CN104418950A - 人去唾液酸糖蛋白受体单克隆抗体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单克隆抗体及其制备和应用。所述的单克隆抗体可良好地识别ASGPR抗原，不与其他蛋白发生交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。该抗体可应用于原发性肝细胞癌和转移性肝癌的鉴别、循环肝癌细胞的分离和检测、肝脏成像和肝脏药物或基因的靶向递送。

Description

人去唾液酸糖蛋白受体单克隆抗体及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种特异性地识别和结合人去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein Receptor，ASGPR)胞外段的单克隆抗体、其制备方法及其应用。

背景技术

去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，又称肝凝集素或肝糖凝集蛋白，特异性表达于哺乳动物肝窦状隙和基底外侧的肝实质细胞表面，主要生理功能为清除外周血循环中含有D-半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺残基的糖蛋白、脂蛋白和凋亡细胞。ASGPR独特的生理功能及其高度的肝细胞特异性，使其在肝细胞癌和转移性肝癌的鉴别、循环肝癌细胞的分离和检测、肝脏成像以及肝脏药物或基因的靶向递送等方面具有重要的基础研究意义和潜在的临床应用价值。

近年来已有人利用ASGPR1全长基因[Trahtenherts A,Benhar I.Aninternalizing antibody specific for the human asialoglycoprotein receptor.Hybridoma(Larchmt),2009,28:225-233.]、ASGPR大亚基异构体蛋白H1b[刘嘉,丁红晖,杨燕,胡斌,余源,黄红平,等.抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b多克隆抗体的制备和鉴定.细胞与分子免疫学杂志,2009,10:917-919.]、ASGPR大亚基糖识别区基因[Zhao X,Yu Z,Dai W,Yao Z,Zhou w,Cao L,etal.Construction and functional characterization of an anti-asialoglycoproteinreceptor single-chain variable-fragment-targeted melittin.Biotechnol ApplBiochem,2011,58:405-411.]、ASGPR基因片段[Park JH,Kim KL,Cho EW.Detection of surface asialoglycoprotein receptor in hepatic and extra-hepaticcells using a novel monoclonal antibody.Biotechnol Lett,2006,28:1061-1069.]等制备ASGPR抗体。遗憾的是，只是在近期唯有Santa公司的单克隆抗体可以商购到[美国santa cruz生物公司，http://www.scbt.com/table-asgpr.html]，且仅有一款针对ASGPR1全长序列的小鼠单克隆抗体[sc-52623]。然而，关于这些抗体的应用研究鲜见报道。而Santa公司出售的抗体适用范围有限，无法满足临床应用的需要。

因此，本领域有必要进一步开发特异性良好的ASGPR单克隆抗体，以期实现ASGPR应用价值的临床转化。

发明内容

本发明的目的在于提供人去唾液酸糖蛋白受体单克隆抗体及其制备和应用。

在本发明的第一方面，提供一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC NO:C201370的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

在一个优选例中，所述的单克隆抗体是免疫球蛋白同种型IgG1型。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体以SEQ ID NO:1所示的抗原免疫动物制备获得。

在本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC NO:C201370。

在本发明的另一方面，提供一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：所述的单克隆抗体以及与之连接的标记物；所述的标记物选自(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素或荧光素。

在本发明的另一方面，提供一种检测试剂盒，其中包括：

所述的单克隆抗体；或

所述的杂交瘤细胞株；或

所述的免疫偶联物。

在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：

第二抗体，所述的第二抗体特异性识别所述的单克隆抗体；

免疫磁珠；

显色剂；

洗涤液；和/或

终止液。

在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测人去唾液酸糖蛋白受体的检测试剂或试剂盒。

在一个优选例中，所述的检测人去唾液酸糖蛋白受体包括：(1)定性检测人去唾液酸糖蛋白受体；或(2)定量检测人去唾液酸糖蛋白受体。

在另一优选例中，所述的定性检测包括：通过免疫印迹方法或免疫荧光的方法鉴定人去唾液酸糖蛋白受体的表达情况。

在另一优选例中，所述的定量检测包括：通过流式细胞术对细胞表达人去唾液酸糖蛋白受体的强度或阳性率进行定量，或通过双抗体夹心ELISA法对人去唾液酸糖蛋白受体表达进行定量。

在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒还用于：

肝细胞癌和转移性肝癌的鉴别；

循环肝癌细胞的分离和检测；

肝脏成像；和

肝脏药物或基因的靶向递送。

在本发明的另一方面，提供一种循环肝癌细胞的分离方法，包括下述步骤：

(a)从含有循环肝癌细胞的离体样品中分离单个核细胞(其中含有循环肝癌细胞)；

(b)以第一抗体与单个核细胞混合，从而形成“肝癌细胞-第一抗体”二元复合物；所述的第一抗体是所述的单克隆抗体；

(c)以偶联有第二抗体的磁珠与所述二元复合物混合，从而形成“肝癌细胞-第一抗体-第二抗体-磁珠”四元复合物；和

(d)磁性分离步骤(c)中的四元复合物。

在一个优选例中，所述的分离单个核细胞采取的分离方法为密度梯度细胞分离法。

在另一优选例中，所述的样品选自骨髓、血液或其他体液；较佳地，所述其他体液为淋巴液、胸水或腹水。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、流式细胞术检测肿瘤细胞株表达ASGPR。

图2、免疫组织化学方法检测正常肝组织(A)、肝癌组织(B)、肠癌肝转移组织(C)表达ASGPR的情况。

图3、免疫组织荧光染色方法检测肝癌组织表达ASGPR。

图4、免疫细胞化学方法检测肝癌细胞HepG2(阳性)和乳腺癌细胞MCF-7(阴性)表达ASGPR。

图5、免疫细胞荧光染色方法检测肝癌细胞HepG2(阳性)和乳腺癌细胞MCF-7(阴性)表达ASGPR。

图6、免疫细胞荧光染色方法鉴定从肝癌患者外周血中分离出的循环肝癌细胞，其中Hep Par1+/CD45-/DAPI+为循环肝癌细胞，Hep Par1-/CD45+/DAPI+为单个核细胞。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，提供了一种特异性抗人去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的单克隆抗体。所述的单克隆抗体可良好地识别ASGPR抗原，不与其他蛋白发生交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。可应用于肝细胞癌和转移性肝癌的鉴别、循环肝癌细胞的分离和检测、肝脏成像和肝脏药物或基因的靶向递送。

单克隆抗体

本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个抗原表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对同一个抗原，本领域人员需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定，才能找到特异性结合靶抗原的单抗。由于ASGPR氨基酸序列长，很多抗原决定簇被包在蛋白结构的内部，因此难以找到一种特异性高的单克隆抗体。一些抗ASGPR单克隆抗体被用于实际检测时，难免遭遇到与天然ASGPR蛋白结合特性差的问题，这可能是由于待测样品中ASGPR蛋白的抗原决定簇被包在蛋白结构内部，无法接触到抗体造成的。

针对上述技术难题，本发明人选取了多种ASGPR蛋白的片段来免疫动物，获取动物的脾细胞用于制备杂交瘤细胞株，从而找到合适的用于免疫的片段。大量筛选后，本发明人发现，来自于ASGPR氨基酸序列第61-291aa位上的一段氨基酸序列(SEQ ID NO:1)具有良好的免疫原性，进一步经过单克隆筛选和验证，从而获得本发明的单克隆抗体。ASGPR表达于细胞膜上，而本发明的单克隆抗体识别的区域正是ASGPR位于细胞表面上的表位，而非识别其跨膜区域或膜内区域，因此本发明的单克隆抗体特别适合于进行ASGPR的鉴定。

本发明的单克隆抗体对于ASGPR蛋白具有很高的特异性，不结合于ASGPR以外的其他蛋白。并且，当用于检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可获得精确的检测结果。并且，以所述的单克隆抗体为基础，可制备准确地检测ASGPR的试剂盒。

本发明的单克隆抗体利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等，Nature256:495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:292，1976；Hammerling等，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。一种杂交瘤的制备方法是：

(1)小鼠免疫：选择适龄的小鼠，以抗原肽对小鼠进行免疫；

(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合；

(3)细胞融合：以小鼠脾细胞作为饲养细胞。将(1)中备好的小鼠处死，制备免疫脾细胞悬液。收集(2)中的小鼠骨髓瘤细胞。将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇(PEG)介导细胞融合。融合后的细胞适当稀释，接种至培养板，适当条件培养；

(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取培养液上清做抗体鉴定，筛选阳性克隆；

(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔板，使每孔只有一个细胞生长。从形成细胞集落的孔中取上清做酶联免疫吸附实验(ELISA)，鉴定阳性克隆。可以重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100%。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定；

(6)小鼠腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前10天，给小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，然后接种阳性杂交瘤细胞1.0×10⁶/只，10天后收集腹水后离心，测定抗体效价，并纯化单克隆抗体；

(7)单克隆抗体的纯化：经Affi-Gel protein A-agarose亲和柱(Bio-Rad)纯化腹水上清中的单克隆抗体。

在获得了所述杂交瘤的情况下，可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。作为一种实施方式，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法制备：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用Protein G预装层析柱纯化，获得高纯度的抗ASGPR单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以方便地获得所述的抗体。

本发明的单克隆抗体针对ASGPR H1大亚基，因为H1大亚基在识别配体和介导内吞中发挥重要作用，其表达量亦为H2小亚基的3倍，因此针对H1亚基的抗体更有价值。

本发明还提供能产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO:C201370。

检测试剂盒

在获得了本发明的抗ASGPR单克隆抗体后，本领域人员可通过多种途径来灵敏地检测样品中ASGPR蛋白及其浓度，采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术。包括定性检测和定量检测方法。较佳地，所述的定性检测包括：通过免疫印迹方法或免疫荧光的方法鉴定人去唾液酸糖蛋白受体的存在情况；较佳地，所述的定量检测包括：通过流式细胞术对细胞表达人去唾液酸糖蛋白受体的强度或阳性率进行定量，或通过双抗体夹心ELISA法对人去唾液酸糖蛋白受体表达进行定量。

本发明提供了一种用于检测样品中是否存在ASGPR的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的抗ASGPR单克隆抗体。

所述试剂盒中除了含有本发明的抗ASGPR单克隆抗体以外，还可以包含其他检测试剂或辅剂，如显色剂、标记物、二抗、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要其中利用了本发明的抗ASGPR单克隆抗体作为与ASGPR特异性结合的试剂。

如本文所用，所述的“标记物”是指用于确定待检测样品中ASGPR的存在与否以及存在的量的标志物，其也可直接偶联于抗ASGPR单克隆抗体上，构成免疫偶联物。在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中ASGPR蛋白的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的标记物可直接被设置于检测抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗检测抗体的二抗上。本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、生物素、荧光素、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报告标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示检测抗体与ASGPR发生结合的识别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。

为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个ASGPR蛋白的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

在本发明的另一优选例中，上述的单克隆抗体还可以与标记偶联，所述的标记选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、或荧光素。

本发明还提供一种肿瘤细胞的分离方法。

本发明的单克隆抗体分选肝癌细胞的应用

本发明还提供了一种循环肝癌细胞的分离方法，包括下述步骤：(a)从含有循环肝癌细胞的离体样品中分离单个核细胞(其中含有循环肝癌细胞)；(b)以第一抗体与单个核细胞混合，从而形成“肝癌细胞-第一抗体”二元复合物；所述的第一抗体是所述的单克隆抗体；(c)以偶联有第二抗体的磁珠与所述二元复合物混合，从而形成“肝癌细胞-第一抗体-第二抗体-磁珠”四元复合物；和(d)磁性分离步骤(c)中的四元复合物。

本发明的抗体为单克隆抗体，特异性高于多克隆抗体。并且，本发明的抗体是针对人抗原的鼠源抗体，小鼠单克隆抗体的制备技术成熟、操作简单，能够快速地大量生产；能够与目前可商购的磁珠标记的二抗(针对鼠源的)相配套。

本发明的抗体为小鼠IgG1。目前市面上磁珠标记的二抗包含抗小鼠IgG1和IgG两种(包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)，显然特异性更好的抗IgG1磁珠更佳；虽然市面上还有抗生物素磁珠，但是使用该磁珠还需要事先应用生物素标记抗体，增加了操作步骤，不如直接选用二抗磁珠。

本发明的单克隆抗体识别位点位于ASGPR胞外段。当应用识别ASGPR胞内段或ASGPR全长的抗体进行磁珠标记时需要透膜操作，但是透膜操作对循环肝癌细胞产生损伤，一来导致循环肝癌细胞无法完整地分离，二来即便分离了也无法进行后续的研究或者培养。而本发明的单克隆抗体克服了该技术问题，实现了无需进行透膜操作的技术效果。

因此，应用ASGPR H1大亚基胞外段61-291氨基酸序列(SEQ ID NO:1)为免疫原制备的小鼠IgG1单克隆抗体，与已知的ASGPR抗体相比，具有优异技术效果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、单克隆抗体的制备

通过RT-PCR扩增获得ASGPR cDNA(编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1的ASGPR片段)，以pGEX-4T-1质粒(购自美国Invitrogen公司)为载体，插入到该载体的BamHⅠ和EcoRⅠ位点中，构建加上GST标签的ASGPR表达重组载体，转化E.coli BL21感受态细胞，经筛选和培养、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达、GST亲和柱纯化、12%SDS-PAGE检测融合蛋白表达。

SQNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLEKQQKDLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSERTCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL(SEQ ID NO:1)

小鼠免疫、细胞融合、阳性杂交瘤细胞克隆筛选、腹水生产和抗体纯化等方法均按照传统融合杂交瘤技术进行。

经过对大量杂交瘤细胞的分离筛选，最终筛选到一株优异杂交瘤细胞株hASGPR-021，其分泌特异性良好的抗ASGPR单克隆抗体。

实施例2、单克隆抗体的检测

①单克隆抗体亚类的鉴定

根据单抗亚类鉴定试剂盒说明书进行。

结果，测得本发明的单克隆抗体是IgG1亚型。

②ELISA

按常规ELISA方法。

③免疫印迹(Western blot)

按常规免疫印迹方法。

④流式细胞术(flow cytometry，FACS)

准备人肝细胞系WRL68和人肝癌细胞系Hep3B、Huh7、HepG2、PLC/PRF/5(以上细胞系均购自中科院上海细胞库)。部分细胞系的ASGPR表达情况已有文献报道[Park JH,Cho EW,Shin SY,Lee YJ,Kim KL.Detection ofthe asialoglycoprotein receptor on cell lines of extrahepatic origin.BiochemBiophys Res Commun,1998,244:304-311]。

常规培养上述细胞系，分别取对数生长期细胞2孔，胰酶消化，1500rpm离心5min，各收集1×10⁶个细胞，分别置于标记为1、2的离心管中，其中1为空白对照管(Control)，2为抗ASGPR单克隆抗体检测管(ASGPR)，PBS洗两遍，弃上清，2号管中加入PBS稀释的抗ASGPR单克隆抗体100μL，1号管中加入相同量的PBS，均在37℃孵育1h，PBS洗2次，各1500rpm离心5min，弃上清，2号管加入PBS稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG二抗100μL，1号管加入等量的PBS，常温避光孵育45min，PBS洗2次，各1500rpm离心5min，弃上清，每管各加入200μL PBS，上机，数据采集分析。

结果如图1，不同肝癌细胞系ASGPR表达存在差异，其中HepG2细胞表达率最高，检测结果与文献报道相符。说明本发明的抗ASGPR单克隆抗体可应用于准确检测细胞系中ASGPR的表达情况。

⑤免疫组织化学染色

正常人肝组织、肝癌组织、结肠癌肝转移组织石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡水化，构橼酸盐缓冲液高温抗原修复，每张切片滴加一滴内源性过氧化酶阻断剂，常温孵育10min，PBS洗，山羊非免疫血清封闭，常温孵育30min，滴加PBS适度稀释的抗ASGPR单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗，滴加增强剂常温孵育20min，PBS洗，滴加HRP酶标二抗，37℃孵育30min，PBS洗，DAB显色5min，自来水冲洗，苏木素复染，PBS反蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，晾干，中性树胶封片，显微镜观察拍照。

结果如图2，可见ASGPR专一性表达于正常肝组织、肝癌组织和转移性肝癌癌旁组织中肝实质细胞表面，而在间质细胞和肠癌转移灶细胞中不表达。

⑥免疫组织荧光染色

肝癌组织切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，构橼酸盐缓冲液高温抗原修复，内源性过氧化物酶阻断剂常温孵育10min，PBS洗3min×3次，山羊非免疫血清封闭，常温孵育30min，滴加PBS适度稀释的抗ASGPR单克隆抗体(二抗对照加等量的PBS)，4℃孵育过夜，PBS洗3min×3次，滴加cy3标记山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育30min，PBS洗3min×3次，DAPI染核3min，PBS洗3min×3次，自然风干，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察，采集图片。

结果如图3，可见本发明的抗ASGPR单克隆抗体可以染色表达ASGPR的肝癌细胞膜，具有良好的特异性。

⑦免疫细胞化学染色

常规培养肝癌细胞HepG2与乳腺癌细胞MCF-7，在对数生长期收集细胞，选取肝癌细胞系与乳腺癌细胞系等比例混合，种植在同一孔中进行细胞爬片，培养过夜，第二天将爬片取出，PBS冲洗，4%甲醛固定，自来水冲洗，0.4%曲拉通透膜，3%内源性过氧化物酶阻断剂阻断，山羊非免疫血清封闭，滴加PBS适度稀释的抗ASGPR单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗，滴加增强剂常温孵育20min，PBS洗，滴加HRP酶标二抗，37℃孵育30min，PBS洗，DAB显色5min，自来水冲洗，苏木素复染，PBS反蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，晾干，中性树胶封片，显微镜观察拍照。

结果如图4，可见抗ASGPR单克隆抗体可以特异性染色表达ASGPR的HepG2细胞(胞核较小)的细胞膜，而对于不表达ASGPR的乳腺癌细胞MCF-7(胞核较大)则不发生特异性结合。

⑧免疫细胞荧光染色

常规培养肝癌细胞HepG2与乳腺癌细胞MCF-7，在对数生长期收集细胞，选取肝癌细胞系与其他肿瘤细胞系等比例混合，种植在同一孔中进行细胞爬片，培养过夜，第二天将爬片取出，PBS冲洗，4%甲醛固定，自来水冲洗，0.4%曲拉通透膜，山羊非免疫血清封闭，滴加PBS适度稀释的抗ASGPR单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗3min×3次，滴加cy3标记山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育30min，PBS洗3min×3次，DAPI染核3min，PBS洗3min×3次，自然风干，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察，采集图片。

结果如图5，可见抗ASGPR单克隆抗体可以特异性染色表达ASGPR的HepG2细胞的细胞膜，而对于不表达ASGPR的乳腺癌细胞MCF-7则不发生特异性结合。

实施例3、利用单克隆抗体分离和鉴定循环肝癌细胞

主要材料：5mL肝癌患者志愿者外周血，EDTA抗凝。Ficoll-Paque Plus，购自GE Healthcare。本发明的小鼠抗人ASGPR单抗(IgG1)。磁性分离器、anti-Mouse IgG1MicroBeads、MS磁性分选柱、30μm滤网、CK3-6H5(针对上皮组织来源肿瘤细胞的抗体)均购自德国Miltenyi公司。400R台式离心机(带细胞离心涂片附件)，购自德国Heraeus公司。多聚赖氨酸玻片，购自福建迈新公司。SP二步法免疫组化试剂盒，购自福州迈新生物公司。PBS洗液(含2mM EDTA和0.5%BSA)自配。

步骤：

(A)Ficoll分离外周血单个核细胞

1)将5mL EDTA抗凝血与5mL PBS洗液于50mL离心管中混匀，平铺于7mL Ficoll上，18℃，600g，离心25min。

2)吸弃上层血清。

3)吸取单个核细胞层，置于15mL离心管中。

4)加3倍体积PBS洗液，18℃，300g，离心10min。

5)吸弃上清，8mL PBS洗液重悬，18℃，300g，离心10min。

6)彻底吸弃上清。

(B)磁珠分离循环肝癌细胞

1)130μL PBS洗液重悬细胞。

2)加20μL小鼠抗人ASGPR单抗，混匀。

3)室温孵育30min。

4)加5mL PBS洗液，18℃，300g，离心10min，吸弃上清。

5)重复上一步。

6)加80μL PBS洗液。

7)加20μL anti-Mouse IgG1MicroBeads，混匀。

8)4℃，孵育15min。

9)加5mL PBS洗液，18℃，300g，离心10min。

10)吸弃上清，500μL PBS洗液重悬(注意尽量不要产生气泡)。

11)安装MS磁性分选柱和滤网。

12)500μL PBS洗液加入滤网。

13)待分选柱下方液滴刚刚停止，即向滤网加入500μL细胞悬液。

14)加500μL PBS洗液于15mL离心管中，洗涤残留细胞。

15)待分选柱上方液体快流完时，加入500μL细胞悬液。

16)待分选柱上方液体快流完时，加入500μL PBS洗液。

17)重复上一步2次。

18)待分选柱下方液滴刚刚停止，将分选柱移出磁场，置于另一个无菌的15mL离心管上。

19)加1mL PBS洗液于分选柱中，立即用活塞将液体快速推入离心管中。

20)重复上一步。

21)18℃，300g，离心10min。

22)吸弃上清，100μL PBS洗液重悬。

(C)循环肝癌细胞的免疫荧光染色鉴定

收集上述细胞悬液进行细胞涂片，52℃烤干，经4%甲醛固定，0.4%曲拉通透膜，3%内源性过氧化物酶阻断剂阻断，山羊非免疫血清封闭，应用肝细胞特异性Hep Par1抗体或上皮细胞特异性CK抗体，结合血细胞特异性CD45抗体进行染色，4℃孵育过夜，PBS洗，滴加cy3抗小鼠二抗和Alexa fluor488抗大鼠二抗，37℃孵育30min，PBS洗，DAPI染核，PBS洗，自然晾干，抗荧光猝灭封片剂封片，显微镜观察拍照。

结果：

结果如图6所示。肝癌细胞呈现Hep Par1阳性、DAPI阳性、CD45阴性，细胞呈圆至椭圆形，细胞核完整，具有细胞体积大、核浆比高等恶性肿瘤细胞特征。

生物材料保藏

本申请中，杂交瘤细胞株hASGPR-021已经保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO:C201370，保藏日为：2013年5月24日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC NO:C201370的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体是免疫球蛋白同种型IgG1型。

3.一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCCNO:C201370。

4.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：权利要求1所述的单克隆抗体以及与之连接的标记物；所述的标记物选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素或荧光素。

5.一种检测试剂盒，其特征在于，其中包括：

权利要求1所述的单克隆抗体；或

权利要求3所述的杂交瘤细胞株；或

权利要求4所述的免疫偶联物。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：

第二抗体，所述的第二抗体特异性识别权利要求1所述的单克隆抗体；

免疫磁珠；

显色剂；

洗涤液；和/或

终止液。

7.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测人去唾液酸糖蛋白受体的检测试剂或试剂盒。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的检测人去唾液酸糖蛋白受体包括：(1)定性检测人去唾液酸糖蛋白受体；或(2)定量检测人去唾液酸糖蛋白受体。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂或试剂盒还用于：

肝细胞癌和转移性肝癌的鉴别；

循环肝癌细胞的分离和检测；

肝脏成像；和

肝脏药物或基因的靶向递送。

10.一种循环肝癌细胞的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(a)从含有循环肝癌细胞的离体样品中分离单个核细胞；

(b)以第一抗体与单个核细胞混合，从而形成“肝癌细胞-第一抗体”二元复合物；所述的第一抗体是权利要求1所述的单克隆抗体；

(c)以偶联有第二抗体的磁珠与所述二元复合物混合，从而形成“肝癌细胞-第一抗体-第二抗体-磁珠”四元复合物；和

(d)磁性分离步骤(c)中的四元复合物；

较佳地，所述的分离单个核细胞采取的分离方法为密度梯度细胞分离法；

较佳地，所述的样品选自骨髓、血液或其他体液；较佳地，所述其他体液为淋巴液、胸水或腹水。