JPS63159762A - 口内微生物の評価方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 辣Ｊ口り団 本発明は、微生物の介在によって起る歯周疾患をモニタ
ーするために、口内の試料中の微生物の存在について評
価する方法に関するものである。

別の面では、本発明はこのような方法に使用するのに適
した材料に圓するものである。

背景技術 歯周疾患とは、歯を取り囲む支持組織が炎症及び、また
は病気を起す様々な状態を記述するのに使用される一般
的用語である。この病気に患る人達は、先づ歯肉炎とい
う歯周疾患の１つの形で悩まされる。歯肉炎は、通常、
歯肉組織の穏かな、慢性の、可逆的な炎症である。より
重篤な場合では、病気の過程は広範囲に亘り、近接歯肉
組織が破壊され、歯の廻りに穴があく。やがてこの穴が
深まり垂直の骨がそして歯が喪失することもあり得る。

歯周疾患を理解する上の近年における主要な進歩は、病
気の多くが微生物によって媒介された状態であることが
認識されたことであり、したがって、これらの部位での
微生物菌相を評価することにより、健庫者と疾患者とを
区別することが可能となるかもしれないこと、さらに、
疾患者においては、病気を部位毎に識別できるかもしれ
ないことが認識されたことであった。様々な微生物が歯
肉炎や若年性歯周炎、成人性歯周炎、壊死性及び潰癌性
歯肉炎のような歯周疾患と関連づけられた。

一般にライては、Ｒ，Ｃ，Ｐａｇｅ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、
Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏ１１３　：３４５−３５５　（１９
８６）及びり、Ｈ，Ｆｉｎｅら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐｅ
ｒｉｄｏｎｔｏｌ　１３　：　５３３−５４６（１９８
６）を見よ。

今日迄、どの特別の微生物種についても、もしあるとし
ても、その精密な病因論的及至病原的役割は完全には解
明されていない。また、研究者は誰も、種々の微生物の
互い同士、或は口内の環境変化に対する相互関係を完全
には明確にしていない。この知識の不足は、大部分、関
与していると思われ種々の微生物種またはそれ亜種を、
従来の技術を用いて、体系的に、正確にそして再現性を
持って同定する場合に遭遇する困難によるものである。

この困難は、興味の対象となる微生物が、培養できると
しても、複雑で骨の折れる厳密に嫌気的な培養技術を用
いてはじめて培養できることが多いという事実から主に
生ずる。その上、これらの微生物が一般的に単離される
口内のサンプル、例えば歯垢は、その採取と調ＶＡ（例
えば、無菌嫌気状態を維持すること）において、誤りや
問題が起り易く、ある特定の旧来の分析の妨害物質を含
んでいることが多いので、微生物分析が困難なサンプル
なのである。歯周疾患に結びつくとされている微生物は
、多くが、嫌気的培養法とか、暗視野顕鏡やもつと最近
では、位相差顕鏡、のような技術によって最も頻繁に検
出される。微生物自体の評価のための示唆される方法に
は、フローサイトメトリーやＤＮＡプローブを入ってい
る。微生物相の、？Ｆ価に対する他の手段には、微生物
の生産物の決定、宿主ｉｓの応答と生成物、免疫応答、
及び細砲内酵素がある。

蛍光抗体顕鏡法のような従来からある免疫学的手法も用
いられるが、これは、特定の口内微生物（例えばＪａｃ
ｏｂら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１０
　：　９３４−９３６　（１９７９）をみよ。）に対す
る抗体の生産を含む。これらの技術は、研究目的には適
切であるが、数多くの部位についての迅速で、ルーチン
な臨床検査としては一般的に、骨が折れすぎ、時間がか
かりすぎそして費用がかかりすぎる。

近年に至り、モノクローナル抗体の技術が発展し、種々
の微生物及び微生物の抗原決定基に特異的な抗体の生産
が可能になった。例えば、Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　
（バクテリアに対するモノクローナル抗体）６：１３１
−１４２）Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、　　（１９８５）の
Ｈｕｔｈａｒｉａら、９グラム陰性バクテリアの共通抗
原の研究におけるモノクローナル抗体の使用″及び＋ａ
ｃａｒｔ。

ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｌｅｔ　　ｏｒ　Ｈｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｎｅｗｓ　４９　：　１−７　（
１９８３）を参照せよ。それでも、微生物病因論の研究
に対するこの技術の使用は最近子をつけられたに過ぎな
い。例えば、ある口内ａａｃｔｅｒｏｔｄｅｓ種に対す
るモノクローナル抗体が報告されテイル、、（例えば、
ｔｂｅｒｓｏ＋ｅら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｈｔｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１９　：　６３９−６４４
　（１９８４）をみよ。） 聞くところによると、大部分のグラム陰性バクテリア間
で高度に類似性があり、免疫学的に交叉反応性を有する
といわれる構造である、グラム陰性菌のリポ多糖の内毒
素の芯に対しもモノクローナル抗体が作られた。（例え
ば広告ＰＣＴ出願ｎｏ、ＷＯ３４１０４４５８をみよ）
だが、他の研究グループは、ロ内グラム陰性菌３種の一
組に対して交叉反応性を示す抗体を単離できなかった。

（Ｄａｈｌｅｎら、Ｉｎｆ、ＩＩｌｍｕｎ、３９　：　
４６６−４６８（１９８３）をみよ。） 特定の種の精密な役割が明確に解明されていない別の理
由、そしてその結果、微生物相の評価が病気をモニター
するのに、通常使用されない理由は、歴史的に経験され
たデーターの解釈に、ついての重要な問題のためである
。実験手法とプロトコルが異なっていること、病気自体
が、部位、段階、個人によって極立って変化しているこ
とから考えると、ある特定の種と、疾患の段階、経過、
重症度との間の有用な関係を樹立するのに十分、簡単で
あり、繰返しが可能で、特異的であり効果的であること
が示された方法は今日迄見当らない。

単に特定の微生物が存在するというだけで、関連疾病の
診断そして、またはモニターに使うことができる場合が
非常に多い他の微生物介在のもつと普通の病気と異なり
、歯周疾患と結びつく口内微生物種は、数が多く、変化
があり、最も重要なことに、疾病両相の一部であるのと
同様に正常の口内両相の一部であることが多い。

口内の微生物種の数と型は、それ自体においても（例え
ば時間の経過とともに）、ある特定の秒間でも、疾病が
存在すること、及び疾病の段階ども、これまでのところ
予測を許さない、当惑させられるやり方で、無関係に変
化しているように思われる。その上、この病気は、両相
の変化が時間の経過とともに非常に徐々に進行する慢性
病であり、そのため病気自身、現れるとしても、臨床症
状としてそれ以上にゆっくりと現れる程である。

それゆえ、歯垢指数、深さの測定、附着度、歯肉の色、
出血傾向のようなパラメーターを観察し、標準的な臨床
、解−１並に形態学的所見を使用することによって歯周
病の評価を行うことに頼らざるを得ない状態が続いてい
る。しかし、これらの方法は、病気の症状を測るもので
あり、どちらかといえば、主観的なものである。その上
、これらは、病気の活発度の進行やパターン、例えば、
個々の部位における悪化もしくは寛解を決定したり、同
時に、治療手段の効果を評価するのにあまり役立たない
。

及」Ｊと１ｎ 歯周疾患の研究、したがってその診断と治療は、主原因
として、微生物相の迅速で再現性があり正確な分析に必
要な道具と解釈の手段が不足しているため、多（の他の
微生物の介在によって起る疾病の場合にくらべて遅れて
いる。本発明はこのような道具を提供する。

要約すれば、本発明は、口内のサンプルの歯周疾患と結
びついた微生物の存在について評価する以下の段階を含
む方法を提供する。

（２）　抗体を用いることにより、該サンプル中の１種
またはそれ以上の特定口内微生物の麺を決定する、 ０　抗体を用いることにより、該サンプル中の対照群の
グラム陰性微生物の樋を決定する、そして （ｃ）　該特定口内微生物の量を、該対照微生物の量と
比較する。

もう１つの面として本発明は、本発明の方法を実行する
上に役に立つ、抗体そしてこれらの抗体を含むキットを
提供し、またこのような抗体を生産するハイブリドーマ
の細胞系も提供する。

ｌ乱Δ１！皇呈」 本方法は、歯垢や歯肉からの液体のような口内サンプル
中の微生物相を迅速、正確、簡単な方法で評価すること
を可能にし、有用な結果、すなわち、もつと時間がかか
り、もつと骨の折れる微生物の嫌気的培養の過程によっ
て得られる結果と良く相国する結果を生ずる。抗体を用
いることにより、この方法は骨の折れる費用のかかる技
術により、このような微生物を培養したり、染色したり
、もしくは別の方法で同定することを必要とするような
、もつと伝統的な手法よりも、有意な利点を提供する。

個々の微生物を単に個々の微生物と比較するよりも、グ
ラム陰性微生物対照群との比較を提供することにより、
本方法は、個々の微生物が、単にそれら自身（例えば、
時間の経過、または、異なる部位間）または、すべての
同定可能な、または、培養可能な（例えばグラム陽性微
生物を含む）微生物を含むもつと大きな群と比較したら
ば、得られるより以上に正確、そして、または、もつと
劇的な評価結果を与える。

ここで用いられる“歯周疾患″という用語は、微生物に
よって媒介されるもしくは密接に結びついている炎症、
病気その他の症状のどの段階にせよ、哺乳類の口内環境
のどの部位にせよ、そのすべてを指す。

ここで用いられる口内微生物という用語は、その特別な
微生物が、それ自体病気の原因作用体であろうと、なか
ろうと、歯周疾患の発展と経過を通じて口の中に存在し
得る種々の微生物の目、科、属、種、亜種、菌株及び菌
株の生産物のすべてを指す。

ここで用いられる“量“という言葉は、例えば、口内微
生物もしくは、微生物群の濃度の決定におけるように定
量的であり、あるいは、口内微生物もしくは微生物群が
、あらかじめ決められた水準より、高いか、低いかを示
す、比較定量という意味で半定量的であるというその意
図した目的に対して十分、定量的であったり、半定量的
であったりする定量である。

ここで用いられる〃特定口内微生物”という用語は、単
一の抗体で決定することができる口中微生物の１つまた
はそれ以上の属、種、亜種、もしくは菌株を指す。

ここで用いられる“バッテリー“という語は、２つ、も
しくはそれ以上の特定口内微生物を指す。

ここで用いられる“対照″という言葉は、グラム陰性口
内微生物の１つ、またはそれ以上の属を指し、すべての
グラム陰性口腔微生物と、その部分集合を含むことがで
きる。しかし、段階０で決定される対照微生物の群は、
発明の方法の段階へで決定されるどの特定微生物とも同
一であるべきではない。すなわち、対照微生物は、段階
（２）におけるどの特定の決定とも異る微生物を少くと
もいくつか含んでいるべきである。好ましくは、このよ
うな対照微生物の存在が、単一抗体の使用によるように
、同時に定量できる。さらに好ましくは、対照微生物は
、本発明の方法の段階（２）で定量される特定口内微生
物のそれぞれを含んでいる。

より好ましい態様では、段階（２）で定量される特定口
内微生物は、グラム陰性の口内微生物であり、最も好ま
しくは、次のような属： Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、　　Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｓ。

Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ、　　Ｈａｅｒａｏｐｈｔ
ｌｕｓとＴｒｅｇｏｎａｒａａに属するものである。特
に好ましい態様においては、バッテリーの中のそれぞれ
の特定口内微生物の量が決定される。バッテリーは、以
下のグラム陰性口内微生物種のうち、２種及至２種以上
を含む。

更に好ましくは、これらの微生物のそれぞれの微生物の
リポ多糖（“ＬＰＳ“）成分によって提供される抗原に
特異的なモノクローナル抗体を使用することにより、こ
れらの特定口内微生物を定量的に測定する。

この発明のより好ましい方法はまた、これら特定微生物
の量を、このような参照微生物のすべてによって共有さ
れているＬＰＳ成分によって提供される抗原に対して特
異的なモノクローナル抗体の使用によって、対照微生物
の量と比較する方法も含んでいる。

発明は、特定口内微生物と参照微生物を区別することを
可能にする抗原の存在を利用する。このような抗原を探
知するため、抗体を作ることができる。でき上った抗体
は歯垢や歯肉液のような口内サンプルで代表される複雑
な環境下で、このような抗原の測定に有用である。本発
明を使用することにより、個別の特定口内微生物を、口
内サンプル中において対照微生物と同時に定量すること
ができ、有用かつ有意な方法で比較することができる。

以下の論議により、この発明の方法を遂行する上で有用
な材料を作るのに役立つ考慮が明かとなる。

本発明の、より好ましい方法は、最低、ある特定口内微
生物に対する１抗体と、対照微生物に対する１抗体とを
必要とする。

ここで用いられる“抗体“というｆｆｉは例えば、モノ
クローナル抗体はもとより、単−特異性多クローン性抗
体のように、本発明の方法において使用可能な識別性が
十分にある抗体すべてを指す。

本発明の方法に用いられるより好ましい抗体はモノクロ
ーナル抗体である。

イムノグロブリンはすべて使用できるが、ＩａＧがより
好ましい。抗体全体が、その断片か、いずれも使用でき
る。単一モノクローナル抗体が使用でき、モノクローナ
ル抗体の混合物、ボリクＯ−ナル抗体の混合物を含めて
、それらの混合物が使用できる。用いられる抗体の数と
型は、検出すべき異なる抗原の抗原部位と数によって決
る。

より好ましくは、抗体組成物には、非特異的抗体、すな
わち、望ましい抗原以外の抗原と結合する抗体が混って
いないことである。

本発明において有用な抗体は、ｉｎ　ＶｉｔｒＯでのリ
ンパ球のマイト−ジエン及び、または、抗原による刺戟
、ｎｆｆ１の断片の培養、リンパ球クローンのウィルス
による形′貿変換、または組み換えＤＮＡの技術をはじ
めとする、その技術に熟達した人々には、明らかとなる
種々の方法によって得ることができる。

好ましくは、モノクロール抗体は、Ｈｉｌｓｔｅｉｎと
ＫＯｈｌ１３ｒ１．：より論じられＮａｔｕｒｅ　　２
５６　：　４９５−４９７．１９７５に発表されたハイ
ブリドーマ製造と同様の工程によって得ることができる
。この工程はマウス（または他の適切な動物）に望む抗
原物質を注射することを含んでいる。本発明では、その
抗原には、部分的に、または完全に精製した口内微生物
の培養物を用いることができる。またその抗原は、酵素
や毒素のような、微生物の精製、または部分的精製を行
った成分を用いることもできる。その抗原は、或は、例
えば、ＷＯ３４１０４４５８に記載された超音波処理及
び抽出法または、そこに引用されている他の方法によっ
て精製したＬＰＳを用いることもできる。その報告は、
ここに引用文献として収めである。

モノクローナル抗体を調製するには、マウスのような適
切な宿主を免疫法に従って、力価の高い抗原を含んでい
る細胞の１！濁液、または、細胞の区分で免疫する。そ
の投与経路とスケジュールは、一般に抗原刺戟と生産に
対して確立されている方法にしたがって行われる。免疫
した後、免疫リンパ球様細胞を、好ましくは、＃誠から
単離し、適当なミエローマ、ブラスマ細胞腫、もしくは
ハイプリドーマ細胞と融合させ、ハイブリッドｔｉａｍ
系（すなわち、ハイブリドーマ）を作り出す。ハイブリ
ドーマは、選んだ抗原に対し、抗体を産生じ、無限に培
養、継代培養を行うことができる。

次に融合によって生じたハイブリドーマの集団について
、イムノグロブリン生産のスクリーニングを行うことが
できる。既知の技術にしたがって精製した抗原を用いて
の、エンザイムイムノアツセイのようなイムノグロブリ
ンのスクリーニング用のアッセイを用いることができる
。細胞培養液中に存在するイムノグロブリンは、さらに
免疫に用いたａ胞及至その断片との反応能力について試
験する。これは上述のイムノアッセイを既存の技術に従
って改変することによって達成できる。

ハイブリドーマの培養により、免疫を行った抗原と反応
するモノクローナル抗体を生産することがわかると、さ
らに試験をしてその選択性を決定スル。培養物を例えば
Ｔｈ０ＩａＳ　Ｊ、ＨＣＫｅａｒｎ。

“Ｃｌｏｎｉｎｇ　　ｏｆ　　Ｈｙｂｒｉｄｏｉａ　　
Ｃｅ１ｌｓ　　ｂｙ　　ＬｉｍｉｔｉｎｇＤｉｌｕｔｉ
ｏｎｓ　　ｉｎ　　ｔｈｅ　　Ｆｌｕｉｄ　　Ｐｈａｓ
ｅ”　　ｉｎ　　Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ　　　Ｐ　３　７　４　　、　にｅｎｎｅｔｔ、
Ｒ，Ｈ，、ＨｃＫｅａｒｎＴ。

Ｊ、ａｎｄ　　Ｋ、Ｂ、Ｂｅｃｈｔｏｌ、ｅｄｓ、ｐｌ
ｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ　（１９８０）に記載
されているようなその道の熟達者によく知られている技
術を用いて、培養物を限界稀釈することにより単一クロ
ーン性を確保した。

これらのクローン化したハイブリドーマによって生産さ
れたモノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイで、免
疫に使用した菌株または抗原と異なる抗原との交叉反応
性を決定するための試験を行う。その上、抗体を、その
道（Ｔｏｂｉｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、　７６　：　４３５０−４３５４（１９７９）をみ
よ）の熟達者にとってよく知られている電気泳動的手段
（例えば、ウェスターンプロット及びイムノプレシビテ
ーション）によって分離した微生物細胞成分に結合する
能力についてアッセイする。　　　　゛ どれかハイブリドーマの細胞系が、望む特異性を持って
いることがわかると、次にそれらは、例えば、その道の
熟達者にはよく知られているマウスの腹水産生の伝統的
組織培養の技術によって、培養、継代培養を行って、抗
体の連続生産を確立することができる。これらの細胞系
は凍結乾燥や凍結をはじめとする常用技術によって貯蔵
保存できる。

アッセイに用いる抗体は、イオン交換クロマトグラフィ
ーや、例えば組織培養液、や、清澄化した腹水を５０％
硫安で処理することによる沈澱法のような因襲的な技術
で単離することができる。

この処理により抗体は沈澱する。沈澱は随意に（そして
、より好ましくは）燐酸バッファー食塩水（ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓｏｌ　ｉｎｅ、　ｐ　
Ｂ３　”ｐＨ７，５）に再懸濁して使用する。得られた
抗体は、例えば既知の技術で、凍結乾燥、凍結を行って
貯蔵できる。

本発明の方法において用いるのに適した抗原は、固有口
内微生物と参照微生物を区別できるようにし、そしてよ
り好ましくは、さらに個別の固有微生物同志を区別でき
るようにする細胞内外のいかなる分子種をも含む。

抗原部位（すなわち、エピトープ）を提供するのに適し
た細胞成分、または産物は、抗原として役立つ、すなわ
ち、単独で抗原性があるかハプテンとして作用し、本発
明の方法により評価される口内サンプルにおいて、モノ
クローナル抗体と免疫的に反応することができるすべて
を含む。

適切な抗原には、例えば鞭毛、細胞のエンベロープ、被
膜もしくは細胞質に存在しているもの、または口内微生
物によって生産され、細胞外因子、毒素、酵素のような
ｌ１ｒｆｊ１外環境で見出されるものがある。

好ましい抗原は微生物および選りぬきのグループへ最適
の特異性およθ結合特性を示すものであると同様に、サ
ンプルあるいは細胞に最小の物理的操作をもちいて検出
可能であるこ“とです。たとへぼ、細胞外から、あるい
は細胞壁に到達しやすい、あるいはエンベロープ状外皮
の抗原。

特に好ましいのは、各抗原が選択した取り扱い、抽出お
よび分析処決により同程度に影響をうけると考えると直
接比較を安心しでできるように、同一または似たような
分子成分からできていることです。

好ましい抗原源はリポ多糖（“ＬＰＳ“）です。

ＬＰＳの噛脱は、次を参照のこと。一般的には、Ｒ，Ｊ
、ＥＩｉｎ　ｅｔ　ａｌ。

ＣＲＣ）ｌａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙＬａｓｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、編　■巻　２１５
−２３９　（１９７３）　ＩＪ、５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　３９　：　
２４３−２７０ＬＰＳは各種の理由から抗原の理想的な
資源です。ＬＰＳはすべてのグラム陰性口内微生物にと
いうわけでないが、大抵の場合多量に存在する細胞壁構
成成分である。

出願人は従来ＬＰＳの存在が未殖であり論争されていた
たとへば、Ｔ、ＶｉｎＣｅｎｔｉ＋の種におけるＬＰＳ
抗原を同定することを可能にした。さらに、ＬＰＳは本
発明の方法で対照微生物の抗原源として役立ち得る相対
的には゛通常“の領域（すなわち、コア（中核）および
リビドＡ領域）と、特異的口内微生物と対照微生物を識
別する抗原源として役立ち得る相対的には”可変″領域
（すなわち、″０抗原“領域との両者から成立している
。

さらに、ＬＰＳは、試験のための抽出および調製に用い
られる多くの物理化学的処理に起因する変化に通常領域
でも可変領域でも高度の抵抗を示すようである。

しかしながら、ＬＰＳ使用のもう１つの利点は、ＩＩ胞
堅壁成分同様エンドトキシンして細胞内に見出されると
同様に口内サンプル中細胞外にも発見されると期待し得
るということである。たとへば、Ｃ，Ｇ、Ｄａｌｙ　ｅ
ｔ　ａｌ、　Ｊ、０ｒａｌ　Ｐａｔｈｏｌ、９　：　１
−１５（１９８０）。

それ故、細胞外だけにあるいは細胞内だけに存在する場
合よりも、ＬＰＳは抗原のより大きなプールです。ここ
に明らかにしたＬＰＳの両型式を同時に検出する能力は
、ある意味でエンドトキシン検定にも全細胞検定にも最
善の特色を与へる。

本発明の方法は特異的な口内微生物を、好ましくは１群
の形で用いる。適切な特異的口腔微生物は、口内微生物
の検出可能な属・種・亜種および株を包含する。

本発明の方法においての使用に適切な特異的口内微生物
は次の属の１種またはそれ以上の微生物を包含するが、
これらに限るものではない。

ｕ」」±ユ五− 歯周疾患と関係して付随するなんらかの物理変化に先立
って、急速にかつ菌数がかなり変る特異的な口内細菌が
好ましい。好ましいのはまた歯周疾患の病原性の過程で
実際に役割を演じ、歯周疾患によって影響を受けるだけ
の微生物には対立する特異的な口内細菌である。さらに
、好ましいのは、グラム陰性の特異的口内微生物である
。好ましくは、１群が２ケないし２０ケの特異的口内微
生物から成るものであり、より好ましいのは２ケから１
０ケのものである。

適切な対照微生物とは、１群として検出し得るグラム陰
性口内微生物の組み合せも包含する（たとへぼ、すべて
のグラム陰性口内微生物あるいはそのサブセットは、本
発明の方法の過程りにおいて意味のある比較のできる個
々のあるいは複数の科、目あるいは属を包含する。

好ましい対照微生物は単一抗体によっても測定すること
ができ、上に記したように、対照微生物は、好ましくは
、本発明の方法の過程（２）において測定した各特異的
口内微生物を包含する。

特に好ましい対照微生物は、単一抗体によって検出され
るようなすべてのグラム随性口内微生物である。

特異的口内微生物および対照微生物の抗体は、公知の各
種免疫検定ホルマートでの使用を容易にするキットにす
ることができる。好ましくは、特殊のキットの中の抗体
は、特異的口内微生物および対照微生物の単一分子成分
によって与えられた抗原への特異的モノクローナル抗体
であることがのぞましい。もつとも好ましいのは、分子
成分がＬＰＳであるものである。

特異的な口内微生物および対照微生物の存在を測定する
特殊な免疫検定ホルマートがこの発明の決定的なもので
はないが、その限りにおいて、ホルマートは必要とする
程度の感度と信頼性を備へている。

多数の異なった型式の検定法が各種のプロトコルと４１
［識をもっている。

大抵は、特異的な測定部位を検出するための通常用いら
れる検定は競争的にたん白質を結合する検定で、その抗
体またはフラグメントが用いられている。種々の検定が
図示されているので、米国特許ナンバー３．６５４’、
０９０．３，８１７．８３７．４，２３３，４０２．４
，２７５．１４９および４，５８４．２６８参照のこと
。

一般的には、試薬溶液はＷ！識抗体あるいはＩＩＡ識抗
原を含有して形成されている。

試薬溶液は、標識成分にくわえて、ｌｌｌ液液ような添
加物だとへばｆＩ４酸塩、トリス、バルビタールあるい
は同種のものを正規には約０．０１から約１０１Ｈの範
囲の濃度で含有することができ、その濃度は検定中ｐＨ
を約６から７の範囲で、より一般的には７から８に維持
すれば十分である。他の添加物としては保存剤だとへば
アジ化ナトリウム、不活性たん白質たとへぼ血清アルブ
ミン、食塩、界向活性剤あるいは同種のものを含んでい
て、標識成分を保存し、抗原・抗体複合体の形成を増強
し、非特異的結合の形成を防ぐなど同種のことを助けて
いる。

次の討論で、本発明の方法を実施するために上記の材料
について考える。

理想的には、検定は歯科治療をする人が敏速かつ容易に
使用できる様式にされて、無駄な時間・費用あるいは装
置なしで使用できる結果を与える。

好ましい具体化をすると、本発明の方法は次の様式で使
用される。

口内サンプルは、興味ある抗原を免疫学的に反応させる
何らかの手段によって、何らかの資源または場所から手
に入れることかできる。サンプルは、たとへば抗原が細
胞外に見出されるなら口内微生物そのものを含んでいる
必要はない。サンプルは口腔環境から直接的に採取でき
るが、また人工的にも調製できる。たとへば培養物から
あるいは保存媒地から口内微生物はｌ製することができ
、あるいは、さもなければ発見することができる。

口腔環境においては、サンプルはたとへぼだ液、舌、歯
の表面、上歯肉面、下歯肉面から物理的に手に入れるこ
とができる。

研究の示すところでは、サンプル採集の好ましい口腔部
位は歯肉間隙および下歯肉面である。サンプルはｉｎ　
ｖｉｖｏでも検定することができ、たとへば検出し、局
存化するモノクローナル抗体を使用することにより、あ
るいは反対に口腔環境で口内機生物を免疫学的に反応さ
せることによる。

口内サンプルは、滅菌歯周シープ、ガスフラッシュ注射
器、ろ紙片、ガラスキュベツトあるいはピペット等の使
用をふくめで公知の各種の手段で入手できる。

本発明の実施には、サンプル中の微生物を分離または培
養する必要が一般的にはないので、嫌気的あるいは無菌
條件にさへ維持する必要はない。サンプルはサンプリン
グと同時に分析され、公知の方法にしたがって保存され
る。

上に記したように、サンプルは１ケまたはそれ以上の特
異的口内微生物の量を測定するために評価し、対照微生
物の量と比較する。本発明の方法の過程（２）および０
はい゛ずれの順番でも実施でき、好ましくは、同じ口内
サンプルの一部を用いて同時に行う。

比較の結果は各種の技術を使って示される。たとへぼ、
結果は特異的口内微生物社と対照微生物の量の比の形で
表現される。この比は指示と関連して用いられ、たとへ
ば、疾病と比を関連づける標準曲線に用いられる。

この比はコンピューター分析の手段で歯周疾患との関係
を指示すると計算され解釈される。

本発明の結果は、単に、比の形で表現される必要はなく
、のぞむならば、その比較が限界または範囲内かどうか
をプラスまたはマイナスのような単純な形式でも表現さ
れる。同様に、他の有効な比較が、たとへぼ、多変量検
定解析の形でなされる。

本発明の方法によって得られた結果は、このサンプルに
関する他の観察または測定の結果（深部測定、顕微鏡評
価、たん白質測定、生菌数）あるいは免疫応答、体温、
栄養状態、衛生状態等のように臨床パラメータとして討
論される患者の１１１９または測定結果と関係づけるこ
とも可能である。

このようにして、歯周疾患とその治療が一層明確にされ
、理解されて、よりしっかりと治療される。

本発明の抗体を使用して製造したキットは、抗体だけか
らもできるが、現在商業的に入手可能で公知のろ紙や試
薬を含有し、装置の包装にも各種のものを包含するもの
である。有用な任意の成分は第二義的なものであり、特
異的口内微生物抗体および検定する対照微生物抗体への
酵素結合抗体が！！衝液、酵素基質およびその他同種の
もの同様、検出系の一部として役立つのである。

蛍光物質または放射性同位元素で標識した抗体も本検定
法を改訂して使用することもできる。

次の実施例は本発明の理解を助けるために提供するもの
であり、本発明の特許請求の範囲を限定するものではな
い。

特に指示がなければすべてのパーセントは重量によるも
のであり、添加されたモノクローナル抗体の量は回収し
た腹水液の量を示していて、約１００μｇ／Ｉ１１の濃
度となるように燐Ｍ塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で稀釈
しである。

実施例に 秒のスピロヘータＴ、ｄＱｎｔｉＣＯ１ａとＴ、Ｖｉｎ
Ｃ（！ｎｔｉｉのモノクローナル抗体の産生は二種の密
接に関連する口内微生物のモノクローナル抗体を区別し
て産生ずることに関るある種の考慮を示すために記述す
る。

Ｔ、ｄｅｎｔｉＣＯｌａまたはＴ、ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ
の純粋株は、アメリカ基準株培養コレクション、Ｒｏｃ
ｋｗｅｌｌ（ＡＴＣＣ３５２０）とＲ，Ｃ，ＪＯｈｎＳ
Ｏｎ博士、ミネソタ大学から得た。

■、ＶｉｎＣ１ｌｔｉｉ株（および下に記述するＴｒｅ
ｐｏｎｃｍｅの他の野生株）は、Ｒ，Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏ
ｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、３１　：８９−１０６　（１９７
７）に記述された方法に従って分離され、同定した。さ
らに、Ｒ，Ｈ，５ｓｉｂｅｒｔ、Ｔｈｅ　Ｐｒｏｋａｒ
ｙｏｔｅｓ　（Ｈ，Ｐ、５ｔａｒｒ。

等）ｐｐ、５６４−５７７゜５ｐｒｉｎ（７ｅｒ出版べ
／Ｌ／　１．Ｊ　ンハイデルベルク（１９８１）に記述
されている通りに成育した。その公示はこの文書に参考
までに組み入れた。

細胞は、培養液からグラジェント遠心分離により、コロ
イド状ポリビニルピロリジン被覆シリカ（“ｐｅｒｃｏ
ｌｌ“、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ。

ＰｉＳＣａｔａＷａＶ、Ｎ、Ｊ、　　）に分離した。

各培養液は９０％ｐｅｒｃｏｌｌ〜燐酸塩緩衝生理食塩
水（”ＰＢＳ”　、ｐＨ７，４）Ｆｌ＋１釈し、（０，
３９ｄ　　ｐｅｌｒｃＯｌｌ　／培養液−）、３１．０
００ｘｏ４℃で２０分間遠心分離した。スピロヘータの
バンドはピペットで回収し、ｐｅｒｃｏｌｌ液を強化す
るために１００．０００ｘｏ　　４℃で１時間、再度遠
心分離した。ベレット化したスピロヘータを１０８細胞
／ｄの濃度でＰＢＳに再懸濁し、−７０℃で凍結した。

Ｔ、ｄｅｎｔｉｃｏｌａで免疫化するため、５３１令の
雌マウスｂａｌｂ／Ｃ（Ｃｈａｓ、Ｒｉｖｅｒｓ、Ｗｉ
ｌｍｉｎａｔｏｎ、ＨＡ）を５×１０６の洗浄したスピ
ロヘータをＰＢＳ中腹腔内注射して免疫化した。２ケ月
間にわたって、マウスに６回注射した。注入の４日前、
マウスに尾静脈から１０６スピロヘータ細胞を注射した
。

Ｔ、ＶｉｎＣｅｎｔｉ＋の場合も、同じ免疫化゛スケジ
ュールを用いた。

Ｔ、ｄｅｎｔｉｃｏｌａの抗体を産生ずるハイブリドー
マを得るため、３匹の免疫化したマウスの牌臓を摘出し
、処置して白血球を分離した。白血球は、Ｎ５−１薬剤
標識したマウス骨髄腫（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ１８から入手
）と、各骨儲腫Ｉ胞当り４！５ｌＩＩ！ｌ拳の割合！混
合、Ｌ／、３５％ポリエチレングリコール中細中細金融
た。細胞融合技術はＧａ　Ｉ　ｆ　ｒｅ等Ｎａｔｕｒｅ
２６６：５５０−５５２　（１９７７）の記述した方法
を用いた。その公示は本文書中に参考までに組み入れた
。

生成した細胞懸濁液は組織培養液中で（ＯＬＩ　Ｉ　ｂ
ｅｃｃ。

の改良イーグル培地（Ｓｉａａａ　Ｃｈｅｓｉｃａｌ　
Ｃｏ、、Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ＞　４　、５００ａｙ／　１グルコー
スと２０■ＨＮ−２−とドロキシエチルピペラジン−Ｎ
’−２−エタンスルルホンｌ１ｌ（“トＩＥＰＥｓ“、
　Ｓｉｇｍａｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕ
ｉｓ、ＨＯ）ハツト培地で補強（０，１３６７１９／１
００−ヒボキサンチン、０．００１８１９／１００Ｉｄ
アミノプテリン、０．０７６η／１００−チミジン、ｐ
ｔ１７．２−７．４．５ｉｕａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、からすべて商業的に入手可能）。

この培地の中で、細胞融合しない骨髄腫細胞は選択的に
死滅し、ハイブリッド細胞だけが成育する。

成育１０日模、ハイブリドーマの培養液は丁、ｄｅｎｔ
ｉｃｏｌａの抗体産生を次のように酵素結合免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）により測定する。

１０６ケのスピロヘータＢ、ｄｅｎｔ＋ｃｏ＋ａ　）を
ゲルタールアルデヒドを用いてマイクロタイタープレー
トの底に（１＋ｎｕｌｏｎ　ＩＩ　、　Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ。

Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、Ｖａ　）交叉結合する。まず最
初に、０．１％ゲルタールアルデヒド水溶液を用いてプ
レートを１時間被覆し、プレートを３回水洗する。

スピロヘータはそれからＰＢＳ１００μｌに移し、室温
で２時間培養する。その後、１％ウシ血消アルブミン（
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕ
ｉｓ、ＮＯ）でプレートをブロックし、３回ＰＢＳで洗
浄した。

ハイブリドーマ培養液め上澄み液（５０μりを室温で１
時間加えて、除去し、ウェル（穴）をＰＢＳですすいだ
。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン１
００ａｄ！　（５０ｎ（Ｊ／ｄ）（Ｋｉｒｋｅｇａｒｒ
ｄとＰｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＨＤ　）を加えて、混合液
を室温でさらに１時間培養した。結合しない抗体を除去
し、プレートを前述のように洗浄し、ペルオキシダーゼ
基質溶液１００μｍ（オルソフェニレンジアミン（Ｓｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）　５０１１１／
　１００　ｘｄｌ　：Ｈ２Ｏ２，０，０３％、クエン酸
緩衝液、ｐＨ４，５）を加えた。反応は１０分後、２．
５Ｍ学濃度（４９０ｎｍ）を分光光度計で測定した。

ポジティブな試験結果を示したハイブリドーマ培養液を
増殖用に選択し、その他は棄却した。

ｒ、　　Ｖｉｎｃｅｎｔｉ＋の抗体を産生ずるハイブリ
ドーマも案出し、同じような方法でスクリーニングした
。異なる点は、Ｎ５−１の代りに、Ｓ　Ｐ　２１０マウ
ス骨簡腫細１に！　（ＡＴＣＣ−ＣＲＬＩ　５８１　）
が用いられ、マイクロタイタープレート上に固定したＴ
、　　ｖｉｎｃｃｎｔｉｉを用いて培養液をスクリーニ
ングした。さらに、ポジティブな試験結果を示した培養
液を増殖用に選択し、その他は棄却した。

実施例２ モノクローナル抗体の特異性 その特異性を決定するために、増殖した培養液の５種ま
たはＴｒｅｐｏｎｅｇ＋ｅｓと他の６種の細菌の１吻型
への結合能力を試験した。

モノクローナル抗体の特異性を決定するために用いた口
内微生物の基準株あるいは野生株のすべてはＡＴＣＣか
ら入手あるいは標準的な技術にしたがって地方の臨床サ
ンプルから分離・分類し、下記表−１にリストしである
。モノクローナル抗体はまた一８Ｓｔｐｈａ１等の記す
方法で次の微生物から抽出したＬＰＳで試験した（Ｂｉ
ｏｃｈｅｇ＋、Ｒｅｖ、９　：　１９１−１９５　（１
９８１）、Ｐｒｏ　ｒｅｓｓＡＩＩｃｒＧ　３３　：９
−３９　（１９８３）。

その開示は参考までに本文中に組み入れである。

Ｅ、ｃｏｌｉ（ＬＰＳ　　０５５：ＢＳ、０１２７８８
とＱ　ｌ　ｌ　１：　３４　）　、Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎ
ａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ（Ｆ−Ｄ、ｔＶＥｌｅ　１
　）と５ａｌｌＯｒＩＯＩＩａ　１ｉｎｎＯ８Ｏｔａ　
（Ｒｅ５９５）から抽出したＬＰＳはＣａ１ｂｉｏｃｈ
ｅｓ、ＳａｎＤｉＯｇＯ，Ｃ＾から入手した。Ｖｉｂｒ
ｉＯｃｈｏｌｅｒａｅから抽出したＬＰＳはＳｉｇｍａ
　ｃｈｅｓｉｃａ！　Ｃｏ、がら入手し）精製リビドＡ
　（Ｓ、Ｉｎ１ｎｎｅＳＯｔａ由来）はＣａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍから入手した。リビドＡはまた酸抽出も行い、Ｂ
、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからも公知の方法で精製した。

上述のように、すべての微生物をゲルタールアルデヒド
を用いてマイクロタイタープレートに交叉結合した。バ
イプリドーマ培養液の上澄み液を加えて、実施例１に記
したようにヤギ抗マウス１びを用いて結合を検出した。

表−２には、Ｔ、ｄｅｎｔｉｃｏｌａを結合する４５の
抗体（ここでは“ＴＤＥ“あるいは“ＴＤＥ“と明示し
た）およびｒ、ｖｉｎｃｅｎｔｔ＋　と結合する１２の
抗体（ＴＶＣ’）の実験結果を記るしである。

ＴＤＥ　（またはＴＤＦ）またはＴＶＣ明示の侵の数字
はクローン・ナンバーを示していて、もしあるならばハ
イフンの後の数字は亜クローン・ナンバーを示している
。表−２の“十″印は指示したモノクローナル抗体と微
生物株の間にポジティブの免疫反応が検出されたことを
示していて、“−“印はこのような反応が検出されなか
ったことを示している。

“ＮＤ“印はこの特殊反応のデータがないことを示して
いる。

１１１１１１１１１１＋１１１１１１１１Ｈ１１１１１
１１＋＋＋１ｌｌｌｌｌｌｌｌト　１１１１１１１＋’
＋＋１ｌｌｌｌｌｌｌｌト　１１１１１１１＋＋＋１ｌ
ｌｌｌｌｌｌｌ←　１１１１１１１＋＋＋１ｌｌｌｌｌ
ｌｌｌ←　ｌ　　ｌ　　ｌ＋ｌ　　１＋＋＋＋ｌ　　ｌ
　　ｌ　　ｌ　　ｌ＋ｌ　　ｌ　　１＋＋１＋＋＋１＋
＋＋＋ｌ　　ｌ　　ｌ　　＋＋＋＋＋１＋１１１１１１
＋＋＋１ｌｌｌｌｌ＋＋ｌｌ＋ｌ　　＋＋＋＋１＋＋＋
＋ｌ　　ｌ　　ｌ　　ｌ＋＋＋ｌ　　ｌ＋ｌ　　＋＋＋
ｌ　　ｌ　　１＋＋＋ｌ　　ｌ＋ｌ　　＋＋＋＋１＋＋
＋＋＋＋＋＋＋十＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋表２のデータは
、特定のｙ、ｄｅｎｔ＋ｃｏ＋ａ生物型（たとえばＴＤ
Ｅ　　０１）、或は全体としてＴ、ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ
　　（たとえばＴＤＥ　　０９）に対立するＴ、ｄｅｎ
ｔｉｃｏｌａ　、或は、Ｔ、ｄｅｎｔｉｃｏｌａに対立
するＴ、ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ　　（たとえばＴＶＣ０１
）に対し特異的なモノクローナル抗体が得られることを
示している。■、ｄｃｎｔｉｃｏｌａ及びＴ、ｖｉｎｃ
ｅｎｔｉｉに対するモノクローナル抗体を生産する雑１
細胞系統については、アメリカ基準株培養コレクション
（合衆１Ｎ２０８５２メリーランド州ロックビル、バー
クローン通１２３０１　）に委託し、それぞれＡＴＣＣ
の登録番号を割りあてた（出願番号ＴＤＦＯＩＦ４９及
びＴＶＣＯ２Ｅ１４−０１は１９８６年１１月１８日に
供託された）。

スピロヘータ種には哺乳類起源の抗原に対する抗体を誘
導するものがあることが報告されている。

この性質の反応性によりもし試料中にこのような哺乳類
の抗原が含まれていると免疫検定法に望ましくないバッ
クグランドを与えるので抗体が生成しているかを調べる
ことが重要である。

Ｈｅｐ−２細胞（ヒト上皮様Ｉ！！瘍細胞、アメリカ基
準株培養コレクション登録番号ＣＣＬ２３、ロックビル
、メリーランド州）をスライドガラス上で成長させ、ア
セトンで固定し、空気乾燥した。

スピロヘータに対する抗体を生成するハイブリドーマの
培養液を細胞の頂上に置き、１時開インキュベート後洗
浄した。そこから蛍光ヤギ抗マウスＩＱＧ＜ペンシルバ
ニア州コックネイビルのカベル研究所）を加え、さらに
１時間インキュベートした後、未結合の抗体を洗浄して
取除いた。細胞をリン酸緩衝グリセロールにのせて倒立
蛍光顕微鏡で測定した。これらの細胞と結合した抗体を
排除してから以後の微生物学的定置法を行った。

例　　４ 細菌　　構　　と結　した抗体 スピロヘータに対する抗体の結合についてざらに特性を
表わすため、に、Ｔａｂｉｎ等の方法（Ｐｒｏｃ。

よる「ウェスタン法」により結合したものの発現を検出
した。この方法では、微生物の構成分子はポリアクリル
アミドゲル電気泳動により変性し換言されて分離する。

分子量により分子は分画される。その後、ニトロセルロ
ースフィルターに移し、結合させて、モノクローナル抗
体によるブロービングに適した形にする。固定抗原に対
する抗体の結合は、酵素でラベルしたヤギ抗マウスＩａ
Ｇにより検出し、抗原の分子量で示される。各々への抗
原に対づる抗体の特異性がこの結果確立される。

洗浄したスピロヘータ（Ｔ、ｄｅｎｔｉｃＯｌａ或は１
、ＶｉｎＣｅｎｔｉ＋　）を最少量の電気泳動用！１衝
液（４％ドデシル硫酸ナトリウム（ｒｓＤｓＪ　、バイ
オランド研究所、カリフォルニア州すッチモンド）；２
−メルカプトエタノール、２０％グリセロール、０．１
２５Ｍトリス、ｐ１１６．８）に溶解し、２分間沸騰水
浴に入れた。各々の試料に２５−八で１０％ポリアクリ
ルアミドゲルによる電気泳動をゲルの染料ａｉが透明と
なるまで２〜３時間行った。

ゲルを正方形のニトロセルロース上（１５Ｘ１５α、バ
イオラッド研究所）にのせＬａｅｍｌｌ　Ｉ　ｉの方法
（イギリス、Ｎａｔｕｒｅ２２７　：６８０−６８５　
（１９７０））により、トリス−メタノール！１衝液中
で１晩３０ｍ＋八で放置し、結合したものの発現を検出
した。移された抗原を界面活性剤［トウィーン２０　Ｊ
　　（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｄｉａｏｎｏｓｔｉｃｓ、　ニュ
ーヨーク、オレンジベリー）（ｒＰＢｓ−トウィーン２
ｏ」）、ＤＨ７，４を０．０５％含むリン酸塩緩衝生ｌ
！食塩水により洗浄し、抗体を含む上ｆｆ１３ｄ中に入
れた。

１時間室温に放置後、抗原を洗浄して未結合の抗体を除
きペルオキシダーゼをラベルしたヤギ抗マウスＩＱ３ｍ
ｌを加えた。さらに１時間インキュベート後、洗浄し、
プロ、ットをペルオキシダーゼ基質溶液に移して展開さ
せた。展開したバンドの数及び位置から分子量標準と比
較検討した。

ウェスタン法によれば、クローンＴＤＥＯ１−０１は、
ウェスタン法により変性する抗原との結合を遮断してプ
ロット上で結合しない七ツクローナル抗体を生成するこ
とが示された。ＴＤＥ５４−０４は６７．０００ドルト
ンの分子量を持つ通常のトレボネーマ抗原でありＬＰＳ
ではない種と結合した。ＴＶＧＯ２−０１はＬＰＳの示
す様式を持つ様々の分子量の種と結合した。

匠−１ トレボネーマの　層　と　体の 多くのグラム陰性菌の通常の細胸壁及び膜構造に加えて
、肚江肛旦虹旦と目では外層膜を持つ。

これらの微生物に関連した抗体の多くは外層膜がある。

外層膜は洗浄剤（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉａ＋ｌｕｎ、７：２４９−２５８　（１９７３））に
より選択的に微生物から取除いた後、分画遠心によりそ
の他の成分から分離することができる。

Ｔ、ｄｅｎｔｉＣＯＩａ及びＴ、ｖｉｎｃｅｎｔｉｉか
ら分離した外層膜をマイクロタイタープレートに吸着さ
せ、抗体との結合能について調べた。外層膜分離物を炭
酸ｍｉｉ液（０，１Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．１Ｍ炭
酸ナトリウム、ｐ）１９．５）で２０μｇ／７！に希釈
し、この中から５０μｌをピペットで採取して各々のマ
イクロタイターの内壁に加えた。プレートを１晩４℃で
インキュベート後、ＰＢＳ−トウイーン２０で洗浄し、
種々の濃度の抗体溶液（ＴＤＥ５４−０４及びＴＶＣＯ
２−０１）５０μオを加えた。室温で１時間インキュベ
ート後、プレートを洗浄しペルオキシダーゼでラベルし
たヤギ抗マウスＩａを５０μｌ加えた。プレートを室温
で１時間インキュベート後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−１−ウィー
ン２０で洗浄しペルオキシダーゼ基質溶液１０μｌを加
えた。抗体結合は４９００ｉｌにおけるプレート用分光
光度計の読みから求めた。

表　　３ ■ＶＣＯ１−Ｏｆ　　　　　　　　　　　　　、＋　　
　　　　　　　　　　　　−ＴＤＥＯＩ−０１−− 丁ＤＥ５４−０４　　　　　　　　　　　　　＋　　　
　　　　　　　　　　　＋ＴＤＥ５４−０４は明らかに
どちらの微生物の外層膜上にも通常のトレボネーマ抗原
を結合する。

例　　６ トレボネーマの　−゛・ トレポネーマは濾過定量力に用いる透明切片としては不
都合な大きさとなる。微生物は長さく６〜２０μｍ）の
割には直径（０，１５〜０．２５μ而）が小さいので、
最初の分離で他の細菌と分けるためにこれを利用してい
る。そのため、スピロヘータを保持する最長の膜の孔径
（臨床試料の洗浄を容易にするために）を測定する必要
があった。利用できる膜の孔径は二０．１μ瓦；０．２
２μ瓦；０．４５μｍ及び５．０μｍであった。ＰＢＳ
−トウイーン２０中のＴ、ｄｅｎｔｉｃｏｌａ１０００
万を各々のフィルターに加えた。懸濁液を真空濾過して
微生物を固定した。懸濁液はＰＢＳトウーン２０で２回
洗浄し、スピロヘータに対する抗体を加えた。１時間イ
ンキュベート後、プレートを再度洗浄し、ペルオキシダ
ーゼでラベルしたヤギ抗マウス■ｇＧを添加した。再度
インキュベート及び洗浄後、酵素基質（−１００μｌ）
を加え、４９０ｎｌにおける吸光度を測定した。意外に
も０．４５μｍのフィルターでもスビＯへ一部を保持す
る効力は０．２２μｍのものと同様であった。０．１μ
ｍと５μｍのフィルターは不適当であるとされた。

臨床試料の洗浄を容易にするために最適な孔径を求める
ため微生物の量を変えてスパイクしたプラーク試料２４
ｉ＆ｌを０．４５μｍ及び０．２２μ風のフィルターの
マイクロタイターの穴に置いた（「ミリタイター」、ミ
リポアＣＯ８，マサチューセッツ州ベッドフォード）、
試料を上記のようにフィルター上で吸引した後洗浄した
。フィルターには栓ができる徴候がみられた。０．２２
μｍのフィルターでは、最低濃度の微生物を除くすべて
に栓ができたが、一方０．４５μｍのフィルターでは、
すべてのプラーク試料を添加した後でも緩衝液を通すこ
と、ができた。ヤギ抗マウスＩＧＧを各々の細胞に加え
、３回洗浄模、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて固定
プラークに関連した非特異的なバックグランドレベルを
測定した。

０．２２μｍのフィルターでは、すべての穴がバックグ
ランドが高くて満足のいくものではなかった。０．４５
μ扉のフィルターではすべての穴がバックグランドがご
くわずかであるか、まったくなかった。数個の穴にみら
れたわずかなバックグランドは、穴の中で固定された微
生物の数とは関連がみられなかった（相関係数−０，０
８９）。

スピロヘータを用いた免疫濾過定量法の有効さを調べる
ためにＰＢＳ−トウイーン２０　１００μ！中に１［菌
１０６個を入れた溶液を抗スピロヘータモノクローナル
抗体の種々の希釈液１００μｌを加え、室温で１５分間
インキュベートした。

混合物を次に０．４５μｍのミリタイタープレートの穴
の中に加え、ＰＢＳ−トウイーン２０で３回洗浄した。

ヤギ抗マウスＩｇＧを５０μｌ加え、室温で１５分間イ
ンキュベートした。プレートを上記のように３回゛洗浄
し、ペルオキシダーゼ基質溶液を１００μｌ加え、４９
０ｎ−における吸光度を測定した。４９０　ｎｍの吸光
度に対し細菌濃度の対数をプロットして得られた希釈曲
線によればこの定量法は１試料につき約５×１０３から
１．５×１０５の間の細菌数の時に最高感度を示すこと
がわかった。

例７ スパイクしたプラーク　料を用いた免疫濾過定１基 歯周疾患の見られない個体のプラーク試料はｉｔｓｔｇ
ａｒｔｅｎ等の方法（Ｊ、Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ、８
　：　１２２（１９８１））により得、Ｔ、　　ｄｅｎ
ｔｉｃｏｌａ及びＴ、　ｖｉｎｃｅｎｔｉｉの数をいろ
いろ変えてスパイクした。抗スピロヘータモノクローナ
ル抗体１００μｌを加え、室温で１時間試料をインキュ
ベートした。これを０．４５μ卯のミリタイタープレー
トの穴に移して、例６と同様に固定した。固定されたプ
ラークをＰＢＳ−トウイーン２０で３回洗浄し、ペルオ
キシダーゼでラベルしたヤギ抗マウスＩｏＧ１００μオ
を、加えた。さらに３０分間インキュベートした後、未
結合の抗体を除去し、上記のとおりに穴を３回洗浄した
。ペルオキシダーゼ基質溶液１００μオを加え４９０ｎ
１１における吸光度を測定した。吸光度から求められた
スパイクした試料中のスピロヘータ数と位相差顕微鏡分
析により求められたスピロヘータ数との間の相関係数は
０．８７３であり、すなわち許容限界内であつだ。

ｃｔｓｔｇａｒｔｅｎ等の方法により５２４例のプラー
ク試料を得て、スピロヘータ数について評価した。

これらの試料について次に上述のＴＤＥＯＩ−０１抗体
を用いて免疫濾過定量法を行った。

プラーク試料をメンブランフィルタ−付きのマイクロタ
イタープレート中で固定し、Ｐ８Ｓトウイーン２０を用
いて３回洗浄した。モノクローナル抗体ＴＤＥＯＩ−０
１（５０μ！）を各々の穴に加えて、室温で１時間イン
キュベートした。上述の方法でさらに洗浄後、ペルオキ
シダーゼでラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ（５０μｌ）
を加えさらに１時間インキュベートした。再度穴を洗浄
し酵素基質を加えた。各々の穴の吸−光度を測定し、吸
光度が負の試料とわかっているグループを越えた時に正
と評価した（平均吸光度（４９０ｒｖ）＋２標準偏差）
。次の表４に示す結果より、免疫濾過定量法は長く手間
のかかる暗視野顕微鏡法とよい相関があることが明らか
となった。

匠旦 モノクローナル抗体を上述のとおりに分離し、これらは
、各々次の種に対し特異的であった：ＨａｅｌＯｐｈｉ
　ｌｕｓ　　組肚肚旦Ｉｕｓ、このような抗体を生成す
るハイプリドーマ細砲系の細菌源及びＡＴＣＣ登録番号
については表５に示す。ＬＰＳに対し特異性を持つ各々
の種のモノクローナル抗体については上述の各々の３種
類の方法で測定した。

１）例１で述べた既知の細胞株、野生株、抽出されたＬ
ＰＳ及びリビドＡの免疫活性は、例６で述べた免疫濾過
定量法又は、Ｄａｗｓｏｎ、　Ｈ，（Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｒｅｐｏｒｔ　Ｎｏ、　６．１９８４．７月、Ｐａｎｄ
ｅｘ研究所）及びＨａＳＳＯｎ、　Ｐ、　Ｌ、等（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ±−Ｊ１Ｌロ巴工幻伎−１ｔａｎｇｏｎｅ等
、ｅｄｓ、Ｖｏｌ　７４　：１０６−１３９　（１９８
１））の方法により、「パンデックス」免疫定ｍ用プレ
ート（カタログ番号２２−０１０−１、パンデツクス研
究所、イリノイ州シカゴ）を用いた粒子計数蛍光免疫定
量法によっても結合したものの発現を検出した。

２）細胞溶解質全体のウェスタン法及び３）精製したＬ
ＰＳを用いた例１に述べたＥＬＩＳＡ免疫定量法。

ｒｘｌｏ：ＩｃＯ口　　口 ａ：１ａｌｌｌｃｏａ）ａ：ｌ ｒ　　　　　ｒ　　　　　ｒ　　　　　ｒ　　　　　ｒ
吠　　吠　　吹　　叩　　に ！１　　　−　　　　Ｆ　　　　−７１ｒ　　　ｒ　　
　ｒ　　　ｒ　　　ｒ Ｊ＃　　壮　　壮　　壮　　計 Ｃｏ（ＯＣＯＣＯＣＯ の　　の　　の　　の　　の ■■■Φ■ ｊ＞　　　ｒ　　　Ｆ”　　　ｒ　　　ｒ　　　ｒｌ　
　／　／　Ｉ　、／ 例　　１０ モノクローナル抗体を分離し、評価されたすべてのグラ
ム陰性の口腔内微生物に対し免疫学的に活性なものを選
択した。これらの抗体は免疫原としｒＢ、ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ（ＡＴＣＣ３３２７７）を用いて上記の方法に
より分離した。このような抗体を生成するハイプリドー
マＩｆ胞系は、ＡＴＣＣに委託され、登録番号を与えら
れてぎた（出願番号ＢＧＮ５８Ｆ４３．１９８６年１１
月１８日に供託された。

この細胞系が生成するモノクローナル抗体は、例１に述
べた基準株、野生株、抽出したＬＰＳ及びリビドＡを含
む、調４べたグラム陰性の口腔内微生物すべてに対し交
差反応性がみられた。

このモノクローナル抗体が作用するエピトープは上述の
ウェスタン法によりＬＰＳであることがわかった。

例　　１１ 上述のモノクローナル抗体は、水沫と２０人の歯周疾患
の患者の臨床的評価及び同じ患者について嫌気培養法に
よる微生物相の評価の両方との相関を求めるために用い
た。

プラーク試料はすでに述べた方法で入手し、あらかじめ
嫌気的に殺菌した（　ＩＰＲＡｓＪ　）希釈剤中に分散
し、以下のように分離して、殺菌したＰＢＳで１：１０
０に希釈した。希釈試料の１／２ｄを次に殺菌したガラ
ス棒を用いて１５０冒の培養プレートの表面に広げた。

嫌気性菌培地■（Ｄｉｅｅｄ、　Ｉｎｃ、　、ミネソタ
州ミネアポリス）を１ユニ立倶団ｃｉｌム胚、　１卦ユ
」工１幻口」よ及びＦｕＳＯｂａＣｔｅｒｉＬｌｏｌの
培養に用いた。変形チョコレート寒天（ＤｉＨｃｄ、　
Ｉｎｃ、　、ミネソタ州ミネアポリス）を１旧」舌上ｈ
ｉ堕」−培養に用いた。嫌気性菌培地Ｉのプレートは３
７℃で嫌気的に１０日間インキユベートシた。チョコレ
ート寒天のプレートは３７℃において１０％炭酸ガス（
空気９０％）中で３〜４日インキュベートした。種の確
認はすべて４ｏ１ｆｆ等が述べた方法（Ｊ、Ｐｅｒｉｏ
、Ｒｅｓ、　２０　：　２３７−２５０　（１９８５）
）により行った。この発表は以後参考文献と合併される
。トレボネーマについては、これらの微生物での培養が
国号であったため行わなかった。

ＰＲＡＳ希釈剤は次の方法で調製した：水２００ｄにゆ
っくり加える ０、２ｇ塩化カルシウム ０．２ｇ硫酸マグネシウム７水塩 水５００ｍにゆっくり加える １、０ｇリン酸水素二カリウム １．０ｇリン酸二水素カリウム ２．０ｇ塩化ナトリウム １０．０ｇ炭酸水素ナトリウム ２つの溶液を混合し、水２００ａｅを加える、混合溶液
から４００〆を、取り、 水４００ｍ１！ １．６ｇゼラチン（Ｄｉｒｃｏ、Ｍｌ、デトロイト）３
．２ｄｌｌ素指示薬（０，０−２５％レサズリン”　Ｄ
ｉｒｃｏ） ｏ、４ｇシスティン塩酸塩を加える。

濃塩酸を用いてｐＨを６．６に調整する。溶液を嫌気性
フード内に入れ２４時間放置する。そして無菌状態で殺
菌した薬びんに２０ｄずつ入れふたをする。

２０人の患者から得た試料をＨｃＡｒｔｈｕｒ等が述べ
た方法（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ、　Ｂ
　：　６８４−６９０　（１９８６））によりコロニー
に印をつけ、例６で述べた免疫濾過定量法も行った。コ
ロニープロット法により検査した５種の口内微生物の各
々の比率は次の式のようにＬＰＳを含む細胞の割合とし
て表わした。

各々の抗体についてのこれらの割合を各々の方法により
測定しくすなわらコロニープロット法及び免疫濾過定量
法）、この２つの割合をもう一方のものに対してプロッ
トした。最も適する曲線を一次回帰分析法により求めた
。次にこれらの値開の相関係数についてＰｉａＺＺａ等
（ＩｌｌｌＵｎＯＩＯ（ｌｌｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ　　
（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ等、、ｅｄｓ、）ＶＯｌ、１．Ｅ
）Ｉ）４１９−４５６　（１９７９）、）の方法に基ず
いて求め表６に示した。

表　　６ ０内微生物　　　　　　　　相関係数 コロニープロット法 対 Ｂ、　ｇｉｎｇｉＶａｌ　ｉｓ　　　　　　　　　　　
　　　　、７９４Ｂ、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ　　　　
　　　　　　　　　　、８５ＧＬ」虫阻助工ｌｕｓ　　
　　　　　　　　　、８１４Ｆ、ｎｕｃｌｅａｔｕａ＋
　　　　　　　　　　　　　　　　、６９３これらの結
果から水沫は、口内微生物の同定及び比較に関しては従
来の培養法とよく相関（Ｐ≧０．００５）することが示
された。

種々の変法及び教法が水沫の展望及び意図からはなれず
に出てくるであろうが、水沫はここに示された具体例に
のみ限られたものでないことを理解すべきである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）歯周疾患に関係する微生物相の存在に関して口内
   サンプルを評価する方法において次の過程を包含するこ
   とを特徴とする口内サンプルの評価法： （ａ）抗体の使用により、上記口内サンプルの１ケまた
   はそれ以上の特異的口内微生物の量を測定する、 （ｂ）抗体の使用により、上記口内サンプルのグラム陰
   性口内微生物の対照グループの量を測定する、及び （ｃ）上記の対照微生物の量と上記特異的口内微生物を
   比較する。
2. （２）特許請求の範囲第１項において、上記特異的口内
   微生物が￥Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、￥￥Ｂａｃ
   ｔｅｒｏｉｄｅｓ、￥￥Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、
   ￥￥ｌｌａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ￥と￥Ｔｒｅｐｏｎｃｍ
   ａ￥属からなるグループから選別されて、過程（ａ）の
   上記抗体がモノクローナル抗体である方法。
3. （３）特許請求の範囲第２項において、上記特異的口内
   微生物が￥Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ￥￥ａｃｔｉ
   ｎｏｍｙｃｅｔｕｍｃｏｍｉｔａｎｓ、￥￥Ｂａｃｔｅ
   ｒｏｉｄｅｓ￥￥ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、￥￥Ｂａｃｔ
   ｅｒｏｉｄｅｓ￥￥ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、￥￥Ｆｕ
   ｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥￥ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、￥￥
   Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ￥￥ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ、
   ￥￥Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ￥￥ｄｅｈｔｉｃｏｌａ￥およ
   び￥Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ￥￥ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ￥の種
   からなるグループから選別されて、上記特異的口内微生
   物がＡＴＣＣ添付ナンバーＨＢ９６２８、ＨＢ９２６９
   、ＨＢ９２７０、ＨＢ９２７１、ＨＢ９２７２、ＨＢ９
   ２７３およびＨＢ９２７４のハイブリツド細胞系により
   産生したモノクローナル抗体によりそれぞれ検出される
   ことをさらに特徴とする方法。
4. （４）特許請求の範囲第２項において、上記モノクロー
   ナル抗体がリポポリサツカライド（またはリポ多糖）に
   特異的であることをさらに特徴とする方法。
5. （５）特許請求の範囲第１項において、上記対照微生物
   が上記サンプルにおいてすべてのグラム陰性微生物を含
   有して、上記対照微生物の量が単一のモノクローナル抗
   体の使用によつて測定されることをさらに特徴とする方
   法。
6. （６）歯周疾患に関係する微生物相の存在に関して口内
   サンプルを評価するキツトで、上記キツトが （ａ）特異的口内微生物に１ケまたはそれ以上の抗体、
   および （ｂ）グラム陰性口内微生物の対照グループに１ケまた
   はそれ以上の抗体 を包含することをさらに特徴とするキツト。
7. （７）特許請求の範囲第６項において、上記特異的口内
   微生物が￥Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、￥￥Ｂａｃ
   ｔｅｒｏｉｄｅｓ￥￥Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、￥
   ￥Ｈａｅｍｏｐｈｉ１ｕｓ、￥および￥Ｔｒｅｐｏｎｅ
   ｍａ￥属からなるグループから選別されて、上記特異的
   口内微生物および上記対照微生物への上記抗体がモノク
   ローナル抗体であることをさらに特徴とするキツト。
8. （８）特許請求の範囲第７項において、上記特異的口内
   微生物が￥Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ￥￥ａｃｔｉ
   ｎｏｍｙｃｅｔｕｍｃｏｍｉｔａｎｓ、￥￥Ｂａｃｔｅ
   ｒｏｉｄｅｓ￥￥ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、￥￥Ｂａｃｔ
   ｅｒｏｉｄｅｓ￥￥ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ￥￥Ｆｕｓ
   ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥￥ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、￥￥Ｈ
   ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ￥￥ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ、￥
   ￥Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ￥￥ｄｅｎｔｉｃｏｌａ￥および
   ￥Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ￥￥ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ￥種から
   なるグループから選別されて、上記特異的口内微生物へ
   の上記モノクローナル抗体がＡＴＣＣ添付ナンバーＨＢ
   ９２６８、ＨＢ９２６９、ＨＢ９２７０、ＨＢ９２７１
   、ＨＢ９２７２、ＨＢ９２７３、およびＨＢ９２７４の
   ハイブリツド細胞系により産生されることを、さらに特
   徴とするキツト。
9. （９）上記キツトが１種またはそれ以上のグラム陰性口
   内微生物に特異的な１ケまたはそれ以上のモノクローナ
   ル抗体を、およびすべてのグラム陰性口内微生物に特異
   的な１ケまたはそれ以上のモノクローナル抗体を包含す
   ることを特徴とするキツト。
10. （１０）特許請求の範囲第６項において、上述のキツト
    が上記抗体の（ａ）部および上記抗体の軸部への酵素結
    合抗体を、および上記酵素結合抗体の上記酵素の基質を
    包含することをさらに特徴とするキツト。