KR20210122813A - 항체 및 그의 기능성 단편 - Google Patents

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고이치 사이토
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스미또모 가가꾸 가부시키가이샤
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Abstract

개시되어 있는 것은, 3'-시알릴락토스에 결합하고, 3 이하의 아미노산 치환해도 되는, ARKNGGLDYAMDY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 단편, 해당 항체 또는 그의 기능성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 해당 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 해당 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 질환의 검사약 및 의약 조성물이다.

Description

항체 및 그의 기능성 단편
본 발명은 항체 또는 그의 기능성 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 해당 항체 또는 그의 기능성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 해당 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 해당 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 질환의 검사약 및 의약 조성물에 관한 것이다.
암은 일본에 있어서의 사망 원인 중 제1위로, 평균 수명의 연장에 따라 사망자수는 해마다 증가하고 있다. 암에 의한 사망자수의 감소를 위해서는 조기 진단이 가장 중요하게 여겨지고 있지만, 초기에 특징적인 증상이 없는 경우가 많아, 진단되었을 때는 이미 암이 진행되어 치료가 곤란해져 있다. 또한, 췌장암 등의 암에서는 수술에 의해 암 조직을 절제할 수 있어도 수술 후의 재발률이 높아, 수술 후의 모니터링을 빼놓을 수 없다. 따라서, 혈액 검사 등 간편한 암의 검사 방법은, 적절한 실시에 의해 확실한 효과가 얻어지는 점에서 중요한 역할을 담당하고 있다.
지금까지 암 항원에 대한 항체가 많이 제작되고 있고, 특히 모노클로날 항체는 감도 및 특이도가 높고, 또한 반영구적으로 사용할 수 있기 때문에, 일반적으로 사용되고 있다. 조기 진단이 가장 곤란한 췌장암의 경우, CA19-9 모노클로날 항체를 사용하는 검사 방법이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 또한, 위암에서는 CEA 항체, 난소암에서는 CA125 항체 등이 암의 검사에 사용되고 있다.
Erxi W. Shuang Z. Kruttika B. Qingyong M.: CA19-9 and pancreatic cancer. Clin Adv Hematol Oncol. 2013 11(1): 53-55.
본 발명은 암의 검사 및 치료에 이용 가능한 항체 또는 그의 기능성 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 해당 항체 또는 그의 기능성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 해당 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 해당 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 질환의 검사약 및 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 인간ES 세포를 마우스에 면역함으로써 항체를 취득하고, 해당 항체의 항원값을 지표로 함으로써 암의 이환의 가능성을 판정할 수 있다고 하는 지견을 얻었다. 또한, 해당 항체가 암 세포 상해 활성을 갖는 것도 발견했다.
본 발명은 이들 지견에 기초하여 더욱 검토를 거듭하여 완성된 것이며, 다음의 항체 또는 그의 기능성 단편, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 질환의 검사약 및 의약 조성물을 제공하는 것이다.
항 1. 3'-시알릴락토스에 결합하고, 3 이하의 아미노산 치환해도 되는, ARKNGGLDYAMDY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그의 기능성 단편.
항 2. 3'-시알릴락토스에 결합하고,
(i) 3 이하의 아미노산 치환해도 되는, GIDFSIYW(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열, INSDSSTI(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열 및 ARKNGGLDYAMDY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 그리고/또는
(ii) 1 이하의 아미노산 치환해도 되는, KSISKY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열, SGS의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열 및 QQHNEYPWT(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 또는 그의 기능성 단편.
항 3. 상기 항체가 척추 동물 유래인, 항 1 또는 2에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편.
항 4. 상기 항체가 마우스 유래인, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편.
항 5. 상기 항체가 IgG 또는 IgM인, 항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편.
항 6. 상기 기능성 단편이, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 디아보디, 트리아보디, 테트라보디 또는 미니보디인, 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편.
항 7. 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
항 8. 항 7에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
항 9. 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환의 검사약.
항 10. 상기 질환이 암인, 항 9에 기재된 검사약.
항 11. 상기 암이 췌장암, 멜라노마, 갑상선암, 위암, 정소암 및 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, 항 10에 기재된 검사약.
항 12. 진단제로 표지된, 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환을 진단하기 위한 의약 조성물.
항 13. 상기 진단제가 방사성 물질인, 항 12에 기재된 의약 조성물.
항 14. 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환을 치료하기 위한 의약 조성물.
항 15. 치료제로 표지된, 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환을 치료하기 위한 의약 조성물.
항 16. 상기 치료제가 항암제인, 항 15에 기재된 의약 조성물.
항 17. 상기 치료제가 방사성 물질인, 항 15에 기재된 의약 조성물.
또한, 본 발명은 이하도 제공한다.
항 18. 췌장암 등의 암의 이환의 가능성을 검사하는 방법이며, (1) 피검체로부터 채취된 생체 시료에 대해서 항 9 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 검사약을 사용해서 항원의 양 또는 농도를 측정하는 공정을 포함하는, 방법.
항 19. 추가로, (2) 상기 공정 (1)에서 측정된 상기 항원의 양 또는 농도의 값이 미리 설정된 컷오프값 이상인 경우에, 상기 피검체가 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정하는 공정을 포함하는, 항 18에 기재된 방법.
항 20. 피검체에 있어서의 췌장암 등의 암을 진단하는 방법이며,
(1a) 피검체로부터 채취된 생체 시료에 대해서 항 9 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 검사약을 사용해서 항원의 양 또는 농도를 측정하는 공정, 및
(2a) 상기 공정 (1a)에서 측정된 상기 항원의 양 또는 농도의 값이 미리 설정된 컷오프값 이상인 경우에, 상기 피검체가 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정하는 공정
을 포함하는, 방법.
항 21. 추가로, (3) 상기 공정 (2a)에서 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정된 피검체에 대하여 췌장암 등의 암의 진단 방법을 적용하는 공정을 포함하는, 항 20에 기재된 방법.
항 22. 상기 공정 (3)에 있어서 적용되는 췌장암 등의 암의 진단 방법이, 생검법, PET 검사법, CT 검사법 및 초음파 검사법으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, 항 21에 기재된 방법.
항 23. 피검체에 있어서의 췌장암 등의 암을 검사 및 치료하는 방법이며,
(1b) 피검체로부터 채취된 생체 시료에 대해서 항 9 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 검사약을 사용해서 항원의 양 또는 농도를 측정하는 공정,
(2b) 상기 공정 (1b)에서 측정된 상기 항원의 양 또는 농도의 값이 미리 설정된 컷오프값 이상인 경우에, 상기 피검체가 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정하는 공정,
(3b) 상기 공정 (2b)에서 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정된 피검체에 대하여 췌장암 등의 암의 진단 방법을 적용하는 공정, 및
(4b) 상기 공정 (2b)에서 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정된 피검체, 또는 상기 공정 (3b)에서 췌장암 등의 암으로 이환하고 있다고 진단된 피검체에 대하여 췌장암 등의 암 치료를 행하는 공정
을 포함하는, 방법.
항 24. 피검체에 있어서의 췌장암 등의 암을 진단하는 방법이며, 진단제로 표지된 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을, 해당 진단을 필요로 하는 피검체에 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
항 25. 상기 진단제가 방사성 물질인, 항 24에 기재된 방법.
항 26. 피검체에 있어서의 췌장암 등의 암을 치료하는 방법이며, 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을, 해당 치료를 필요로 하는 피검체에 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
항 27. 상기 항체 또는 그의 기능성 단편이 치료제로 표지된 것인, 항 26에 기재된 방법.
항 28. 상기 치료제가 항암제인, 항 27에 기재된 방법.
항 29. 상기 치료제가 방사성 물질인, 항 27에 기재된 방법.
본 발명에 따르면, 암의 검사 및 치료에 이용 가능한 항체 또는 그의 기능성 단편을 제공할 수 있다. 또한, 해당 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 검사약을 사용하면, 췌장암 등의 암의 이환의 가능성을 검사하는 것이 가능해진다. 또한, 해당 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 의약 조성물을 사용하면, 췌장암 등의 암을 진단 및 치료하는 것이 가능해진다.
도 1은 실시예 2에서 행해진, 3B1E2 항체(마우스 IgG2a)와 3'-시알릴락토스의 결합 결과를 나타낸다. 종축은 450㎚의 흡광도를 나타낸다. 횡축은 항체의 농도를 나타낸다.
도 2는 실시예 2에서 행해진, 3B1E2 항체(마우스 IgM)와 3'-시알릴락토스의 결합 결과를 나타낸다. 종축은 450㎚의 흡광도를 나타낸다. 횡축은 항체의 농도를 나타낸다.
도 3은 실시예 4에서의 건강인 및 췌장암 환자의 혈청에 있어서의, 3B1E2 항체의 항원값을 나타낸다. 종축이 3B1E2 항체의 항원값을 나타낸다(수치는 450㎚의 흡광도).
도 4는 실시예 5에서 행해진, 3B1E2 항체(마우스 IgG2a)와 컨트롤 항체(마우스 IgG2a)의 암 세포 상해 활성의 결과를 나타낸다. 종축은 암 세포 상해 활성을 나타낸다. 횡축은 항체의 농도를 나타낸다. 데이터는 평균±표준 편차로 나타낸다. n=3.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해서 상세히 설명한다.
또한, 본 명세서에 있어서 「포함한다(comprise)」란, 「본질적으로 이루어진다(essentially consist of)」라고 하는 의미와, 「만으로 이루어진다(consist of)」라고 하는 의미도 포함한다.
1. 항체 또는 그의 기능성 단편
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편이 결합할 수 있는 특이적인 항원으로서, 3'-시알릴락토스를 들 수 있다. 3'-시알릴락토스의 구조식의 일례로서는, 하기 식 (A)[식 중, Ac는 아세틸기를 나타낸다.]를 들 수 있고, 분자식은 C23H34NO19, 분자량은 628.51이다.
Figure pct00001
3'-시알릴락토스 당쇄란, Neu5Acα(2→3)Galβ(1→4)Glc로 표현되는 당쇄, 즉 뉴라민산(Neu5Ac)의 2위치의 히드록시기와 갈락토오스(Gal)의 3위치의 히드록시기가 α글리코시드 결합에 의해 연결되고, 또한 해당 갈락토오스(Gal)의 1위치의 히드록시기와 글루코오스(Glc)의 4위치의 히드록시기가 β글리코시드 결합에 의해 연결 되어 이루어지는 당쇄이다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편은 3 이하의 아미노산 치환해도 되는, ARKNGGLDYAMDY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편은 또한,
(i) 3 이하의 아미노산 치환해도 되는, GIDFSIYW(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열, INSDSSTI(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열 및 ARKNGGLDYAMDY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 그리고/또는
(ii) 1 이하의 아미노산 치환해도 되는, KSISKY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열, SGS의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열 및 QQHNEYPWT(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
아미노산 치환은 3'-시알릴락토스에 대한 결합성이 유지되도록 행해진다. 상기 「3 이하의 아미노산 치환해도 된다」 및 「1 이하의 아미노산 치환해도 된다」란, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 있어서 합계 3개 또는 1개 이하의 아미노산을 치환해도 되는 것을 의미하고, 아미노산 치환은 CDR의 부분에서 행해지는 것이 바람직하다.
아미노산 치환의 수는 바람직하게는 2 이하, 보다 바람직하게는 1 이하이고, 더욱 바람직하게는 0이다. 아미노산을 치환하는 경우, 성질이 비슷한 아미노산으로 치환하면, 원래의 항체 단편의 활성이 유지되기 쉽다고 생각된다. 특정한 아미노산 서열에 있어서, 아미노산을 치환시키는 기술은 공지이다.
「그의 기능성 단편」이란, 그의 기능성 단편이 유래하는 항체로서의 결합 활성의 일부 또는 전부를 유지하는 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체의 일부를 나타내는 것으로 한다. 기능성 단편으로서는, 예를 들어 Fd, Fv, Fab, F(ab'), F(ab)2, F(ab')2, 단쇄 Fv(scFv), 디아보디, 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody) 및 미니보디를 들 수 있다.
「중쇄」란, 아미노 말단 부분이 약 120 내지 130 또는 그 이상인 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카르복시 말단 부분이 정상 영역을 포함하는, 약 50 내지 70kDa의 폴리펩티드쇄를 의미한다. 정상 영역은 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열에 기초하여, 알파(α), 델타(δ), 입실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)라 칭해지는 5종의 별개의 형 중 1종일 수 있다. 별개의 형의 중쇄는 사이즈가 다르고, α, δ 및 γ는 약 450아미노산을 함유하고, μ 및 ε은 약 550아미노산을 함유한다. 이들 별개의 형의 중쇄를 경쇄와 조합하면, IgG의 4개의 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)를 포함하여, 5개의 주지의 클래스 항체, 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 생긴다.
「경쇄」란, 아미노 말단 부분이 약 100 내지 약 110 또는 그 이상인 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카르복시 말단 부분이 정상 영역을 포함하는, 약 25kDa의 폴리펩티드쇄를 의미한다. 경쇄의 대략의 길이는 211 내지 217아미노산이다. 정상 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 또는 람다(λ)라 칭해지는 2종의 별개의 형이 존재한다.
「가변 영역」이란, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 아미노 말단에 위치하고, 길이가 중쇄에서는 약 120 내지 130잔기, 경쇄에서는 약 100 내지 110잔기이며, 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 관여하는, 항체의 경쇄 또는 중쇄의 일부이다. 가변 영역은 다른 항체 사이에서 서열이 광범위하게 걸쳐 다르며, 서열의 변동성은 가변 영역에 존재하는 CDR(complementary determining region: 상보성 결정 영역)에 집중되고, 가변 영역 내의 변동성이 낮은 부분은 프레임 워크 영역이라 칭해진다. 경쇄 및 중쇄의 CDR은 항체와 항원의 상호 작용에 주로 관여한다.
「CDR」이란, 항체 중쇄(H) 가변 영역 β-시트 프레임 워크의 비프레임 워크 영역 내의 3개의 초가변 영역(H1, H2 또는 H3) 중 1개, 또는 항체 경쇄(L) 가변 영역 β-시트 프레임 워크의 비프레임 워크 영역 내의 3개의 초가변 영역(L1, L2 또는 L3) 중 1개를 의미한다. CDR은 프레임 워크 영역 서열 내에 산재하는 초가변 영역 서열이다.
「결합」이란, 복합체가 형성되는 분자간의 상호 작용을 의미한다. 상호 작용은, 예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호 작용, 및/또는 반데르발스 상호 작용을 포함한 비공유 결합성의 상호 작용이다. 항체 또는 그의 기능성 단편의 결합은, 예를 들어 실시예 2 및 4에서 제시되는 방법인 효소 결합 면역 흡착 어세이, 또는 기타 공지된 방법을 사용해서 검출할 수 있다.
본 발명의 항체로서는, 마우스, 래트, 소, 토끼, 염소, 양, 모르모트 등의 척추 동물 유래의 것임이 바람직하고, 그 중에서도 마우스 유래의 것임이 보다 바람직하다.
본 발명의 항체의 아이소타입은 특별히 제한되지 않는다. 해당 아이소 타입으로서는, 예를 들어 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 들 수 있다. 이들 중에서도, 바람직하게는 IgG 또는 IgM이다.
서열번호 1 내지 3의 CDR 아미노산 서열은 각각 중쇄 가변 영역 CDR1 내지 3에, 서열번호 4, SGS, 서열번호 5의 CDR 아미노산 서열은 각각 경쇄 가변 영역 CDR1 내지 3에 대응하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체는, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 양쪽 모두 포함하고 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 항체 또는 그의 기능성 단편을 코드하는 것을 특징으로 한다.
「폴리뉴클레오티드」란, 데옥시리보뉴클레오티드 혹은 리보뉴클레오티드 중 어느 것 또는 그의 유사체의, 임의의 길이의 폴리머의 형태의 뉴클레오티드를 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 서열은 4종의 뉴클레오티드 염기: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우에는 티민 대신에 우라실(U)로 구성된다. 폴리뉴클레오티드는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전이 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 이중쇄 분자와 단일쇄 분자의 양쪽을 의미한다.
서열번호 1 내지 3의 CDR 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열로서는, 예를 들어 각각, GGAATCGATTTTAGTATATACTGG(서열번호 6), ATTAATTCAGATAGCAGTACAATA(서열번호 7), GCAAGAAAGAATGGGGGATTGGACTATGCTATGGACTAC(서열번호 8)를 들 수 있다. 또한, 서열번호 4, SGS, 서열번호 5의 CDR 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열로서, 예를 들어 각각, AAGAGCATTAGCAAATAT(서열번호 9), TCTGGATCC, CAACAGCATAATGAATACCCGTGGACG(서열번호 10)를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성할 수도 있고, 또는 적절한 공급원(예를 들어, 항체를 발현시키기 위해서 선택된 하이브리도마 세포 등의 항체를 발현하는 세포로부터 단리한 cDNA)으로부터, 서열의 3' 및 5' 말단과 하이브리다이즈 가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해, 혹은 특정한 핵산 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 클로닝에 의해 얻을 수도 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭 핵산을 당 기술 분야에서 주지된 임의의 방법을 사용하여, 복제 가능한 클로닝 벡터에 클로닝할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 얻어지면, 당 기술 분야에서 주지된 방법을 사용한 재조합 DNA 기술에 의해 항체 또는 그의 기능성 단편을 산생시키기 위한 벡터를 제작할 수 있고, 또한 주지된 방법을 사용하여, 항체 또는 그의 기능성 단편의 코드 서열 그리고 적절한 전사 및 번역 제어 시그널을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 또한, 정상 영역은 인간, 마우스, 래트 등의 종간에서 크게 다른데, 동일종의 항체간의 정상 영역은 매우 유사하기 때문에, 각각의 종의 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 클로닝함으로써, 인간, 마우스, 래트 등의 항체를 제작할 수 있다.
발현 벡터는 종래의 방법에 의해 숙주 세포에 도입할 수 있고, 이어서 형질 감염된 세포를 종래의 방법에 의해 배양해서 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 산생시킬 수 있다. 면역 글로불린 분자 전체를 발현시키기 위해서는, 중쇄 및 경쇄를 양쪽 코드하는 벡터를 숙주 세포에 있어서 동시 발현시키면 된다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 발현시키기 위해서, 다양한 숙주-발현 벡터계를 이용할 수 있다. 예를 들어, 항체 코드 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 혹은 코스미드 DNA 발현 벡터를 사용해서 형질 전환한 세균(예를 들어, 대장균, 고초균), 항체 코드 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터를 사용해서 형질 전환한 효모(예를 들어, 사카로마이세스·피키아) 등의 미생물, 항체 코드 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로 바이러스)를 감염시킨 곤충 세포계, 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, TMV)를 감염시키거나 혹은 항체 코드 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)를 사용해서 형질 전환한 식물 세포계, 또는 포유 동물 세포의 게놈에서 유래하는 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 혹은 포유 동물 바이러스에서 유래하는 프로모터(예를 들어, 아데노 바이러스 후기 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 갖는 포유 동물 세포계(예를 들어, COS, CHO, HEK293, 3T3 세포)를 들 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편이 재조합 발현에 의해 산생되면, 그것을, 면역 글로불린 분자를 정제하기 위한 당 기술 분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 단백질 A 크로마토그래피, 겔 여과 칼럼 크로마토그래피), 원심 분리, 염석 등에 의해 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편은 정제를 용이하게 하기 위해서 공지된 이종(異種) 폴리펩티드 서열과 융합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편은 폴리-히스티딘 태그(His 태그), FLAG 태그, 적혈구 응집소 태그(HA 태그) 또는 myc 태그를 재조합에 의해 부가함으로써 정제할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체의 기능성 단편은 공지된 방법에 의해 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편을 제작하기 위해서), 펩신(F(ab')2 단편을 제작하기 위해서) 등의 효소를 사용한 면역 글로불린 분자의 단백질 분해성의 절단에 의해 제작할 수 있다.
2. 질환의 검사약
본 발명의 질환의 검사약은, 상기 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 검사약은 특히 암의 이환의 가능성을 검사하는 약이다.
본 발명의 질환의 검사약은 췌장암 등의 암의 이환의 가능성을 검사(또는 판정)하는 방법이며, 피검체로부터 채취된 생체 시료에 있어서의, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도를 측정하는 공정을 포함하는 방법(본 명세서에 있어서, 「본 발명의 검사 방법」이라고 칭하기도 한다.)에 사용할 수 있다. 이하, 이에 대해서 설명한다.
검사 대상인 췌장암 등의 암은 특별히 제한되지 않고, 모든 종류, 스테이지 등의 암을 포함한다. 암의 종류로서는, 바람직하게는 췌장암, 멜라노마, 갑상선암, 위암, 정소암 및 난소암이며, 특히 바람직하게는 췌장암이다. 췌장암의 종류로서는, 예를 들어 췌관암, 췌장 내분비 종양, 췌관 내 유두 점액성 종양, 점액성 낭포 종양, 선방 세포암 등을 들 수 있고, 바람직하게는 췌관암 등을 들 수 있다. 또한, 멜라노마의 종류로서는, 말단 흑자형, 표재 확대형, 결절형, 악성 흑자형 등을 들 수 있고, 말단 흑자형은 일본인에게 많은 반면, 표재 확대형은 백인에게 많다. 검사 대상인 암의 스테이지로서는, 보다 조기의 스테이지부터 순서대로, 스테이지 0, 스테이지 I, 스테이지 II, 스테이지 III 및 스테이지 IV(스테이지 IVa, 스테이지 IVb)를 들 수 있다.
피검체는 본 발명의 검사 방법의 대상 생물이며, 그 생물종은 특별히 제한되지 않는다. 피검체의 생물종으로서는, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼 등의 다양한 포유류 동물을 들 수 있고, 바람직하게는 인간을 들 수 있다.
피검체의 암에 관한 상태는 특별히 제한되지 않는다. 피검체로서는, 예를 들어 암으로 이환하고 있는지의 여부가 불명료한 검체, 암 이환 경력이 없는 검체, 암 이환 경력이 있으며 암 치료를 받은 검체, 다른 판정 방법에 의해 암으로 이환하고 있다(혹은 이환하고 있지 않다)고 이미 판정되어 있는 검체 등을 들 수 있다.
생체 시료는, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원을 함유할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 생체 시료로서는, 예를 들어 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 수액, 관절액, 소변, 조직액, 땀, 눈물, 타액 등의 체액, 이들 체액 유래의 시료를 들 수 있다. 체액 유래의 시료로서는, 체액으로부터 조제되는 시료인 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 체액으로부터 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편이 결합하는 항원을 농축, 정제하거나 해서 얻어지는 시료 등을 들 수 있다. 체액으로서는, 바람직하게는 전혈, 혈청, 혈장 등을 들 수 있다. 생체 시료는 1종 단독으로 채용해도 되고, 2종 이상을 조합해서 채용해도 된다.
생체 시료는 당업자에게 공지된 방법으로 피검체로부터 채취할 수 있다. 예를 들어, 전혈은 주사기 등을 사용한 채혈에 의해 채취할 수 있다. 또한, 채혈은 의사, 간호사 등의 의료 종사자가 행하는 것이 바람직하다. 혈청은 혈액으로부터 혈구 및 특정한 혈액 응고 인자를 제거한 부분이며, 예를 들어 혈액을 응고시킨 후의 상청으로서 얻을 수 있다. 혈장은 혈액으로부터 혈구를 제거한 부분이며, 예를 들어 혈액을 응고시키지 않는 조건 하에서 원심 분리에 제공했을 때의 상청으로서 얻을 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원은, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합할 수 있는 3'-시알릴락토스, 또는 3'-시알릴락토스를 포함하는 분자이며, 이의 한정에 있어서 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 검사 방법은, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도를 측정하는 공정을 포함하고, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다. 해당 방법으로서는, 예를 들어 이뮤노어세이를 들 수 있다. 이뮤노어세이는 직접법, 관절법, 균일법, 불균일법, 경합법, 비경합법 등을 막론하고, 널리 채용할 수 있다. 이뮤노어세이로서 보다 구체적으로는, 예를 들어 ELISA(예를 들어, 직접법, 간접법, 샌드위치법, 경합법 등), 라디오이뮤노어세이(RIA), 이뮤노라디오메트릭어세이(IRMA), 엔자임이뮤노어세이(EIA), 샌드위치 EIA, 면역 크로마토그래피, 웨스턴 블롯, 면역 침강, 슬롯 혹은 도트 블롯 어세이, 면역 조직 염색, 형광 이뮤노어세이, 아비딘-비오틴 또는 스트렙트아비딘-비오틴계를 사용하는 이뮤노어세이, 표면 플라스몬 공명(SPR)법을 사용하는 이뮤노어세이 등을 들 수 있다. 검출 방법은 1종 단독으로 채용해도 되고, 2종 이상을 조합해서 채용해도 된다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도를 측정하는 공정에 있어서, 항원을 검출할 때 사용되는 표지물(예를 들어, 표지 항체 등)에 있어서의 표지의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 표지로서는, 예를 들어 형광 물질, 발광 물질, 색소, 효소, 금 콜로이드, 방사성 동위체 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제 등의 효소 표지는 안전성, 경제성, 검출 감도 등의 관점에서 바람직하다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도를 측정, 산출하는 방법의 상세에 대해서 설명한다.
그의 일 양태로서는, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편과, 피검체로부터 채취된 생체 시료를 접촉시키는 공정, 그리고 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합한 항원량을 측정하는 공정을 예시할 수 있다.
피검체로부터 채취된 생체 시료와의 접촉의 양태는 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도를 측정하는 방법(예를 들어, 각종 이뮤노어세이 등)의 종류에 따라 적절한 양태를 선택할 수 있다.
접촉 양태로서는, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편 및 생체 시료 중 어느 한쪽만을 고상으로 고정한 상태에서 접촉시키는 양태, 이들 양쪽 모두 고상으로 고정하지 않은 상태에서 접촉시키는 양태 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 효율성 등의 관점에서, 바람직하게는 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편만을 고상으로 고정한 상태에서 접촉시키는 양태를 들 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편 및 생체 시료 중 어느 한쪽만을 고상으로 고정하는 경우, 고정 후에, 트리스히드록시메틸아미노메탄(Tris) 및/또는 에테르형 비이온 계면 활성제를 포함하는 용액으로 고상을 세정하는 것이 바람직하다.
고상으로서는, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편 및 생체 시료를 고정 가능한 것인 한 특별히 제한되지 않는다. 해당 고상으로서는, 예를 들어 폴리스티렌, 유리, 니트로셀룰로오스 등을 주성분으로서 포함하는 플레이트, 슬라이드, 막 등을 들 수 있다. 고상은 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편 및 생체 시료를 보다 용이하게 고정시키기 위한 성분, 예를 들어 반응 용이성 화합물(예를 들어, 반응 용이성기를 갖는 화합물, 금 콜로이드 등)로 코팅된 것이어도 된다. 반응 용이성기를 갖는 화합물로서는, 당쇄 또는 당쇄 유도체와 공유 결합을 형성할 수 있는 기이며, 예를 들어 (1H-이미다졸-1-일)카르보닐기, 숙신이미딜옥시카르보닐기, 에폭시기, 알데히드기, 아미노기, 티올기, 카르복실기, 아지드기, 시아노기, 활성 에스테르기 (1H-벤조트리아졸-1-일옥시카르보닐기, 펜타플루오로페닐옥시카르보닐기, 파라니트로페닐옥시카르보닐기 등), 또는 할로겐화카르보닐기(염화카르보닐기, 불화카르보닐기, 브롬화카르보닐기, 요오드화카르보닐기) 등을 갖는 화합물을 들 수 있다.
반응 용이성기를 갖는 화합물로서는, 예를 들어 에폭시실란, 폴리리신 등을 들 수 있다.
반응 용이성 화합물로 코팅된 고상을 사용하는 경우, 소혈청 알부민(BSA) 등을 포함하는 완충액을 사용해서 반응 용이성 화합물을 블로킹하는 것이 바람직하고, 블로킹 시간은 60분간 이상인 것이 바람직하다. 또한, 블로킹액에는, 트리스히드록시메틸아미노메탄(Tris) 및/또는 에테르형 비이온 계면 활성제를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합한 항원량을 측정하는 양태는 특별히 제한되지 않고, 상술한 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도를 측정하는 방법(예를 들어, 각종 이뮤노어세이 등)의 종류에 따라 적절한 양태를 선택할 수 있다. 해당 측정은, 예를 들어 사용된 표지물의 표지에서 유래하는 시그널을 정량함으로써 행할 수 있다. 보다 구체적인 양태로서는, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합한 항원에 대하여, 표지한 본 발명의 항체 혹은 그의 기능성 단편, 또는 항원에 대한 표지한 항체를 접촉시켜서, 결합한 표지 항체의 표지에서 유래하는 시그널을 정량함으로써 행할 수 있다.
얻어진 시그널양에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합한 항원량을 산출할 수 있다. 예를 들어 비경합법의 경우이면, 얻어진 시그널양을 그대로 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합한 항원량으로 할 수 있다. 또한, 별도 예로서 경합법의 경우이면, 얻어진 시그널양과 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합한 항원량과는 반비례의 관계에 있으므로, 이 관계에 기초해서 얻어진 시그널양으로부터 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합한 항원량을 산출할 수 있다.
본 발명의 검사 방법에 의하면, 췌장암 등의 암의 이환의 검출 지표인 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원값을 제공할 수 있고, 이에 의해 췌장암 등의 암의 이환의 가능성의 판정 등을 보조할 수 있다.
본 발명의 검사 방법은 일 양태로서, 추가로, 측정된 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도의 값이 미리 설정된 컷오프값 이상인 경우에, 상기 피검체가 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 여기서 「췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성」이란, 「생체 시료 채취 시에 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성」을 의미한다.
본 발명의 검사 방법에 의하면, 췌장암으로 이환하고 있을 가능성을 판정하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 검사 방법은 보다 높은 감도로 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성을 판정할 수 있으므로, 본 발명의 검사 방법에 의해, 실로 췌장암 등의 암으로 이환하고 있는 피검체를 보다 확실하게 「췌장암 등의 암으로 이환하고 있다」고 판정할 수 있다(즉, 「췌장암으로 이환하고 있지 않다」고 오판정할 가능성을 보다 저감시킬 수 있다).
컷오프값은 감도, 특이도, 양성 적중률, 음성 적중률 등의 관점에서 당업자가 적절히 설정할 수 있고, 예를 들어 췌장암 등의 암으로 이환하고 있지 않은 피검체로부터 채취된 생체 시료에 있어서의 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도의 값의 평균값, 퍼센타일값, 또는 최댓값으로 할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 췌장암 등의 암으로 이환하고 있지 않은 피검체 및 췌장암 등의 암으로 이환하고 있는 피검체로부터 각각 채취된 생체 시료에 있어서의, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도를 측정하고, 해당 측정값을 사용하여, 수신자 조작 특성(Receiver Operating Characteristic, ROC) 곡선의 해석 등에 기초한 통계 해석(보다 구체적으로는, 유덴 지수(Youden index)를 사용한 방법이 예시된다.)을 행함으로써 컷오프값을 설정할 수 있다.
또한, 동일한 피검체로부터 일정 기간 전에 채취된 생체 시료에 있어서의 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원량 또는 농도의 값을 컷오프값으로 할 수도 있다. 「일정 기간」이란, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도가 동일 피검체 내에서 변화될 수 있을 정도의 기간이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 1개월 내지 10년, 2개월 내지 5년, 3개월 내지 2년, 4개월 내지 1년 정도의 기간을 들 수 있다.
본 발명의 검사 방법의 변법으로서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도의 값이, 동일한 피검체로부터 일정 기간 전에 채취된 생체 시료에 있어서의 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도의 값보다 높은 경우에, 상기 피검체가 장래 췌장암 등의 암으로 이환할 가능성이 높다고 판정하는 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다. 해당 공정을 포함하는 검사 방법에 의해, 장래에 있어서의 췌장암 이환 리스크를 판정한다.
「일정 기간」이란, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도가 동일 피검체 내에서 변화될 수 있을 정도의 기간이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 1개월 내지 10년, 2개월 내지 5년, 3개월 내지 2년, 4개월 내지 1년 정도의 기간을 들 수 있다.
「높다」 정도는 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도의 값이, 동일한 피검체로부터 일정 기간 전에 채취된 생체 시료에 있어서의 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편에 결합하는 항원의 양 또는 농도의 값의 2배 이상, 4배 이상, 8배 이상, 20배 이상인 것이 예시된다.
본 발명의 검사 방법에 의해 피검체가 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정된 경우, 본 발명의 검사 방법에 추가로 다른 진단 방법을 조합함으로써, 보다 높은 정밀도로 췌장암 등의 암의 이환을 진단할 수 있다. 다른 진단 방법으로서는 특별히 제한되지 않고, 공지된 진단 방법을 각종 채용할 수 있다. 해당 진단 방법으로서는, 예를 들어 생검법, PET 검사법, CT 검사법, 초음파 검사법, 종양 마커 검사법 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 보다 높은 정밀도로 췌장암을 진단할 수 있다고 하는 관점에서, 바람직하게는 생검법, PET 검사법, CT 검사법, 초음파 검사법 등을 들 수 있다. 진단 방법은 1종 단독으로 채용해도 되고, 2종 이상을 조합해서 채용해도 된다.
본 발명의 검사약은, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 조성물의 형태여도 된다. 해당 조성물에는 필요에 따라서 다른 성분이 포함되어 있어도 된다. 다른 성분으로서는, 예를 들어 기제, 담체, 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 증점제, 보습제, 착색료, 향료, 킬레이트제 등을 들 수 있다.
본 발명의 검사약은, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 키트의 형태여도 된다. 해당 키트에는, 본 발명의 검사 방법의 실시에 사용될 수 있는 기구, 시약 등이 포함되어 있어도 된다.
기구로서는 예를 들어 시험관, 마이크로타이터 플레이트, 아가로오스 입자, 라텍스 입자, 정제용 칼럼, 에폭시 코팅 슬라이드 유리, 금 콜로이드 코팅 슬라이드 유리 등을 들 수 있다.
시약으로서는, 예를 들어 본 발명의 항체의 항원에 대한 항체 혹은 그의 표지 항체, 표준 시료(양성 대조, 음성 대조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체의 항원에 대한 항체로서는, 3'-시알릴락토스에 대한 항체, 본 발명의 항체가 결합하는 분자(예를 들어, 단백질)에 대한 항체 등을 사용할 수 있다.
표지 항체를 제작하기 위한 표지물의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 표지물로서는, 예를 들어 형광 물질, 발광 물질, 색소, 효소, 금 콜로이드, 방사성 동위체 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제 등의 효소 표지는 안전성, 경제성, 검출 감도 등의 관점에서 바람직하다.
표준 시료로서는, 본 발명의 항체의 항원이 사용된다. 본 발명의 항체의 항원은, 예를 들어 본 발명의 항체를 사용해서 생체 시료로부터 면역 침강법에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 또한, 3'-시알릴락토스를 포함하는 폴리머(예를 들어, GlycoTech Corporation제의 3'-시알릴락토스-PAA), 3'-시알릴락토스가 표면에 노출되어 있는 리포솜 또는 단백질 등을 제작함으로써, 본 발명의 항체의 항원을 취득할 수 있다.
또한, 본 발명은 진단제로 표지된 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환을 진단하기 위한 의약 조성물도 제공한다. 본 발명의 검사 방법에 의해, 피검체가 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정된 경우, 진단제로 표지된 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 의약 조성물을, 예를 들어 혈관내, 근육내, 피하 또는 복강내에 투여하고 전신을 검사함으로써, 보다 높은 정밀도로 췌장암 등의 암의 이환을 진단할 수 있다.
본 발명의 질환을 진단하기 위한 의약 조성물은 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 더 포함할 수 있다. 사용할 수 있는 약학적으로 허용될 수 있는 담체로서는, 인산 완충 식염수 용액, 물, 기름·물 에멀션 등의 에멀션, 여러가지의 형의 습윤제 등의 당 기술 분야에서 공지된 표준의 의약 담체를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 질환을 진단하기 위한 의약 조성물에 있어서, 다른 성분, 예를 들어 의약품 그레이드의 안정제, 완충제, 방부제, 부형제 등도 사용할 수 있고, pH, 등장성, 안정성 등을 고려하는 의약 조성물의 조제는 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 표지하는 진단제로서는, 방사성 물질, 형광 재료, 발광 재료, 생물 발광 재료, 광음향 이미징 재료 등을 들 수 있다. 방사성 물질로서는 지르코늄(89Zr), 요오드(131I, 125I, 124I, 123I 및 121I), 인듐(115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga) 등 및 다양한 양전자 방출성 금속, 형광 재료로서는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트 등, 발광 재료로서는 루미놀 등, 생물 발광 재료로서는 루시페라아제, 루시페린, 애쿠오린 등, 광 음향 이미징 재료로서는 금 나노 입자, 단층 카본 나노튜브, 인도시아닌 그린, 메틸렌 블루 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 표지하는 방법으로서는, 폴리에틸렌글리콜 등의 링커를 사용해서 간접적으로 화합물을 결합시키는 방법, 및 항체 또 그의 기능성 단편의 시스테인 잔기에 디술피드 결합을 형성시킴으로써 화합물을 직접 결합시키는 방법을 들 수 있다. 또한, N-숙시닐-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 등의 이종 2관능성 가교제를 사용해서 항체 또는 그의 기능성 단편에 화합물을 직접 결합시키는 것도 가능하다. 나아가, 항체의 Fc 영역의 당쇄를 산화해서 화합물을 결합시킬 수도 있다.
본 발명의 질환을 진단하기 위한 의약 조성물에 포함되는, 진단제로 표지된 항체 또는 그의 기능성 단편의 투여량은 약리학적으로 유효한 양이면 특별히 한정되지 않고, 인종, 성별, 연령, 암의 종류 등에 따라서 적절히 결정할 수 있고, 통상 0.01 내지 1,000㎎/kg, 적합하게는 0.1 내지 100㎎/kg이다. 본 발명의 진단제로 표지된 항체 또는 그의 기능성 단편을 피검체에 있어서의 결합 부위에 우선적으로 집중시키기 위해서 및 결합 부위에 결합하지 않은 항체 또는 그의 기능성 단편을 백그라운드 레벨까지 제거하기 위한 시간은, 사용하는 진단제의 종류, 투여 방법 등에 따라 적절히 결정할 수 있고, 예를 들어 투여 후 6 내지 48시간 정도이다. 또한, 질환을 모니터링하는 경우, 예를 들어 투여 후의 시간 간격은 5 내지 20일로, 최초의 진단으로부터 1 내지 12개월 반복함으로써 행한다.
본 발명의 질환을 진단하기 위한 의약 조성물에 포함되는, 진단제로 표지된 항체 또는 그의 기능성 단편의 존재는 공지된 방법을 사용해서 피검체의 전신을 검사함으로써 검출할 수 있다. 당해 검출 방법은 사용하는 진단제의 종류에 의존하는 것이며, 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 방법으로서는, 컴퓨터 단층 촬영법, 양전자 방출 단층 촬영법, 자기 공명 화상법, 초음파 검사, 광음향 이미징법 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물을 사용해서 진단할 수 있는 질환으로서는 상기의 췌장암 등의 암을 들 수 있고, 본 발명의 의약 조성물은 특히 3'-시알릴락토스를 고 발현하는 암을 진단하기 위해서 유용하다. 즉, 본 발명의 검사 방법에 의해, 피검체가 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정된 경우, 본 발명의 의약 조성물을 투여함으로써 피검체의 췌장암 등의 암을 보다 높은 정밀도로 진단하는 것이 가능해진다.
3. 암의 치료
본 발명의 검사 방법에 의해, 피검체가 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정된 경우, 또는 다른 진단 방법을 조합해서 피검체가 췌장암 등의 암이라고 진단된 경우, 피험자에 대하여 암 치료를 행함으로써 피검체의 암을 치료하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 검사 방법은 보다 높은 감도로 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성을 판단할 수 있으므로, 본 발명의 검사 방법 또는 다른 진단 방법과의 조합에 의해, 실로 암으로 이환하고 있는 피검체를 보다 확실하게 치료할 수 있다(즉, 실로 암으로 이환하고 있는 피검체를 치료 대상으로부터 제외할 가능성을 보다 저감시킬 수 있다).
암 치료의 방법으로서는 특별히 제한되지 않고, 공지된 치료 방법을 각종 채용할 수 있다. 치료 방법으로서는, 예를 들어 화학 요법, 외과 치료법, 방사선 치료법, 면역 요법 등을 들 수 있다. 이들은 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다.
화학 요법에 사용되는 치료약으로서는 특별히 제한되지 않고, 각종 항암제를 사용할 수 있다. 항암제로서는, 예를 들어 알킬화제, 대사 길항제, 미소관 저해제, 항생 물질 항암제, 토포이소머라아제 저해제, 백금 제제, 분자 표적약, 호르몬제, 생물 제제 등을 들 수 있다. 알킬화제로서는, 예를 들어 시클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 다카르바진, 테모졸로미드, 니무스틴, 부술판, 멜팔란, 프로카르바진, 라니무스틴 등을 들 수 있다. 대사 길항제로서는, 예를 들어 에노시타빈, 카르모푸르, 카페시타빈, 테가푸르, 테가푸르·우라실, 테가푸르·기메라실·오테라실 칼륨, 젬시타빈, 시타라빈, 시타라빈옥포스페이트, 넬라라빈, 플루오로우라실, 플루다라빈, 페메트렉시드, 펜토스타틴, 메토트렉세이트, 클라드리빈, 독시플루리딘, 히드록시카르바미드, 머캅토퓨린 등을 들 수 있다. 미소관 저해제로서는, 예를 들어 빈크리스틴 등의 알칼로이드계 항암제, 도세탁셀, 파클리탁셀 등의 탁산계 항암제를 들 수 있다. 항생 물질 항암제로서는, 예를 들어 마이토마이신 C, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 블레오마이신, 액티노마이신 D, 아클라루비신, 이다루비신, 피라루비신, 페플로마이신, 미톡산트론, 암루비신, 지노스타틴 스티말라머 등을 들 수 있다. 토포이소머라아제 저해제로서는, 예를 들어 토포이소머라아제 I 저해 작용을 갖는 CPT-11, 이리노테칸, 노기테칸, 토포이소머라아제 II 저해 작용을 갖는 에토포시드, 소부족산 등을 들 수 있다. 백금 제제로서는, 예를 들어 시스플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴 등을 들 수 있다. 호르몬제로서는, 예를 들어 덱사메타손, 피나스테리드, 타목시펜, 아스트로졸, 엑세메스탄, 에티닐에스트라디올, 클로르마디논, 고세렐린, 비칼루타미드, 플루타미드, 프레드니솔론, 류프로렐린, 레트로졸, 에스트라무스틴, 토레미펜, 포스페스트롤, 미토탄, 메틸테스토스테론, 메드록시프로게스테론, 메피티오스탄 등을 들 수 있다. 생물 제제로서는, 예를 들어 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체 등의 면역 체크포인트 저해제, 인터페론 α, β 및 γ, 인터류킨 2, 우베니멕스, 건조 BCG 등을 들 수 있다. 분자 표적약으로서는, 예를 들어 리툭시맙, 알렘투주맙, 트라스투주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 게피티닙, 에를로티닙, 템시롤리무스, 베바시주맙, VEGF trap, 수니티닙, 소라페닙, 토시투주맙, 보르테조밉, 겜투주맙·오조가마이신, 이브리투모맙·오조가마이신, 이브리투모맙티욱세탄, 타미바로텐, 트레티노인 등을 들 수 있다. 여기에 특정하는 분자 표적 약 이외에도, 인간 상피성 증식 인자 수용체 2저해제, 상피성 증식 인자 수용체 저해제, Bcr-Abl 티로신 키나아제 저해제, 상피성 증식 인자 티로신 키나아제 저해제, mTOR 저해제, 혈관 내피 증식 인자 수용체 2저해제(α-VEGFR-2항체) 등의 혈관 신생을 표적으로 한 저해제, MAP 키나아제 저해제 등의 각종 티로신 키나아제 저해제, 사이토카인을 표적으로 한 저해제, 프로테아솜 저해제, 항체-항암제 배합체 등의 분자 표적약 등도 포함할 수 있다. 이들 저해제에는 항체도 포함된다.
대표적인 췌장암 치료약으로서는, 젬시타빈, TS-1, 에를로티닙, 젬시타빈과 에를로티닙의 병용약, 젬시타빈과 알부민 결합형 파클리탁셀의 병용약, 4종의 약제(옥살리플라틴, 레보폴리네이트, 이리노테칸 및 플루오로우라실)의 병용약 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환을 치료하기 위한 의약 조성물도 제공한다. 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편 자체가 암 세포 상해 활성을 갖고 있으므로, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편 단독으로도 췌장암 등의 암의 치료에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 각종 항암제 및 췌장암 치료약, 리신 등의 독소 화합물, 방사성 물질 방사 활성 금속 이온(예를 들어, 알파 이미터 등의 방사 활성을 갖는 화합물) 등의 방사성 물질 등의 치료제로 표지된 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환을 치료하기 위한 의약 조성물도 제공한다. 그의 표지법으로서는, 폴리에틸렌글리콜 등의 링커를 사용해서 간접적으로 화합물을 결합시키는 방법, 및 항체 또는 그의 기능성 단편의 시스테인 잔기에 디술피드 결합을 형성시킴으로써 화합물을 직접 결합시키는 방법을 들 수 있다. 또한, N-숙시닐-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 등의 이종 2관능성 가교제를 사용해서 항체 또는 그의 기능성 단편에 화합물을 직접 결합시키는 것도 가능하다. 나아가, 항체의 Fc 영역의 당쇄를 산화해서 화합물을 결합시킬 수도 있다.
본 발명의 질환을 치료하기 위한 의약 조성물은 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 더 포함할 수 있다. 사용할 수 있는 약학적으로 허용될 수 있는 담체로서는, 인산 완충 식염수 용액, 물, 기름·물 에멀션 등의 에멀션, 여러가지의 형의 습윤제 등의 당 기술 분야에서 공지된 표준의 의약 담체를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 질환을 치료하기 위한 의약 조성물에는 다른 성분, 예를 들어 의약품 그레이드의 안정제, 완충제, 방부제, 부형제 등도 사용할 수 있고, pH, 등장성, 안정성 등을 고려하는 의약 조성물의 조제는 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 질환을 치료하기 위한 의약 조성물에 포함되는 항체 또는 그의 기능성 단편, 및 치료제로 표지된 항체 또는 그의 기능성 단편의 투여량은 약리학적으로 유효한 양이면 특별히 한정되지 않고, 인종, 성별, 연령, 암의 종류 등에 따라서 적절히 결정할 수 있고, 통상 0.01 내지 1,000㎎/kg, 적합하게는 0.1 내지 100㎎/kg을, 1 내지 180일간에 1회, 또는 1일 2회 혹은 3회 이상 투여할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물을 사용해서 치료할 수 있는 질환으로서는 상기 췌장암 등의 암을 들 수 있고, 본 발명의 의약 조성물은 특히 3'-시알릴락토스를 고 발현하는 암을 치료하기 위해서 유용하다. 즉, 본 발명의 검사 방법에 의해, 피검체가 췌장암 등의 암으로 이환하고 있을 가능성이 높다고 판정된 경우, 본 발명의 의약 조성물을 투여함으로써 피검체의 췌장암 등의 암을 치료하는 것이 가능해진다.
실시예
이하에, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예 등에 의해 하등 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 ES 세포에 대한 마우스 모노클로날 항체의 제작
(a) 하이브리도마의 조제
인간 ES 세포(클론명: KhES-1)를 마이토마이신 처리한 마우스 초대 섬유아세포(오리엔탈 고우보 고교 가부시키가이샤제, 카탈로그 번호: KBL9284400) 상에서, 첨가제(20% KSR(KnockOut Serum Replacement, Invitrogen제, 카탈로그 번호: 10828028), 2mM 글루타민, 0.1mM 비필수 아미노산)를 포함하는 DMEM/F12 배지(Sigma-Aldrich제, 카탈로그 번호: D9785) 안에서 배양해서 미분화능을 유지했다. 미분화 인간 ES 세포에 효소 용액(0.25% 트립신, 1㎎/㎖ 콜라게나아제 IV, 20% KSR, 1mM CaCl2)을 포함하는 PBS(인산 완충 생리 식염수)를 첨가하여 피펫팅에 의해 세포를 박리하고, 원심 분리(1000rpm, 3분간)를 행하였다. 침전물의 미분화 인간 ES 세포에 PBS를 첨가하여 현탁한 후에, 2배량의 ADJUBANT COMPLETE FREUND(DIFCO제, 카탈로그 번호: 263810)를 첨가하여 초음파 처리해서 유화시켜서 면역원으로 했다.
8주령 암형 C57BL/6JJmsSl 마우스의 능선부에 면역원 50㎕를 주사하고, 14일 후에 PBS에 미분화 인간 ES 세포를 현탁시킨 현탁액을 면역원으로서 추가 면역했다. 추가 면역 3일 후에 복부 림프절로부터 림프구를 채취하고, 림프구의 세포수를 측정 후, 림프구 1×108개와 마우스 미엘로마 SP2 세포 2×107개를 혼화해서 원심 분리(1300rpm, 10분간)했다. 침전물에 PEG1500(Roche제, 카탈로그 번호: 783641) 1㎖를 첨가하고, 37℃에서 2분간 보온해서 세포 융합을 행한 후에, DMEM 배지(후지 필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤제, 카탈로그 번호: 044-29765) 4.5㎖를 첨가하여 원심 분리했다. 이어서, 침전물에 HAT 배지(히포크산틴 13.61㎎/l, 아미노프테린 0.176㎎/l, 티미딘 3.88㎎/l, 소태아 혈청 10%를 포함하는 Hybridoma-SFM(GIBCO제, 카탈로그 번호: 12300-067)) 50㎖ 첨가하여 혼화한 후에, 1웰당 100㎕의 하이브리도마 현탁액을 96웰 플레이트 4매에 파종해서 5일간 배양했다.
(b) 하이브리도마의 선별
96웰 플레이트에 마우스 초대 섬유아세포 상에서 미분화 인간 ES 세포를 배양 후, PBS로 10배 희석한 37% 포름알데히드(후지 필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤제, 카탈로그 번호: 06400406)를 첨가하여 실온에서 15분간 고정했다. PBS로 1회 세정 후, 0.5% Triton-X 100을 1웰당 50㎕ 첨가하여 실온에서 5분간 정치하고, PBS로 3회 세정 후, NGS 블로킹액(1% BSA, 2% 염소 혈청, 3.75% 글리신을 포함하는 PBS 용액)을 첨가하여 실온에서 30분간 정치했다. 이어서, NGS 블로킹액을 제거하고, 실시예 1 (a)의 하이브리도마 상청을 40㎕ 첨가하여 실온에서 1시간 정치하고, PBS로 3회 세정 후, NGS 블로킹액으로 500배 희석한 염소 항마우스 IgG(H＋L)-Alexa Fluor 488(abcam제, 카탈로그 번호: ab150113)을 첨가하여 실온에서 30분간 정치했다. 이어서, PBS로 3회 세정 후에 PBS를 1웰당 50㎕ 첨가하여 형광 현미경으로 형광상을 관찰하여, 마우스 초대 섬유아세포가 아니고, 미분화 인간 ES 세포만이 염색되는 하이브리도마 상청을 선별했다.
선별된 상청을 포함하는 웰로부터 하이브리도마를 회수하고, 하이브리도마 100개당 HAT 배지 10㎖ 첨가하고, 96웰 플레이트에 1웰당 100㎕(이론상, 1웰당 하이브리도마 1개) 첨가하여 배양하고, 상기와 마찬가지로 하여 면역 염색법에 의해 하이브리도마 상청을 선별했다. 그 결과, 미분화 인간 ES 세포에 반응하는 항체를 산생하는 클론 3B1E2가 얻어졌다.
(c) 3B1E2 항체의 정제
HAT 배지 안에서 클론 3B1E2를 확대 배양해서 번식시켰다. 10㎝ 샤알레까지 번식시킨 후, HAT 배지 안의 소태아 혈청을 10%에서 5%, 2%, 1%, 0%까지 서서히 낮추어 배양하고, 15㎝ 샤알레에 다시 뿌려서 소태아 혈청을 포함하지 않는 HAT 배지 안에서 12일간 배양했다.
얻어진 배양 상청에 314g/l가 되도록 황산암모늄과 액량의 1/10양의 1M Tris-HCl(pH8.0)을 첨가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 원심 분리(18,000rpm, 4℃, 30분간)하여 얻어진 침전에, 20mM NaCl을 포함하는 15.7mM 인산 완충액(pH6.3) 2㎖를 첨가하여 완전히 용해하고, PD-10 칼럼(GE Healthcare제, 카탈로그 번호: 17-0851-01)에 제공한 후에 동일 완충액 2.5㎖로 용출했다. 이어서, 얻어진 용출액을 HiTrap SP HP 강이온 교환 칼럼(GE Healthcare제, 카탈로그 번호: 17-1151-01)에 제공하고, 1M NaCl을 포함하는 15.7mM 인산 완충액(pH6.3)으로 용출해서 분취했다. 각 분획을 SDS-PAGE해서 항체 분획을 취득하고, BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific제, 카탈로그 번호: 23225)를 사용해서 단백질 농도를 결정했다. 또한, Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit(BioRad제, 카탈로그 번호: MMT1)를 사용해서 항체의 클래스를 결정한 바, IgM, κ였다.
(d) 3B1E2 항체 유전자의 결정
클론 3B1E2로부터 ISOGENII(가부시키가이샤 닛폰 진제, 카탈로그 번호: 311-07361)를 사용해서 전체 RNA를 정제하고, 마우스 IgM의 중쇄 또는 경쇄 정상 영역의 프라이머(Mu IgM VH 3'-1 Primer 또는 Mu Igκ VL 3'-1 Primer : Merck제, 카탈로그 번호: 69831-3CN)와 역전사 효소(Thermo Fisher Scientific제, 카탈로그 번호: 18080044)를 첨가하여 55℃, 30분간 반응시켜서 cDNA를 조제했다. 얻어진 cDNA와, Mouse Ig-Primer Set(Merck제, 카탈로그 번호: 69831-3CN)의 Mu Ig VH 5'-F Primer와 Mu IgM VH 3'-1 Primer, 또는 Mu Igκ VL 5'-G Primer와 Mu Igκ VL 3'-1 Primer를 사용해서 PCR을 행하여, 각각 중쇄 및 경쇄의 약 500bp의 마우스 항체 유전자 단편을 취득했다. 얻어진 유전자 단편을 pGEM-T Easy 벡터(Promega제, 카탈로그 번호: A1360)에 삽입해서 클로닝을 행하였다.
DNA 시퀀서에 의해 3B1E2 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR 염기서열을 결정하고, 표 1에 나타낸 중쇄 및 경쇄의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열이 동정되었다. 또한, 이하에 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 전체의 아미노산 서열 및 염기서열을 나타낸다.
Figure pct00002
중쇄 가변 영역(아미노산 서열)
MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGIDFSIYWMSWVRRAPGKGLEWIGEINSDSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARKNGGLDYAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 11)
경쇄 가변 영역(아미노산 서열)
MVLISLLFWISGAQCDVQITQSPSYLAASPGETITINCRSSKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK(서열번호 12)
중쇄 가변 영역(염기서열 서열)
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGTTGCTCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAGGTGAAGCTTCTCCAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGAATCGATTTTAGTATATACTGGATGAGTTGGGTTCGGCGGGCTCCAGGGAAAGGACTAGAATGGATTGGAGAAATTAATTCAGATAGCAGTACAATAAACTATGCACCATCTCTAAAGGATAAATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTGCAAGAAAGAATGGGGGATTGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 13)
경쇄 가변 영역(염기서열 서열)
ATGGTTCTCATATCCTTGCTGTTCTGGATATCAGGTGCCCAGTGTGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGTCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTACAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG(서열번호 14)
(e) 3B1E2 항체(마우스 IgG2a, κ)의 조제
실시예 1 (d)에서 얻어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 유전자 단편을 마우스 항체(IgG2a) 발현용 벡터 pUC19-CAG-HC(mIgG2a) 또는 pUC19-CAG-HC(mKappa)에 각각 삽입했다. 제작된 2종의 플라스미드 각 0.25㎍을, 0.4×106 세포의 HEK293 세포에 PEI(Merck제, 카탈로그 번호: 408727-100ML)를 사용해서 유전자 도입해서 3일간 배양했다. 얻어진 배양 상청을 회수하고, 실시예 1 (c)와 마찬가지로 하여 황산암모늄과 1M Tris-HCl(pH8.0)을 첨가하여, 3B1E2 항체(마우스 IgG2a, κ)를 조제했다.
실시예 2. 3B1E2 항체와 3'-시알릴락토스의 결합
MaxiSorp 96웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific제, 카탈로그 번호: 439454)의 각 웰에 10㎍/㎖의 3'-시알릴락토스-PAA(polyacrylamide)(GlycoTech Corporation제, 카탈로그 번호: 08-038) PBS 용액을 100㎕ 첨가하여, 실온에서 16시간 정치했다. 이어서, 각 웰을 300㎕의 1% Triton-X 100을 포함하는 PBS(세정액)로 3회 세정 후, 200㎕의 5% BSA 및 1% Triton-X 100을 포함하는 PBS를 첨가하여 실온에서 1시간 정치했다. 각 웰을 300㎕의 세정액으로 세정 후, 3B1E2 항체(마우스 IgG2a 또는 마우스 IgM) 또는 각 컨트롤 항체(마우스 IgG2a: BioLegend제, 카탈로그 번호: 401502 또는 마우스 IgM: BioLegend제, 카탈로그 번호: 401602)를 100㎕씩 첨가하여 실온에서 2시간 정치했다.
이어서, 각 웰을 300㎕의 세정액으로 5회 세정 후, 1,000배로 희석한 퍼옥시다아제 표지 염소 항마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch제, 카탈로그 번호: 115-035-071) 또는 퍼옥시다아제 표지 염소 항마우스 IgM 항체(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호: 115-035-075)를 100㎕씩 첨가하여 실온에서 1시간 정치한 후에, 300㎕의 세정액으로 3회 세정하고, 퍼옥시다아제 기질액(SeraCare Life Sciences제, 카탈로그 번호: 5120-0053)을 100㎕씩 첨가하여 실온에서 30분간 정치했다. 반응 후, 2% 황산을 50㎕ 첨가하여 반응을 정지시킨 후에, 각 웰에 450㎚의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정했다.
그 결과, 도 1에 도시한 바와 같이, 3B1E2 항체(마우스 IgG2a)는 컨트롤 항체와 비교하여, 3'-시알릴락토스에 강하게 결합하고 있는 것이 나타났다. 또한, 도 2에 도시한 바와 같이, 3B1E2 항체(마우스 IgM)는 컨트롤 항체에 비하여, 3'-시알릴락토스에 강하게 결합하고 있는 것이 나타났다.
실시예 3. 3B1E2 항체에 의한 암 조직의 병리 검사
복수종의 조직에 대해서 암 조직(각 15표본 정도)의 절편이 탑재되어 있는 조직 어레이 슬라이드(US Biomax제, 카탈로그 번호: MC5003c)를 탈파라핀 처리(크실렌 7분간 3회, 메탄올 2분간 3회, 수세)한 후에, 3% 과산화수소를 포함하는 메탄올을 첨가하여 내인성 퍼옥시다아제를 불활성화했다. 수세한 후에, 10mM 시트르산 완충액(pH6.0) 안에서 98℃, 5분간 보온해서 항원을 활성화했다. 세정 후, 팝 펜으로 표본의 둘레를 둘러싼 후에, 블록 에이스(DS 파마 바이오 메디칼 가부시키가이샤제, 카탈로그 번호: UKB40) 용액을 첨가하여 실온에서 15분간 블로킹 처리했다.
이어서, 50㎍/㎖ 3B1E2 항체(마우스 IgG2a)를 300㎕ 첨가하여, 실온에서 2시간 정치하고, PBS로 3회 세정한 후에, 인간 조직용 히스토파인 심플 스테인 MAX-PO(가부시키가이샤 니치레이제, 카탈로그 번호: 424131)를 첨가하여 실온에서 30분간 정치했다. PBS로 3회 세정 후, DAB 발색액(Dako제, 카탈로그 번호: K3468)을 첨가하여 1분간 반응시킨 후에 수세하고, 헤마톡실린 용액(사쿠라 파인텍 재팬 가부시키가이샤제, 카탈로그 번호: 8656)을 첨가하여 약 30초간 핵을 염색했다. 수세 후, 슬라이드를 탈수 처리(75% 에탄올 3분간, 95% 에탄올 3분간, 100% 에탄올 3분간 2회), 투철 처리(크실렌 3분간 2회)한 후에 봉입해서 현미경 관찰했다.
전체 표본에 대한 3B1E2 항체(마우스 IgG2a)로 염색된 양성 표본의 비율을 측정한 결과, 표 2에 도시한 바와 같이, 췌장암 및 멜라노마에서는 표본의 50% 이상이 양성이고, 또한 갑상선암, 위암, 정소암, 난소암에서는 10% 이상이 양성이었다. 이러한 점에서, 췌장암, 멜라노마, 갑상선암, 위암, 정소암, 난소암의 암 조직에서는 3B1E2 항체의 항원이 검출되는 것이 나타났다.
Figure pct00003
실시예 4. 3B1E2 항체에 의한 췌장암 환자의 혈액 검사
(a) 3B1E2 항체(마우스 IgM)의 퍼옥시다아제 표지
3B1E2 항체(마우스 IgM) 10㎍을 Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit(가부시키가이샤 도진 가가쿠 겐큐쇼제, 카탈로그 번호: LK33)를 사용하여, 프로토콜을 따라서 퍼옥시다아제 표지했다.
(b) 혈청 검체의 조제
생체 시료로서, 건강인 13명 및 췌장암 환자 55명(스테이지 I: 15명, 스테이지 II: 15명, 스테이지 III: 11명, 스테이지 IV: 14명)의 혈청을, 후지 필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤를 통해 미국의 병원에서 입수했다. 각 혈청은, 검체 희석 용액(1% BSA 및 0.05% Triton-X 100을 포함하는 PBS)으로 6배로 희석해서 혈청 검체로 했다.
(c) 건강인 및 췌장암 환자의 혈청 중의 3B1E2 항체의 항원값의 측정
MaxiSorp 96웰 플레이트의 각 웰에 10㎍/㎖의 3B1E2 항체(마우스 IgG2a)를 100㎕ 첨가하고, 4℃, 16시간 정치했다. 이어서, 각 웰을 세정액(0.05% Triton-X 100을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH8.0), 140mM NaCl) 200㎕로 3회 세정하고, 5% BSA를 포함하는 세정액 200㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 정치했다. 각 웰을 3회 세정하고, 혈청 검체 100㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 정치 후, 각 웰을 5회 세정하고, 검체 희석 용액으로 10,000배로 희석한 퍼옥시다아제 표지 3B1E2 항체(마우스 IgM)를 100㎕씩 첨가하여 실온에서 1시간 정치했다. 각 웰을 5회 세정한 후에, 퍼옥시다아제 기질액(SeraCare Life Sciences제, 코드 번호: 5120-0053)을 100㎕씩 첨가하여 실온에서 30분간 정치했다. 반응 후, 2% 황산을 50㎕ 첨가하여 반응을 정지시키고, 각 웰에 450㎚의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정했다.
그 결과, 도 3에 도시한 바와 같이, 건강인에 비해서 췌장암 환자에서는 혈청 중의 3B1E2 항체의 항원값이 유의미하게(p＜0.0001) 높아, 췌장암의 이환과 3B1E2 항체의 항원값이 상관하고 있는 것이 나타났다.
실시예 5. 3B1E2 항체의 암 세포에 대한 상해 작용
3B1E2 항체는 인간 췌장암 세포주 KP-3L(JCRB 생물 자원 뱅크, 세포 등록번호: JCRB0178.1)의 세포막 표면에 결합한다. 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich제, 카탈로그 번호: A7906)을 포함하는 RPMI-1640 배지(후지 필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤제, 코드 번호: 186-02155) 중에서 KP-3L을 분산하고, 96웰 배양 플레이트에 1웰당 2×104개 파종했다. 다음날, 배지 35㎕를 제거하고, 3B1E2 항체(마우스 IgG2a) 또는 컨트롤 항체(BioLegend제, 카탈로그 번호: 401502)를 포함하는 RPMI-1640 배지를 10㎕ 첨가하여 실온에서 30분간 정치했다. 이어서, 토끼 보체 혈청(Sigma-Aldrich제, 카탈로그 번호: S7764)을 25㎕ 첨가하여 37℃, 5% CO2 하에서 4시간 배양했다. 그 후, 플레이트를 1,000rpm으로 5분간 원심 분리해서 상청 50㎕를 회수하고, 상청 중의 락토오스 데히드로게나아제 활성을 cytotoxicity detection kit(Roche제, 카탈로그 번호: 4744926)를 사용하여 측정했다. 음성 대조는 항체 대신에 RPMI-1640 배지, 양성 대조는 항체 대신에 RPMI-1640 배지, 및 토끼 보체 혈청 대신에 Tween(상표) 20을 첨가하여 마찬가지로 측정했다. 항체의 암 세포 상해 활성은 이하의 식에 기초하여 산출했다.
암 세포 상해 활성(%)=(항체의 485㎚의 흡광도-음성 대조의 485㎚의 흡광도)/(양성 대조의 485㎚의 흡광도-음성 대조의 485㎚의 흡광도)×100
그 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, 3B1E2 항체에서는 농도 의존적으로 암 세포 상해 활성이 상승하고, 그 활성은 모든 농도에 있어서 컨트롤에 비해서 유의미하게(P＜0.01) 높은 것이 나타났다.
본 발명의 항체를 사용한 검사약은 췌장암 등의 암의 이환의 가능성을 판정하는 것이 가능하다. 본 발명의 항체의 항원값을 측정함으로써, 췌장암 등의 암의 진행 및 항암제의 유효성을 모니터링하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 항체를 사용한 의약 조성물은 췌장암 등의 암을 진단 및 치료하는 것이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED <120> ANTIBODY AND FUNCTIONAL FRAGMENT THEREOF <130> P19-296WO <150> JP 2019-017285 <151> 2019-02-01 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gly Ile Asp Phe Ser Ile Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Ile Asn Ser Asp Ser Ser Thr Ile 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Ala Arg Lys Asn Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 ggaatcgatt ttagtatata ctgg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 attaattcag atagcagtac aata 24 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 gcaagaaaga atgggggatt ggactatgct atggactac 39 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 aagagcatta gcaaatat 18 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 caacagcata atgaataccc gtggacg 27 <210> 11 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser 35 40 45 Ile Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Glu Ile Asn Ser Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Lys Asn Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Val Leu Ile Ser Leu Leu Phe Trp Ile Ser Gly Ala Gln Cys Asp 1 5 10 15 Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly Glu 20 25 30 Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu 35 40 45 Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile Tyr 50 55 60 Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 65 70 75 80 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 85 90 95 Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr 100 105 110 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 <210> 13 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg 60 aagcttctcc agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt 120 gcagcctcag gaatcgattt tagtatatac tggatgagtt gggttcggcg ggctccaggg 180 aaaggactag aatggattgg agaaattaat tcagatagca gtacaataaa ctatgcacca 240 tctctaaagg ataaattcac catctccaga gacaacgcca aaaatacgct gtacctgcaa 300 atgagcaaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaagaaa gaatggggga 360 ttggactatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 414 <210> 14 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 atggttctca tatccttgct gttctggata tcaggtgccc agtgtgatgt ccagataacc 60 cagtctccat cttatcttgc tgcatctcct ggagaaacca ttactattaa ttgcaggtca 120 agtaagagca ttagcaaata tttagcctgg tatcaagaga aacctgggaa aactaataag 180 cttcttatct actctggatc cactttacaa tctggaattc catcaaggtt cagtggcagt 240 ggatctggta cagatttcac tctcaccatc agtagcctgg agcctgaaga ttttgcaatg 300 tattactgtc aacagcataa tgaatacccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa 360 atcaag 366

Claims (17)

  1. 3'-시알릴락토스에 결합하고, 3 이하의 아미노산 치환해도 되는, ARKNGGLDYAMDY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그의 기능성 단편.
  2. 3'-시알릴락토스에 결합하고,
    (i) 3 이하의 아미노산 치환해도 되는, GIDFSIYW(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열, INSDSSTI(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열 및 ARKNGGLDYAMDY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 그리고/또는
    (ii) 1 이하의 아미노산 치환해도 되는, KSISKY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열, SGS의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열 및 QQHNEYPWT(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 항체 또는 그의 기능성 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 척추 동물 유래인, 항체 또는 그의 기능성 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 마우스 유래인, 항체 또는 그의 기능성 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG 또는 IgM인, 항체 또는 그의 기능성 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 단편이, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 디아보디, 트리아보디, 테트라보디 또는 미니보디인, 항체 또는 그의 기능성 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환의 검사약.
  10. 제9항에 있어서, 상기 질환이 암인, 검사약.
  11. 제10항에 있어서, 상기 암이 췌장암, 멜라노마, 갑상선암, 위암, 정소암 및 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, 검사약.
  12. 진단제로 표지된, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환을 진단하기 위한 의약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 진단제가 방사성 물질인, 의약 조성물.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환을 치료하기 위한 의약 조성물.
  15. 치료제로 표지된, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 질환을 치료하기 위한 의약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 치료제가 항암제인, 의약 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 치료제가 방사성 물질인, 의약 조성물.
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