CN111334478B

CN111334478B - 一种用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其双重检测试纸卡

Info

Publication number: CN111334478B
Application number: CN202010124993.9A
Authority: CN
Inventors: 邓柏林; 郑雪莹; 郑金来; 宋彦军; 陈会玲; 郭俊林; 刘庆斌; 韦海涛; 李志军
Original assignee: Beijing Standard Zai Hui Bio Technology Co ltd; Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Current assignee: Beijing standard Zai Hui Bio Technology Co.,Ltd.; CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION OF BEIJING
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2040-02-27
Also published as: CN111334478A

Abstract

本发明提供了一种用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其双重检测试纸卡。本发明通过实验获得4株杂交瘤细胞株T1‑T4(选择了2株1F2和6D6进行保藏)及其分泌的单克隆抗体，获得的单克隆抗体用于制备犬瘟热病毒和犬细小病毒的双重检测试纸卡。制备获得的犬瘟热病毒和犬细小病毒的双重检测试纸卡具有高灵敏度、高特异性、高准确度，可一步同时检测样品中犬细小病毒和犬瘟热病毒，具有操作简便快速、肉眼可判读结果、结果易保存、无需特殊仪器(设备)和试剂等优点。

Description

一种用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其双重检测试纸卡

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其双重检测试纸卡。

背景技术

犬瘟热病毒病和犬细小病毒病是当前严重危害犬只健康的最主要疫病，两种病在发病早期引起的临床症状相似且常为混合感染，单凭临床症状往往难以做出鉴别出具体是哪种病毒感染，必须借助实验室检测手段。现行国家标准中规定的常用检测方法有三种，分别为免疫酶方法、免疫组织化学方法以及RT-PCR方法。临床上也只有一次测试仅能检测一种病毒的胶体金技术。

应用国标中方法对犬瘟热病毒和犬细小病毒进行检测，不仅仪器程度化要求高，并且需要经过繁琐过程，检测时间长，费用较高，不利于在动物医院等地推广使用，而且，这些方法都需要专业技术人员进行操作。应用胶体金诊断技术对病原体检测的技术颇多，基本原理大同小异，都是双抗夹心法检测病原，包括畜禽疫病的各种病毒。目前市面上也存在有单独检测犬瘟热病毒和犬细小病毒的胶体金试纸条，但其检测灵敏度低，需要浓度高的病毒才能检测出，导致检测过程中出现漏检、假阴性结果；且仅有单一的胶体金检测方法，无法同时检测两种病毒，使用成本还是较高。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的一是提供用于检测犬瘟热和犬细小病毒的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供一种犬瘟热病毒和犬细小病毒双重检测试纸卡，该检测试纸卡可同时用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种以犬瘟热病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1，名称为T1(5C3)，命名为1F2。

一种以犬瘟热病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2，名称为T2(3G7)。

经过比较，根据性能选择了1F2细胞株进行保藏，该细胞株已于2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18537。

由杂交瘤细胞株1F2分泌的特异性单克隆抗体命名为T1anti，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，另外含有T1anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明。

由杂交瘤细胞株T2分泌的特异性单克隆抗体命名为T2anti，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，另外含有T2anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明。

一种以犬细小病毒F2b型为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬细小病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3，名称为T3(4E6)，命名为6D6。

一种以犬细小病毒F2c型为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬细小病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4，名称为T4(5D4)。

经过比较，根据性能选择了杂交瘤细胞株6D6进行保藏，该细胞株已于2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18538。

由杂交瘤细胞株6D6分泌的特异性单克隆抗体命名为T3anti，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，另外含有T3anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明。

由杂交瘤细胞株T4分泌的特异性单克隆抗体命名为T4anti，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，另外含有T4anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明。

一种制备杂交瘤细胞株T1-T4及其分泌的单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：

S1、用犬瘟热病毒或犬细小病毒作为免疫原免疫动物；

S2、分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；

S3、筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株T1-T4；

S4、从杂交瘤细胞株T1-T4的培养液或接种杂交瘤细胞株T1-T4的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。

一种制备杂交瘤细胞株1F2和T2及其分泌的单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：

S1、用犬瘟热病毒作为免疫原免疫动物；

S3、筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株1F2和T2；

S4、从杂交瘤细胞株1F2和T2的培养液或接种杂交瘤细胞株1F2和T2的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。

一种制备杂交瘤细胞株6D6和T4及其分泌的单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：

S1、用犬细小病毒作为免疫原免疫动物；

S3、筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株6D6和T4；

S4、从杂交瘤细胞株6D6和T4的培养液或接种杂交瘤细胞株6D6和T4的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。

如上所述的方法中，在步骤S1中，所述犬瘟热或犬细小病毒可为活病毒或灭活病毒，优选为灭活病毒，浓度为5-1000μg/mL；所述免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。

如上所述的方法中，在步骤S2中，当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。

如上所述的方法中，在步骤S3中，在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。

如上所述的方法中，在步骤S4中，可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌犬瘟热和犬细小病毒单克隆抗体T1anti-T4anti的杂交瘤细胞株T1-T4，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体T1anti-T4anti。

如上所述的方法中，在步骤S4中，可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌犬瘟热病毒单克隆抗体T1anti或T2anti的杂交瘤细胞株1F2或T2，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体。

如上所述的方法中，在步骤S4中，可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌犬细小病毒单克隆抗体T3anti或T4anti的杂交瘤细胞株6D6或T4，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体。

一种犬瘟热病毒和犬细小病毒双重检测试纸卡，其包括玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)，硝酸纤维素膜上设有检测线T1线和T2线及质控线即C线，所述T1线和T2线为分别包被有犬瘟热病毒单克隆抗体和犬细小病毒的单克隆抗体，所述质控线包被有羊抗鼠免疫球蛋白。

进一步的，所述结合物释放垫为玻璃纤维膜上包被有标记有犬瘟热病毒和犬细小病毒的单克隆抗体的胶体金。

进一步的，所述犬瘟热病毒的单克隆抗体为权利要求1和2杂交瘤细胞株分泌获得，所述犬细小病毒的单克隆抗体为权利要求3和4杂交瘤细胞株分泌获得。

一种犬瘟热病毒和犬细小病毒双重检测试纸卡的制备方法，包括以下步骤：

1)包被硝酸纤维素膜(NC膜)：采用犬瘟热病毒的单克隆抗体1F2anti和犬细小病毒的单克隆抗体6D6anti分别包被硝酸纤维素膜的检测线T1和T2，用羊抗鼠免疫球蛋白包被质控线C线；

进一步地，用浓度为2-15mg/mL的单克隆抗体T1anti-T4anti包被检测线(T1线和T2线)；用浓度为2-8mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白包被质控线(C线)；用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体1F2anti和羊抗鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，检测线和质控线间距为0.3-1.0cm，通常选择0.5cm。37℃干燥1小时后备用。

进一步地，用浓度为12mg/mL的单克隆抗体T1anti和浓度为10mg/ml的单克隆抗体T3anti分别包被检测线T1线和T2线；用浓度为6mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白包被质控线(C线)；用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体T1anti和T3anti以及羊抗鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，检测线和质控线间距为0.3-1.0cm，通常选择0.5cm。37℃干燥1小时后备用。

2)结合物释放垫的制备：用胶体金标记单克隆抗体；之后将其喷在玻璃纤维膜上；

具体按如下进行：

2.1用胶体金标记单克隆抗体T2anti，方法为：在磁力搅拌下，向三角瓶中加入150ml纯化水，煮沸。加入1％四氯化金溶液5ml，煮沸。再加入1％柠檬酸三钠溶液7ml，煮沸5分钟。冷却后保存于2-8℃。取1毫升胶体金溶液于离心管中。加入15μL 0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min。加入4mg/ml 10μL1F2抗体，混匀后静置30min。加入10μL 20％BSA溶液，平衡5min。加入10μL 20％PEG20000溶液，平衡30min；用离心机10000rpm，离心10min，去上清液。加入100μL金标复溶液(含有2％蔗糖、1％BSA、0.1Triton X100、0.1％的硼酸缓冲液)，复溶后备用。同样方法标记T4anti抗体。

2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上包被有胶体金标记的特异性单克隆抗体T2anti和T4anti，将复溶后的金子1:4稀释后按照8μL/cm的速度喷膜，37℃下放置2小时干燥，备用。

3)制备金标纸层析试纸

在PVC背板上先黏贴硝酸纤维素膜，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端黏贴吸水垫，在靠近测试线一端黏贴结合物释放垫和样品垫，得到用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒金标纸层析试纸，然后可按所需大小进行切割，得到用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒金标纸层析测试条，加干燥剂后密封保存。

如将上述步骤制备的测试条装入塑料卡中，制成测试卡，并组装成试剂盒，该试纸盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

本发明的有益效果在于：

本发明使用可以诱发机体产生免疫反应的犬瘟热病毒和犬细小病毒作为免疫原，采用常规杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒和犬细小病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株T1-T4，并由该细胞株分泌得到单克隆抗体T1anti-T4anti。本发明的单克隆抗体能够特异性地识别犬瘟热病毒和犬细小病毒，可用于两种病毒，并具有高特异性、高灵敏度的优点。实验证明，本发明的单克隆抗体可以准确检测样品中犬瘟热病毒和犬细小病毒的水平，而不与犬冠状病毒、腺病毒、发生交叉反应。本发明将在犬瘟热病毒和犬细小病毒的检测、疫苗生产、流行病学研究中发挥重要作用，应用前景广阔。

本发明还提供了用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒的双重检测试纸卡，具有高灵敏度、高特异性、高准确度，可一步同时检测样品中犬细小病毒和犬瘟热病毒的胶体金免疫层析双抗体夹心快速诊断技术，肉眼可判读结果、结果易保存、无需特殊仪器(设备)和试剂等优点，可替代国外同类产品，并在犬只临床健康体检、病原检测鉴别以及产地检疫中应用推广，优化疫病的检测手段，提高疫病防控水平。

附图说明

图1为胶体金试纸条组装示意图。

图2为胶体金纸层析试纸条正面结构图。

图3犬瘟热病毒灵敏度检测结果。

图4犬细小病毒灵敏度检测结果。

图5为胶体金纸层析试纸条特异性检测结果。

图6为PCR方法检测犬瘟热病毒的灵敏度检测结果。

图7为胶体金纸层析试纸条检测犬瘟热病毒的灵敏度检测结果。

图8为PCR方法检测犬细小病毒的灵敏度检测结果。

图9为胶体金纸层析试纸条检测犬细小病毒的灵敏度检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例1获得持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞T1

以犬瘟热病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为T1。

杂交瘤细胞株T1的获得方法，包括以下步骤：

1、动物免疫

1)基础免疫：以犬瘟热病毒(由北京市动物疫病预防控制中心提供)作为免疫原，采用蔗糖密度梯度离心法测定，纯度≥85％，浓度为10-1000μg/mL。必要时，可用超滤管浓缩病毒抗原以提高病毒含量，浓缩后抗原与福氏完全佐剂(购于Sigma公司)等体积混合并充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只Balb/c小鼠(8-12周龄，雌性，SPF级动物培养，购自军事医学科学院实验动物中心)每次注射量为150μg。

2)加强免疫：将浓缩后抗原与福氏不完全佐剂(购于Sigma公司)等体积混合并充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只Balb/c小鼠每次注射量为200μg。在进行细胞融合前3天，腹腔注射含200μg抗原的生理盐水溶液，以进一步增强免疫效果。小鼠的筛选，1：45000，选择2-5只小鼠。

2、杂交瘤细胞的制备和筛选

用常规方法收集小鼠的脾细胞，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞按10:1的比例在500g/L PEG4000(融合剂，购于Sigma公司)的诱导下进行融合。用HAT(购自生兴生物技术(南京)有限公司)选择性培养液培养，培养条件为5％二氧化碳、37℃。融合后10-15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗犬瘟热病毒的杂交瘤细胞株，间接ELISA法的操作步骤为：用110μL浓度为4μg/mL的犬瘟热病毒病毒包板，拍干后，用1％BSA封闭液(100ml pH7.410mM PBS中加入1g BSA，BSA购于Sigma公司)封闭，以免疫小鼠血清1:2000，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG(购自美国ABCAM公司)100μL，最后测定450nm OD值，以OD450值大于阴性对照2倍为阳性判断依据。

对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆，具体方法是：

1)取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。

2)用HT培养液将细胞稀释成500个/mL、100个/mL、50个/mL和25个/mL的悬液。

3)用吸管将细胞悬液分别种入微量培养板，每孔0.05mL，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。

4)5％CO₂饱和湿度，37℃培养。

5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

6)克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，通过间接ELISA法测培养液上清抗体，选择阳性克隆，并传4～6代就可以建成克隆株。

3、杂交瘤细胞的获得

重复步骤2，进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株针对犬瘟热病毒可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并根据克隆产生位置分别编号为9H4、2D6、7F4、5C3、6F8。

4、杂交瘤细胞所得单抗的性能检测

1)细胞培养液上清效价测定：检测上述杂交瘤细胞培养上清的效价，结果如表1所示，效价为：1:12-1:150，表明培养上清中均含有目标抗体，其中2B4抗体效价略低。

表1杂交瘤细胞培养上清的效价

5、杂交瘤细胞的传代培养

将T1杂交瘤细胞(编号为5C3)命名为杂交瘤细胞株1F2，在含有10％胎牛血清的DMEM高糖(含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中继续进行培养、传代，培养到第10代后，杂交瘤细胞株1F2仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:64以上，表明获得了能够稳定传代，并可以持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

6、保存杂交瘤细胞

获得持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须保存一部分杂交瘤细胞，这是因为在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性；另外，在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。

保存方法包括以下步骤：

1)去掉细胞培养瓶中旧的培养液，加入含有10％胎牛血清的RPM1640培养基，使细胞悬浮。

2)1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用细胞冻存液(二甲基亚砜：胎牛血清：RPM1640＝1：3：6)复溶制成悬液，浓度5.0×105细胞/mL。

3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。具体地：

称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时，用pH7.4 10mM PBS稀释至0.4％。制备单细胞悬液，并作适当稀释。将细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀(终浓度0.04％)。在三分钟内，镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。计算活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。

4)将细胞无菌分装至1.8ml细胞冻存管(购自浙江拱东医疗科技有限公司)，每瓶0.5mL-1.0mL，拧紧瓶盖。

5)细胞冻存：4℃放置2小时，然后-20℃再放置2小时，之后液氮罐气态部分(-70℃)放置2小时，最后转入液氮长期保存。

将获得的杂交瘤细胞株1F2进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18537，保藏日期为2019年10月23日，地址是北京朝阳区北辰西路1号院3号。

采用上述方法用犬细小病毒作为免疫原，免疫动物获得的杂交瘤细胞株命名为6D6，将获得的杂交瘤细胞株6D6进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18538，保藏日期为2019年10月23日，地址是北京朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2、用单克隆抗体1F2和6D6制备的金标纸层析测试卡检测犬瘟热病毒和犬细小病毒

1、制备金标纸层析试纸

如图1、2所示(图中1为金标纸层析试纸的纵截面结构图，图中2为金标纸正面结构图，)，用于检测犬瘟热病毒的金标纸层析试纸由吸水垫(1)、硝酸纤维素膜即NC膜(2)、玻璃纤维膜样品垫(3)、玻璃纤维素膜结合物释放垫(4)组成，硝酸纤维素膜(2)上设有检测线T1线(6)和T2线(7)和质控线C线(8)。

金标纸层析试纸的制备方法包括以下步骤：

1)包被硝酸纤维素膜(NC膜)

用浓度为4mg/mL的单克隆抗体1F2anti包被检测线(T1线)、3mg/ml 6D6anti包被检测线(T2线)。用浓度为4mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白(购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体1F2anti和羊抗鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜(购自Millipore公司)2上，形成相互分离的检测线6和质控线5，质控线和测试线间距一般为0.3-1.0cm，优选0.5cm，37℃干燥1小时备用。

2)结合物释放垫4的制备

2.1用胶体金标记单克隆抗体T1和T3(即单克隆抗体1F2和6D6)，方法为：在磁力加热搅拌下，向三角瓶中加入155ml纯化水，煮沸。加入1％四氯化金溶液5ml，煮沸。再加入1％柠檬酸三钠溶液7ml，煮沸5分钟，即为胶体金溶液，冷却后保存于2-8℃。取1毫升胶体金溶液于离心管中。加入15μL 0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min。加入4mg/ml 10μL 1F2抗体，混匀后静置30min。加入10μL 20％BSA溶液，平衡5min。加入10μL 20％PEG20000溶液，平衡30min；用离心机10000rpm，离心10min，去上清液。加入100μL金标复溶液(含有2％蔗糖、1％酪蛋白、0.5％BSA、0.1Triton X100、0.1％SDS的硼酸缓冲液)，复溶后备用。同样方法标记6D6抗体。

2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上包被有胶体金标记的特异性单克隆抗体T1 anti和T3 anti(即1F2 anti和6D6 anti)，将复溶后的金子用金标复溶液1:4稀释后按照8μL/cm的速度喷膜，37℃下放置2小时干燥，备用。

3)制备金标纸层析测试条和测试卡

如图7所示，在PVC背板7上先黏贴硝酸纤维素膜2，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端黏贴吸水垫1，在靠近测试线一端黏贴结合物释放垫4和样品垫3，得到用于检测犬瘟热病毒金标纸层析试纸，然后可按所需大小进行切割，得到用于检测犬瘟热病毒金标纸层析测试条，加干燥剂后密封保存。

如将上述步骤制备的测试条装入塑料卡中，制成测试卡，并组装成试剂盒，该试纸盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗(图7)。

2、金标纸层析测试条和测试卡的使用

金标纸层析试纸条的使用方法：将样品垫端浸入样品中，样品垫3即吸取液体向上端移动，流经结合物释放垫4时，使干片上的胶体金标记单克隆抗体T1anti和T3anti复溶(1F2 anti和6D6 anti)复溶，并带动其向硝酸纤维膜2渗移。若样本中有待测特异抗原(阳性样本)，其可与胶体金标记单克隆抗体T1anti和T3anti(即1F2anti和6D6anti)结合，此抗原抗体复合物流至检测线6即被固相抗体所获，若为犬瘟热病毒感染则在膜上显出红色检测线条T1线，若为犬细小病毒感染则在膜上显出红色检测线条T2线过剩的胶体金标记单克隆抗体1F2anti和6D6anti继续前行，至质控线5与羊抗鼠免疫球蛋白(固相二抗)结合，而显出红色质控线条(C线)。反之，若样本中无待测特异抗原(阴性样本)，则无检测线条(T线)，而仅显示质控线条(C线)。如果检测线(T线)与质控线(C线)均不显色或仅检测线(T线)显色，则表示金标纸层析试纸(卡)失效。具体在本发明中，不同检测结果与其检测显示的条带的情况，如图2所示。(T1为犬瘟热病毒，T2为犬细小病毒)金标纸层析测试卡和试剂盒的使用方法：检测时，取待检样品1-2滴，滴在试纸盒的点样口，根据观测窗内的检测线(T1线和T2)和质控线(C线)是否出现色带来确定样品中是否存在犬瘟热病毒和犬细小病毒。

3、用单克隆抗体T1anti和T3anti(即1F2anti和6D6anti)及金标纸层析试纸盒检测犬瘟热病毒和犬细小病毒

用单克隆抗体T1anti和T3anti(1F2anti和6D6anti)及金标纸层析试纸盒检测不同浓度(浓度分别为320、160、80、20ng/mL)的犬瘟热病毒和犬细小病毒，以检测试纸盒的灵敏度。

检测结果如图3和图4所示，犬瘟热病毒和犬细小病毒检测灵敏度均可达32ng/mL，表明该产品具有较好的灵敏度。

实施例3

1.特异性

利用该胶体金试纸条检测犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒(CCV)、犬传染性肝炎病毒(ICHV)和犬副流感病毒(CPIV)，结果显示，犬瘟热病毒出现检测线T1，犬细小病毒出现检测线T2，其他病毒均未出现，结果如图5所示。

2.灵敏度

将犬瘟热病毒和犬细小病毒的重组质粒10倍稀释成1.3×10⁸～1.3×10³拷贝/μL，再分别用PCR方法检测。结果显示，PCR检测样品犬瘟热病毒阳性DNA模板的下限量1.3×10³拷贝/μL(结果如图6所示)，而胶体金试纸条检测犬瘟热病毒DNA模板的下限量为1.3×10⁴拷贝/μL(结果如图7所示)。PCR检测样品犬细小病毒阳性DNA模板的下限量为1.3×10³拷贝/μL(结果如图8所示)，而胶体金试纸条检测犬细小病毒DNA模板的下限量同样为1.3×10⁴拷贝/μL(结果如图9所示)。

3.效果比较

同目前市场上较为常用的胶体金进口某品牌的检测效果进行比较，共测试100份样品，其中进口某品牌检测阳性为43份，该胶体金试纸条检测阳性为38份，检测阳性样品经PCR检测，阳性为40份，该产品的检测符合率为95％。

经成本测算，生产该胶体金试纸条的成本(不含人工)仅为1.5元/个。

Claims

1.一种以犬瘟热病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬瘟热病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1，名称为T1，命名为1F2，其保藏编号为CGMCC No.18537。

2.一种以犬细小病毒F2b型为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗犬细小病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3，名称为T3，命名为6D6，其保藏编号为CGMCC No.18538。

3.一种犬瘟热病毒和犬细小病毒双重检测试纸卡，其包括玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设有检测线T1线和T2线及质控线，所述T1线和T2线为分别包被有权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的犬瘟热病毒的单克隆抗体和权利要求2所述杂交瘤细胞株分泌的犬细小病毒的单克隆抗体，所述质控线包被有羊抗鼠免疫球蛋白。

4.如权利要求3所述的双重检测试纸卡，其特征在于，所述结合物释放垫为玻璃纤维膜上包被有标记有犬瘟热病毒的单克隆抗体和犬细小病毒的单克隆抗体的胶体金。

5.权利要求3或4所述双重检测试纸卡的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1）包被硝酸纤维素膜：采用权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的犬瘟热病毒的单克隆抗体和权利要求2所述杂交瘤细胞株分泌的犬细小病毒的单克隆抗体分别包被硝酸纤维素膜的检测线T1和T2，用羊抗鼠免疫球蛋白包被质控线C线；

2）结合物释放垫的制备：用胶体金标记单克隆抗体；之后将其喷在玻璃纤维膜上；

3）制备金标纸层析试纸：在PVC背板上先黏贴硝酸纤维素膜，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端黏贴吸水垫，在靠近测试线一端黏贴结合物释放垫和样品垫，按所需大小进行切割，得到用于检测犬瘟热病毒和犬细小病毒金标纸层析测试条。