JP2505963B2 - 歯周疾患に伴う微生物の検出方法及びそれらに有用なキット - Google Patents

歯周疾患に伴う微生物の検出方法及びそれらに有用なキット

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、診断試験キット及び歯
周疾患に伴う微生物の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】医療分野において、生物学的流体中に低
濃度で存在する生物学的物質の迅速、正確及び定性的又
は定量的な検出に関する研究及び診断方法の必要性が、
依然として存在する。
【０００３】特定の微生物は、ヒト及び動物の各種の歯
周疾患、例えば、歯肉炎及び歯周炎に対する指標として
関連付けられてきた。このような疾患の重大性は、特に
長生きしている人々のような世代のヒトにとってますま
す重要性が増してきたので、このような疾患の予防は著
しく重要性が増大してきた。
【０００４】歯周疾患に伴う微生物の検出における技術
分野での促進が、ヨーロッパ特許第Ａ−０，４３９，２
１０号明細書に記載されている。このケースは、微孔質
濾過膜の限定領域で水不溶性試薬を用いるイムノメトリ
ックアッセイにおいて、これらの微生物、詳細には、ア
クチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃ
ｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリ
ス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ）及びプレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔ
ｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）の同時検出並びに区
別を記載している。これらの微生物の同時検出及び区別
は、相当な臨床的及び商業的意義を有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記と同様のアッセイ
が、上記微生物を検出する際に当該技術分野において重
要な進歩を表すとはいえ、或る場合では、特に臨床被検
体を試験する場合に、許容しがたいバックグラウンドが
得られた。また、既知界面活性抽出組成物は、目的の微
生物のすべての血清型由来の抗原を適切に抽出できなか
ったことが認められた。この課題は、特定のアニオン界
面活性剤と混合されたカチオン界面活性剤の高pH溶液
を、抽出組成物として用いることにより解決された。
【０００６】しかしながら、微生物間で区別するための
若干の臨床被検体のアッセイにおいて、ある種の微生物
が検出しようとする別の種よりも比較的高濃度で存在す
る場合に、偽陽性が得られていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この課題は、下記工程を
含んで成る歯周疾患に伴う微生物の検出方法を用いて解
決される。 Ａ．歯周疾患に伴う微生物由来の抗原を、少なくともpH
８に緩衝化された抽出組成物を用いて抽出する工程、 Ｂ．抽出組成物を、pH８．５から１１．５であり且つ十
分な量の非免疫反応性遮断性タンパク質を必須に含んで
成る遮断性組成物と混合させて、少なくとも０．２重量
パーセントのタンパク質を有する混合物を提供する工程
であって、前記タンパク質が乳タンパク質もしくは酵素
であり、タンパク質の遮断的性質が混合物の高いpHもし
くはそこに存在するいかなる界面活性剤によっても悪影
響を受けないことを特徴とする工程、 Ｃ．工程Ｂで生成された混合物のpHを８．５から１１．
５に維持しながら、混合物を抗原に特異的な抗体と接触
させて免疫学的複合体を生成させる工程、並びに Ｄ．複合体を検出する工程。
【０００８】また、本発明は、個別に包装された （ａ）少なくともpH８に緩衝化された抽出組成物、 （ｂ）歯周疾患に伴う微生物に特異的な水溶性抗体、及
び （ｃ）pH８．５から１１．５であり且つ非免疫反応性遮
断性タンパク質を必須に含んで成る組成物であって、前
記タンパク質がpH８．５から１１．５で安定である乳タ
ンパク質もしくは酵素である組成物、を含んで成る診断
試験キットを提供する。
【０００９】
【具体的な態様】本発明は、歯周疾患に伴う１つ以上の
微生物の存在を迅速かつ高感度で測定するのに使用でき
る。詳細には、アクチノバシラス・アクチノマイセテム
コミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ポルフィロモ
ナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ）｛以前はバクテロイデス・ジンジ
バリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ）として既知である｝及びプレボテラ・インターメデ
ィア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）
｛以前はバクテロイデス・インターメディアス（Ｂａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）として既
知である｝が、本発明を用いて別個にあるいはひとまと
めにして検出又は区別できる。しかしながら、また、歯
周疾患に伴うと推測される別の微生物が、本発明を用い
て検出又は互いに区別できる。限定されるものではない
が、このような別の微生物としては、ウォリネラ・レク
タ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｒｅｃｔａ）、バクテロイデ
ス・フォルシタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｏｒｓ
ｙｔｈｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅ
ｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、フソバクテリウム・ヌ
クレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅ
ａｔｕｍ）及びトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐ
ｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）が挙げられる。その
ままの状態の微生物が本発明で検出できるとはいえ、宿
主生物体由来の目的の検出可能な抗原（例えば、リポ多
糖類、莢膜抗原もしくは外膜タンパク質）を抽出するこ
とは好ましい。このような抗原は、唾液、咽喉もしくは
口腔由来の粘液、ヒトもしくは動物の組織抽出物、歯肉
組織、歯垢又は歯肉溝流体より抽出できる。
【００１０】上記微生物からの抗原抽出は、適する物理
的もしくは化学的手段、例えば洗浄剤（例えば、デオキ
シコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムもしく
はデシル硫酸ナトリウム）を用いて、既知方法に従って
達成できる。
【００１１】好ましい抽出方法は、カチオン界面活性剤
及びアニオン界面活性剤の高pH組成物を用いる具体例に
関連して以下に具体的に説明される。
【００１２】所望であれば、抽出された抗原はオリジナ
ル被検体より取り除かれ、又はオリジナル被検体が緩衝
剤もしくは水で適当に希釈でき、あるいは外来物質を除
去しそしてアッセイに際して抗原と対応する抗体の複合
体化を促進するために濾過できる。しかしながら、抽出
された抗原の更なる処理がどのようなものであっても、
得られる混合物のpHを８より下に低減することなく、そ
れが非免疫反応性遮断性タンパク質（下記）を含む遮断
性タンパク質と混合されることが本発明の利点である。
必要であれば、適する高pH緩衝剤もしくは塩基を混合物
に添加してpHを高めに維持できる。好ましくは、得られ
る混合物がpH約８．５〜１１．５である。
【００１３】抽出組成物は、抗原抽出前に、その間に又
はその後のどこかで、本明細書に記載された遮断性組成
物と混合される。好ましくは、それらは抗原が抽出され
た後に混合される。一般的には、混合は、数秒間穏やか
に攪拌しながら室温で或る組成物を別のものへ添加する
ことにより実施される。所望であれば、次いで適当な塩
基又は高pH緩衝剤を添加して高いpHを維持できる。
【００１４】従って、抽出された抗原は、抗体との抗原
複合体化前に、或る時点で、高pHで、１つ以上の非免疫
反応性遮断性タンパク質と混合される。一般的には、遮
断性タンパク質は、高濃度の或る抗原（例えば、プレボ
テラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎ
ｔｅｒｍｅｄｉａ）及びポルフィロモナス・ジンジバリ
ス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ）より抽出された抗原）の交差反応を低減又は排除す
る。一般的には、それらはpH６〜１１の水性緩衝液の状
態で供給される。この緩衝化遮断性溶液中のタンパク質
の濃度は、０．４〜７重量パーセントまで変化でき、次
いで当業者は、混合物の総重量に基づいて少なくとも約
０．２パーセントの量でタンパク質が存在するように抗
原との混合物を提供するのに、どの程度の量を使用すべ
きであるか決定できる。好ましくは、非免疫反応性遮断
性タンパク質が、得られる抽出された抗原との混合物中
に、０．２〜１重量パーセントの量で存在する。
【００１５】有用な非免疫反応性タンパク質としては、
血清タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、フィブ
リノーゲン及びフィブロネクチン）、カゼイン及び別の
乳タンパク質類、プロテアーゼ類を初めとする各種の酵
素類、所望の結果を提供するかどうか調べるために容易
に試験できる別のタンパク質類が挙げられる。このよう
な試験は、タンパク質が分解されるかどうか調べるため
に、次いで下記例１に記載のようにアッセイの際に遮断
性タンパク質としてそれを使用するために、約１０分
間、適量のタンパク質をいずれか適当な界面活性剤（例
えば、カチオン界面活性剤及びアニオン界面活性剤の混
合物）のpH８の溶液に入れる工程を包含するであろう。
アッセイの結果が、多数の微生物細胞（約１×１０8 細
胞数／mL）に伴う高い抗原濃度で交差反応の低減又は排
除を示す場合には、そのタンパク質は遮断性タンパク質
として有用である。
【００１６】このようなタンパク質は、それらが目的の
抗原あるいはそれに対する抗体のどちらかと特異的に複
合体化しないので、「非免疫反応性」である。
【００１７】特に有用な遮断性タンパク質としては、高
いpH及び高い界面活性剤濃度で必要な安定性を有するプ
ロテアーゼ類が挙げられる。このような特性を有するプ
ロテアーゼは、まさにいくらもない。このようなもの
は、微生物類（例えば、細菌及び真菌）、動物もしくは
ヒトの器官（例えば、膵臓）並びに植物を包含する数多
くの供給源のいずれかより得ることができる。また、プ
ロテアーゼ類は、世代交代微生物類及び多くの市販品よ
り入手できる。
【００１８】高度に安定なプロテアーゼ類は、文献、例
えば、米国特許第４，９１４，０３１号明細書に記載さ
れている。一般的には、このような材料は、より短い配
列の一方もしくは両方のアミノ酸残基が、異なるアミノ
酸の残基（例えば、セリンもしくはアスパラギン酸）に
より削除又は置換される１つ以上のＡｓｎ−Ｇｌｙアミ
ノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列を担持するバシラス
・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
プロテアーゼの類似体であるサブチリシンプロテアーゼ
類である。１０９番目及び２１８番目のどちらかもしく
は両方の位置においてアスパラギン酸残基（Ａｓｎ）が
セリン残基で置換されることは特に望ましい。このよう
な適するプロテアーゼの更なる特徴づけが、上記特許に
見いだされる。
【００１９】最も好ましいプロテアーゼは、上記特徴を
有するが、更に負に苛電したアミノ酸で置換されたアミ
ノ酸配列中に存在するカルシウムバインディング部位に
１つ以上のアミノ酸残基を担持する。例えば、配列の７
６番目の位置のアスパラギンアミノ酸残基は、非常に有
利にするためにアスパラギン酸に置換できる。このよう
なプロテアーゼ類の製造方法は上記特許に記載されてい
る。
【００２０】或る非常に有用なプロテアーゼがＡＭＩＤ
ＥＫ １３１の商標でＧｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ（ロチェスター，ニューヨーク）により
市販されている。
【００２１】遮断性組成物は、必須の成分として上記非
免疫反応性タンパク質のみを有するが、それは、塩類、
例えば、塩化ナトリウム及び塩化カルシウム、アジ化ナ
トリウム並びにジオール類、例えばプロパンジオール
（プロテアーゼ安定性を助長するのに有用である）を包
含する１つ以上の任意の成分を包含できる。
【００２２】抽出された抗原及び非免疫反応性タンパク
質の混合物のpHを低減することなく（そして恐らく高い
pHを維持するために適当な高pH緩衝剤もしくは塩基を添
加することにより）、次いで混合物は抽出された抗原に
特異的な抗体と接触して免疫学的複合体を生成する。こ
れは、多種多様なアッセイフォーマット（下記により詳
細に記載されている）で実施できる。
【００２３】本発明の粒子に有用な抗体はモノクローナ
ルもしくはポリクローナルであることができる。モノク
ローナル抗体は標準的方法を用いて製造できる。また、
ポリクローナル抗体も標準的方法を用いて製造できる。
一般的には、高度に特異的なポリクローナル抗体を提供
するための好ましい方法は、第１回目に免疫量の抗原を
哺乳動物に注射し、第２回目に促進量の抗原を第１回目
の後第２及び第１４日目の間に哺乳動物に注射し、そし
て第１回目の注射後から始めて第１５日目に、７日間の
単位で少なくとも４回の期間に７日毎に少なくとも３
回、促進量の抗原を哺乳動物に注射する工程を要する。
免疫量及び促進量は、当業者により容易に決定できる。
最終の促進量注射後、抗血清は哺乳動物より取り出され
る。
【００２４】抗原及び抗体の免疫学的複合体の生成は、
数多くの方法のいずれかを用いて達成でき、そして以下
に詳細に記載される「サンドウイッチ」アッセイが最も
好ましいとはいえ、本発明が特定の方法に限定される訳
ではない。
【００２５】或る態様では、抽出された抗原は、固形支
持体、例えば、ポリマーもしくはガラスの粒子類、濾過
膜類、セルロース製フィルターペーパー類、固体ポリマ
ーもしくは樹脂コートフィルム類、ガラス製スライド類
もしくは試験管のガラス壁、ガラスもしくはポリマーキ
ュベット類並びに普通の当業者により容易に検出可能な
別の支持体類に、直接付着又は共有結合によって不溶化
できる。一般的には、このようなアッセイは、抗原が直
接支持体に結合し、そして不溶化された抗原と複合体化
させるために抗体が用いられることによる、「直接バイ
ンディング」アッセイとして当該技術分野で既知であ
る。抗体は、検出可能な複合体を生成するために直接標
識できるが、又、複合体は、適当に標識されかつ最初の
未標識抗体に特異的である抗体を用いて検出できる。
【００２６】本発明の好ましい態様は、抗体の一方が水
不溶性支持体上に固定化されており（又は、例えばアビ
ジン−ビオチンもしくは別の特異的バインディング反応
を介して固定化可能であり）、そしてもう一方の抗体が
水溶性かつ検出可能に標識されているような２つの抗体
と、抽出された抗原が、異なる抗原決定部位で反応する
イムノメトリックもしくはサンドウイッチアッセイであ
る。或る抗体が固定化されるのに適する支持体として
は、直接バインディングアッセイについて先に記載のも
のが挙げられる。好ましくは、有機体類、天然もしくは
合成ポリマー類、ガラス、セラミック類、珪藻土もしく
は磁性粒子類が用いられる。これらの粒子は、より好ま
しくはポリマー製球状形のものであり、そして約０．０
１〜１０μｍの平均粒子サイズを有する。
【００２７】抗体は、水不溶性免疫学的試薬を生成する
ために、材料の表面上に反応性基との付着又は共有結合
反応を包含する物理的もしくは化学的方法により粒子キ
ャリヤー材料に付着できる。共有結合は最良のアッセイ
感度を得るのに好ましい。
【００２８】特に有用な粒状キャリアー材料は、例え
ば、活性ハロ原子、活性化２置換エチルスルホニル基も
しくはビニルスルホニル基を有する１種以上のエチレン
系不飽和重合性モノマーから製造されるヨーロッパ特許
第Ａ ０，３２３，６９２号明細書に記載されるポリマ
ービーズである。別の特に有用な反応性カルボキシ基を
有する粒子が、ヨーロッパ特許第Ａ ０，４６６，２２
０号明細書に記載されている。
【００２９】より好ましくは、上記免疫学的試薬が、化
学的もしくは生物学的反応に不活性である微孔質濾過膜
上に塗布又は堆積される。特に有用な材料は、処理又は
未処理ポリアミド微孔質膜である。
【００３０】一般的には、膜は最大寸法における平均細
孔サイズが０．４〜５μｍであるとはいえ、生成される
複合体が膜上に残存しそして流体排液に悪影響を及ぼさ
ない限り、より小さな又はより大きな細孔が許容される
であろう。適当な抗体を有する水不溶性免疫学的試薬
は、膜の全表面上に亘って又はそれらの限定領域で膜に
付着できる。
【００３１】膜は、アッセイにおいて手で支えてそれら
の上に抽出された抗原及び抗体の複合体化に要する部位
を提供できる。しかしながら、好ましくは、膜が使い捨
て試験デバイス又は膜及びそれらを介して流動される流
体を保持するのに適する構成及び構造を有する物に設置
又は取り付けられる。特に有用な試験デバイスは、商標
ＳＵＲＥＣＥＬＬ試験デバイスとしてイーストマン・コ
ダック・カンパニーより市販されているものである。
【００３２】一度、抗原及び抗体の水不溶性複合体が生
成されると（好ましくは膜上に）、複合体を検出する前
に複合体化されていない材料を取り除くために、複合体
は適当な洗浄組成物で洗浄される。検出方法に依存し
て、次いで水不溶性複合体は数多くの標準試薬及び方法
を用いて検出できる。例えば、複合体は、トレーサー類
もしくはシグナル生成性標識を用いずに当該技術分野で
既知である光散乱方法を用いて検出してもよい。
【００３３】しかしながら好ましくは、アッセイフォー
マットが直接バインディングアッセイもしくはイムノメ
トリックアッセイのいずれであろうと、免疫学的複合体
が抗体上の検出可能な標識により検出される。限定され
るものではないが、このような標識としては、酵素類、
アビジン、ビオチン、放射性同位体類、蛍光源類及び色
素源類が挙げられる。放射性同位体類、酵素類及びビオ
チンが好ましい。酵素類がより好ましく、それらは比色
測定、蛍光測定もしくは化学ルミネッセンスシグナルを
発生させるのに使用できる。
【００３４】好ましいイムノメトリックアッセイでは、
或る時点で抗原を検出可能に標識された水溶性抗体と接
触せしめる。これは、免疫学的複合体の生成の前に、そ
れと同時に又はそれに次いで起こすことができるが、一
般的には、本発明の洗浄組成物で洗浄する前に行われ
る。従って、抗原及び２つの抗体の複合体は、複合体化
されなかった材料が洗い流される時に好ましい膜上に残
留する。このサンドウイッチ複合体の生成及び洗浄後、
一般的に先に記載されるような試薬及び方法を用いて検
出が行われる。
【００３５】歯周疾患に伴う微生物の好ましい検出方法
において、上記方法は下記工程を含んで成る。 Ａ．歯周疾患に伴う微生物由来の抗原を、pH８．５〜１
１．５に緩衝化された抽出組成物を用いて抽出する工
程、 Ｂ．工程Ａにおける抽出の前に、それと同時に又はその
直後に、抽出組成物のpHを８より下に低減することな
く、抽出組成物を、十分な量の非免疫反応性遮断性タン
パク質を必須に含んで成る遮断性組成物と混合させて、
少なくとも０．２重量パーセントのタンパク質を有する
混合物を提供する工程であって、タンパク質の遮断的性
質が混合物の高いpHもしくはそこに存在するいかなる界
面活性剤によっても悪影響を受けないことを特徴とする
工程、 Ｃ．工程Ｂで生成された混合物を、抽出された抗原に特
異的な抗体を付着した水不溶性粒子を含んで成る水不溶
性試薬を表面上に有する微孔質濾過膜と、その膜表面の
分離区域で接触させて、その区域で水不溶性複合体を生
成させる工程、 Ｄ．工程Ｂの後であるが、工程Ｃにおける接触の前に、
それと同時に又はその直後に、抽出された抗原を、抽出
された抗原に特異的な検出可能に標識された水溶性第２
抗体と接触させて、膜上の区域に、微生物に特異的な検
出可能に標識された水不溶性サンドウイッチ複合体を生
成させようとする工程、 Ｅ．複合体化されなかった材料を、膜を介して洗浄する
工程、並びに Ｆ．膜上の区域内の標識された水不溶性サンドウイッチ
複合体を検出する工程。
【００３６】より好ましくは、上記方法が、複数のこの
ような微生物の同時検出もしくは区別に有用であり、上
記方法では、膜は、目的の特定の微生物抗原の各々につ
いて別個の水不溶性試薬を含有する複数の別個のかつ独
立した区域を有する。
【００３７】本発明に有用な本明細書に記載される非免
疫反応性遮断性タンパク質の溶液は、単独で又は使い捨
て試験キットの一部として給供できる。このような試験
キットは、限定されるものではないが、少なくとも約pH
８に緩衝化された抽出組成物を包含する数多くの個別に
包装されたキット成分を有すると、一般的には先に記載
されている。
【００３８】
【実施例】以下の例では、特に断らない限り、すべての
パーセンテージは重量パーセントである。
【００３９】具体例の材料 ３つの試験ウェル中に組み入れられたＬＯＰＲＯＤＹＮ
Ｅ（商標）ナイロン微孔質濾過膜（平均細孔サイズ１．
２μｍ）を含有するＳＵＲＥＣＥＬＬ（商標）使い捨て
試験デバイスを用いた。膜は、いずれか更なる処理を施
すことなく用いた。
【００４０】色素提供性組成物Ａは、４，５−ビス（４
−メトキシフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４
−ヒドロキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（０．
００８％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン
酸ナトリウム緩衝剤（１０ミリモル、pH６．８）、過酸
化水素（１０ミリモル）、４′−ヒドロキシアセトアニ
リド（０．５ミリモル）及びジエチレントリアミン五酢
酸（０．５マイクロモル）を含むように製造した。色素
提供性組成物Ｂは、４′−ヒドロキシアセトアニリドを
５ミリモルで存在させたことを除いて同様に製造し、色
素提供性組成物Ｃでは、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ドを２ミリモルで存在させた。
【００４１】色素停止溶液は、リン酸緩衝溶液中にアジ
化ナトリウム（０．１％）を含んで成るものであった。
洗浄組成物Ａは、コハク酸（０．１モル、pH５）中にＴ
ＥＲＧＩＴＯＬ（商標）４アニオン界面活性剤（５％）
を含んで成るものであった。洗浄組成物Ｂは、リン酸ナ
トリウム緩衝剤（０．１モル、pH７．３）中にデシル硫
酸（１．８％）を含んで成るものであった。洗浄組成物
Ｃは、グリシン緩衝剤（０．１モル、pH１０）中に、Ｔ
ＥＲＧＩＴＯＬ（商標）４アニオン界面活性剤（５％）
を含んで成るものであった。洗浄組成物Ｄは、グリシン
緩衝剤（０．１モル、pH１０）中に、ＴＥＲＧＩＴＯＬ
（商標）４アニオン界面活性剤（５％）及びカゼイン
（０．５％）を含んで成るものであった。
【００４２】抽出組成物は、グリシン緩衝剤（０．１モ
ル、pH８．５）中にＥＭＣＯＬ（商標）ＣＣ９カチオン
界面活性剤（５％、Ｗｉｔｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）及びドデシル硫酸ナトリウム（５％）を含んで成
るものであった。サンプル処理後の最終抗原濃度は、４
５０μＬ中、約１．２５×１０8 細胞数／mLであった。
【００４３】非免疫反応性遮断性タンパク質の遮断性溶
液Ａは、グリシン緩衝剤（０．１モル、pH１０）中にＡ
ＭＩＤＥＫ（商標）１３１プロテアーゼ（２ｗ／ｖ％、
Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、塩
化ナトリウム（５０ミリモル）、塩化カルシウム−２Ｈ
2 Ｏ（５ミリモル）、１，２−プロパンジオール（１０
％）及びアジ化ナトリウム（０．０１％）を含んで成る
ものであった。遮断性組成物Ｂは、２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸緩衝剤（１０ミリモル、pH６）中
に同様の成分を含有させたものであり、プロテアーゼは
０．８％で存在させた。
【００４４】三種の微生物、アクチノバシラス・アクチ
ノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）
（Ａ．ａ．）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅ
ｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｐ．ｉ．）
及びポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｒｏｐｈｙｒ
ｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｐ．ｇ．）の
各々に対して向けられたポリクローナル抗体を、ウサギ
の静脈内注射により生成した。ＩｇＧ画分を硫酸アンモ
ニウム沈降により生成し、そしてリン酸緩衝溶液（０．
３〜０．４％溶液）中４℃で保管した。抗血清を生成す
るのに用いた菌株は、Ｈ．Ｓ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＳＵ
ＮＹ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｄｅｎｔ
ｉｓｔｒｙ）より生存培養菌として給供された。単離体
を嫌気性プレート上で継代培養した。微生物は、以下の
寄託番号、Ａ．ａ．（血清型Ａ，Ｂ及びＣ、各々）に関
してはＡＴＣＣ ４３７１７，ＡＴＣＣ ４３７１８及
びＡＴＣＣ ４３７１９、Ｐ．ｉ．（血清型Ａ，Ｂ及び
Ｃ、各々）に関してはＡＴＣＣ ２５６１１，ＮＣＴＣ
９３３６及びＡＴＣＣ ４９０４６、並びにＰ．ｇ．
（血清型Ａ，Ｂ及びＣ、各々）に関してはＡＴＣＣ ３
３２７７，ＡＴＣＣ ５３９７８及びＡＴＣＣ５３９７
７により同定されるものである。ＡＴＣＣは、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）であ
り、ＮＣＴＣは、ナショナル・コレクション・オブ・タ
イプ・カルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（Ｌｏ
ｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）である。
【００４５】抗体を、（上記）ヨーロッパ特許第Ａ
０，３２３，６９２号明細書の製造方法を用いて製造さ
れたポリ〔スチレン−コ−４−（２−クロロエチルスル
ホニルメチル）スチレン〕（モル比９５．５：４．５）
のポリマー粒子（平均直径１μｍ）に対して共有結合せ
しめることにより、水不溶性試薬を製造した。抗体
（Ａ．ａ．の３種の血清型の各々に特異的な抗体０．１
７mg／mL、Ｐ．ｉ．もしくはＰ．ｇ．の３種の血清型の
各々に特異的な抗体０．２５mg／mL）を、試験管中のホ
ウ酸塩緩衝剤（０．０５モル、pH８．５）の溶液に添加
してよく混合することにより、共有結合は達成された。
ポリマー粒子（３％固体、平均直径０．０１μｍ）を緩
衝化混合物に添加し、そして粒子に抗体を共有結合させ
るまで、室温で４時間、得られた懸濁液を転倒回転し
た。次いで懸濁液を２８００rpm で１０分間遠心分離に
かけた。上清を取り除き、そしてペレットをＴＷＥＥＮ
（商標）２０非イオン界面活性剤（０．１％、ＩＣＩ
Ａｍｅｒｉｃａｓ）及びメルチオレート（商標）（０．
０１％）を含有するグリシン緩衝剤（０．１％、pH８．
５）に懸濁せしめた。
【００４６】上記試薬のコーティング懸濁液（０．３５
％固体）を、グリシン緩衝剤（０．１モル、pH８．５）
中、ポリアクリルアミドバインダー（５％）、ＴＷＥＥ
Ｎ（商標）２０非イオン界面活性剤（０．１％）、メル
チオレート（商標）（０．０１％）及びＵＶＩＴＥＸ
（商標）蛍光増白剤（０．０００５％、Ｃｉｂａ−Ｇｅ
ｉｇｙ）を有するように製造した。別個の抗原に向けら
れた各試薬を、上記試験デバイスにおける膜の限定領域
に塗布した。
【００４７】Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５，１９７９の方法を用い
て西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した各微生物に向
けられた抗体を用いて、酵素−抗体結合体を製造した。
結合体を含んで成る各結合体組成物（１mL当りＰ．ｉ．
血清型Ｂ抗体１５μｇ、１mL当りＰ．ｉ．血清型Ａもし
くはＣ抗体７．５μｇ、並びに１mL当りＰ．ｇ．及び
Ａ．ａ．各血清型抗体１０μｇ）を、緩衝剤（０．１モ
ル、pH７．５）中カゼイン〔０．５％、３−（Ｎ−モル
ホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤０．１モルへの１％
溶液より、pH７．５〕、ＴＷＥＥＮ（商標）２０非イオ
ン界面活性剤（０．３％）、メルチオレート（商標）
（０．０１％）及び４′−ヒドロキシアセトアニリド
（１０ミリモル）の溶液に添加した。溶液を０．２２μ
ｍフィルターを介して濾過した。他のすべての材料及び
試薬は、イーストマン・コダック・カンパニーもしくは
別の販売元より入手した。
【００４８】具体例の一般的なアッセイプロトコール：
例中に記載される事柄を除いて、これらの具体例では下
記一般的な方法を用いた。ポリマー粒子上の抗体の試薬
を、上述のようにＳＵＲＥＣＥＬＬ（商標）試験デバイ
ス中の膜の限定区域に置いて乾燥した。Ａ．ａ．，Ｐ．
ｉ．及びＰ．ｇ．に特異的な各試薬の１つについて、３
つの区域が存在した。
【００４９】３種の微生物由来の抗原を、室温で抽出組
成物を用いて抽出し、例１〜４に関しては、プロテアー
ゼ、抽出溶液及び抗原保存溶液を包含する溶液中、最終
濃度（１．２５×１０8 細胞数／mL）を提供し、そして
例５〜１３に関しては、サンプルの抽出剤４５０μＬ
中、抗原溶液のみの中で同濃度の細胞を提供した。抽出
は、直ちに混合することで行った。
【００５０】例５〜１４に関しては、次いでサンプルの
抽出剤を、室温で遮断性組成物（例５〜１２については
４５０μＬ、例１３及び１４については２６５〜３００
μＬ）と混合した。次いで使用の前に、得られた混合物
をＬＯＰＲＯＤＹＮＥ（商標）微孔質濾過膜（平均細孔
サイズ１．２μｍ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）を介して濾過した。
【００５１】濾過した混合物を抗体試薬を含有する試験
デバイスの試験ウェルに添加して、膜を介して排水させ
た。抗体結合体組成物（８０μＬ）を、各試験ウェルに
添加し、続いて室温（約１８〜２５℃）で２分間インキ
ュベーションした。次いで洗浄溶液（５００μＬ）を各
試験ウェルに添加し、そして排水させた。洗浄を繰り返
した。色素提供性組成物（８０μＬ）を各試験ウェルに
添加し、続いて室温で１分間インキュベーションした。
次いで膜上の別個の区域中に得られた色素シグナルを、
目視的に評価し、そして反射濃度値を有する較正された
カラーチャートと比較した。これらの値を、伝統的なＷ
ｉｌｌｉａｍｓ−Ｃｌａｐｐｅｒ変換（Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓ
ｏｃ．Ａｍ．，４３，５９５，１９５３）を用いて透過
濃度に変換した。０．００３以下のＤT 値は、目視的評
価の「色素シグナルなし」に相等する。抽出から膜上色
素シグナルの評価までの全アッセイプロトコールは、約
５分未満の時間を必要とし、すべて室温で実施した。
【００５２】例１及び２ ポルフィロモナス・ジンジバ
リス（ＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓＧｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ）の検出における抽出前後での遮断性組成物の使用 これらの例は、Ｐ．ｇ．由来の抗原の抽出前後の両時点
における遮断性組成物の使用を具体的に示すものであ
る。本発明は、遮断性組成物を使用することなく行われ
たアッセイと比較した。また、本発明と組合わせた２種
の異なる洗浄溶液の使用を評価した。
【００５３】上述のように微生物より抗原を抽出した
（１．２５×１０8 細胞数／mL）。例１で抽出工程の前
に遮断性組成物を抽出組成物に添加したことを除いて、
これらのアッセイに上記プロトコールを用いた。これを
行った後、遮断性組成物（１００μＬ）をトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（２０μＬ）及び抗
原溶液（１００μＬ）と混合し、次いでこの混合物を抽
出組成物（６００μＬ）と組合わせた。
【００５４】抽出工程後、遮断性組成物を抽出組成物に
添加し、抽出組成物（３００μＬ）をまず抗原溶液（１
００μＬ）と混合した。抗原抽出後、遮断性組成物（４
００μＬ）及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝剤（４０μＬ）を添加した。遮断性タンパク質を
含有しない対照サンプルを、抗原溶液（１００μＬ）、
リン酸緩衝溶液（１００μＬ）及び抽出組成物（６００
μＬ）より製造した。
【００５５】遮断性組成物及び抽出組成物の混合物にト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（１．６
５モル、pH１０〜１２）を添加することにより、すべて
のアッセイにおいて高いpHを維持した。次いで各混合物
を微孔質濾過膜（平均細孔サイズ１．２μｍ）を介して
濾過し、アッセイにおける使用に際して等分した。これ
らのアッセイには洗浄組成物Ａ及びＢを用いた。すべて
のアッセイで色素提供性組成物Ａを用いた。
【００５６】これらのアッセイは、以下のように本明細
書では同定される。 対照Ａ：使用される遮断性組成物なし、洗浄溶液Ｂ。 対照Ｂ：使用される遮断性組成物なし、洗浄溶液Ａ。 対照Ｃ：遮断性組成物Ｂ（抽出前に添加）、洗浄溶液
Ｂ。 対照Ｄ：遮断性組成物Ｂ（抽出後に添加）、洗浄溶液
Ｂ。 例１：遮断性組成物Ｂ（抽出前に添加）、洗浄溶液Ａ。 例２：遮断性組成物Ｂ（抽出後に添加）、洗浄溶液Ａ。
【００５７】膜上の別個の区域〔Ｐ．ｉ．，Ａ．ａ．及
びＰ．ｇ．に特異的な試薬についての各々１つの区域〕
中に得られた色素シグナルを、上記のように評価し、そ
して下記第Ｉ表に示した。これらの結果は、たとえ総シ
グナルが洗浄組成物中ＴＥＲＧＩＴＯＬ（商標）４アニ
オン界面活性剤を用いて対照Ｂにおいて十分に低減され
たとしても、遮断性タンパク質を全く利用しない対照Ａ
及びＢが、別の微生物に対する抗体とＰ．ｇ．抗原の受
け入れられない非常に「明白な」交差反応性を有するこ
とを示す。
【００５８】更にこれらの結果は、遮断性タンパク質が
抽出前後のどちらかで抗原と混合されて交差反応性を低
減できると同時に、抽出された抗原（Ｐ．ｇ．）に対し
て高感度を提供できることを示す。抽出後にそれらを混
合することは最も交差反応性が低く好ましい（例２）。
【００５９】
【表１】
【００６０】例３ より高いpHを用いたＰ．ジンジバリ
ス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）についてのアッセイ 本例は、抽出剤及び遮断性組成物の混合物がpH９．０〜
９．３であったことを除いて、例１及び２のアッセイと
同様である。上記遮断性組成物（４００μＬ）及びトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（４０μ
Ｌ）を抽出剤（４００μＬ）に添加して、アッセイ用混
合物を生成した。
【００６１】対照Ｅアッセイでは、遮断性組成物を全く
使用せず、そして洗浄組成物Ａを用いた。対照Ｆアッセ
イは、洗浄組成物Ｂを用いたことを除いて同様であっ
た。対照Ｇアッセイでは、遮断性組成物を洗浄組成物Ｂ
と共に用いた。例３では、遮断性組成物を洗浄組成物Ａ
と共に用いた。すべてのアッセイに色素提供性組成物Ａ
を用いた。結果を下記第II表に示す。最も低い交差反応
性が、例３のアッセイで達成された。
【００６２】
【表２】
【００６３】例４ 各種のpH値で抽出するアッセイ 遮断性組成物Ｂを用いる本発明のアッセイを、抽出組成
物のpHを変更又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝剤を削除することにより、同様のアッセイと比
較した。従って、得られた抽出組成物及び遮断性組成物
の混合物のpHは、変化していた。アッセイでは、洗浄組
成物Ａ及び色素提供性組成物Ａを用いた。
【００６４】アッセイは、以下パラメーターを有した。 対照Ｈ：抽出組成物はpH５．２であり、そして遮断性組
成物Ｂと混合したが、pHを調整するのに全く緩衝剤を用
いなかったので、最終pHは６．６〜７．２であった。
【００６５】対照Ｉ：抽出組成物はpH８．５であり、遮
断性組成物Ｂ及び緩衝剤を削除した。 対照Ｊ：抽出組成物はpH８．５であり、遮断性組成物Ｂ
と混合したが、pHを調整するのに全く緩衝剤を用いなか
ったので、最終pHは８．２であった。 対照Ｋ：抽出組成物はpH８．５であり緩衝剤と混合した
が、遮断性組成物Ｂを削除したので、最終pHは９．３で
あった。 例４：抽出組成物はpH８．５であり、遮断性組成物Ｂ及
び緩衝剤と混合して最終pH９．３とした。
【００６６】アッセイのデータを下記第III 表に示す。
遮断性組成物及び抽出組成物の混合物の最終pHが、アッ
セイにおいて「明白な」交差反応性を除去するのに重要
であることは、明らかである。pHを約８より増大するこ
とが、「明白な」交差反応性を低減すると同時に目的の
抗原に対する感度を維持した。約９を越えるpHで遮断性
組成物を用いた場合に、最適な挙動が得られた。しかし
ながら、遮断性組成物を使用することなくpHを９より上
に増大することは、「明白な」交差反応性を十分に低減
しなかった。
【００６７】
【表３】
【００６８】例５〜９ カゼインＡｓ遮断性タンパク質
の使用 例５〜８は、本発明のアッセイに際して遮断性タンパク
質としてカゼインの使用を示すものである。多様な濃度
のタンパク質を試みた。また、例９は遮断性タンパク質
としてプロテアーゼ（ＡＭＩＤＥＫ（商標）１３１プロ
テアーゼ）の使用を示す。対照Ｌは、「遮断性組成物」
として緩衝剤を用いたアッセイであった。
【００６９】これらのアッセイでは、Ｐ．ジンジバリス
（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）抗原を含有する被検体
（４５０μＬ）を遮断性組成物（４５０μＬ）と混合
し、そして得られた混合物を１．２μｍフィルターを介
して濾過してからアッセイで使用した。得られた混合物
のpHは９．３であった。アッセイでは、洗浄溶液Ｃ及び
色素提供性組成物Ｂを用いた。多様な量のカゼイン（例
５では０．２５％、例６では０．５％、例７では０．７
５％及び例８では１％）もしくはプロテアーゼ（１％
ＡＭＩＤＥＫ（商標）１３１、例９）を含有する遮断性
組成物は、またグリシン緩衝剤（１００ミリモル、pH１
０）中に塩化ナトリウム（５０ミリモル）、塩化カルシ
ウム−２Ｈ2 Ｏ（５ミリモル）、アジ化ナトリウム
（０．０１％）及び１，２−プロパンジオール（１０
％）を含有した。
【００７０】アッセイの結果は、下記第IV表に示されて
いる。それらは、またカゼインが、交差反応性を低減す
るのに本発明の実施に際して遮断性タンパク質として有
効であるが、とはいえプロテアーゼの使用（例９）が、
目的の抗原に対してより大きな感度を提供するのに好ま
しいことを示している。
【００７１】
【表４】
【００７２】例１０〜１２ 遮断性タンパク質としての
ウシ血清アルブミンの使用 例１０及び１１は、本発明の実施に際して遮断性タンパ
ク質として血清タンパク質、すなわちウシ血清アルブミ
ン（１％及び２％、各々）の使用を示すものである。例
１２は、好ましい遮断性タンパクとしてプロテアーゼ
（ＡＭＩＤＥＫ（商標）１３１プロテアーゼ、例９の組
成物）の使用を重ねて示している。遮断性組成物中の別
の成分は、例５〜９に示したものと同様であった。対照
Ｍアッセイは、遮断性組成物を全く用いなかった。色素
提供性組成物Ｃ及び洗浄組成物Ｄを、これらのアッセイ
で用いた。
【００７３】データは、結果を下記第Ｖ表に列挙する。
ウシ血清アルブミンが好ましいプロテアーゼより良好な
結果を提供しないことを示すとはいえ、それは「明白
な」交差反応性を低減することにおいて、望ましい改良
を提供している。
【００７４】
【表５】
【００７５】例１３ 本発明の好ましい態様 本例は、Ｐ．ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ）より抽出された抗原を、遮断性組成物Ａを用いて検
出することによる本発明の好ましいアッセイを代表す
る。洗浄組成物Ｄ及び色素提供性組成物Ｃを用いた。遮
断性組成物及び抽出剤の混合物を試験デバイスの試験ウ
ェルに添加する場合、それはpH約９．３であった。対照
Ｎアッセイを、遮断性組成物を用いることなく実施し
た。アッセイの結果を下記第VI表に示す。
【００７６】
【表６】
【００７７】例１４ ３種の微生物の検出 本例は、Ａ．ａ．，Ｐ．ｇ．及びＰ．ｉ．より抽出され
る多様な濃度の抗原を検出するための本発明の実施を具
体的に説明するものである。アッセイは、上記プロトコ
ールを用いて実施した。抗原を試験デバイスの試験ウェ
ルに添加する前に、室温で数秒間、抽出された抗原の溶
液を、ＡＭＩＤＥＫ（商標）プロテアーゼ（Ｇｅｎｅｎ
ｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔ
ｅｒ，Ｎ．Ｙ．）を含有する組成物（２０mg／mLの溶液
３００μＬ）と混合した。色素提供性組成物Ｂを本例に
用い、そして抗体結合体の容量は、１サンプル当り８０
μＬであった。
【００７８】洗浄組成物は、グリシン緩衝剤（０．１モ
ル、pH１０）中、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（商標）４アニオン
界面活性剤（１．３５％）、カゼイン（０．５％）及び
チメロサール（０．１％）を含んで成るものであった。
【００７９】抗原は、Ｐ．ｇ．血清型Ａ，Ｂ及びＣ、
Ｐ．ｉ．血清型Ａ及びＡ．ａ．血清型Ｂより抽出した。
試験された抗原濃度は、Ｐ．ｇ．及びＰ．ｉ．に関して
は１．２５×１０8 細胞数／mL、１．５６×１０7 細胞
数／mL及び１．９５×１０6 細胞数／mL並びにＡ．ａ．
に関しては６．２５×１０7 細胞数／mL、３．９１×１
０6 細胞数／mL及び４．８８×１０5 細胞数／mLであっ
た。
【００８０】アッセイの結果を下記第VII 表に示す。そ
れらは、歯周疾患に伴う３種の異なる微生物を検出する
際の本発明の使用を具体的に説明し、そしてそれらはプ
ロテアーゼの使用が各々３種の微生物の検出を干渉しな
いことを示す。特に高い抗原濃度で行う場合に、タンパ
ク質前処理の使用は、交差反応性の除去を助長する。
【００８１】
【表７】
【００８２】
【発明の効果】本発明は、迅速かつ高感度な歯周疾患に
伴う微生物の検出方法を提供する。それは、同一試験被
検体中に存在する複数のこのような微生物間の迅速かつ
有効な区別手段を提供する。それは、単一試験デバイス
もしくは試験ウェルにおける歯周疾患に伴う微生物の区
別に特に有用である。上述のように、微生物間で区別さ
れることは、特定の診断方法及び処置の際に、極めて重
要である。本発明は、その手段を提供し、そして１つ以
上の別の微生物が検出しようとする別のものよりかなり
高濃度で存在する場合には、特に区別可能にすると同時
に、バックグラウンドを低く保ち、そして非特異的免疫
学的反応を最低限にする。これらの利点は、抽出前に又
は直後に比較的高いpHで、抗原を少なくとも約０．２
（重量）％の非免疫反応性遮断性タンパク質と混合させ
ると同時に比較的高いpHを維持させることにより可能で
ある。「遮断性」タンパク質は、イムノアッセイにおい
て正確なシグナルを不明瞭にする非特異的相互作用を顕
著に遮断する。特に有用な非免疫反応性タンパク質は、
プロテアーゼであるが、多くのプロテアーゼが、高いpH
及びアッセイで通常用いられる高濃度の界面活性剤によ
り悪影響を受ける。従って、本発明に用いられる非免疫
反応性遮断性タンパク質（プロテアーゼあるいは別のタ
ンパク質）は、抽出組成物の高いpHもしくは界面活性剤
により悪影響を受けない遮断性の性質を有すべきであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブライアン アンソニー シュナイダー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14626, ロチェスター，ハーベスト ドライブ 226 (56)参考文献 特開 昭63−159762（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−43094（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ａ．歯周疾患に伴う微生物由来の抗原
    を、少なくともpH８に緩衝化された抽出組成物を用いて
    抽出する工程、 Ｂ．抽出組成物を、pH８．５から１１．５であり且つ十
    分な量の非免疫反応性遮断性タンパク質を必須に含んで
    成る遮断性組成物と混合させて、少なくとも０．２重量
    パーセントのタンパク質を有する混合物を提供する工程
    であって、前記タンパク質が乳タンパク質もしくは酵素
    であり、タンパク質の遮断的性質が混合物の高いpHもし
    くはそこに存在するいかなる界面活性剤によっても悪影
    響を受けないことを特徴とする工程、 Ｃ．工程Ｂで生成された混合物のpHを８．５から１１．
    ５に維持しながら、混合物を抗原に特異的な抗体と接触
    させて免疫学的複合体を生成させる工程、並びに Ｄ．複合体を検出する工程、 を含んで成る歯周疾患に伴う微生物の検出方法。
  2. 【請求項２】 個別に包装された （ａ）少なくともpH８に緩衝化された抽出組成物、 （ｂ）歯周疾患に伴う微生物に特異的な水溶性抗体、及
    び （ｃ）pH８．５から１１．５であり且つ非免疫反応性遮
    断性タンパク質を必須に含んで成る組成物であって、前
    記タンパク質がpH８．５から１１．５で安定である乳タ
    ンパク質もしくは酵素である組成物、 を含んで成る診断試験キット。
  3. 【請求項３】 非免疫反応性遮断性タンパク質がプロテ
    アーゼである、請求項２に記載の試験キット。
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