显示条带，标明反应设置存在问题。
根据这些结果，轻链克隆1、2和4以及重链克隆1、2和6在约克大学(Toronto，ON)测序。序列显示于图36。轻链克隆pNEF38(Ch-ARH460-16-2Vk)#4和重链克隆pDEF38(Ch-ARH460-16-2Vh)#2具有正确的序列，用于构建嵌合H460-16-2构建体。
4.0产生(ch)ARH460-16-2-IgG1的初始克隆
4.1pMPGCR5IgG1-Vk+hH460的构建
该质粒包含H460-16-2的嵌合IgG1同种型的重链和轻链(Ch-ARH460-16-2Vh和Ch-ARH460-16-2Vk)，由cumate可诱导启动子(CR5)调控。此外，该质粒包含潮霉素的抗性基因以便于选择稳定的克隆(图37)。如下所述，该质粒通过首先构建两个中间质粒来产生。
A)pMPGCR5VkH460AscId的构建
利用BamH I消化从pMPGCR5B43k(图38)切除编码抗体B43轻链的DNA片段。在平端化(blunting)末端并利用小牛肠磷酸酶(CIP)处理后，载体DNA与编码轻链的DNA片段连接，所述轻链通过用Xba I和BsiWI消化pNEF38(Ch-ARH460-16-2VK)#4继之以T4DNA聚合酶处理以平端化末端而获得。
B)pCR5IgG1VhH460AscI的构建
利用Hind III消化从pKCR5B43G3(图39)切除编码B43重链的DNA片段。在用T4DNA聚合酶平端化末端并用CIP处理后，载体DNA与编码重链的DNA片段连接，所述重链通过用Xba I和PacI消化pDEF38(Ch-ARH460-16-2VH)#2来分离。连接前，所述DNA片段用T4DNA聚合酶平端化。
C)最终组装
利用Asc I消化从pCR5IgG1VhH460AscI切除重链表达盒(启动子，编码序列，poly A信号)，并将其插入pMPGCR5VkH460AscId的Asc I位点，所述pMPGCR5VkH460AscId在连接前经CIP处理去磷酸化。所获构建体(pMPGCR5IgG1-Vk+hH460)的图谱显示于图37。
5.0表达嵌合H460-16-12的克隆的产生
2000年5月从Gibco BRL(Burlington，ON)购得一瓶CHO-SF(a)，并在添加4mM L-谷氨酰胺的CD-CHO培养基(Gibco BRL，Burlington，ON)中解冻。细胞在添加4mM L-谷氨酰胺的CD-CHO培养基中生长10天，并在90％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)和10％DMSO中制备冷冻储存液。按照制造商的推荐，利用Lipofectamine2000(Invitrogen，Burlington，ON)通过线性化的pMPG-BFP/CMV-cTA/tk-neo转染CHO-SF(a)细胞，产生稳定表达cumate反式激活因子(cTA)的CHOcTA细胞。三天后，在G418(1.2mg/mL)存在的条件下孵育转染细胞，4周后，用pAdCR5GFPq转染G418抗性细胞库。两天后，在EPICS TM V(Model752；Beckman-Coulter，Hialeah，FL)多参数激光流式细胞仪和细胞分类器上分选表达GFP最高的细胞，再按照每孔一个细胞的密度转移到96孔板，所述孔包含1.2mg/mL的G418。挑取汇合的克隆并扩增，并在腺病毒载体(AdCR5GFPq)感染后24小时，利用Coulter EPICS Tm XI流式细胞仪(Beckman-Coulter，Hialeah，FL)通过流式细胞术测量GFP强度来间接确定细胞合成cTA的量，所述腺病毒载体表达受CR5启动子调控的GFP。利用细胞显微操作器(Caron等，2000)从用AdCR5GFPq转导后荧光最强的克隆中转移特定细胞到96孔板，进行第二轮克隆。所述细胞在无G418的条件下生长，挑取汇合的集落并扩增。通过流式细胞术测量用AdCR5GFPq感染后产生的GFPq的强度来间接计算这些细胞产生cTA的数量。扩增一个最高产的亚克隆(CHOcTA-5F-1)。产生一个小规模的细胞库，并在液氮中冻存。
解冻CHO-SF(b)细胞(Invitrogen，Burlington，ON)，并在50ml添加IXHT添加剂(Invitrogen，Burlington，ON)、4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，Burlington，ON)的CD CHO培养基(Invitrogen，Burlington，ON)中于37℃生长传代3次后，按照下文所述利用10％DMSO(Invitrogen，Burlington，ON)制备包含22个冻存管的细胞库。在INRS-Institut Armand-Frappier，Montreal，QC检验该细胞库中支原体的存在。没有检测到支原体。按照制造商的推荐，利用Lipofectbmine2000(Invitrogen，Burlington，ON)通过线性化的pMPG-/t???k-neo/cymR_VP16-nls转染CHO-SF(b)细胞，产生稳定表达cumbte反式激活因子(cTA)的CHOcTA细胞。第二天，在G418(1.2mg/mL)存在的条件下，按照每孔10000或者5000个细胞的浓度将细胞分散到96孔板。3至4周后，挑取抗性集落并扩增。感染腺病毒载体(AdCR5GFPq)24小时后通过流式细胞术测量GFP的强度来间接确定细胞合成cTA的数量，所述腺病毒载体表达受CR5启动子调控的GFP。初次转染后一个月加三周后，利用细胞显微操作器(Caron等，2000)从用AdCR5GFPq(CHOs cTA#10)转导后荧光最强的克隆中转移特定细胞到96孔板，进行第二轮克隆。所述细胞在无G418的条件下生长，挑取汇合的集落(3至4周后)并扩增。通过流式细胞术测量感染AdCR5GFPq后产生的GFPq的强度来间接计算这些细胞产生cTA的数量。扩增最高产的亚克隆(CHOcTA-10-9)。产生一个小规模的细胞库，并在液氮中冻存。在INRS-Institut Armand-Frappier检验该细胞库中支原体的存在。没有检测到支原体。
通过Lipofectamine2000试剂使用线性化的pMPGCR5IgG1-Vk+hH460(SspI消化)转染表达cumate反式激活因子的CHO细胞(CHOcTA，克隆10-9和5F-1)。第二天，按照不同浓度(10000或者5000个细胞/孔)将细胞转移到96孔板。在这个时间点，向培养基中添加600μg/mL的潮霉素B。两至三周后，通过ELISA分析抗性集落(378个克隆)上清中IgG1抗体的存在(通过ELISA和western印迹确定的量只是产生抗体的粗略估算，因为用于定量的标准品(纯化的人IgG)不同于细胞产生的H460-16-2的嵌合IgG1)。总共104个克隆产生可检测量的抗体。
然后扩增十二个克隆，并利用24小时产能试验通过western印迹和SDS-PAGE检测所述抗体的表达。还鉴定了30℃6至13天的分批培养物中的抗体产生(图40和41)。在30℃进行抗体的产生，因为在这个温度CR5启动子作用更强。
6个克隆是17、71、80、6′、47′和147′。利用CHOcTA-10-9产生克隆17、71和80，而利用CHOcTA-5F1产生克隆6′、47′和147′。利用人IgG作为标准品，通过考马斯Fluo-Orange染色估算这6个克隆在37℃分泌4至6pg/细胞/天。
6.0产生(ch)ARH460-16-2-IgG2的初始克隆
6.1pMPGCR5VK+h460-IgG2的构建
该质粒包含H460-16-2的嵌合IgG2同种型的重链和轻链，受cumate可诱导启动子(CR5)的调控。此外，该质粒包含潮霉素的抗性基因以便于稳定克隆的选择(图42)。该质粒通过如下所述的数次PCR和亚克隆步骤产生。
A)轻链的嵌合(pMPGCR5VkH460的构建)
利用质粒pVkH460-16-2#1-1以及引物ARvarlc和jctvar-k#3(图43)通过PCR分离编码H460-16-2轻链可变区的DNA片段(PCR B)。利用质粒pMPGB43k以及引物ARkappa和jctk-var#3(图43)通过PCR分离编码人IgG K轻链恒定区的DNA片段(PCR A)。利用片段PCR B和PCR A作为模板以及引物Arvarlc和ARkappa，通过PCR将所述可变区与所述恒定区组装。所获DNA片段(PCR C)用BamH I消化并连接入pMPGCR5B43k(图38)，所述pMPGCR5B43k之前已经用BamH I消化以切除B43轻链。连接前，线性化载体通过小牛肠磷酸酶(CIP)处理去磷酸化。获得的载体被称为pMPGCR5VkH460koz。将完整的轻链送去测序。除了Kosak序列内有一处突变外，核苷酸序列与预期一致。经过将pMPGCR5vKH460koz的可变区与pMPGCR5kH460wrongjct(参见下文)可变区交换来校正该突变，这通过用Kpn I消化这两种质粒并将正确的DNA片段连接在一起来实现。所获质粒被称为pMPGCR5VkH460，并通过测序确认轻链的核苷酸序列。
B)pMPGCR5VkH460wrortgjct的构建
该质粒包含H460-16-2的嵌合轻链，在可变区和恒定区之间具有不同的接头。为了构建该质粒，利用质粒pVkH460-16-2#1-1以及引物ARvarlc和ARjctvar-k(图30)通过PCR分离编码H460-16-2轻链可变区的DNA片段(PCR B1)。利用质粒pMPGB43k以及引物ARkappa和ARjctk-var(图43)通过PCR分离编码人IgGκ轻链恒定区的DNA片段(PCR A1)。利用片段PCR B1和PCR A1作为模板以及引物Arvarlc和ARkappa，通过PCR将所述可变区与所述恒定区组装。所获DNA片段(PCR C1)然后用BamH I消化并连接入pMPGCR5B43k(图38)，所述pMPGCR5B43k之前已经用BamH I消化以切除B43轻链。连接前，所述载体经CIP处理去磷酸化。获得的载体被称为pMPGCR5VkH460wrongjctkoz。通过测序确认轻链的核苷酸序列。
C)重链的嵌合(pKCR5IgG2VhH460的构建)
利用质粒pVhH460-16-2#3以及引物ARigg2varlc和ARhvarswa(图43)通过PCR分离编码H460-16-2重链可变区的DNA片段(PCR D)所述PCR产物用Apa I消化，并连接到编码人IgG2恒定区的4.6kb DNA片段。通过用Apa I消化pkHc(BRI，NRC，Montreal Qc)继之以CIP处理，获得该载体。所获质粒被称为pKIgG2-VhH460。
通过Swa I消化释放pKIgG2-VhH460编码的完整重链，并将其克隆入pKCR5B43G3(图39)，所述pKCR5B43G3先前已经用Hind III消化以切除B43重链。连接前，所述质粒经T4DNA聚合酶处理被平端化，并经CIP处理去磷酸化。所获质粒被称为pKCR5IgG2VhH460wrongjct，并通过测序确认完整重链的核苷酸序列。嵌合IgG2的可变区和轻链之间的接头是与众不同的。因此，决定对其进行修饰。利用引物ApaICR5和IgG2TVSSASTK(图43)，通过pKCR5IgG2VhH460wrongjct的PCR扩增包含正确接头的DNA片段。所述PCR片段用Apa I消化并克隆入先用Apa I消化的pKCR5IgG2VhH460wrongjct。连接前，所述4.6kb片段经CIP处理去磷酸化。所获质粒被称为pKCR5IgG2VhH460，并通过测序确认嵌合IgG2的核苷酸序列。
D)IgG2表达载体的最终组装
利用Asc I消化从pKCR5IgG2VhH460切除重链表达盒(启动子，编码序列，poly A信号)，并将其插入pMPGCR5VkH460的Asc I位点，所述pMPGCR5VkH460AscId在连接前经CIP处理去磷酸化。通过测序确认重链和轻链的完整核苷酸序列。所获构建体(pMPGCR5VK+h460-IgG2)的图谱显示于图42。
7.0初始克隆的产生
用表达嵌合IgG2抗体的质粒pMPGCR5VK+h460-IgG2(图42)转染生长在无血清化学合成培养基中的CHO-cTA(克隆10-9)细胞，在潮霉素存在的条件下产生稳定克隆。通过ELISA分析374个克隆的IgG2抗体表达。80个克隆是抗体表达阳性的。通过western印迹或者SDS-PAGE分析58个最高产克隆分泌抗体的量(图44)。最高产的克隆在37℃的产量为5至10pg/细胞/天。6个克隆是：克隆40、50、51、52、54和56。
8.0高产克隆的筛选
在没有选择压力的条件下，利用显微操作器对克隆40、50、51、54和56进行亚克隆(每个克隆大约50个细胞)。通过Western印迹分析或者SDS-PAGE，继之以考马斯Fuo-Orange染色，检测51个亚克隆的生成水平(图45)。下面是最高产的亚克隆，括号内表示37℃产生抗体的量：40F8(11)，40B7(7)，56B9(7)，40F7(7)，56E9(5)，40E11(5)，40D9(6)，56B8(6)，5611(4)和54E10(3)。
9.0上清的检测
来自每个嵌合IgG1和IgG2克隆的上清被用作Western印迹探针，来确定是否存在能够检测鼠抗体H460-16-2的靶抗原(CD44)的IgG。将包含300微克人乳腺癌细胞MDA-MB-231的全细胞膜部分的样品煮沸，并通过SDS-PAGE(制备凝胶，10％丙烯酰胺)/Western免疫印迹进行分析。按照Western印迹的标准程序，利用1:2稀释(用溶于TBST的10％脱脂乳)的细胞培养上清检测Western印迹。
结果表明所有上清(来源于嵌合IgG1和嵌合IgG2-分泌克隆)都能检测CD44，其在类似(计算的)浓度(5微克/mL；图46和47)具有类似于从鼠亲代MAb获得的信号。
10.0挑选的克隆在生物反应器中的生产
根据SDS-PAGE分析，嵌合IgG1克隆6′看起来是分泌最高的克隆，并且在Western印迹中，其与鼠H460-16-2以类似的方式结合MDA-MB-231细胞的细胞膜制备物。因此，使用克隆6′在30℃的摇瓶中分批培养产生抗体。通过SDS-PAGE继之以考马斯Fluo-Orange染色(图48)，鉴定每批的抗体浓度。不同批次的体积和抗体浓度显示如下：批次super22Nov：1.6L，150mg/L；批次N3：65L，200mg/L；批次N4：65L，100mg/L以及批次N5和N6：8L，200mg/L。克隆6′被用于将来所有的嵌合IgG1研究，将其称为(ch)ARH460-16-2-IgG1。
根据SDS-PAGE分析，嵌合IgG2克隆40B7看起来是分泌最高的克隆，并且在Western印迹中，其与鼠H460-16-2以类似的方式结合MDA-MB-231细胞的细胞膜制备物。因此，生产更多量的克隆40B7(图49)。生产了包含大约140mg/升抗体的20升培养基。通过SDS-PAGE继之以考马斯FluOrange染色，测定培养基中的抗体浓度。克隆40b7被用于将来所有的嵌合IgG2研究，将其称为(ch)ARH460-16-2-IgG2。
实施例10
MDA-MB-231细胞的体内肿瘤实验
参考图50和51，4至6周大的雌性SCID小鼠经颈背皮下注射植入溶于100微升盐水的5百万人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)。每周用卡钳测量肿瘤生长。当移植后35天大部分群组的平均肿瘤体积达到91mm3(范围55-143mm3)时，小鼠根据肿瘤大小被分成几组。来自各组的小鼠被随机分配到4个治疗组(每组10只)，这样的话每个治疗组的平均肿瘤体积与其他组不会显著不同。每组腹腔内注入稀释后体积为300微升的15mg/kg H460-16-2、(ch)ARH460-16-2-IgG1、(ch)ARH460-16-2-IgG2测试抗体或者缓冲液对照，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释剂从原液浓度稀释。然后按照相同方式每周给药所述抗体3次，共10次剂量，直到移植后第57天。大约每7天用卡钳测量一次肿瘤生长，直到移植后第62天或者个别动物达到CCAC终点。在整个研究期间每周一次记录动物的体重。研究结束时，根据CCAC指南处死所有的动物。
如图50所示，在人乳腺癌的已确立的MDA-MB-231体内模型中，鼠H460-16-2和(ch)ARH460-16-2-IgG1均降低肿瘤生长。在第62天，最后一次剂量给药后5天，H460-16-2治疗导致39％的肿瘤生长抑制(平均T/C＝57％)。肿瘤生长的这种减低显著不同于对照(p＝0.0037)。嵌合抗体(ch)ARH460-16-2-IgG1导致增强的肿瘤生长抑制，为64％(平均T/C＝26.9％；p<0.0001)。相反，和缓冲液对照相比，嵌合抗体的IgG2形式((ch)ARH460-16-2-IgG2)没有抑制肿瘤生长(TGI＝0％；平均T/C＝122％；p＝0.7264)。
在整个研究期间没有临床毒性症状。每周测量一次的体重是健康状况和发育停滞的表征。图51显示整个研究期间各治疗组的体重结果。与缓冲液对照组相比，来自H460-16-2或者(ch)ARH460-16-2-IgG2治疗组的小鼠的体重没有显著变化。但是缓冲液对照治疗组和(ch)ARH460-16-2-IgG1治疗组之间存在显著的体重降低(p＝0.0005)。
总之，在MDA-MB-231乳腺癌模型中，(ch)ARH460-16-2-IgG1显示与鼠抗体相同或者比鼠抗体更高的效果。相反，在人MDA-MB-231乳腺癌的这种模型中，(ch)ARH460-16-2-IgG2嵌合抗体没有降低肿瘤生长。
实施例11
用H460-16-2、(ch)ARH460-16-2-IgG1和(ch)ARH460-16-2IgG2处理的MDA-MB-231细胞的膜联蛋白-V染色
进行膜联蛋白-V染色以确定H460-16-2的嵌合形式是否能够按照鼠对应物的相同方式诱导人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的凋亡。用0.25、2.5和20微克/mL的H460-16-2、(ch)ARH460-16-2-IgG1或者(ch)ARH460-16-2-IgG2处理MDA-MB-231细胞24小时。每种抗体与相同浓度的相应同种型对照(1B7.11，抗TNP，鼠IgG1，κ，实验室生产；人骨髓瘤IgG1，k，Sigma，Oakville，ON；人骨髓瘤IgG2，k，Sigma，Oakville，ON)一起重复检测3次。包含未处理的样品作为阴性对照，并包含喜树碱(Biovision；Exton，PA)作为阳性对照。利用荧光测定珠(BD Bioscience，Oakville，ON)补偿FACS装置的荧光偶联物的光溢出。细胞然后用膜联蛋白-V和7AAD染色，并于1小时内在FACSArray上获取。
在两个独立实验中，将鼠和两种嵌合H460-16-2抗体在彼此之间以及与它们相应的同种型对照抗体之间比较(图52)。图52还显示2个实验的平均值。发现用同种型对照处理的细胞的自发凋亡作用与只用赋形剂处理的细胞类似。发现在每个实验中，鼠和人嵌合IgG1和IgG2H460-16-2抗体均以剂量依赖性方式诱导乳腺癌细胞系的凋亡，在(ch)ARH460-16-2IgG1和IgG2抗体中观察到更高的凋亡作用。该结果表明与嵌合IgG1抗体相比，在体外(ch)ARH460-16-2-IgG2抗体具有最大的凋亡作用。
所有3种抗体均显示超过它们预期同种型对照的坏死和坏死/凋亡群百分比的增加。在(ch)ARH460-16-2-IgG2中观察到坏死和坏死/凋亡群百分比的最大增加，然后是(ch)ARH460-16-2-IgG1，再次是H460-16-2。
优势证据标明，H460-16-2、(ch)ARH460-16-2-IgG2、(ch)ARH460-16-2-IgG1和AR37A335.8通过CD44上存在的表位的连接来介导抗癌作用。在实施例5中已经显示，H460-16-2和AR37A335.8抗体可用于免疫沉淀来自表达细胞例如MDA-MB-231细胞的同源抗原。此外还显示，利用下列说明的技术，但并不限于FACS、细胞ELISA或者IHC，H460-16-2、(ch)ARH460-16-2-IgG2、(ch)ARH460-16-2-IgG1和AR37A335.8抗体可用于检测表达CD44抗原部分的细胞和/或组织，所述CD44抗原部分与上述抗体特异结合。
因此，利用FACS、细胞ELISA或者IHC分析，可以显示免疫沉淀的H460-16-2、(ch)ARH460-16-2-IgG2、(ch)ARH460-16-2-IgG1和AR37A335.8抗原能够抑制任一抗体对这类细胞或者组织的结合。此外，就像H460-16-2、(ch)ARH460-16-2-IgG2、(ch)ARH460-16-2-IgG1和AR37A335.8抗体一样，其他抗CD44抗体可用于免疫沉淀和分离其他形式的CD44抗原，并且利用相同类型的分析，所述抗原也可用于抑制这些抗体与表达该抗原的细胞或者组织的结合。
本说明书中提及的所有专利和公开出版物代表了本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开出版物通过引用的方式并入本文，其引用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。
应该理解，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限定在本文所描述和显示的特定形式或布局。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出多种变化，本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。本领域的技术人员很容易看出使本发明良好地适合实现所描述的目的并获得最终结果和益处，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相关化合物、方法、操作和技术都是优选实施方案中有代表性的，其目的在于示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到包括在本发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的范围所限定。尽管借助特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解所要求保护的本发明并不仅仅局限于这些特定的实施方案。事实上，所描述的实施本发明的一些方式的的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而易见的，均在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110>阿里乌斯研究公司
<120>显示CD44表面表达的细胞的细胞毒性介导
<130>2056I.000065
<150>US10/810,165
<151>2004-03-26
<150>US09/415,278
<151>1999-10-08
<150>US09/727,361
<151>2000-11-29
<150>US10/603,000
<151>2003-06-23
<150>US10/647,818
<151>2003-08-22
<160>36
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>810
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2Vκ(M)1-1的商业载体
<400>1
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<210>2
<211>820
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2Vκ(M)1-2的商业载体
<400>2
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<212>DNA
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<220>
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gtatagttta tcgaagtgct atctggatta acttctccaa tccattctag ccctttccct    300
ggagcctgcc ggacccaact catccagtat ctactaaaat cgaatcctga ggttgcacag    360
gagagtttca gggatcctcc aggctgcacc aggccacctc cagactcgag aagcttcacc    420
tcacactgga ccccttttaa aagagcaaca ataaaaaaaa tcagcccaaa atccatgtca    480
actagta                                                              487
<210>7
<211>477
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物H460-16-2V重链#4的商业载体
<400>7
atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg     60
aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt    120
gcaacctcag gattcgattt tagtagatac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg    180
aaagagctag aatggattgg agaagttaat ccagatagca cttcgataaa ctatacgcca    240
tctctaaagg atcaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct ggacctgcaa    300
atgagcaaag tgagctctga agacacagcc ctttattact gtacaaggcc taattactac    360
ggtagtaggt accactacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtt    420
tcctcagcca aaacgacacc cccatccgtt tatccattgg cccctggaag cttggga       477
<210>8
<211>487
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物H460-16-2V重链#5的商业载体
<400>8
cccaagcttc caggggccaa gggataaacg ggtgggggtg tcgttttggc tgaggaaacg     60
gtgactgagg ttccttgacc ccagtagtcc atagcatagt agtggtacct actaccgtag    120
taattaggcc ttgtacagta ataaagggct gtgtcttcag agctcacttt gctcatttgc    180
aggtccagcg tatttttggc gttgtctctg gagatgatga attgatcctt tagagatggc    240
gtatagttta tcgaagtgct atctggatta acttctccaa tccattctag ccctttccct    300
ggagcctgcc ggacccaact catccagtat ctactaaaat cgaatcctga ggttgcacag    360
gagagtttca gggatcctcc aggctgcacc aggccacctc cagactcgag aagcttcact    420
tcacactgga ccccttttaa aagagcaaca ataaaaaaaa tcagcccaaa atccatgtcg    480
actagta                                                              487
<210>9
<211>634
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2V重链#1的商业载体
<400>9
atcgtaatac gactcactat agggcgaatt gggccctcta gatgcatgct cgagcggccg     60
ccagtgtgat ggatatctgc agaattcgcc cttgggaatt catgaagttg gggctcagct    120
gggtttcatg tcgactagtc acaaaagaat cagcactctc atgtcgaagg gcgaattcca    180
gcacactggc ggccgttact agtggatccg agctcggtac caagcttggc gtaatcatgg    240
tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc    300
ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg    360
ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc    420
ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact    480
gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta    540
atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag    600
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg tttt                                634
<210>10
<211>757
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2V重链#3的商业载体
<400>10
gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggccctc tagatgcatg ctcgagcggc     60
cgccagtgtg gatggatatc tgcagaattc gcccttccca agcttccagg ggccaaggga    120
tagacgggtg ggggtgtcgt tttggctgag gaaacggtga ctgaggttcc ttgaccccag    180
tagtccatag catagtagtg gtacctacta ccgtagtaat taggccttgt acagtaataa    240
agggctgtgt cttcagagct cactttgctc atttgcaggt ccagcgtatt tttggcgttg    300
tctctggaga tgatgaattg atcctttaga gatggcgtat agtttatcga agtgctatct    360
ggattaactt ctccaatcca ttctagccct ttccctggag cctgccggac ccaactcatc    420
cagtatctac taaaatcgaa tcctgaggtt gcacagggag agtttcaggg atcctccagg    480
ctgcaccagg ccacctccag actcgagaag cttcacctca cactggaccc cttttaaaag    540
agcaacaata aaaaaaatca gcccaaaatc catgtcgact agtaagggcg aattccagca    600
cactggcggc cgttactagt ggatccgagc tcggtaccaa gcttggcgta atcatggtca    660
tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga    720
agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtga                             757
<210>11
<211>718
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2V重链#17的商业载体
<400>11
gattgaatac gactcactat agggcgaatt gggccctcta gatgcatgct cgagcggccg     60
ccagtgtgat ggatatctgc agaattcgcc cttcccaagc ttccagggac caggggataa    120
acggatgggg gtgtcgtttt ggctgaggaa acggtgactg aggttccttg accccagtag    180
tccatagcat agtagtggta cctactaccg tagtaattag gccttgtaca gtaataaagg    240
gctgtgtctt cagagctcac tttgctcatt tgcaggtcca gcgtattttt ggcgttgtct    300
ctggagatga tgaattgatc ctttagagat ggcgtatagt ttatcgaagt gctatctgga    360
ttaacttctc caatccattc tagccctttc cctggagcct gccggaccca actcatccag    420
tatctactaa aatcgaatcc tgaggttgca caggagagtt tcagggatcc tccaggctgc    480
accaggccac ctccagactc gagaagcttc acctcacact ggaccccttt taaaagagca    540
acaataaaaa aaatcagccc aaaatccatg taagggcgaa ttccagcaca ctggcggccg    600
ttactagtgg atccgagctc ggtaccaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct    660
gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagt      718
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>12
cgtggaagct tcgtacggcc catcggtctt ccccctggca                           40
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>13
tagaaggcac  agtcgagg                                                  18
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>14
gcgccaagat ctgatatcca gatgaca                                           27
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>15
ggaggttgcg gccgcagtcc gttatatttc                                        30
<210>16
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>16
gcggaggcta gcggggatat ccaccatgga ttttgggctg                             40
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>17
gagtgccgta cgtggaggct gaggaaacgg tgac                                   34
<210>18
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>18
gctggctagc acgcgttaaa catgaagttt ccttct                                 36
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>19
cgcgaggcta gcacgcgtat ccaccatg                                        28
<210>20
<211>704
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2Vκ#1的商业载体
<400>20
atgaagtttc cttctcaact tctgctctta ctgctgtttg gaatcccagg catgagatct     60
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgtct ctctgggaga cagagtcacc    120
atcaattgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca    180
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca    240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat ttttctctca ccattagcaa cctggagaaa    300
gaagatgttg ccacttactt ttgccaacag ggtagtacgc ttccattcac gttcggctcg    360
gggacaaagt tggaaataaa acggactgcg gccgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca    420
tctgatgagc agttgaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc    480
ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg    540
agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc    600
tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc    660
tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttga                     704
<210>21
<211>704
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2Vκ#2的商业载体
<400>21
atgaagtttc cttctcaact tctgctctta ctgctgtttg gaatcccagg catgagatct      60
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgtct ctctgggaga cagagtcacc     120
atcaattgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca     180
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca    240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat ttttctctca ccattagcaa cctggagaaa    300
gaagatgttg ccacttactt ttgccaacag ggtagtacgc ttccattcac gttcggctcg    360
gggacaaagt tggaaataaa acggactgcg gccgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca    420
tctgatgagc agttgaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc    480
ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg    540
agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc    600
tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc    660
tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttga                     704
<210>22
<211>704
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2Vκ#4的商业载体
<400>22
atgaagtttc cttctcaact tctgctctta ctgctgtttg gaatcccagg catgagatct     60
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgtct ctctgggaga cagagtcacc    120
atcaattgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca    180
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca    240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tttctctcac cattagcaac ctggagaaag    300
aagatgttgc cacttacttt tgccaacagg gtagtacgct tccattcacg ttcggctcgg    360
ggacaaagtt ggaaataaaa cggactgcgg ccgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat    420
ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc    480
ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg    540
agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc    600
tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc    660
tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttga                     704
<210>23
<211>1055
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2V重链#1的商业载体
<400>23
ccatttggtg tccggcgacg gtagccaggc cagcctggcc atggaagtaa ttcttggaat      60
ttgcccattt tgagtttgga gcgaagctga ttgacaaagc tgcttagccg ttcaaaggta     120
ttcttcgaac ttttttttta aggtgttgtg aaaaccaagc ttctcgagcg tacgtattaa     180
ttaactcacg cgtatccacc atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa     240
aaggggtcca gtgtgaggtg aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag     300
gatccctgaa actctcctgt gcaacctcag gattcgattt tagtagatac tggatgagtt     360
gggtccggca ggctccaggg aaagggctag aatggattgg agaagttaat ccagatagca     420
cttcgataaa ctatacgcca tctctaaagg atcaattcat catctccaga gacaacgcca     480
aaaatacgct ggacctgcaa atgagcaaag tgagctctga agacacagcc ctttattact     540
gtacaaggcc taattactac ggtagtaggt accactacta tgctatggac tactggggtc     600
aaggaacctc agtcaccgtt tcctcagcct ccacgtacgg cccatcggtc ttccccctgg     660
caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact     720
acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca     780
ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc     840
cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca     900
ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt     960
gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccagga    1020
caccctcatg atctcccgga cccctgaggg cacat                               1055
<210>24
<211>1670
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2V重链#2的商业载体
<400>24
atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg     60
aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt    120
gcaacctcag gattcgattt tagtagatac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg    180
aaagggctag aatggattgg agaagttaat ccagatagca cttcgataaa ctatacgcca    240
tctctaaagg atcaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct ggacctgcaa    300
atgagcaaag tgagctctga agacacagcc ctttattact gtacaaggcc taattactac    360
ggtagtaggt accactacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtt    420
tcctcagcct ccacgtacgg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc    480
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg     540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag     600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc     660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt     720
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg     780
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca     840
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc     900
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct     960
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg    1020
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag    1080
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc    1140
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg    1200
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc    1260
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac    1320
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc    1380
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct    1440
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc cccctgtctc cgggtaaatg actcgagcat    1500
gcatctagaa tattacccct aacacctgcc acccagtctt aatcagtggt ggaagaacgg    1560
tctcagaact gtttgtctca attggccatt taagtttata gtgaagactg gttaatgata    1620
acaatgcatc ggaaaccttc aggaggaaag gagaatgttt gtggaacaat               1670
<210>25
<211>988
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有插入物ARH460-16-2V重链#6的商业载体
<400>25
cacatttggt gggctggaga ctgtagccag gccagcctgg ccatggaagt aattcttgga     60
atttgcccat tttgagtttg gagcgaagct gattgacaaa gctgcttagc cgttcaaagg    120
tattcttcga actttttttt taaggtgttg tgaaaaccaa gcttctcgag cgtacgtatt    180
aattaactca cgcgtatcca ccatggattt tgggctgatt ttttttattg ttgctctttt    240
aaaaggggtc cagtgtgagg tgaagcttct cgagtctgga ggtggcctgg tgcagcctgg    300
aggatccctg aaactctcct gtgcaacctc aggattcgat tttagtagat actggatgag    360
ttgggtccgg caggctccag ggaaagggct agaatggatt ggagaagtta atccagatag    420
cacttcgata aactatacgc catctctaaa ggatcaattc atcatctcca gagacaacgc    480
caaaaatacg ctggacctgc aaatgagcaa agtgagctct gaagacacag ccctttatta    540
ctgtacaagg cctaattact acggtagtag gtaccactac tatgctatgg actactgggg    600
tcaaggaacc tcagtcaccg tttcctcagc ctccacgtac ggcccatcgg tcttccccct    660
ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga    720
ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca    780
caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt    840
gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa    900
caccaaggtg gacaagaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg    960
tgccagcacc tgaactcctg ggggggac                                       988
<210>26
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>26
cgggggatcc gccgccacca tggtatcctc acctcag                              37
<210>27
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>27
gacagatggt gcagccacag tccgttttat ttccaacttt  g                        41
<210>28
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>28
cgggggatcc ctaacactct cccctgttga agc                                  33
<210>29
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>29
caaagttgga aataaaacgg actgtggctg caccatctgt c                   41
<210>30
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>30
gacagatggt gcagccacag ttgcggccgc agtccgtttt a                   41
<210>31
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>31
taaaacggac tgcggccgca actgtggctg caccatctgt c                   41
<210>32
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>32
catgggggcc cttggtggag ccgtacgtgg aggctga                        37
<210>33
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>33
ctagggggcc catttaaatc gccgccacca tggattttgg gctgatt             47
<210>34
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>34
ggaacaaaag ctgggtaccg ggccccccct cgaggtc                              37
<210>35
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物序列
<400>35
ccgatgggcc cttggtggaa gctgaggaaa cggtgac                              37
<210>36
<211>438
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有正确的插入物H460-16-2V重链的商业载体
<400>36
atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg     60
aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt    120
gcaacctcag gattcgattt tagtagatac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg    180
aaagggctag aatggattgg agaagttaat ccagatagca cttcgataaa ctatacgcca    240
tctctaaagg atcaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct ggacctgcaa    300
atgagcaaag tgagctctga agacacagcc ctttattact gtacaaggcc taattactac    360
ggtagtaggt accactacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtt    420
tcctcagcca aaacgaca                                                  438

Claims (13)

1.分离的单克隆抗体，所述抗体由IDAC保藏的保藏号为280104-06的杂交瘤产生。
2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含全部两个可变区，其中全部CDR区对应权利要求1的分离的单克隆抗体的CDR区并且全部FR残基是人免疫球蛋白共有序列的那些FR残基。
3.由IDAC保藏的保藏号为280104-06的杂交瘤。
4.IDAC保藏的保藏号为280104-06的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体在制备引发抗体诱导的选自人类肿瘤的组织样品中癌细胞的细胞毒性作用的药物中的用途，
其中所述分离的单克隆抗体用于与所述组织样品接触；
其中所述分离的单克隆抗体与所述组织样品的结合诱导细胞的细胞毒性作用，
其中所述肿瘤是结肠癌或前列腺癌，其中所述癌细胞是LnCap前列腺癌细胞或结肠癌细胞。
5.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体的Fv分子、Fab分子、Fab’分子或F(ab’)2分子。
6.如权利要求2所述的人源化抗体的Fv分子、Fab分子、Fab’分子或F(ab’)2分子。
7.如权利要求1、2、5或者6中任一项所述的分离的抗体或者Fv分子、Fab分子、Fab’分子或F(ab’)2分子，所述抗体或者Fv分子、Fab分子、Fab’分子或F(ab’)2分子与选自由细胞毒部分、酶、放射性化合物和造血细胞组成的组的成员偶联。
8.分离的单克隆抗体在制备用于治疗哺乳动物中对抗体诱导的细胞的细胞毒性作用敏感的人类肿瘤的药物中的用途，其中所述人类肿瘤表达与所述分离的单克隆抗体特异结合的抗原，所述分离的单克隆抗体由IDAC保藏的保藏号为280104-06的杂交瘤产生，其中所述肿瘤是结肠癌或前列腺癌，其中所述结肠癌或前列腺癌的癌细胞是LnCap前列腺癌细胞或结肠癌细胞。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述单克隆抗体与细胞毒部分偶联。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述细胞毒部分是放射性同位素。
11.如权利要求8所述的用途，其中所述单克隆抗体活化补体。
12.如权利要求8所述的用途，其中所述单克隆抗体介导抗体依赖的细胞的细胞毒性。
13.如权利要求8所述的用途，其中所述单克隆抗体是所述分离的单克隆抗体的人源化抗体。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050100542A1 (en) * 1999-10-08 2005-05-12 Young David S. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US7947496B2 (en) * 1999-10-08 2011-05-24 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20090004103A1 (en) * 1999-10-08 2009-01-01 Young David S F Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20080124327A1 (en) * 1999-10-08 2008-05-29 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US8048416B2 (en) * 1999-10-08 2011-11-01 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US7419792B2 (en) * 1999-10-08 2008-09-02 Arius Research Inc. Laminin Receptor 1 Precursor Protein (37LRP) epitope delineated by an Hepatocellular carcinoma specific antibody
US8071072B2 (en) * 1999-10-08 2011-12-06 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
CN101663049A (zh) * 2007-03-09 2010-03-03 霍夫曼-拉罗奇有限公司 证明cd44表面表达的细胞的细胞毒性介导
EP2009028A1 (en) * 2007-06-27 2008-12-31 Monoclonal Antibodies Therapeutics Combination of a conventional anti-cancer treatment with anti-CD44 antibody administration for treating solid tumors
CA2793838C (en) 2010-03-19 2019-09-17 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Integrin interaction inhibitors for the treatment of cancer
WO2012129335A2 (en) * 2011-03-21 2012-09-27 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc Hyd1 peptides for relapsed cancer
WO2013035824A1 (ja) 2011-09-07 2013-03-14 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞の分離
WO2015048477A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Cyclic peptide conjugates and methods of use
CN109402064B (zh) * 2018-11-05 2021-05-14 湖南省肿瘤医院 杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用
CN112569351B (zh) * 2020-12-16 2021-10-15 南通大学 Cd44抗体在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用
CN114250200A (zh) * 2021-12-23 2022-03-29 蚌埠医学院 一种非小细胞肺癌脑转移和脊髓转移的动物模型构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005018667A1 (en) * 2003-08-22 2005-03-03 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of cd44

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US486158A (en) 1892-11-15 John cook
US4172124A (en) * 1978-04-28 1979-10-23 The Wistar Institute Method of producing tumor antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4828991A (en) * 1984-01-31 1989-05-09 Akzo N.V. Tumor specific monoclonal antibodies
EP0266032A1 (en) 1986-08-29 1988-05-04 Beecham Group Plc Modified fibrinolytic enzyme
NZ222509A (en) * 1986-11-19 1993-03-26 Oncogen Hybridoma cell line producing antibodies binding to tumour-associated mucin antigen
US4861581A (en) * 1986-12-05 1989-08-29 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5171665A (en) * 1989-04-17 1992-12-15 Oncogen Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5980896A (en) * 1989-06-30 1999-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies reactive with human carcinomas
DE4014510A1 (de) * 1990-05-07 1991-11-14 Kernforschungsz Karlsruhe Variante cd44-oberflaechenproteine, diese kodierende c-dna-sequenzen, antikoerper gegen diese proteine sowie ihre verwendung in der diagnostik und therapie
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
DE69229254T2 (de) * 1991-10-30 1999-09-23 Idemitsu Kosan Co Verfahren zur Herstellung von menschlichen Lymphozyten und menschlichen Antikörpern; und so hergestellte Antikörper
DK1136556T3 (da) 1991-11-25 2005-10-03 Enzon Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multivalente antigen-bindende proteiner
IL105008A0 (en) * 1992-03-13 1993-07-08 Yeda Res & Dev Double transfectants of mhc genes as cellular vaccines for immunoprevention of tumor metastasis
CA2149635A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 David Tarin Peptide corresponding to cd44 exon 6, antibodies specific for said peptide and use of these antibodies for diagnosis of tumors
US5879898A (en) * 1992-11-20 1999-03-09 Isis Innovation Limited Antibodies specific for peptide corresponding to CD44 exon 6, and use of these antibodies for diagnosis of tumors
ATE244888T1 (de) * 1993-02-05 2003-07-15 Epigen Inc Humanes carcinoma-antigen (hca), hca antikörper, hca immunoassays, aufzeichnungsmethoden und therapy
US5693322A (en) * 1993-03-11 1997-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Enhanced intercellular interaction by associational antibody molecules
EP0703989B1 (en) 1993-06-18 1997-11-05 Oy Biotie Therapies COMPOSITIONS AND DIAGNOSTIC METHODS USING MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST CD44v6
WO1995020401A1 (en) 1994-01-31 1995-08-03 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
UA58482C2 (uk) * 1994-06-08 2003-08-15 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Моноклональне антитіло vff-18 проти сd44v6 і його фрагменти
EP1018518A2 (en) * 1994-06-24 2000-07-12 Vladimir P. Torchilin Use of autoantibodies for tumor therapy and prophylaxis
US5783186A (en) * 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
WO1998006839A1 (en) * 1996-07-15 1998-02-19 Human Genome Sciences, Inc. Cd44-like protein
ES2176574T3 (es) * 1996-09-03 2002-12-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Utilizacion de anticuerpos bi y triespecificos para la induccion de inmunidad tumoral.
DE19653607A1 (de) * 1996-12-20 1998-06-25 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen
DE19708713C2 (de) * 1997-03-04 2002-11-28 Boehringer Ingelheim Int Verwendung von anti-CD44 Antikörpern enthaltenden Präparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunreaktionen
US5816468A (en) * 1997-06-24 1998-10-06 Testo Industries Corp. No-idle-striking structure for nailing machines
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US7947496B2 (en) * 1999-10-08 2011-05-24 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US6180357B1 (en) * 1999-10-08 2001-01-30 Arius Research, Inc. Individualized patient-specific anti-cancer antibodies
US20050100542A1 (en) * 1999-10-08 2005-05-12 Young David S. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US7252821B2 (en) 1999-10-08 2007-08-07 Arius Research Inc. Cancerous disease modifying antibodies
US6657048B2 (en) * 1999-10-08 2003-12-02 Arius Research, Inc. Individualized anti-cancer antibodies
US20040001789A1 (en) * 1999-10-08 2004-01-01 Young David S. F. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of gp96 or precursors thereof
CZ20032787A3 (en) 2001-04-03 2004-03-17 Merck Patent Gmbh Renal cell carcinoma tumor markers
YU91403A (sh) 2001-05-18 2006-05-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh. Antitela specifična za cd44v6
US20030103985A1 (en) * 2001-05-18 2003-06-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates
CA2471206A1 (en) 2001-12-21 2003-07-10 Arius Research, Inc. Individualized anti-cancer antibodies
US7399835B2 (en) * 2004-02-26 2008-07-15 Arius Research Inc. Cancerous disease modifying antibodies
US7319674B2 (en) 2003-07-24 2008-01-15 Cisco Technology, Inc. System and method for exchanging awareness information in a network environment
US7348413B2 (en) * 2004-02-26 2008-03-25 Arius Research Inc. Cancerous disease modifying antibodies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005018667A1 (en) * 2003-08-22 2005-03-03 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of cd44

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