JPS6232363A - 抗核抗体の検出方法及び装置 - Google Patents
抗核抗体の検出方法及び装置Info
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- JPS6232363A JPS6232363A JP14470586A JP14470586A JPS6232363A JP S6232363 A JPS6232363 A JP S6232363A JP 14470586 A JP14470586 A JP 14470586A JP 14470586 A JP14470586 A JP 14470586A JP S6232363 A JPS6232363 A JP S6232363A
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
- G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産１Ｌしｎ上」Ｌ矩ガ一
本発明は、ヒトの患者からの生物学的試料、例えば血清
試料、中の抗核抗体の検出に関連する。
試料、中の抗核抗体の検出に関連する。
従朋−
何らかの病気にかかっているヒト患者の血液は、自己抗
体の存在により特徴づけられが、この自己抗体は、その
患者の細胞の核内に存在する１以上の抗原と反応性であ
る。これらの自己抗体は、それらの病気に特有な症状に
対して、少なくとも幾分かは原因となっていると考えら
れる。抗体を生じることのできる核抗原には、ＤＮＡ、
核蛋白質および核多糖類、がある。血液中の抗核抗体の
存在により特徴づけられる病気には、全身性紅斑性狼１
１（ＳＬＥ）；混合結合組織病；ショーグレン症候群；
および♀皮症；が含まれる。
体の存在により特徴づけられが、この自己抗体は、その
患者の細胞の核内に存在する１以上の抗原と反応性であ
る。これらの自己抗体は、それらの病気に特有な症状に
対して、少なくとも幾分かは原因となっていると考えら
れる。抗体を生じることのできる核抗原には、ＤＮＡ、
核蛋白質および核多糖類、がある。血液中の抗核抗体の
存在により特徴づけられる病気には、全身性紅斑性狼１
１（ＳＬＥ）；混合結合組織病；ショーグレン症候群；
および♀皮症；が含まれる。
適当でしかも臨機の診断ならびに治療を促進するために
は、９期に血清中の抗核抗体の存在を検出することが重
要である。今日、このような血清の与予検は、例えば、
細胞（例えばヒトのＨＥｐ−２細胞株のもの）をガラス
スライド上で成長させ、この細胞と細胞′１１膜の透過
性を増すように処理し、血清試料をこのスライドに適用
して、間接的な免疫蛍光により抗核抗体とスライド上の
細胞の核抗原との間の免疫複合体を検出することを包含
する。
は、９期に血清中の抗核抗体の存在を検出することが重
要である。今日、このような血清の与予検は、例えば、
細胞（例えばヒトのＨＥｐ−２細胞株のもの）をガラス
スライド上で成長させ、この細胞と細胞′１１膜の透過
性を増すように処理し、血清試料をこのスライドに適用
して、間接的な免疫蛍光により抗核抗体とスライド上の
細胞の核抗原との間の免疫複合体を検出することを包含
する。
例えばモルデン（Ｍｏｌｄｅｎ）外（１９８３）Ａ４．
Ｊ 。
Ｊ 。
Ｃｌ１ｎ、 Ｐａｔｈ、 ８２ １．５７．に記載され
た間接的な免疫蛍光抗核抗体試験により、実施される。
た間接的な免疫蛍光抗核抗体試験により、実施される。
一般に、本発明は、多数の真核を固体支持体、例えば９
６穴（ｗｅ Ｉ Ｉ ）エリザ（ＥＬＩＳＡ）平板、に
付着させ；この試料をこの試料中の抗核抗体が細胞核内
の核抗原との免疫複合体を形成するのに十分な粂件下で
、支持体と接触させ；そしてこの免疫複合体を試料中の
抗核抗体の存在の指示物として検出する；ことによる生
物学的試料中の抗核抗体の検出を包含する、。
６穴（ｗｅ Ｉ Ｉ ）エリザ（ＥＬＩＳＡ）平板、に
付着させ；この試料をこの試料中の抗核抗体が細胞核内
の核抗原との免疫複合体を形成するのに十分な粂件下で
、支持体と接触させ；そしてこの免疫複合体を試料中の
抗核抗体の存在の指示物として検出する；ことによる生
物学的試料中の抗核抗体の検出を包含する、。
好ましくは、固体支持体上の核の下には、事実上無核抗
原に対する抗体と反応せず、そしてこの核のように試料
中の抗核抗体を結びつけるのに役立つ、被膜、例えば核
抗原の被膜、がある、２つの異った核抗原含有被膜を用
いるのが特に有利であって、例えば一つは同じ核を離断
することによって調製したものが無傷の形で使用され；
そして二つめは別の源からのものであって；この第二の
源の抗原は、試料中の抗核抗体を結合することに加えて
、その抽出し得る核抗原を結合することにより他の被膜
成分を安定させる。この、核と被膜との結合が、核また
は被膜単独よりもはるかに有効な予検装置を提供する。
原に対する抗体と反応せず、そしてこの核のように試料
中の抗核抗体を結びつけるのに役立つ、被膜、例えば核
抗原の被膜、がある、２つの異った核抗原含有被膜を用
いるのが特に有利であって、例えば一つは同じ核を離断
することによって調製したものが無傷の形で使用され；
そして二つめは別の源からのものであって；この第二の
源の抗原は、試料中の抗核抗体を結合することに加えて
、その抽出し得る核抗原を結合することにより他の被膜
成分を安定させる。この、核と被膜との結合が、核また
は被膜単独よりもはるかに有効な予検装置を提供する。
その他の好ましい具体化では、免疫複合体の検出は、標
識された抗ヒト抗体、最も好ましくは、化学的に基質（
これが次に試薬に作用して色の変化を起こす）を変える
ように作用する酵素との結合により標識されたもの、に
よって実施される。
識された抗ヒト抗体、最も好ましくは、化学的に基質（
これが次に試薬に作用して色の変化を起こす）を変える
ように作用する酵素との結合により標識されたもの、に
よって実施される。
本発明は、これまで特定の非可動性抗原と反応性の特異
な抗体の検出についてのみ得られ、抗核抗体の存在に対
する試料の予検法については得られなかった速度、簡易
性、感度、および自動操作の可能性、を包含する、系で
、抗核抗体の存在に対するヒト血清の予検法を与える。
な抗体の検出についてのみ得られ、抗核抗体の存在に対
する試料の予検法については得られなかった速度、簡易
性、感度、および自動操作の可能性、を包含する、系で
、抗核抗体の存在に対するヒト血清の予検法を与える。
本発明によれば、その血清が抗核抗体を含有していて、
そのためその患者がかかっている特定の自己免疫病を識
別して適当な治療の開始を早めるための特有の診断試験
を受けなくてはならない患者を識別するための、大規模
な血清試料の予検法が与えられるであろう。
そのためその患者がかかっている特定の自己免疫病を識
別して適当な治療の開始を早めるための特有の診断試験
を受けなくてはならない患者を識別するための、大規模
な血清試料の予検法が与えられるであろう。
本発明のその他の特徴ならびに利点は、下記のその好ま
しい具体化の説明、および特許請求の範囲から明らかで
あろう。
しい具体化の説明、および特許請求の範囲から明らかで
あろう。
本発明のＡＮＡ試験の特定の具体化を以下に記述する。
試験平板を次の３つの核抗原含有物質で被覆する：
１）“’ＧＮ”と表示される無傷のヒト細胞核；２）
“’ＮＳ”と表示される離断されたヒト細胞核の核抗原
；および ３）”ＥＮＡ”と表示される子牛の胸腺抗原（ＤＮＡお
よび核蛋白質を含有する）。
“’ＮＳ”と表示される離断されたヒト細胞核の核抗原
；および ３）”ＥＮＡ”と表示される子牛の胸腺抗原（ＤＮＡお
よび核蛋白質を含有する）。
第一段諧は、１５０ｃｍ２の培養皿で３日間、皿の全面
の３分の１に接種したＨＥｐ−２細胞を成長させること
である。ＨＥｐ−２細胞は、メリーランド州ロックビル
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２３から得
られる、ヒトの良道腫瘍細胞株である。この培養皿をヒ
ユームフード内に入れ、培地を２リツトルの収集フラス
コ内に吸引する。
の３分の１に接種したＨＥｐ−２細胞を成長させること
である。ＨＥｐ−２細胞は、メリーランド州ロックビル
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２３から得
られる、ヒトの良道腫瘍細胞株である。この培養皿をヒ
ユームフード内に入れ、培地を２リツトルの収集フラス
コ内に吸引する。
次に容器に１０１１の塩水を加えて、全部の皿を静かに
揺すって細胞から培地を洗い落とす０次に塩水を第二の
２リツトル収集フラスコ内に吸引する。
揺すって細胞から培地を洗い落とす０次に塩水を第二の
２リツトル収集フラスコ内に吸引する。
次に容器に’３ｚｌの塩水を加えて、細胞を、ゴムのポ
リスマンを用いて皿からガラスロッド上に掻きとる。こ
の細胞を、パスツールピペツ１へで５０１１のポリプロ
ピレン遠心管に移し、セントラ（Ｃｅｎｔｒａ） ７
Ｒ遠心分Ｍ機上で、５００ ｘｇ（１５００ｒｐｍ）で
５分間遠心分離する。上澄みを捨て、細胞ベレットを、
脱イオン化８２０１リツトルあたり０．４ｇ ＮａＨ２
ＰＯ＜；６．８ｇＮａ２ＨＰＯ＜；および３．０ｇＮａ
Ｃ／を含有し、６ＮＮａＯＨまたは６ＮＨＣ１でｐｉ（
８，０に調整した。リン酸塩で緩衝化した塩水中に完全
に再懸濁させてもとの容積とする。ａＮ成分については
、細胞懸濁液の全容積の１０分の１を別の５０１１の遠
心管に入れ、これに、細胞懸濁液１ｘｌあたり２５％の
グルタルアルデヒド０．０２ｚ１を加える。この懸濁液
を混きして、室温で３０分間放置する。
リスマンを用いて皿からガラスロッド上に掻きとる。こ
の細胞を、パスツールピペツ１へで５０１１のポリプロ
ピレン遠心管に移し、セントラ（Ｃｅｎｔｒａ） ７
Ｒ遠心分Ｍ機上で、５００ ｘｇ（１５００ｒｐｍ）で
５分間遠心分離する。上澄みを捨て、細胞ベレットを、
脱イオン化８２０１リツトルあたり０．４ｇ ＮａＨ２
ＰＯ＜；６．８ｇＮａ２ＨＰＯ＜；および３．０ｇＮａ
Ｃ／を含有し、６ＮＮａＯＨまたは６ＮＨＣ１でｐｉ（
８，０に調整した。リン酸塩で緩衝化した塩水中に完全
に再懸濁させてもとの容積とする。ａＮ成分については
、細胞懸濁液の全容積の１０分の１を別の５０１１の遠
心管に入れ、これに、細胞懸濁液１ｘｌあたり２５％の
グルタルアルデヒド０．０２ｚ１を加える。この懸濁液
を混きして、室温で３０分間放置する。
残っている１０分の９の細胞懸濁液に、上記のｐＨｓ、
ｏのリン酸塩緩衝化塩水中の１０．０％トライトン（Ｔ
ｒｉｔｏｎ）Ｘ −１００、洗剤、を加えるが、この洗
剤溶）αは、この細胞懸濁液の容積の２０分の１景加え
られる。この懸濁液を１０−１５秒渦動させて細胞質を
抽出し、完全に洗剤を溶解させる。細胞を５００ｘｇで
５分間遠心分離し、上澄みを捨てて、ペレットをもとの
容積の塩水中に渦動させることによって完全に再懸濁さ
せ細胞質物質を、再び５００ｘＦ１で遠心分離する。
ｏのリン酸塩緩衝化塩水中の１０．０％トライトン（Ｔ
ｒｉｔｏｎ）Ｘ −１００、洗剤、を加えるが、この洗
剤溶）αは、この細胞懸濁液の容積の２０分の１景加え
られる。この懸濁液を１０−１５秒渦動させて細胞質を
抽出し、完全に洗剤を溶解させる。細胞を５００ｘｇで
５分間遠心分離し、上澄みを捨てて、ペレットをもとの
容積の塩水中に渦動させることによって完全に再懸濁さ
せ細胞質物質を、再び５００ｘＦ１で遠心分離する。
次に上澄みを捨て、核を前の容積の１／２の、６ＮＨＣ
１でｐＨ８，１に調整した、脱イオン水１リツトルあた
り１ 、２１ ｇＴｒｉｓおよび０．３８ｇＥＤＴＡよ
り成る核ＩＩ衝液中に再懸濁させる。その後、核を、ブ
ランリン（Ｂ ｒａｎｓｏｎ） ２００ Ｍ音波発生ｔ
ｌｌ（ｓｏｎ ｉ ｒ １ｅｒ）上、出力５．２０％パ
ルスされた使用サイクルで、２分間超音波処理する０次
にこの核物質を１０，０００ｒｐ−で１０分間遠心分離
して、上澄み、ＮＳ、をとっておく。
１でｐＨ８，１に調整した、脱イオン水１リツトルあた
り１ 、２１ ｇＴｒｉｓおよび０．３８ｇＥＤＴＡよ
り成る核ＩＩ衝液中に再懸濁させる。その後、核を、ブ
ランリン（Ｂ ｒａｎｓｏｎ） ２００ Ｍ音波発生ｔ
ｌｌ（ｓｏｎ ｉ ｒ １ｅｒ）上、出力５．２０％パ
ルスされた使用サイクルで、２分間超音波処理する０次
にこの核物質を１０，０００ｒｐ−で１０分間遠心分離
して、上澄み、ＮＳ、をとっておく。
上記のＧＮ懸濁液を、その容積の２０分の１の１０．０
％トライトン（Ｔ ｒｉｔｏｎ）Ｘ −１００と混合し
、１０−１５秒間渦動させて細胞質を抽出し、５００ｘ
ｇで５分遠心分離する。上澄みを捨て、ベレットをもと
のＧＮ容積の、１ｍｇ／ｘｌＤＬ−リジンを含む塩水に
再懸濁させて、室温で１０分間放置する。次に核を、ｌ
５００ｘｇ（２７００ｒｐ…）で５分間遠心分離し、
上澄みを捨て、ペレットを、もとのＣ，Ｎ容積の上記の
核緩衝液に再懸濁させて、上記のように超音波処理する
。この懸濁液が最終的なＧＮ”Ｃりり無傷の核を含有し
ている。
％トライトン（Ｔ ｒｉｔｏｎ）Ｘ −１００と混合し
、１０−１５秒間渦動させて細胞質を抽出し、５００ｘ
ｇで５分遠心分離する。上澄みを捨て、ベレットをもと
のＧＮ容積の、１ｍｇ／ｘｌＤＬ−リジンを含む塩水に
再懸濁させて、室温で１０分間放置する。次に核を、ｌ
５００ｘｇ（２７００ｒｐ…）で５分間遠心分離し、
上澄みを捨て、ペレットを、もとのＣ，Ｎ容積の上記の
核緩衝液に再懸濁させて、上記のように超音波処理する
。この懸濁液が最終的なＧＮ”Ｃりり無傷の核を含有し
ている。
ＥＮＡを製造するには、凍結乾燥させた子牛の胸腺７゛
セ（−ン扮末１００泊ビ［アーカンサス州、スプリング
ダール、インムノビジョン（Ｉｍｍ旧＋ｏｖｉｓｉｏ口
）から商業的に−Ｆに入れることができる〕を、１）■
（８，０のリン酸塩桜画化塩水５ｚｌと混きする。子牛
の胸腺製剤にはＤＮＡおよび非−ＤＮＡ核抗原の両方が
３有されている。
セ（−ン扮末１００泊ビ［アーカンサス州、スプリング
ダール、インムノビジョン（Ｉｍｍ旧＋ｏｖｉｓｉｏ口
）から商業的に−Ｆに入れることができる〕を、１）■
（８，０のリン酸塩桜画化塩水５ｚｌと混きする。子牛
の胸腺製剤にはＤＮＡおよび非−ＤＮＡ核抗原の両方が
３有されている。
この子牛の胸腺懸濁液を先に述べたように超ｒ？波処理
し、１０．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する：この
上澄みが最終的なＥＮＡ調製物である。
し、１０．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する：この
上澄みが最終的なＥＮＡ調製物である。
次に、被膜混な物を、等容積のＮＳ（５，Ｏｎ＋ｇ蛋白
質、’ｚｆ）；Ｇ Ｎ （２、５ｍｇ蛋白責／ Ｉ’ｌ
）およびＥＮＡ（１，Ｏｎ＋ｇ蛋白ｉ／ｚｌ）；を−
緒に混りすることによって：Ａ製するが：蛋白質はロウ
リイ（Ｌｏｗｒｙ）法により決定される。この温き物中
のこｔしらの成分の３１容し得る濃度範囲は、０００５
ないし ５０＋ｈｇ、・’ｚｉ２Ｎｓ；０．００５ない
し５０１１１ｇ ／’ ｘ ｉ！ Ｇ Ｎ ：お５上び
０．００５’ｊｊいし５０す、’ｍ（ＩＥ Ｎ Ａ ；
である。くぼみ（ｕｉｅ Ｉ ｌ ）あたり１５０マイ
クロリ・・７１−ルの被膜混合物が、マクロ滴板、例え
ばダイナデク（Ｄ ｙｎａｔｅｅｈ）ｊ：たはヌンク（
Ｎ ｕｎｃ）により作成されるのようなもの、に加えら
れる。特に在用なのは、グ、イナテク、リム・−ベーウ
エルズ（Ｄ’ｙｎａｔｃｃｌ＋ Ｒｃｍｏｖａ −Ｗｅ
ｌ Ｉｓ）およびヌンク・マ・イクロウェル モジュ
ールス（Ｎ ｕｎｃ Ｍ ｉｅｒｏＷｅｌｌｍｏｄｕ
ｌｃｓ）であり、これらはスティップーくぼみ（ｓｔｉ
ｐ−ｕ＋ｅｌｌｓ）てあろ９くぼみを３７°Ｃで一夜乾
イマさぜイ１１、；欠に下（反を密−ｔ、ｌ して、ｆ
ｌＦ、用するまて１１°Ｃて貯蔵しておく、。
質、’ｚｆ）；Ｇ Ｎ （２、５ｍｇ蛋白責／ Ｉ’ｌ
）およびＥＮＡ（１，Ｏｎ＋ｇ蛋白ｉ／ｚｌ）；を−
緒に混りすることによって：Ａ製するが：蛋白質はロウ
リイ（Ｌｏｗｒｙ）法により決定される。この温き物中
のこｔしらの成分の３１容し得る濃度範囲は、０００５
ないし ５０＋ｈｇ、・’ｚｉ２Ｎｓ；０．００５ない
し５０１１１ｇ ／’ ｘ ｉ！ Ｇ Ｎ ：お５上び
０．００５’ｊｊいし５０す、’ｍ（ＩＥ Ｎ Ａ ；
である。くぼみ（ｕｉｅ Ｉ ｌ ）あたり１５０マイ
クロリ・・７１−ルの被膜混合物が、マクロ滴板、例え
ばダイナデク（Ｄ ｙｎａｔｅｅｈ）ｊ：たはヌンク（
Ｎ ｕｎｃ）により作成されるのようなもの、に加えら
れる。特に在用なのは、グ、イナテク、リム・−ベーウ
エルズ（Ｄ’ｙｎａｔｃｃｌ＋ Ｒｃｍｏｖａ −Ｗｅ
ｌ Ｉｓ）およびヌンク・マ・イクロウェル モジュ
ールス（Ｎ ｕｎｃ Ｍ ｉｅｒｏＷｅｌｌｍｏｄｕ
ｌｃｓ）であり、これらはスティップーくぼみ（ｓｔｉ
ｐ−ｕ＋ｅｌｌｓ）てあろ９くぼみを３７°Ｃで一夜乾
イマさぜイ１１、；欠に下（反を密−ｔ、ｌ して、ｆ
ｌＦ、用するまて１１°Ｃて貯蔵しておく、。
、吐−仏−
上記の□へＮ 、Ａ平板は、二段階（逐次）検定１、ま
たは一段暗（同時）検定、１９ ｊ、５抗体の存在につ
いてヒｌ−の血清試料を予検する。営めに使用される、
＝−関陸畏淀− 未希釈血清５０マイクロリットルを各平板に加え、これ
らの平板を室温で１５−３０分間培五する。次に未希釈
血清を吸引して除き、西洋わさび過酸化酵素（ＨＲＰ）
に結合１７たヒトＦ ｃ Ｉ ８Ｇに対するヤギ抗体よ
り成る復α体５０マイクロリツ１−ルを平板に加えた；
この抗−Ｆｃ抗体は商業的に得られる。ＨＲＰ−抗体複
合体は、抗〜ＦｃＩｇＧ抗体のｇ−ＭＢＳ誘導体および
Ｉ（ＲＰの脱アセチル化５ＡＴＡ誘導体を合成した渣；
この２つの誘導体反応させて、３１目−ｔｐ分子、７′
抗体Ｄ・子を含有する複合体を形成させることによって
製造される。
たは一段暗（同時）検定、１９ ｊ、５抗体の存在につ
いてヒｌ−の血清試料を予検する。営めに使用される、
＝−関陸畏淀− 未希釈血清５０マイクロリットルを各平板に加え、これ
らの平板を室温で１５−３０分間培五する。次に未希釈
血清を吸引して除き、西洋わさび過酸化酵素（ＨＲＰ）
に結合１７たヒトＦ ｃ Ｉ ８Ｇに対するヤギ抗体よ
り成る復α体５０マイクロリツ１−ルを平板に加えた；
この抗−Ｆｃ抗体は商業的に得られる。ＨＲＰ−抗体複
合体は、抗〜ＦｃＩｇＧ抗体のｇ−ＭＢＳ誘導体および
Ｉ（ＲＰの脱アセチル化５ＡＴＡ誘導体を合成した渣；
この２つの誘導体反応させて、３１目−ｔｐ分子、７′
抗体Ｄ・子を含有する複合体を形成させることによって
製造される。
抗−ＦｃＸＨＧ抗体の９−−■？ＢＳ誘導体は次のよう
にｉ、て製造される。
にｉ、て製造される。
購入したままの抗体は粉末化されｌ：形て゛あって、再
構成さｈ、なくてはならない。次に抗体溶液を濾過し１
、抗体濃度を’５．０ｍｇ７ｘ１に調整する。次に、Ｄ
Ｍ Ｆ中の５−ＭＢＳの原液（ｉｏｍｙｚ・’ｔｒ１
）３−／、５ｚＮを、かくはんしながら、抗体溶液２１
Ｎに滴加する７５分後に、別の３７．５ｄのｇ−ＭＢＳ
よりを加え（最終的な抗体／ ｙ Ｍ Ｂ Ｓモル比
−１：４０）、全体の混ご物を添加の後５分間がくはん
する。その後、混合物を平衡化しｆごＧ−２５脱塩川カ
ラム」ユを通し、続いて透析を行な・って、遊離の９−
ＭＢＳを完全に除去する。次いでｇ−ＭＢＳ−一誘導抗
体を、ＨＲＰのＳ Ａ Ｔ Ａ誘導体に加えるが、この
ＨＲ，Ｐの５ＡＴＡ誘導体は次のようにして製造される
。
構成さｈ、なくてはならない。次に抗体溶液を濾過し１
、抗体濃度を’５．０ｍｇ７ｘ１に調整する。次に、Ｄ
Ｍ Ｆ中の５−ＭＢＳの原液（ｉｏｍｙｚ・’ｔｒ１
）３−／、５ｚＮを、かくはんしながら、抗体溶液２１
Ｎに滴加する７５分後に、別の３７．５ｄのｇ−ＭＢＳ
よりを加え（最終的な抗体／ ｙ Ｍ Ｂ Ｓモル比
−１：４０）、全体の混ご物を添加の後５分間がくはん
する。その後、混合物を平衡化しｆごＧ−２５脱塩川カ
ラム」ユを通し、続いて透析を行な・って、遊離の９−
ＭＢＳを完全に除去する。次いでｇ−ＭＢＳ−一誘導抗
体を、ＨＲＰのＳ Ａ Ｔ Ａ誘導体に加えるが、この
ＨＲ，Ｐの５ＡＴＡ誘導体は次のようにして製造される
。
６．９３ｍｇの５ＡＴＡを、２００ｚ１のＤＭＦに溶解
させ、この溶液１１９Ｎｆを、かくはんしながら、０．
０５リン酸塩ＥｏＴ、ｌ！Ｗ液（４，０ｍｇ／ｍｅ、ｐ
Ｈ７，５）中のＨＲＰ５０りの溶液に添加する。得られ
る混合物を１−０分間反応させて、１モルスルフヒドリ
ル基１モルト（ＲＰを得る。次に、この反応混合物を先
にリン酸塩Ｅ Ｄ Ｔ Ａ １．１街液で平衡化したセ
ファデクス（Ｓ ｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ−２５脱塩川カ
ラム上で脱塩し、褐色のピークを脱アセチル化のために
集める。
させ、この溶液１１９Ｎｆを、かくはんしながら、０．
０５リン酸塩ＥｏＴ、ｌ！Ｗ液（４，０ｍｇ／ｍｅ、ｐ
Ｈ７，５）中のＨＲＰ５０りの溶液に添加する。得られ
る混合物を１−０分間反応させて、１モルスルフヒドリ
ル基１モルト（ＲＰを得る。次に、この反応混合物を先
にリン酸塩Ｅ Ｄ Ｔ Ａ １．１街液で平衡化したセ
ファデクス（Ｓ ｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ−２５脱塩川カ
ラム上で脱塩し、褐色のピークを脱アセチル化のために
集める。
Ｓ Ａ Ｔ Ａ−ＨＲＰ誘導体を脱アセチル化するため
に、２．５ｍＭＥＤＴＡを含有スルヒドロキシルアミン
の５０ｍＭ水溶液１００Ｍ１をＳ Ａ Ｔ Ａ −ＨＲ
Ｐ誘導体に加え一混合肚１を室温で１時間かくはんする
。次にこの混合物を、先にリン酸塩Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 緩
衝液で平衡化したセファデクスＧ−２５脱塩用カラム上
で脱塩し、脱アセチル化され；ｑ−Ｓ Ａ Ｔ Ａ−Ｈ
ＲＰ誘導体を含有する褐色ピークを集める。
に、２．５ｍＭＥＤＴＡを含有スルヒドロキシルアミン
の５０ｍＭ水溶液１００Ｍ１をＳ Ａ Ｔ Ａ −ＨＲ
Ｐ誘導体に加え一混合肚１を室温で１時間かくはんする
。次にこの混合物を、先にリン酸塩Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 緩
衝液で平衡化したセファデクスＧ−２５脱塩用カラム上
で脱塩し、脱アセチル化され；ｑ−Ｓ Ａ Ｔ Ａ−Ｈ
ＲＰ誘導体を含有する褐色ピークを集める。
脱アセチル化Ｓ Ａ Ｔ Ａ −ＨＲＰ誘導体１４りを
２−Ｍ Ｂ Ｓ−抗体誘導体１６．５１と合わせて、か
くはんしながら室温で１時間培養すると、ｆ−Ｉ ＲＰ
−一抗体複合体が得られる。次に、この複合体を、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，２；］、ＯｍＭ■ぺＩ）Ｔ
Ａ、′鉄（［ｆｌ）；１０２≦Ｄ−マンニｌ〜−ル：お
よび２？≦庶糖；を含有する安定化した緩衝溶液中で−
・夜透析する。この透析された複合体を、この後、使用
の時まで凍結乾燥した形で貯蔵する。
２−Ｍ Ｂ Ｓ−抗体誘導体１６．５１と合わせて、か
くはんしながら室温で１時間培養すると、ｆ−Ｉ ＲＰ
−一抗体複合体が得られる。次に、この複合体を、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，２；］、ＯｍＭ■ぺＩ）Ｔ
Ａ、′鉄（［ｆｌ）；１０２≦Ｄ−マンニｌ〜−ル：お
よび２？≦庶糖；を含有する安定化した緩衝溶液中で−
・夜透析する。この透析された複合体を、この後、使用
の時まで凍結乾燥した形で貯蔵する。
この複合体を平板から吸引して除き、６．０Ｎ−１（Ｃ
１でρＩ−（８゜０に調整した、２０リットルの脱イオ
ン水あたり２４．２ｇトリズマ（Ｔ’ｒｉｚｍａ）塩基
、１７６ ｙＮ ａＣＩ！、０．０４ｇチメロサール、
および２０ｚｊ！ｌ−ウィーン２０を含有する洗浄用緩
衝液で平板分２回洗浄する。
１でρＩ−（８゜０に調整した、２０リットルの脱イオ
ン水あたり２４．２ｇトリズマ（Ｔ’ｒｉｚｍａ）塩基
、１７６ ｙＮ ａＣＩ！、０．０４ｇチメロサール、
および２０ｚｊ！ｌ−ウィーン２０を含有する洗浄用緩
衝液で平板分２回洗浄する。
次の段階は被酸化性呈色試薬Ｏ−フェニレンジアミン（
ＯＰＤ） を含有する呈色試薬を添加することである
。この呈色試薬は、商業的に入手可能なＯＰＤ錠剤（０
，０４ｙ）を、６Ｎ ＮａＯＨを用いてかくはんしな
がら［）８４．５に調整したクエン酸塩−水和物０．１
０５ｇを含有する脱イオン水’５ｘｌ中に溶解させるご
とにより調製される。尿素過酸化物を含有する呈色試薬
５０マイクロリッ１−ルを各里仮に加えて、これへの平
板を室温で１５−３０分間培養する。
ＯＰＤ） を含有する呈色試薬を添加することである
。この呈色試薬は、商業的に入手可能なＯＰＤ錠剤（０
，０４ｙ）を、６Ｎ ＮａＯＨを用いてかくはんしな
がら［）８４．５に調整したクエン酸塩−水和物０．１
０５ｇを含有する脱イオン水’５ｘｌ中に溶解させるご
とにより調製される。尿素過酸化物を含有する呈色試薬
５０マイクロリッ１−ルを各里仮に加えて、これへの平
板を室温で１５−３０分間培養する。
その後、］、、ＯＮ Ｈ２ＳＯ＜を５０マイクロリッ
トル添加することによっ”Ｃ反応を停止させ、平板を光
学濃度読みとり器中４９０ｎｍＴ″読みとる。吸光度は
その血清試料中に存在する抗核抗体の尺度である。
トル添加することによっ”Ｃ反応を停止させ、平板を光
学濃度読みとり器中４９０ｎｍＴ″読みとる。吸光度は
その血清試料中に存在する抗核抗体の尺度である。
二ｌ訃挾一定一
未希釈血清５０マ・イクロリットルを各平板に加え、こ
れらの平板を室温で１５−３０分間培養する。次に、抗
−Ｆ ｃ ／ ＨＲＰ複合体５０マイクロリットルを加
えて４：れらの平板をさらに１５−３０分間培養する。
れらの平板を室温で１５−３０分間培養する。次に、抗
−Ｆ ｃ ／ ＨＲＰ複合体５０マイクロリットルを加
えて４：れらの平板をさらに１５−３０分間培養する。
次にこの複自体を吸引し、平板を洗浄用緩衝液で２回洗
浄する。その後ＯＰＤ／過酸化物溶液５０マイクロリツ
１−・ルを加え、平板を１５−３０分間培養し、１．Ｏ
Ｎ Ｈ７ＳＯ，で反応を停止させて、４９０ｎｍで吸
光度を読みとる。
浄する。その後ＯＰＤ／過酸化物溶液５０マイクロリツ
１−・ルを加え、平板を１５−３０分間培養し、１．Ｏ
Ｎ Ｈ７ＳＯ，で反応を停止させて、４９０ｎｍで吸
光度を読みとる。
１」。
二段階法および一段階法の両方で、作用の機構ならびに
種々の成分の使用についての原理は同一であって、下記
のように要約することができる。
種々の成分の使用についての原理は同一であって、下記
のように要約することができる。
無傷の細胞核の下に置く核抗原被膜（ＮＳならびにＥＮ
Ａ）の目的は、そうしなければその平板のくぼみ（ｗｅ
！Ｉ！！＞への唾清試料中の抗体の非７８異結合により
ひき起こされ得るバックグラウンドの排除である。杭抜
性でない血清中の抗体はほとんど、この被膜に結合しな
いであろうし、バックグラウンドは従って最小となる。
Ａ）の目的は、そうしなければその平板のくぼみ（ｗｅ
！Ｉ！！＞への唾清試料中の抗体の非７８異結合により
ひき起こされ得るバックグラウンドの排除である。杭抜
性でない血清中の抗体はほとんど、この被膜に結合しな
いであろうし、バックグラウンドは従って最小となる。
ＥＮＡもまた、ＮＳの特定の抽出様抗原を結合するのに
役立つ。
役立つ。
無傷の核および被膜は５．：れらが多様な核抗原を含有
するため、試料中の事実上すべての抗核抗体の平板への
結合をひき起こし、このため感度は高く、偽否定の危険
は低い。
するため、試料中の事実上すべての抗核抗体の平板への
結合をひき起こし、このため感度は高く、偽否定の危険
は低い。
血清を平板で培養するとき、存在する抗核抗体は平板核
および／′または被膜に結合し、そして、無核抗体を含
む非結合試料成分は、洗い流される。
および／′または被膜に結合し、そして、無核抗体を含
む非結合試料成分は、洗い流される。
その後、抗−Ｆｅ抗体は結合したヒト抗核抗体に特異的
に結合してこれらをＨＲＰで標識し、このものは過酸化
物に作用Ｉ−で活性な中間体を形成し、これが次にＯＰ
Ｄをさ酸化して黄色を生ずる。
に結合してこれらをＨＲＰで標識し、このものは過酸化
物に作用Ｉ−で活性な中間体を形成し、これが次にＯＰ
Ｄをさ酸化して黄色を生ずる。
そ皇魁欠Ｗ制仙
その他の具体化は前記の特許請求の範囲の範囲内にある
。
。
例えば、どんな真核細胞の核も平板を調製するために使
用することができる。一般に、細胞が系統発生論的にヒ
トの細胞に近ければ近いほど、この試験の感度は良好に
なると考えられ、このため霊長動物、特にヒト、の細胞
の核が晟も好ましい。
用することができる。一般に、細胞が系統発生論的にヒ
トの細胞に近ければ近いほど、この試験の感度は良好に
なると考えられ、このため霊長動物、特にヒト、の細胞
の核が晟も好ましい。
バックグラウンドを最小にして、抽出抗原を結合させる
ために使用される抗原被膜成分は変化すＸ、’−Ｊ−４
、−７°−へ、７、＊１１ｎ’ＥＫｔＡ−［４）ｉＩｉ
ｉ仝イ未】９−イＪａｒ丁１寸、２＝、ことができ、ま
たは主に核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、または主に蛋白
質および糖蛋白質、のどちらかを含有する核分画をしよ
うすることができる。被膜用核抗原はあらゆる種から誘
導され得る。
ために使用される抗原被膜成分は変化すＸ、’−Ｊ−４
、−７°−へ、７、＊１１ｎ’ＥＫｔＡ−［４）ｉＩｉ
ｉ仝イ未】９−イＪａｒ丁１寸、２＝、ことができ、ま
たは主に核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、または主に蛋白
質および糖蛋白質、のどちらかを含有する核分画をしよ
うすることができる。被膜用核抗原はあらゆる種から誘
導され得る。
検出・標識系は、広範囲にわたる商業的に入手し得る系
のどれでもよい。例、ンば、もしも上述しフ、−，よう
に第二の抗体７・・′酵素複合体が使用されるならば、
０Ｐ１）の代りに呈色試薬３．３′、５゜５′−テトラ
メチルベ〉′ジジン［マイルズ・ラボラトリイズ（Ｍｉ
ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ３）を使用オろこと
ができる。自動操作が容易であるため発色試験系が好ま
しいけれども、酵素／′呈色試薬系の代りに他の操点例
えば蛍光団または放射性同位元素、を使用することがて
さる。
のどれでもよい。例、ンば、もしも上述しフ、−，よう
に第二の抗体７・・′酵素複合体が使用されるならば、
０Ｐ１）の代りに呈色試薬３．３′、５゜５′−テトラ
メチルベ〉′ジジン［マイルズ・ラボラトリイズ（Ｍｉ
ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ３）を使用オろこと
ができる。自動操作が容易であるため発色試験系が好ま
しいけれども、酵素／′呈色試薬系の代りに他の操点例
えば蛍光団または放射性同位元素、を使用することがて
さる。
〈外５名）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）真核細胞から単離された核を多数付着させている固
体支持体より成る、生物学的試料中の抗核抗体を検出す
る装置。 ２）さらに、無核抗原に対する抗体と事実上反応しない
、上記核の下にある被膜より成る、特許請求の範囲第１
項に記載の装置。 ３）上記被膜が核抗原より成る、特許請求の範囲第２項
に記載の装置。 ４）上記核が霊長動物の細胞から単離される、特許請求
の範囲第１項に記載の装置。 ５）上記霊長動物の細胞がヒト細胞株のものである、特
許請求の範囲第４項に記載の装置。 ６）上記ヒト細胞株がＨＥｐ−２である、特許請求の範
囲第５項に記載の装置。 ７）真核細胞から単離された核を多数付着させている固
体支持体を準備し、 試料中の抗核抗体が上記核の核抗原との免疫複合体を形
成するに十分な条件下で試料をこの支持体と接触させ、
そして 上記免疫複合体を、試料中の上記抗核抗体の存在を示す
ものとして検出する、 ことより成る、生物学的試料中の抗核抗体の存在を検出
する方法。 ８）上記検出段階が、上記固体支持体を、標識と結合さ
せた抗ヒト抗体と接触させることにより実施される、特
許請求の範囲第７項に記載の方法。 ９）上記抗ヒト抗体がヒトＩｇＧ抗体に対する抗体また
はその分画である、特許請求の範囲第８項に記載の方法
。 １０）上記標識が酵素より成っていて、上記支持体を、
上記の酵素により作用されたとき目で見て検知できる変
化を生じることのできる上記酵素に対する基質と接触さ
せることを包含する、特許請求の範囲第８項に記載の方
法。 １１）上記基質は上記酵素により作用されたとき化学的
に変化し、そして上記の化学的に変化した基質の存在に
おいて変色する試薬と、上記固体支持体とを接触させる
ことより成る、特許請求の範囲第１０項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US74741285A | 1985-06-21 | 1985-06-21 | |
| US747412 | 1996-11-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232363A true JPS6232363A (ja) | 1987-02-12 |
Family
ID=25004954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14470586A Pending JPS6232363A (ja) | 1985-06-21 | 1986-06-20 | 抗核抗体の検出方法及び装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0206779A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6232363A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01316662A (ja) * | 1988-03-30 | 1989-12-21 | Hoechst Japan Ltd | 抗核抗体測定用器具の製法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1313818C (en) * | 1987-06-03 | 1993-02-23 | Ross Leon Coppel | Nuclear antigen la |
| EP0335293A3 (en) * | 1988-03-30 | 1990-09-12 | Hoechst Japan Limited | A method of preparing an analytical element for the determination of anti-nuclear antibodies |
| DD301364A7 (de) | 1990-04-19 | 1992-12-10 | Berlin Buch Klinikum | Verfahren zur Bestimmung von antinukleären Antikörpern |
| BE1004457A3 (fr) * | 1991-02-08 | 1992-11-24 | Bio Line Sa | Trousse de depistage d'anticorps antinucleaires et procede de depistage de tels anticorps. |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3997657A (en) * | 1973-10-15 | 1976-12-14 | American Cyanamid Company | Dry slide reagent employed in immunofluorescent test for detection of human antinuclear factor |
| DE2447025A1 (de) * | 1974-10-02 | 1976-04-08 | Behringwerke Ag | Reagens zum nachweis von antinukleaeren faktoren und ein verfahren zu dessen stabilisierung |
| WO1983000877A1 (en) * | 1981-08-31 | 1983-03-17 | Icl Scient | Glucose oxidase immunohistochemical detection of antinuclear antibodies |
| US4487830A (en) * | 1982-05-14 | 1984-12-11 | American Hoechst Corporation | Enzyme/immunofluorescent assay for autoantibodies |
| US4499183A (en) * | 1982-12-21 | 1985-02-12 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Detecting intracellular antigens in swelled and fixed cells with labeled antibody |
-
1986
- 1986-06-20 JP JP14470586A patent/JPS6232363A/ja active Pending
- 1986-06-20 EP EP86304757A patent/EP0206779A1/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01316662A (ja) * | 1988-03-30 | 1989-12-21 | Hoechst Japan Ltd | 抗核抗体測定用器具の製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0206779A1 (en) | 1986-12-30 |
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