JPS60186759A - 色原性担体イムノアツセ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細菌、ビールスおよび溶性抗原の検出および定
蓋のためのイムノアツセー技術、そしてより特定的には
標識免疫コンプレックスを活性担体上に集めそして標識
成分により生成されるシグナルを、その担体との化学的
または物理的相互作用によってその担体物質上に濃縮さ
せるイムノアソセー技術に関する。

臨床実験窒化学珍断テストは健康管理実施の重要な一構
成要素である。近年体液中の可溶性有機抗原、または、
薬物、ホルモン、ビタミン。

代謝産物その他を含むハプテン化合物の測定に対し、て
抗原−抗体反応の特異性を利用した膨大な数のイムノア
ツセー技術が報告されている。

イムノアッセーにおいて検出可能なシグナルを生成させ
るための放射性同位元素、酵素、螢光発生団、酵素阻害
剤、化学または生物発光物質その他を含む多数の標識成
分が特許明細書および特許でない文献に記載されている
。例えばメンズ・イン・エンザイモノジー（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　７０および７．’
５（１９８０）および（１９８１）　、にューヨーク、
アカデミツクプレスおよびそこに含まれている引用文献
を参照されたい）。

ある種のイムノアッセーでは、遊離標識成分から結合形
のものを区別するための分離段階が必要とされる。その
様なアツセーは不均一系であると呼ばれ、そしてこれら
としては例えば放射イムノアツセ−（ＲＩＡ）　、およ
び酵素結合イムノ収着アツセー（コＬＩＳＡ）の様な周
知の技術があげられる。挿々の分離手段例えば遠心分離
、沖過およびクロマトグラフィーが当技術で知ら大【。

ている。

その他のイムノアツセーでは分離段階を必要どされずこ
れは均−系であると呼ばれている。

実施がより速やかでありかつより簡単ではあるけれども
、均一アンセーは往々に（−て不均一アツセーよりも感
度が（Ｊｋ　＜　、そして阻害をより受けやすい。

均一タイプまたは不均一タイプどちらかの通常のイムノ
アツセーにおいては、標識成分の反応生成物はテスト媒
体中に自由に拡散する。このことは分光光度計的検出を
可能ならしめる。

その理由はこの生成物をテスト８Ｎ全体に亘って均一に
分散させうるからである。しかし反応生成ｑ〕の希釈は
感度を限定させそして直接的可視性を困難ならしめる。

イムノアツセーは可溶性抗原およびハプテンの測定用に
広く使用されているけれども、感染症に対する伝統的診
断法は感染源をインビトロまたは実験動物中で培養させ
ることを包含する。

このアプローチはいくつかの不利な点を有している。第
一にいくつかの医学的に重要ゾよビールスは一般に利用
可能な糾織培譬または動物系中で培養することができな
い。これらと１．ては、ロータビールス、肝炎Δ型およ
びＢ型ビールスおよびエプスタイン・ノシービ・−ルス
があケラれる。第二に、多くの感染源は同定しうるまで
に長い培養期間を要求する。ある場合には、この期間は
非常に長くてそのため、その結果は臨床家には有用でな
くなってしまう。第三に、すでに抗生物質治療を受けた
個体から試料が得られた場合には、伝統的培養法は不充
分なものでありうる。

臨床試料中の感染源を直接検出し５るアツセーに対して
は急速に拡大する市場が存在している。その様なアツセ
ーは抗原−抗体反応または微生物酵素活性の測定に基く
ものでありうる。

抗原または酵素検出に基くアツセーは必ずしも生ぎてい
る、または感染性有機体を測定することはできないとい
うことを認識すべきである。

その様なアツセーが実際的に有用であるためには、その
アツセーが速やかな送受反転時間を有していること、関
心ある有機体またはその群の有機体に特異的であること
、比較的小数の有機体に対して感受性であること、そし
て体液中に見出される成分からの阻害を比較的受けない
ことが必須である。

微生物およびビールス抗原に対しては多数のイムノアツ
セーはこれまでに既に述べられている。総説については
、レビュー・インフエクト・ディス（Ｒｅｖ、工ｎｆｅ
ｃｔ、　ｐｌｓ；）、　４．６５、（１９８２）を参照
されたい。伝統的培養法に比べた場合のそれらの利点に
もかかわらず、これらのアツセーの多くは、なお比較的
時間のかかるものであり（１〜６時間）そして労力を要
するものである（多数の試薬添加および洗浄段階が要求
される）。生成されたシグナルは溶液中で測定されるの
であるから、不充分な感度もまた往々にして問題である
。

ファングに付与された１９８２年４月２７日発行の米国
特許第４，６２ス０７３号明細書は各々がそれぞれの四
基源化合物との少くとも−の反応を受ける複数の物質に
対する生物流体中の定量分析法を開示している。機能性
反応性化合物（抗体または非抗体結合蛋白）を不動化さ
せるために使用される基質キャリアーは反応性化合物の
共有結合のための官能基または機能性反応成分のイオン
結合のためのイオン交換部位を有しうる。この基質キャ
リアーはまた吸着媒でありうるが、この場合、反応性化
合物はファンデルワールス力によって吸引される。酵素
はトレーサーとして使用される。そしてこれは酵素に対
する色原住基質中にキャリアーを浸漬することにより測
定される。得られる生成物は沈殿した着色固体である。

カトウに付与された１９８０年３月３０日発行の米国特
許第４，３２２，４９５号明細書は関心ある有機体をそ
の上に不動化させることのできる非孔性セラミックまた
は重合体担体を使用する微生物に対する抗体のイムノア
ツセーを開示している。この担体をその有機体に対する
抗体を含有すると考えられる試料と共に培養し、溢流さ
せることにより洗って非結合成分を除去しそして酵素標
識抗体抗体と共に培養する。更にもう一度洗った後、酵
素標識と反応しうるインディケータ−を適用して発色さ
せる。着色生成物は担−体とは物理的または化学的に相
互作用しない。

ノラーに付与された１９８０年２月５日発行の米国特許
第３．１８７．０７５号明細書は試料からビールスを捕
えるために抗体でコーティングし、不活性固体担体を使
用した肝炎Ｂ型ビールスのイムノアツセーを記載してい
る。洗浄後、結合したビールスを第２の酵素標識抗体お
よび酵素標識に対する基質と反応させる。反応の着色生
成物をナイロンね体上に沈殿させ、そして測定のために
食塩水とアセトンの混合物で溶出させる。

コールなどに付与された１９８１年７月１４日発行のカ
ナダ特許第１，１０４，９２７号明細書は−の成分を微
細孔性膜上で不動化させる免疫化学反応の成分検出法を
開示している。この第１の成分であって不動化させたも
のは免疫化学反応の第２の成分を含有する試料と反応さ
せ次いでその第２の成分に対する酵素標識免疫化学反応
成分と反応させる。膜表面上での色の変化量を酵素標識
の色原体との反応の後で測定する。色原体は酵素標識に
より作用された場合膜上に沈殿しうるものであるかまた
はそれは優先的に膜に結合しうるものである。担体上へ
の色原体の沈殿またはそれとの優先的結合は多くは偶発
的なものである。

ルートらに付与された１９８０年４月２９日発行の米国
特許第４．２００．６９０号明細書はテスト結果を担体
上に形成された色によって測定する腸内寄生虫用のイム
ノアツセーを開示し【いる。

使用される色原性物質は反応溶媒に難溶性であるかまた
は優先的に着色状態でフィルターマトリックス中に捕捉
される。担体上への色原体の沈殿またはそれに対する色
原体の優先的結合は多くは偶発的なものである。

免疫コンプレックスの捕捉のためにポリビニルマイクロ
タイタープレートのフェルへの吸着された補体カスケー
ドの（Ｊｑ酸成分使用はりャーナル・オプ・クリニカル
・マイクロバイオロジー（、Ｔｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ
１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｏｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌｕ
ｍｅｌｌ、５４６．（１９８０）　）に記載されている
。Ｃ］−ｑはサイトメガロビールスおよび山羊抗サイト
メガロビールスの免疫コンプレックスの捕集用に使用さ
れる。酵素標識抗抗体は不均質イムノアッセーにおいて
、免疫コンプレックスの存在を検出するために使用され
ている。このアプローチはそれが関心あるアナライトか
ら誘導されたものではない免疫コンプレックスへの非標
識ｏβｑ結合の一般的性質の故に充分な特異性および感
度を欠いているという不利な点を有している。

著者はＣβｑベースアツセーを７種のイムノアッセーの
第５番にランクさせている。

０１ｑ　−酵素コンジュゲートは可溶性免疫コンプレッ
クスのアッセーに使用された。ジェイ・タリン・ラブ・
イムツル（Ｊ、　０１１ｎ、Ｌａｂ、工ｍｒｎｕｎｏｌ
。

５、１２９．　（１９８１））。熱凝集不溶化工ｇＧが
補体除去人血清中の可溶性工ｇＧ免疫コンプレックスに
結合させたｃ：ｃｑ　−ＨＲＰコンシュメートの捕捉の
ために使用された。酵素−基質相互作用により生成され
た発色体は希釈された形で溶液中に存在しておりそれに
よってアツセー感度を制限する。

ウルマンに付与された１９７９年１１月１３日発行の米
国特許第４，１７４，３８４号明１ＩＭ書は同時のサン
ドイツチイムノアツセーの均質な変法を記載している。

このアツセーにおいては両抗体は共に可溶性の形で使用
されそして一方は螢光体で、そして他方は消光剤によっ
て共に標識されている。両抗体を抗原に結合させた場合
、螢光消光が生ずる。螢光に基くイムノアツセーはシグ
ナルの検出に対してそれが精密な装置を要求すること、
及びアツセーされる生物流体中に一般に存在する螢光性
物質の阻害を受けやすいということの不利な点を有して
いる。

リットマンらに付与された１９８１年１１１月１０１□
日発行の米国特許第４，２９９，９１６号明細書はグル
コースオキシダーゼおよびホースラディツシュ・ノーオ
ギシダーゼを含む非常に近接した相互に作用して表面上
に沈殿した不溶性発色体を生成させる一組の相補的酵素
の使用を開示している。この色の強度は溶液中の選ばれ
たアナライトに関係している。酵素の−を免疫学的−組
の−の成分に結合させ、一方第二の酵素をシグナル生成
試薬と共に溶液に加えるかまたはアナライト含有試料に
それを露出させる前に固体相に最初に結合させる。この
均質イムノアツセーにおいては、免疫化学的に結合した
薬剤は、シグナル検出によるアツセ→完成のためには、
溶液中に遊離に留まっているものから分離させない。

このアツセーは相補的酵素の一組の一方の成分のみが通
常免疫学的活性成分に結合されるという点で特異性にお
いて劣る欠点を有している。

この第二の酵素は溶液中Ｋまたは固体相上に受動的に加
えられて、均質法の非特異的反応性の活性を上昇させる
。この方法はまた非特異的シグナル水準を周囲の媒体中
の可溶性の成分種から上昇させることによりイムノアツ
セーの感度を妥協させている。均質イムノアツセーの感
度は更に免疫反応成分の結合定数により限定される。そ
の理由は、アツセーは一般に競合的様式で実施されるか
らである。受身の固体相上へ形成された発色体の沈殿は
主として偶発的なものであり、そして固体相上にはシグ
ナル増巾の示唆はない。

マギオらに付与された１９８０年１１月１１日発行の米
国特許第４，２３５．４−０２号明細書には均質ている
。このアッセーにおいては、人工ｇＧ’（ｈｕｌｇＧ）
をグルコースオキシダーゼ（Ｇｏ）で標識させ、そして
抗ｈｕＩｇ（）をホースラディツシュパーオキシダーゼ
（ＨＲＰ）で標識させる。グルコースのＧ。

触媒分解生成物の−であるＨ２Ｏ２はＨＲＰの基質とし
て働き、従って生成されるシグナル量は標識成分の近似
の函数となる。試料としての非標識ｈｕ工ｇＧの漸増す
る量の冷加はシグナル減少をもたらす。関心ある化合物
に二の抗体をそれぞれを酵素チャンネリング対の−の成
分で標識させるサンドイッチτツセーの実施の可能性も
また開示されている。このアッセーはシグナル発生手段
がテスト媒体中に自由に拡散するという不利な点を有し
ている。これは分光光度計的検出を容易ならしめるけれ
ども得られるシグナルの希釈はアツセー感度を限定させ
、そしてアッセー結果の直接的可視化を困難ならしめる
。

共に１９８２年１２月４日に出願された出願継続中の特
許出願である第４４６，４５５号および第４４６．４５
４号明細書は不均質イムノアツセーにおける標識成分に
より発生されたシグナルを濃縮させるための活性担体の
使用を開示している。

担体上へのシグナルの濃縮はこの可視化を可能ならしめ
る。もしもシグナルが溶液中に均一に分散しているなら
ば、そのアツセー媒体中でのその希釈の故にバックグラ
ウンド上で実質的に区別し得ないものとなるであろう。

ここに速やかな、そして感染初期段階の生物学的試料中
に存在する小数の有機体に対して感受性のそして潜在的
には定量的である抗原特にビールスまたは細菌由来のも
のに対する改善されたイムノアクセ−法がめられている
のであアナライト例えば可溶性′４４機抗原およびハプ
テン−細胞、微生物および生物試料中のそれらの産生物
の検出および測定のための本発明の色原性担体イムノア
ツセーはアナライトを最終的には酵素標識抗体に接触さ
せる様な系を使用している。アナライトと酵素標識抗体
により形成される免疫コンプレックスを次いで抗体の標
識に使用されたものとは異った酵素で標識させた少くと
も−の血清補体成分に接触させる。標識用に使用される
両酵素は、−の酵素触媒反応と基質の生成物が第二酵素
の基質として相補的に相互反応性である様に選ばれる。

この第二の酵素反応の生成物が次いで活性担体と反応し
てシグナル生成物を形成する。

このアツセー系によるシグナルの発生は両酵素標識成分
の存在および適当な空間的位置に依存する。もしもシグ
ナル生成試薬との処理の間に一方の、酵素標識成分のみ
しか存在していない場合には適当な特異的結合形成が生
じないのであるから、シグナルが生成することはない。

有用なシグナルは免疫コンプレックスへの少（とも−の
酵素標識補体成分の結合（固定）が存在する場合にのみ
生成される。その様な構造はアナライトおよび酵素標識
抗体を包含する結合組合せとして本明細書中で定義され
ている免疫コンプレックスとは区別するために、プロダ
クティブコンプレックスと定義される。

本発明の色原性担体イムノアツセ−（Ｃｈｎ’ｃ回ｇｅ
ｎｉｅｓｕｐｐｏｒｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）は以
下の工程すなわち（ａ）　免疫化学的に抗体に結合した
アナライト（ａｎａｌｙｔｅ）を包含する第一酵素成分
を有する免疫コンプレックスおよび免疫コンプレックス
に結合した少くとも−の補体成分を包含する第二酵素成
分を有するプログクチイブコンプレックス（ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）を活性担体上に集めまた
はそこに形成させること、（Ｂ）　活性担体な洗って未
反応酵素標識結合成分を除去すること、 （Ｃ）　シグナル生成試薬に、との担体上の酵素標識成
分を接触させ、それによってアツセー媒体中に可溶性の
実質的に無色の生成物を形成させること、そして （Ｄ）　その生成物を担体と相互作用させて担体に結合
したシグナル発生生成物を形成させること よりなるものである。

標識免疫コンプレックスは溶液中にまたは活性固体担体
上に直接形成させることができる。

アナライトの酵素標識抗体との前培養によって溶液中に
形成された場合には、それを次いで反応させて酵素標識
補体成分を有するプログクチイブコンプレックスを形成
させる。これはその特異的アナライトとの反応に関与す
る抗体にのみ結合する。そしてこれは次いで担体上に集
められる。担体上でのプロダクティブコンプレックスの
直接的形成はアナライトと酵素標識抗体の前培養により
担体に結合させた酵素標識補体成分により形成された免
疫コンプレックスの免疫学的捕捉を包含しうる。戒はま
た、プロダクティブコンプレックスはアナライトまたは
酵素標識抗体を活性担体に結合させ、次いで免疫コンプ
レックス結合組合せの補合成分に、次いで少くとも−の
酵素標識袖体成分に露出させることによって形成させる
ことができる。

本発明のプロダクティブコンプレックス中の近接した位
置にある二の標識酵素の相補的作用により形成される生
成物はそれらを活性担体と州五り田セ訃六十子は酊浣什
で弧りかつ宙脣的に無色である。シグナル発生生成物形
成のための前記担体とのこの相互作用は化学的、物理的
またはイオン的なものでありうる。

本発明のその他の態様は一連に免疫コンプレックスおよ
び相互に結合するその他の酵素標識補体成分の使用によ
るそれ以上のシグナルの増強である。血清補体系中で生
ずる特異的な一連の結合反応を免疫コンプレックスへの
多酵素標識の結合のために使用し、それによってプログ
クチイブコンプレックスの基質ターンオーバー能力およ
び色原性担体イムノアツセーの感度を上昇させる。

本発明の色原性担体イムノアツセーは種々のアナライト
例えば可溶性有機抗原およびハプテン、細胞、微生物お
よびそれらの生成物の検出および測定に対して適用可能
である。可溶性有機抗原およびハプテンとしては合成抗
原性ベゾチド、薬剤、ホルモン、ビタミン、食品添加物
および有害生物駆除剤があげられる。微生物としては細
菌、マイコプラズマ、リケチア、クラミジアおよびビー
ルスがあげられる。その生成物は合成品例えば酵素、毒
素、コリシン、または細胞表面抗原または分解生成物、
例えばビールス被覆蛋白の抗原性断片でありうる。関心
ある峠１菌のいくつかは、ぶどう球菌、連鎖球菌、ネイ
セリアおよびエンテロバクタ−である。関心するいくつ
かのビールスはヘルペスシンプレックスビールス、エビ
スタインーハーヒールス、サイトメガロビールス、ミク
ソビールス、アゾンビールス、および肝炎ビールスであ
る。アナライトが靴胞または微生物により産生された抗
原または酵素である場合には、それは生きている、また
は死んだ細胞または有機体の表面上に、細胞または有機
体の抽出液中に、または細胞破片として見出すことがで
きる。従って、患者試料中のアナライトの存在は必ずし
も感染性と相関しない。

本発明のアツセーは標識成分により発生される色シグナ
ルを濃縮させる機能を果す様にデザインされた活性担体
を使用している。史にこの担体は、担体マトリックス上
−＼の、またはその内部への物理的捕捉によって、また
は免疫またはプロダクティブコンプレックスの結合組合
せの−の成分の担体結合により中介された免疫化学的捕
捉によってシグナル生成試薬およびアナライトに対する
キャリアーとしてもまた作用しうる。

活性担体とは本発明のイムノアツセー反応成分および酵
素標識をシグナル生成試薬の間の反応生成物と結合形成
しうるまたは結合しうる担体な意味している。

担体によるシグナルの濃縮はそれが溶液中に均一に分散
している場合には、アツセー媒体中のそのシグナルの高
度の希釈の故にバックグラウンドから実質的に区別でき
ない様なその可視化を１工能ならｌ−める。この様にし
て定量的テスト結果の内接的視覚的読みとりが可能とな
る。

この結果はまた例えば良度分析法によつ゛Ｃ１定量的に
または柿々の一連の色強度標準との視覚的比較によって
平定量的に読みとることができる。

１１１体上に濃縮された色強度に加えて、色の位１ａも
廿た情報を与えうる。例えば関心あるアナライトの含有
が疑われる患者試料を抗体−酵素コンジュゲートと前培
養し、次いで担体上に置いた場合には、担体上のシグナ
ルの位置は補体カスケードの少くとも−の成分を包含す
る第二酵素標識試薬を添加することによって検出するこ
とができる。この濃縮されたシグナルはアナライトの位
置に相当する。この税象を比較目的のために外挿して伝
統的培養法により測定された生きているまたは感染性の
有機体の数を試料中に含有されている抗原物質の存在に
関連させることができる。

担体は種々の多孔性物質から生成させることができる。

適当な担体としてはポリアミド例えはニナイロン、殿粉
顆粒、殿粉で被覆した物質例えば綿またはＰ紙、セルロ
ースナイトレート、ポリビニルアセテートおよび部分加
水分解ポリビニルアセテートおよびポリ（アクリルアミ
ド）殿粉、その他の合成または天然重合体、変性ポリア
ミドおよびその混合物があげられる。ナイロンメツシュ
ディスクを例えばＨＣＱ、で加水分解させて可能性ある
以後の反応のための官能基例えば−ＮＨ２および一００
０Ｈを生成させることができる。

ナイロンを更に交叉結合剤例えばＸ、ＡＭＡ−７（三機
能性アジリジン化合物、コルドパケミカル会社からのも
の）またはヘキサンジアミンで処理することができる。

この担体は非孔性物質例えばセラミックビーズ、ディツ
プスティック、試験管および顆粒孔度がイムノアツセー
の実施に要求されない場合には顆粒物質から成形するこ
とができる。担体はまた抗原それらの酵素標識抗体また
は酵素標識血清補体成分と結合形成または結合しうるそ
の他の物質を含有しうる。活性物質を蛋白質が共有結合
的にまたは非共有結合的に結合しうる様なラテックス重
合体で被覆することが時には有利である。更に多孔性物
質を抗原それらの酵素標識抗体または酵素標識袖体成分
と結合形成または結合しうるその他のキャリアーと混合
させることによって活性担体を製造することもまた可能
である。これらキャリアーとしては、ガラスピーズ、セ
ファデクス交叉結合デキストラン、セファロース交叉結
合アガロースおよびゾルパクス［Ｆ］バッキング物質、
（ＫＩｌ工ｅデュポンデネモアスアンドコンパ二一の登
録商品名）があげられる。

担体自体はその上でアツセーを実施するに適当ないずれ
かの物理的形を有しうる。この形はアツセーのかん境に
よって支配される。そしてこれはディスク様のもの例え
ばフィルターディスク、伸長した様なもの例えばスウオ
ブまたはディツプスティック、コラム状、長方形その他
でありうる。一般に多孔性または微細孔性担体が好まし
い。その理由は反応性成分の捕捉および洗浄の機構およ
び効率が最大化されるからである。ある場合にはマクロ
多孔性担体が適当でありうるけれども、平均細孔サイズ
直径１μｍ以下のミクロ多孔性担体が反応に対して利用
可能な増大した表面積の故に一般に好ましい。孔サイズ
はまたアツセーの間に形成される種々の免疫コンプレッ
クスのディメンジョンにより指定されうる。一般的使用
に対しては、担体の細孔サイズは１Ｑｎｍ以下であるか
または１０μｍ以上であることが好ましい。より小さい
方の細孔サイズの選択は生物学的試料中に存在するビー
ルス抗原の粒子間にまぎれ込んだものを除去する。

（はとんどのビールスはサイズ約１８〜２５０　ｎｍで
ある）。より大なる細孔サイズの選択によっては粒子に
よる一様な細菌（一般に桿菌型有機体の平均サイズは０
．５Ｘ２μｍである）の大きさに関連する分画が達成さ
れることがない。一般的要求として、担体物質の孔度は
抗体酵素コンジュゲート（大約の分子量１０４〜１０６
ドルトン）の分画をさける様なものであるべきである。

本発明のアツセーはディスク型多孔性担体上で活性担体
を充填させたカラム中で、または適当な担体物質を使用
して製造されたスウオブ（ｓｗａｂ）上で実施される。

前記の各々を単一アナライトの存在のテストのために適
用することができるし、または特異的結合試薬をアナラ
イト捕捉のために担体に結合させた場合にはそれぞれを
異ったアナライトの存在のテスト用に適用して多数の区
分に二次分画させることができる。

アツセーがスウオプ上で実施される場合には、アツセー
が実施されるスウォプは患者試料の採取に使用されたも
のと同一でありうる。アツセーがディスクまたは力ジム
中で実施される１局合には、患者試料を常法的に別個の
容器中に集め、そしてその一部をアツセー用に取出す。

担体への非特異的結合はこの担体なその非特異的結合部
位を飽和させる希薄な蛋白質溶液（例えばアルブミン）
で前処理することによって、または柚々の試薬および洗
浄溶液中に低濃度の非イオン性表面活性剤を包含させる
ことによって低下または除外させることができる。

担体と、酵素成分とそれらの基質の反応により生成され
た生成物との相互反応は速やかにかつ選択的に起さなく
てはならない。担体上での色原体シグナルの濃縮は物理
的な力または化学的結合の干渉によって生じうる。結合
はイオン性または共有結合的なものでありうる。

物理的力例えば水素結合、ファンデアワールスカおよび
疎水性相互作用は酵素標識とシグナル生成試薬の間の反
応生成物の種々の担体物質への結合に関与しうる。担体
のイオン性は反応生成物のイオン性を補うために調整さ
せることができる。例えば陽イオン性担体を使用して陰
イオン性生成物を固定させることができるしまた七の逆
を実施することができる。酸性重合体のいくつかの例は
Ｊ　＋）スチレンスルホン酸、カルボキシメチルセルロ
ースおよびアクリル酸、メタアクリル酸およびマレイン
酸の共重合体である。塩基性重合体のいくつかの例はポ
リＲプチド、アミノ官能性の単量体の共重合体およびジ
エチルアミノエチルセルロースである。

担体への反応生成物の共有結合は種々の方法で達成する
ことができる。このアプローチの利点は増強された色性
能により強化される。その理由は生成物は担体の全体的
一部となるからである。

担体は反応生成物の共有結合のための官能基を含有する
様に製造される。これらの基は写真技術で既知の色カッ
プラーの一部である。例としてはアゾメチン、アゾ−、
ロイコ−、インダシリン−、インドアニリン−およびピ
ラゾロン染料があげられる。

色カッシラーを有する担体を製造するためには、これら
は低い移動度を有している必要がある。それらは疎水性
および／またはイオン性の基を付加させてその分子量を
上昇させることによって非拡散性とすることができる。

これは直接重合体担体中に包含させることのできる表面
活性剤様構造の結果となる。このカップラーはまたこの
カップラーを担体に共有結合的に結合させることによっ
て、担体上で不動化させることができる。

ある場合には試料からそれぞれアナライトまたは免疫コ
ンプレックスを特異的に捕捉させるために標識抗アナラ
イト抗体または補体成分で担体をコーティングさせるこ
とが望ましい。一般に抗体上の、または補体成分上の官
能基を介して直接またはスぼ−サーアーム例えば蛋白質
。

ポリアミノ酸または合成結合基を介して間接的に担体に
抗体または袖体成分を共有結合的に結合させることが好
ましい。抗体または補体成分の吸着は１時にはアツセー
の間充分な安定性を与えうるけれども、安定性の観点か
らは共有結合が望ましいと考えられている。結合法は結
合活性を可及的最高度に保持させる様に選ばれるべきで
ある。標識抗アナライト抗体がこの方法で使用される場
合には、酵素標識抗体コンジュゲート中に使用される抗
体は担体のコーティングのために使用されるものと同一
でありうるしまたはそれはアナライト上の異った抗原決
定因子に関する抗体でありうる。

アナライトが抗体である様なある場合には。

抗体の以後の免疫化学的捕捉のために同基源抗体を担体
に結合させることができる。

例えばアナライト含有試料の酵素標識抗体との、それに
続く酵素標識補体成分との前培養によってアツセー媒体
中にプロダクティブコンプレックスが形成される様なあ
る場合には、担体は形成されたプロダクティブコンプレ
ックスを保持する様な、しかし余剰の試薬の通過を可能
ならしめる様な孔サイズのものでなくてはならない。市
販の入手可能なｐ紙または多孔性膜は適当な細孔サイズ
の種々の便利な選択を可能ならしめる。−の特に適当な
多孔性膜は、０．４５μと称される細孔サイズを有して
いる。

免疫化学的捕捉のための活性固体担体へ、の酵素標識抗
体または補体成分を包含する活性成分を結合させること
における重要な考察事項は、抗体または補体成分の特異
的結合性とそれらに結合させる酵素の触媒性の両方を保
持させる様な方法で結合を実施させるということである
。

ある場合には活性成分を直接担体にまたは活性体に結合
させることが望ましいがもしれない。

本発明のイムノアッセーの実施に必要とされる抗体は動
物の免疫および細胞融合技術（ハイブリドマ−）を含む
当技術の既知の方法によって生成させることができる。

全血清、腹水または組織培養液としてそれは使用できる
。しかし一般には精製または一部精製調製品を使用する
ことが好ましい。免疫グロブリン分画は硫酸アンモニウ
ム沈殿により生成させることができる。

Ｉｇａ分画はイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル
濾過により得ることができる。抗体はまた抗原でコーテ
ィングした担体からの溶出によってアフィニティー精製
させることができる。

本発明に使用しうる補体固定または結合抗体としては人
工ｇＧ１工ｇＧ２および工ｇＧ５、マウスエｇＧ２ａお
よびマウスエｇＧ２ｂ　、モルモットエｇＧ２　、Ｍ工
ｇＧおよび工ｇＭ抗体の補体固定抗体を有していること
の知られている種からのものがあげられる。

ＩｇＧタイプの抗体が本発明の実施に対して選択された
場合にはそれらは少くとも２−のエピトープを有するア
ナライトに対して特異性を有していなくてはならず、ま
たはそのアナライトに対するものでなくてはならない。

ここにエピトープとは単一決定因子を意味すると理解さ
れる。

選ばれたＩｇＭタイプ抗体は−）またはそれ以上のエピ
トープを有するアナライトに対するものでありうる。

本発明のイムノアツセーにおいては、固体担体上で免疫
コンプレックスを捕捉するためにまたは溶液中で免疫コ
ンプレックスを結合させるための前培養試薬として、ま
たはその様に形成されたプロダクティブコンプレックス
の捕捉のために使用される標識された非抗体蛋白質はア
ナライトとまたは相互の特異的結合反応において沈殿し
た免疫グロブリン分子と相互反応する血清補体蛋白質の
少くとも−の成分である。これら補体蛋白質は可溶性お
よび不溶性膜結合アナライトに対してはＯｌｑ　、　Ｏ
ｌｒおよびＣ１８でありうるが、これら各々は前記補体
蛋白質の免疫コンプレックスへのまたは相互の特異的結
合を阻害しない、それに好ましくは共有結合的に結合さ
せた酵素標識を有している。ＯａｒはＯｌｑにそして０
１ａはｄｌｒに結合することが知られている。

これら補体蛋白質は本発明においては二重の機能を果し
ている。それらは細孔サイズ制御固体相上またはその中
への物理的捕捉を確実ならしめるために、プロダクティ
ブコンプレックスの形のそれらに結合させた免疫コンプ
レックスの分子ディメンジョンを大きくさせる。第２に
それらは近辺における抗体の補合酵素標識との反応に関
与する適当な酵素のキャリアとして働く。

この補体蛋白質は適当な動物源から例えばジエイ・イム
ツル（Ｊ、■ｍｍｕｎｏ１．）１０６，３０４（１９７
１）によって精製させな（てはならない。またはこれは
精製した形で購入することができる。標識抗体と組合せ
て前培養試薬として使用される場合には、標識補体蛋白
質は非特異的吸着または活性化を阻止するために（ａ＋
＋およびＭｇ＋＋陽イオンを実質的に欠いている媒体中
に保持される。カルシウムおよびマグネシウムイオンは
免疫コンプレックスへの標識補体蛋白質の結合を仲介さ
せるために加えられるブツセ−アナライト希釈バッファ
ー中に与えることができる。

標識抗体および補体成分コンジュゲート中の酵素は例え
ば以下の表に示されている様な、当技術に既知の種々の
相補的酵素組合せから選ぶことができる。

第−酵素　第二酵素 グルコースオキシダーゼ　ホースラディツシュパーオキ
シダーゼガラクトースオキシダーゼ　ホースラデイッシ
大ヘーオキシダーゼウリカーゼ　ホースク／イッシュパ
ー：ｍシｐ−ゼグルコースオキシダーゼ　ミク日パーオ
キシダーセエステラーゼ　Ｉ−グルクロニダーゼ アルカリホスファクーゼ　パーオキシダーゼヘキンキナ
ーゼ　グルコース−６−ホスフェート作ト５ダ六−ぜア
ルカリホスファターゼ　β−ガラクトシダーゼこれらの
酵素はそれらの安定性、ターンオーバー数、精製の容易
さ、測定の容易さおよび生物試料中に非々にして見出さ
れる阻害９勿質から自由であることから選択される。更
にそれらは特に第−酵素−基質反応の生成物が第二酵素
の基質として働くというそれらの相補性から選ばれる。

この反応からの生成物は次いで固体担体と相互反応して
本発明のイムノアツセーのシグナルを生成させ、そして
これを濃縮させる。アナライトが酵素である場合には、
それは標識および特異的結合組合せ成分の両方として働
く。

酵素標識の抗体および補体成分へのコｙジュゲーション
は既知の方法によって、そして抗体または補体成分の免
疫反応性の損失および標識の活性損失を最小とさせる様
な方法で実施することができる。結合は直接的なもので
ありうるし、またはスは−サーアームを介しての間接的
なものでありうる。通常アツセーに使用する前に未反応
標識、未反応抗体および補体成分、および非免疫反応性
標識抗体および補体成分を除去するためにコンジュゲー
トをＭ製することが必要である。これはダル濾過とアフ
ィニティークロマトグラフィ一段階の組合せによって達
成することができる。

一般に一活性結合成分当り可及的多数の酵素分子を有す
ることが望ましい。そしてどの場合にも酵素：活性結合
体の比は１：１以下であるべきではない。酵素標識分子
の数は活性結合成分の免疫反応性と標識の酵素反応性の
両方を保持するという圧倒的な要求により限定されてい
る。ある場合には、活性を相互にではなくそれぞれを共
通のキャリアーに活性結合成分と標識を結合させること
が有利でありうる。例えば−の抗体または補体蛋白質お
よびい（っかの標識を高分子１蛋白質または多糖体例え
ばデキストランにコンジュゲートさせることができる。

シグナル生成剤とのプロダクティブコンプレックスの酵
素成分の反応生成物は実質的に無色であり、そしてこれ
は担体と相互反応しうる。

この相互作用は担体と結合したシグナル発生生成物形成
を導く。このシグナル発生生成物は、担体と独立して存
在している場合にはアッセー媒体中に可溶性である。相
互作用は担体物質と実質的に無色の生成物をマツチさせ
ることにより可能ならしめられる。そしてこれは本発明
のアツセーを、感染、：症、・を７生ぜしめる原因の速
やかな決定に対して独特に有用なものとしている。

シグナル生成剤はプロダクティブコンプレックスの酵素
標識成分の生成物の活性担体との相互作用によって検出
可能なシグナルを生成させることが必要な本発明のイム
ノアツセーの成分である。これら試薬は酵素標識用の基
質または例えばカップリングさせた酵素反応において酵
素標識に対する基質を生成させることのできる物質組合
せを包含している。

この生成物は実質的に無色である。即ち実際的アツセー
に対しては充分に可視的ではないがしかしシグナル発生
生成物の形成によって担体と相互作用した場合にはより
可視的に着色され物質でありうるがこれは酵素触媒反応
の生成物とし【生成されたヨー素とコンプレックス形成
して担体上に特性的な背合な生成させることができる。

ここではシグナル発生生成物は殿粉−ヨー素コンプレッ
クスである。

本発明のアツセーは第一にアナライトの含有の疑われて
いる患者試料を抗アナライト抗体−酵素コ／ジ５−ゲー
トおよび酵素標識補体成分例えばＯｌｑを包含する前培
養試薬に接触させることによって実施される。患者試料
としては全血、血清、血漿、尿、脳を髄液、咽喉スウオ
ブ、壊死部浸出液、大便および排泄物の水性分散液、は
く離動または洗浄液をあげることができる。

患者試料が天然の非標識補体成分を含有している場合に
は、ある場合にはその様な試料を補体除去して免疫コン
プレックスと結合しそしてそうすることによってアツセ
ーの間に加えられた標識補体成分を置換させる様な阻害
的補体成分を除去することが好ましい。便利な補体除去
法はジエイ・タリノ・ラブ・イムノＡ／　（Ｊ、　０１
ｉｎ。

Ｌａｂ、工ｍｍｕｎｏｌ、）　５．１２９　（１９８１
）に記載され【いる。

その他の場合には試料を補体除去にかげないことが好ま
しい。天然の補体成分による免疫コンプレックスからの
特異的標識補体成分の置換は本発明のアツセーにおいて
は、既知の濃度の標品との相対的な、患者試料中の前記
天然補体成分の欠除または過剰の評価を与えることに利
用することができる。

典型的には前培養はｐＨ７〜８最も頻ばんにはｐＨ７２
〜′７．５の中性にノくツ１アー化させたそれぞれ０．
１〜１．０μＭ範囲のＯａ”＋およびＭｇ＋＋イオン濃
度（好ましくはＯａ”　０．５〜１．０μＭ１そし、、
ＣＭｇ＋＋０．１〜０．４μＭ）で４〜４５℃最も頻ば
んには２３〜６７℃の温度範囲で１分〜１時間、最も頻
ばんには５分〜１５分の期間に亘って実施されうる。

この前培養から得られた活性成分はプログクチイブコン
プレックスと称される。充分な抗原−抗体反応および補
体固定を短時間に確実ならしめるためには抗体−酵素コ
ンシュゲートおよび酵素標識０１ｑは共にアナライトに
対して少くとも１モル過剰で使用される。反応の化学量
論は経験的に決定される。

それぞれ酵素標１１０１ｒおよびＯｌｅを加えることに
よってその他の酵素分子をこの可溶性アナライトのプロ
ダクティブコンプレックス中に包含させることができる
。

このプログクチイブコンプレックスは濾過。

スポツティングまたはスウオビングによって担体上に沈
着させることができる。担体は次いで４〜１００間のｐ
Ｈにバッファー化させた水性溶液で洗うことができる。

バッファーにはまた表面活性剤例えば非イオン性表面活
性剤蛋白質例えばアルブミンおよび電解質を含有させう
る。

洗浄は担体を通してバッファーを流すことによって達成
することができる。またはある場合には新しいバッファ
ーに担体をくりかえし浸すことによって担体な洗うこと
が充分でありうる。

前者のアプローチが通常より速やかでありかつより効率
的でありそして好ましい。遊離コンジュゲートは担体に
よって捕捉されないが、一方アナライトに結合したコン
ジュゲートは担体上に保持されそして以後のシグナル発
生試薬との反応に対して利用可能となる。免疫化学反応
に関与しなかった試料中の外来性物質もまた洗浄により
除去される。

本発明のアツセーはまた抗アナライト抗体−酵素コンジ
ュゲートを活性固体担体に共有結合的に結合させ、そし
て一連にこの担体を患者試料に接触させ【免疫コンプレ
ックスを形成させ、次いでＣ１ｑ−酵素コンジュゲート
と接触させてプロダクティブコンプレックスを生成させ
ることにより実施することができる。担体を次いで前記
の様にして洗浄することができる。

本発明のアツセーはまた標識補体成分、好ましくはＣ１
ｑ−酵素コンジュゲートを活性固体担体に共有結合的に
結合させ、そしてこの担体を患者試料と抗アナライト抗
体−酵素コンジュゲートの前培養により形成された免疫
コンプレックスと接触させることにより実施しうる。ｐ
Ｈ％時間および培養温度および以後の洗浄の条件は前記
の通りである。

洗浄後担体なシグナル発生試薬に接触させる。

抗体−酵素標識がホースラディツシュパーオキシダーゼ
（ＨＲＦ）であり、そしてＣ１Φ酵素標識力ｔグルコー
スオキシダーゼ（ａＯ）である場合に＆家、シグナル発
生試薬は例えば適当に／々ｙ　−ｙ　７−　（ｔｓさせ
た水性媒体中のグルコースおよびヨーイヒナトリウムよ
りなる。シグナル生成試薬１１担体を通して流すことが
できるしまた１ま担体をこの溶液中に浸すことができる
。グルコースへのグルコースオキシダーゼの作用により
生成したＨ２Ｏ２は１（ＲＰ用の基質として働いて、ヒ
ドロ、４−オキサイドコンプレックスを生成させる。こ
れ瞼家次いでヨー素イオンをヨー素に酸化させる。これ
は殿粉中のアミロースとシグナル発生コンプレックスを
形成して、深育色を生成させる。その強度が試料中のア
ナライト濃度に直接比例している。この色は、担体上で
濃縮される。好ましくは形成される色は安定であり、そ
１．てこれｉｔテスト結果の永久的記録として保存する
ことカｔできる。

シグナル発生生成物の増巾は、標識Ｃ１ｑに基く可溶性
プロダクティブコンプレックスを免疫コンプレックス結
合Ｃ１ｑ、−酵素コンジュゲートに結合する酵素標識０
１ｒおよび酵素標識Ｃ１８試薬でこの添加順序で更に処
理することによって可能となる。これら追加の酵素標識
補体蛋白質はプロダクティブコンプレックスの分子ディ
メンションを増大させそしてまたコンプレックスの特異
活性も付加する。免疫コンプレックスに結合させた各０
１ｑ−酵素ゴ／シユゲート各々に対して２の０１ｒ−酵
素コンジュゲートおよび２の０１ｔａ−酵素コンジュゲ
ートを結合させることができる。

例　１ ヘルズスシンプレツクスビールスのアツセー（Ａ）　Ｃ
１（ｌに対するグルコースオキシダーゼのコンジュゲー
シヨン グルコースオキシダーゼ（シグマケミカル会社、セント
ルイス、Ｍｏ、）’ｉイムノケム（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍ、　。

８．１１７５（１９７１）に記載の２段グルタルアルデ
ヒド法の変法を使用してＣ１ｑ　（ＣＥＲラボラトリー
ズ社、ボストン、Ｍａｓｓ）にコンジュゲートさせた。

１０ｎｇのグルコースオキシダーゼヲ１．２５％（ｖ／
／ｖ）グルタルアルデヒド含有の０．１Ｍホスフェート
バッファー０．２　ｍｌ　（ｐＨ６，８）に溶解させた
。この混合物をしずかにゆ９動かして時々攪拌すること
によって室温に１８時間保持させた。

次いでこの混合物を０．１５　Ｍ　ＮａＣ１を使用して
製造したセファデクスＧ−５０（７アルマシアフアイン
ケミカルズ、ピスカタウエイ、　ＮＪ　）の１×６０ｃ
ｍのカラム上でのグロマトグラフイーにかけた。

カラムを０．１５Ｍ　ＮａＣ７で溶出させ、そして酵素
含有の褐色の帯域を１〜２−容量を集めた。１ηＣ１ｑ
を１−の０．１５　Ｍ　Ｎａ、Ｃ１に加え、そして得ら
れた溶液のｐｌ’（を０．１−の１．０Ｍカーボネート
／ビカーボネートバッファーで９５に調整した。

この溶液を４℃に２４時間保持し、この時点で０．１−
００．２Ｍリジン溶液を加えて、・更に２４時間４℃に
亘ってすべての残存活性アルデヒドを反応させた。この
ようにして製造されたグルコースオキシダーゼ−Ｃ１ｑ
コンジユゲートをボレートバッファー化食塩水（０，１
Ｍ硼酸、Ｏ，［１２５Ｍナトリウムテトラボレー１−、
’　０．０７５Ｍ塩化ナトリウム、Ｉ）Ｈ７，６）で、
そのｐＨが９５から１６に下がるまで、数回水をとりか
えて透析させた。

透析させたコンジュゲート溶液は一２０℃で保存され穴
。

（Ｂ）　活性固体担体の製造 イージーオンスプレースターチ（Ｅ’ａｓｙ　”’　ｏ
ｎＳｐｒａｙ　５ｔａｒｃｈ　）をビーカー中にスプレ
ーしそして沈着せしめた。牛血清アルブミン（ＢＳＡ：
ＲＩＡグレード、シグマケミカル会社１．セントルイス
。

Ｍｏ　）をとの殿粉懸濁液と１．０チ（ｗ／ｖ）の最終
濃度に混合した。ニトロセルロース微細孔性７−１ルタ
ー（タイプＨＡ、０．４５μＭ、　４７　ａｒｍ　ｓ　
ミリボア社、×ドフオード、Ｍａ　）をこの殿粉−ＢＳ
Ａ浴液に沈め、取出し、そして４０℃で乾燥させた。

調製されたフィルターは使用前２ケ月までは密封褐色ビ
ン中に室温で保存された。この時それを例１（Ａ）で使
用されているボレートバッファー化食塩中で再水加させ
た。

（Ｃ）　アツセー （１）　Ｃ１ｑ−酵素コ／シュゲート水準選択ホースラ
デイシュバーオキシダーゼにコンジュゲートさせた免抗
−Ｈ８Ｖ　−１（ＨＲＰ−抗−Ｈ８Ｖ　−１、アキュレ
イトサイエンテイフイク、ウェストヘリ−、ＮＹ）およ
び前記Ａで製造されたグルコースオキシダーゼ（Ｇｏ）
　−Ｃ’ｌｑコンジュゲートの選ばれた量を一緒にＣａ
１士−およびソ虜十十陽イオンなしのｐＨ７，３〜Ｚ４
のベロナールバッファー希釈剤（０，１４Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．００５５Ｍナトリウム−５，５−ジエチルハ
ルピッレート、０．００３５Ｍ塩酸、０゜１％（Ｗ／Ｖ
）ゼラチン）で希釈させた。ＨＲＰ−抗−Ｈ８Ｖ　−１
はいくつかのテスト溶液の各々において１コ３０の最終
希釈で使用された。この場合Ｇｏ　−ｃｘｑコンジュゲ
ートの最終希釈は１：４〜１　：　１２８の範囲であっ
た。

一定量のＨＲＰ−抗−Ｈ８Ｖ　−１含有のＧｏ　−Ｃ１
ｑ希釈液の各々５０μｔに、組成培養液体中のＨ８Ｖ　
−１抗原（Ｍ、Ａ、バイオプロダクツ、ウォーカースピ
ル、Ｍｄ７０．０００５６Ｍ塩化マグネシウムおよび０
．００１５０Ｍ塩化カルシウム含有ベロナールバッファ
ー希釈群液中の１＝５０希釈液として５０μｌ加えた。

各希釈液の５０μｔをまた５０μｔのＭｇ　＋＋および
Ｃａ＋１は含有するがＨ８Ｖ−１は含有しないベロナー
ルバッファーと組合せてネガティブの反応フントロール
とした。各溶液をしずかに混合し、そして室温で５０分
間培養させた。培養の後で、５０μｔの各溶液を前記（
Ｂ）で製造された殿粉コーティングしたフィルターに適
用し、そしてツイン２０表面活性剤（０，０５％η〜）
含有のホスフェートバッファー液加食塩水３０−で洗っ
た。各フィルターを室温で１０分間１７！の色発生溶液
（０，０４Ｍクエン酸、０．０６７Ｍ燐酸ジ−ナトリウ
ム、０．０５６Ｍグルコース、０．０９４Ｍヨー化ナト
リウム、ｐＨ５，５）含有のはトリ皿に浸した。色発生
溶液を１０分後に除去した。色（青ン測定は可視的に（
陰性）〜什→のスクールで評価された。ｒｂｖＪは陰性
の読みとはわずかたけ区別することのできる、しかじ七
ん読みよりは弱い強度の、「かすかに見ることのできる
」色を意味している。視覚的読みとりは、色生成溶液を
最初に各フィルターに接触させた時点から５分、１０分
および１５分でフィルター上で実施された。次の結果が
得られた。

色強度 １：４　＋２　−　＋３　−　＋４　ｂｖｌ：８　＋２
　＋５　−　＋４　ｂｖ Ｃ１６＋１　−＋２−＋３．　ｂｖ ｌ：５２　＋／−−＋／−−＋１　− １：６４　ｂｖ　−ｂｙ　−＋／−− １Ｎ２Ｂ　−ｂｖ−ｂｖ　− Ｃ１ｑ−ＧＯ／　− なし バックグラウンドに対してシグナルを最大化させるＣ１
ｑ　−Ｇｏ水準は１：４と１：８最終希釈の間に選ばれ
た。

（２）抗−Ｈ８Ｖ　−１−ＨＲＰの水準選択前記（Ｃ）
、　（１）に使用されているすべての条件、方法、試薬
および濃度がまた使用されたが但し抗−Ｈ８Ｖ　−１−
ＨＲＰ　：Ｆ　７ジユゲートは１：１ｏ〜１：６０の範
囲に希釈された。Ｃ１ｑ　−（）Ｏは１：５希釈の一定
濃度で使用された。読みとりは色発生溶液の添加から５
分および１０分後に実施された。

次の結果が得られた。

色強度 １：１０　４＋　＋／−４＋　＋／− Ｃ２０３＋　＋／−４＋　＋／− １：３０　２＋　−３＋　十／− １二４０　２＋　−３＋　＋／− １：ｓａ　１＋　−２＋　＋／− １：６０　１＋　−２＋　＋／− コ／シュゲートなし　−十／−十／− １：２０〜１：３０の範囲の抗−Ｈ８ＶＩ　−ＨＲＰの
最終希釈濃度の選択は陽性および陰性濃度試料の充分な
区別を可能ならしめる。

（３）　へル×スシンプレツクスビールスのアツセー感
度 前記（Ｃ）　（１）および（Ｃ）　（２）にすでに開示
されている条件および方法の元におけるアツセー感度を
測定するためにＴ（ＳＶ　−１抗原を１：２０〜１　：
４８６０の範囲に希釈させた。色生成溶液を添加してか
ら５分後に読みと９を実施した。次の結果が得られた。

色強度 に２０４＋ｂｖ １：６０　４＋　− １：１８１］　３＋　− １：５４０　２＋　− １：１６２０　１＋　− １：４８６０　＋／−− 抗原なし　ｂｖ　− 特許出願人　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアースー
アンド・コン′バニ−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）生物学的試料中のアナライトの検出のための （Ａ）　免疫学的に抗体に結合したアナライトを包含す
   る第一酵素成分を有する免疫コンプレックスおよび、免
   疫コンプレックスに結合した少くとも−の補体成分を包
   含する第二酵素成分を有するプロダクティブコンプレッ
   クスを活性担体上に集めまたはそこに形成させること、 （Ｂ）　活性担体を洗うこと。 （０）　シグナル生成試薬に、この担体上の酵素成分を
   接触させ、それによってアツセー媒体中に可溶性の実質
   的に無色の生成物を形成させること、そして Φ）その生成物を担体と相互作用させてその相互作用で
   担体に結合したシグナル発生生成物を形成させること の段階を包含する、イムノアツセー。 ２）プロダクティブコンプレックスがＯ］、ｑ：、　（
   ！ｌｒおよびｃｐｓよりなる群から選んだ酵素標識補体
   成分の醇索標識免疫コンプレックスによる補体固定の生
   成物である前記特許請求の範囲第１項記載のイムノアツ
   セー。 ３）アナライトが可溶性有機抗原およびノ１ブテン、細
   胞、微生物およびそれらの生成物よりなる群から選ばれ
   る前記特許請求の範囲第１項記載のイムノアツセー。 ４）担体がナイロン、セルロースナイトレート。 エチルセルロース、変性ポリアミド、殿粉を被覆した物
   質または殿粉を包含している前記特許請求の範囲第１項
   記載のイムノアツセー。