JPH07117536B2 - 体液中の特異的に結合可能の物質の検出方法及びリガンド受容体 - Google Patents

体液中の特異的に結合可能の物質の検出方法及びリガンド受容体

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JPH07117536B2
JPH07117536B2 JP2117808A JP11780890A JPH07117536B2 JP H07117536 B2 JPH07117536 B2 JP H07117536B2 JP 2117808 A JP2117808 A JP 2117808A JP 11780890 A JP11780890 A JP 11780890A JP H07117536 B2 JPH07117536 B2 JP H07117536B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、標識化、固定化及び複合化のためにリガンド
複合体を使用するイムノアツセイ（Immunoassay）の原
理により、リガンド複合体を形成するために使用するリ
ガンドを遊離の形で含有する体液中の特異的に結合可能
の物質を検出するための方法に関する。
従来の技術 臨床的診断法においては、液体中の特異的に結合可能の
物質を検出するために、多数のテストを行なう。多数の
測定は、均質又は不均質イムノアツセイの原理を基礎に
しており、この場合一般には少なくとも２種のレセプタ
ーを使用し、そのうち一方は標識化されており、他方の
ものは固定化されているか又は固定化可能である。最近
は、標識化されたないしは固定化された又は固定化可能
のレセプターとしてしばしば複合体（Konjugat）を使用
するが、この複合体の場合には、測定すべき物質と特異
的に結合可能の免疫パートナーの、標識又は固相に対す
る結合が、リガンドと同リガンドに対して特異的な結合
パートナーとの相互作用により行なわれている。リガン
ドは一般に小さい分子、例えばハプテンである。ビオチ
ンとストレプトアビジンないしはアビジンとの間の結合
力は、生物学的分子の最高の結合定数の一つを有するの
で、ビオチンをリガンドして頻繁に使用し、それに対す
る特異的結合パートナーとしてストレプトアビジンを使
用する。この場合、前記結合対の使用をもたらす利点の
他に、ビオチンが体液中に遍在する分子であるという欠
点がある。従つてビオチンは試料溶液中に遊離の形で存
在していて結合位置を有しているので、テストの狂いを
もたらす可能性がある。これは、多量のビオチン量を服
用する患者の場合には、極めて重大である。ビオチンは
30ng/ml（試料）を越える量ではすでに狂つた結果をも
たらすと、という事実があるからである。ビオチン処置
を施した患者の場合には、180ng/mlまでの血清値及び約
70ng/mlの持続値が生じることもある。これ故に、テス
ト障害が起らないようにビオチンを除去する方法が探求
されている。同様な問題は、リガンドとして他のハプテ
ン、例えばジコキシゲニンを使用する場合にも生じ、こ
のようなハプテンは治療において同時に適用され、従つ
て同様に体液中に存在しており、そこでテスト妨害を惹
起する可能性がある。
発明が解決しようとする課題 従つて本発明の課題は、妨害的リガンドを含有する体液
中の物質を検出する方法において、該検出方法が妨害さ
れないように前記リガンドを除去するための方法を提供
することである。
課題を解決するための手段 前記課題は、標識化、固定化及び複合化のためにリガン
ド複合体を使用するイムノアツセイの原理により、リガ
ンド複合体を形成するために使用されるリガンドを遊離
の形で含有する体液中の特異的に結合可能の物質を検出
するための方法において、試料溶液を、コアとしてリガ
ンドに対する多数の結合位置を有するポリマー及び被覆
としてタンパク質、ペプチド、核酸ポリマー、炭水化物
及び／又は炭水化物とアミノ酸とから成るコポリマーか
ら構成される少なくとも１層を有するポリマー粒子及び
リガンド複合体を含有する試薬と一緒にインキユベート
し、前記被覆の層厚を、同被覆が遊離リガンドについて
は透過性であるが、リガンド複合体については不透過性
であるように調節することによつて、遊離の形で存在す
るリガンドを免疫学的反応から除くことを特徴とする前
記方法によつて解決される。
ここでリガンド複合体とは、特異的に結合する対、例え
ばビオチン−ストレプトアビジン又は抗原−抗体の一方
のパートナーを有する複合体の意である。複合体のリガ
ンド成分ほ測定すべき物質とは結合しない。しかし複合
体の第二の成分は、測定すべき物質と特異的に結合する
ことのできる分子、例えば抗体から成る。この場合には
リガンド複合体は例えばビオチン及び抗体から成り、ビ
オチンはそのパートナーであるストレプトアビジンに結
合し、抗体は測定すべき物質と結合する。
意外にも、本発明により使用されるポリマー粒子によつ
て、妨害的なリガンドを試料溶液から捕捉することに成
功した。該ポリマー粒子は、遊離リガンドのみが結合さ
れ得るが、同リガンドよりも２倍以上大きい分子量を有
するリガンド複合体は結合され得ないように構成されて
いる。このようにしてリガンドを多量に含有する試料溶
液の場合にも、テスト系におけるリガンド複合体の作用
に不利な影響を与えることなしに、リガンドによる妨害
作用を除去することに成功する。
本発明により実施される、遊離リガンドの除去は、標識
化、固定化又は複合化のためにリガンド複合体を使用す
る方式のイムノアツセイの原理による検出方法のすべて
の変法に関して奏効する。ここで、リガンドとは特異的
結合対の一方のパートナーであつて、比較的小さい分子
量を有しかつ標識、例えば酵素又は蛍光性物質との複合
体の形で又は抗体又はその断片に結合されて、抗体を固
相に結合するために使用される。一般にリガンドとはハ
プテン、低分子抗原ならびに抗体及びそれらの断片のこ
とである。例えばビオチン及びジゴキシゲニンである。
リガンドは、検出すべき物質ともまたレセプターとも交
差反応しない。
本発明による原理が適用されうる検出方法の例は、１段
階法又は２段階法のサンドイッチテスト及び競合テスト
である。適当な実施形の例は、１段階法のサンドイツチ
テストであり、この場合には固相に特定の結合系のパー
トナーが固定されていて、検出すべき物質を、標識レセ
プター及び他の結合パートナーを有する非標識レセプタ
ー複合体と一緒にインキユベートする。次に測定すべき
物質、標識レセプター及び結合パートナーを有するレセ
プターから形成される複合体が、特異的結合能力によ
り、前記固相で固定化されている他のパートナーに結合
し、このようにして全複合体が固定化される。相を分離
した後、両相の一つについて標識を測定することができ
る。
遊離の形で存在していて、測定を妨害するリガンドを、
免疫学的反応から除くためには、試料溶液を、リガンド
の遊離の形に特異的に結合しかつコア及び被覆から成る
ポリマー粒子及びリガンド複合体を含有する試薬と一緒
にインキユベートする。
コアはリガンドの結合位置を供給し、被覆はリガンドを
リガンド複合体から選択するためのバリヤーを形成す
る。
有利な実施形の場合には、ポリマー粒子は水溶性であ
り、試料及び試薬を含有するインキユベーシヨン溶液中
に存在する。
コアは多数のリガンド結合位置を有する。コアは、リガ
ンドに結合可能の物質の均質又は不均質なポリマーであ
るか又は不活性のコアと結合可能の物質から成る被覆と
から構成されていてもよい。ここで不活性とは、免疫学
的反応及び検出反応に関して不活性である物質のことで
ある。
コア中に存在するリガンドと結合位置は、リガンドに特
異的に結合可能の物質によつて供給される。ここでこの
特異的に結合可能の物質は、特異的結合対の他のパート
ナーであつてよくかつ固定化された又は標識化された形
で存在する、リガンドの結合のために使用されるパート
ナーと同じであつてよい。適当な結合対は、例えばビオ
チン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原
−抗体、ハプテン−抗体、タンパク質Ａ−免疫−γ−グ
ロブリン、タンパク質Ｇ−免疫−γ−グロブリン及びハ
プテン−結合タンパク質ならびにその都度結合可能の誘
導体である。リガンドに結合可能の物質から成るポリマ
ーは、個々の結合パートナー相互の又は同パートナーと
不活性分子の架橋にによつて製造することができる。個
々の結合パートナーはホモ−又はヘテロ二価又は多価リ
ンカーを介して相互に結合されうる。有利には架橋は、
二価リンカーによつて行なわれる、そうというのもこれ
によつて重合度の制御をより容易にすることができる。
しかしまた多価リンカーも適当である。リンカーとして
は、水性溶液中で特異的に結合可能のパートナーの官能
基と反応して共有結合を形成することのできる反応性基
を有するような化合物を使用することができる。これに
適する多数の二官能性又は多官能性リンカーは当業者に
とつて周知である。本発明の範囲内において好適なホモ
−又はヘテロ二官能性及び三官能性リンカーの代表的例
は、次の表１に記載してある。
架橋を行なうためには、結合対の溶液に、直接架橋を生
じる条件下でリンカー分子を加えることができる。この
場合架橋度は加えたリンカーの量によつて制御する。他
の有利の実施形においては、結合対に、リガンド及び測
定すべき化合物に関して不活性である適当な結合可能な
成分を加える。このために例えば可溶性タンパク質、特
にウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンである。
コアは、全部結合パートナーのポリマーから構成されて
いてもよい。またコアは、例えばポリスチロールまたは
デキストランから成つていてもよい不活性中心部を有し
かつリガンドに結合可能の物質から成るポリマーで被覆
されていてもよい。
極めて頻繁に使用されるリガンドであるビオチンの場合
には、コアポリマーとして抗ビオチン−抗体又は特に有
利にはアビジン又はストレプトアビジンから成るポリマ
ーを使用する。リガンドとしてジゴキシゲニンを使用す
る場合には、コアポリマーは有利には抗ジゴキンゲニン
−抗体又はその断片を含有する。リガンドがスォレプト
アビジン又はアビジンである場合には、コアポリマーは
ビオチン分子又はストレプトアビシンないしはアビシン
に結合可能の同分子の誘導体、例えばイミノビオチン又
はビオシチンを含有する。
コアは、被覆が遊離リガンドに対しては透過性である
が、リガンド複合体に対しては不透過性であるように形
成されている被覆によつて包囲される。該被覆は、タン
パク質、ペプチド、核酸ポリマー、炭水化物及び／又は
炭水化物とアミノ酸とから成るコポリマーから成る少な
くとも１層から構成されている。前記成分はまた誘導体
の形で使用してもよい。
コアの大きさは、それ自体重要ではなく、大体において
粒子の溶解度によつて分子量に関して限定されている。
遊離の形で存在するリガンドの結合のためには、コアに
おける十分な数の結合位置が必要である。コア中の僅か
な結合位置がすでに著しい妨害除去作用を起こすことが
わかつた。良好な妨害除去作用は約10個の結合位置から
あり、特に良好な妨害除去作用は約50個以上の結合位置
からある。
被覆の形成のためには、有利にはポリマーウシ血清アル
ブミン、ポリマーFab断片又はアミノデキストランポリ
マーを使用する。ポリマーの製造は公知法により個々の
成分の架橋によつて行なう。この際層厚は、被覆が遊離
リガンドに対しては透過性であるが、リガンド複合体に
対しては不透過性であるように調節する。
コアポリマーは、少なくとも１層によつて被覆される。
有利には被覆は、同じか又は異なつていてもよい少なく
とも２層から構成される。有利には被覆は、選択的透過
性を極めて良好に発揮することのできるスポンジ状又は
樹枝状構造を有する。選択的透過性は、例えばウシ血清
アルブミン及び／又は抗体のFab′断片を有する多重被
覆の場合に生じる。
被覆は、共有的に、吸着的に又は特異的結合対（例えば
ビオチン／アビジン）による結合によつて官能的結合と
して行なわれる。
本発明による方法を用いることによつて、試薬溶液から
妨害的リガンドを捕捉することに成功する。妨害除去作
用は高い濃度範囲まで奏効する。すなわち、ピオチン20
0ng/mlまでを含有する試料溶液から、ビオチンをほぼ完
全に除去することができる。さらに多量のビオチンを含
有する試料の場合には、少なくとも十分な除去を行なう
ことができる。これによつて本発明方法は、イムノアツ
セイの原理による測定の精度及び再現性を改善すること
ができる。
また本発明の対象はリガンド受容体でもあり、その特徴
とするところは、該受容体が、コア及び被覆を包含する
水溶性ポリマーレセプター分子から成り、この際コアが
多数のリガンド結合位置を有するポリマーであり、かつ
被覆がタンパク質、ペプチド、、核酸ポリマー、炭水化
物及び／又は炭水化物とアミノ酸とから成るコポリマー
から構成されており、該被覆の層厚が、同被覆が遊離リ
ガンドに対しては透過性であるが、リガンド複合体に対
しては非透過性であるようになつていることである。
次に本発明を図面により詳述する。
第１図は本発明方法の有利な実施形を示す。この場合に
は、ストレプトアビジンが固定化されている固相１、測
定すべき物質７に結合することができかつビオチンと結
合したレセプター３、ならびに測定すべき物質７に結合
することのできる標識レセプター５を、試料溶液と一緒
にインキユベートする。さらに同溶液は本発明によるリ
ガンド受容体９を含有する。反応の際、標識レセプター
５が結合された被測定物質７が、レセプター３を介して
固相１に結合する。溶液中に存在するビオチン10は、リ
ガンド受容体９と反応し、免疫反応を起さない。
第1b図は競合的イムノアツセイの変法を示す。固相１に
は、ストレプトアビジンが結合されている。この固相
を、測定すべき抗体２、標識を有する、抗体２に類似の
抗体４及び測定すべき抗体及び標識レセプターに結合で
き、ビオチンと結合された抗原６と一緒にインキユベー
トする。反応の際測定すべき抗体２と標識レセプター４
とが抗原６への結合を競う。抗体と抗原とから形成され
た複合体は、ビオチンを介してストレプトアビジンで被
覆された固相に結合する。
第2a図及び第2b図は本発明方法の他の変法を示す。
第2a図は、固相11に、測定すべき物質15に結合できる抗
体13が固定化されている実施例を示す。測定すべき物質
15を含有する試料溶液と一緒に、測定すべき物質15と結
合できかつビオチンの結合されたレセプター17をインキ
ユベートする。さらに試料溶液中には、標識及びストレ
プトアビジンから成る複合体19が存在する。免疫学的反
応の際には、レセプター17が測定すべき物質15と反応
し、抗体13介して固相に固定化される。標識は、レセプ
ター19中に含有されたストレプトアビジン及びレセプタ
ー17に含有されたビオチンを介して結合される。
第2b図は競合的方法の他の変法を示す。固相11には測定
すべき物質に結合できる抗体13が固定化されている。試
料溶液には、測定すべき物質とビオチンとから成る複合
体14及び標識とストレプトアビジンとから成る複合体16
を加える。免疫学的反応の際には、測定すべき物質18と
ビオチン含有レセプターとが固相に結合された抗体への
結合を競い合う。標識は、標識化されたレセプター中に
含有されたストレプトアビジンを介してビオチン含有複
合体に結合される。
実施例 例 １ ポリストレプトアビジン（SA（Ｐ））の製造 マレインイミノヘキサノイルストレプトアビジン（SA−
MH）の製造：ストレプトアビジン500mgを、50m mol/
リン酸カリウム緩衝液（KPP）及び100m mol/ NaCl（p
H6.6）50ml中に溶かし、DMSO中に予め溶かしたマレイン
イミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（MHS）25mgと一緒に４℃で２時間インキユベー
トする。次に10m mol/ KPP/50m mol/ NaCl（pH6.
2）に対して透析する。
SAMBAで誘導されたストレプトアビジン（SA−SAMB）の
製造：さらに、50m mol/ KPP/100m mol/ NaCl（pH
7.8）にストレプトアビジン500mgを溶かし、予めDMSO中
に溶かしSAMBA29mgを加え、25℃で撹拌下に3.5時間イン
キユベートする。次に反応混合物を50m mol/ KKP/100
m mol/ NaCl/1m mol/ EDTA（pH6.0）に対して透析
する。
SA−MH及びSA−SAMBの結合：透析されたSA−SAMB溶液50
mlに1mol/ヒドロキシルアミン溶液275μを加え、25
℃で撹拌下に30分インキユベートする。次に反応混合物
を、50m mol/ KPP/100m mol NaCl/2m mol/ EDTA（p
H6.5）各２に対して２回１時間透析する。この透析液
に透析緩衝液110mlを加え、透析されたSA−MH溶液55ml
を加える。この混合物を25℃で２〜４時間撹拌下にイン
キユベートし、架橋度をFPLCゲル濾過によつて半時間の
間隔で検べる。平均の見掛け分子量が700〜800KDに達し
たら、システイン（全量1m mol/、25℃、30分）及び
ヨードアセトアミド（全量5m mol/、25℃、30分）を
加えて架橋を停止する。得られたストレプトアビジンポ
リマーSA（Ｐ）を、50 mol/ KPP/100m mol/ NaCl/1
％サツカロース（pH6.8）中のスペロース（Superose）
６によるゲル濾過によつて精製する。
SA（Ｐ）を含有するフラクシヨンを集め、限外濾過によ
つてｃ−5mg/mlに濃縮し、全量80mg/mlのサツカロース
と共に凝固し、連結乾燥する。
例 ２ ストレプトアビジン−ポリマーから成るコア及び２層の
ウシ血清アルブミン（RSA）から成る被覆を有するポリ
マー粒子の製造。
例１で記載したように製造したSA（Ｐ）−凍結乾燥物
を、全量25mg/mlの水で溶かし、pHを7.0に調節する。得
られたSA（Ｐ）溶液2mlにMHS（DMSO中に予め溶かす）2.
6mgを加え、25℃で撹拌下に60分インキユベートする。1
mol/リシン20μを加えた後、10m mol/ KPP/100m
mol/ NaCl/2m mol/ EDTA（pH6.2）に対して透析す
る。透析液に、RSA溶液〔10m mol/ KPP/100m mol/
NaCl/2m mol/ EDTA（pH6.9）;RSA:SA（Ｐ）＝10:1（m
g/mg）〕5mlを加え、反応混合物のpHを6.9に調節し、25
℃で２時間インキユベートする。0.2mol/システイン
溶液44μを加えた後、RSA−SA（Ｐ）をアクリルアミ
ドアガロースによるゲル濾過によつて未反応RSAから分
離する。このようにして得られたRSA−SA（Ｐ）7.5mg
を、50m mol/ KPP/100m mol/ NaCl/2％サツカロー
ス（pH7.0）1.95mlに溶かした溶液に、予めDMSOに溶か
したMHS770μｇを加え、25℃で１時間インキユベートす
る。次に、1m mol/リシン20μｌを加え、10m mol/
KPP/100m mol/ NaCl/2m mol/ EDTA（pH6.2）に対し
て透析する。透析液（＝RSA−SA（Ｐ）5mg、MHで活性
化）1.76mlに前記のRSA溶液1.1mlを加え、pHを6.9に調
節し、25℃でインキユベートする（RSA:RSA−SA（Ｐ）
＝10:1mg/mg）。次に0.2m mol/システイン溶液29μ
を加え、25℃で30分インキユベートする。得られたRSA
−RSA−SA（Ｐ）をゲル濾過（AcA22、50m mol/ KPP/1
00m mol/ NaCl2％サツカロース、pH7.5）によつて未
反応RSAから分離する。RSA−RSA−SA（Ｐ）を含有する
フラクシヨンを集め、ゲル濾過によつて約1mg/mlの濃度
に濃縮する。
例 ３ ストレプトアビジンポリマーから成るコア及び順次に適
用された２層のFab′断片から成る被覆を有するポリマ
ー粒子の製造。
例２と同様に処理する、但しRSAの代りにモノクロナー
ル抗TSH−抗体のFab′断片を使用する。この場合Fab′
及びSA（Ｐ）ないしはSab′及びFab′−SA（Ｐ）は5:1
（mg/ml）の割合で使用する。その他の反応条件は同じ
である。
抗TSH−抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統は、Eur
opean Collection of Animal Cell CulturesでECACC871
22202の名称下に寄託されている。
例 ４ ストレンプトアビジンポリマーから成るコア及びアミノ
デキストランから成る被覆を有するポリマー粒子の製
造。
例２で記載したように、SA（Ｐ）をMHSと反応させ、次
に50m mol/ KPP/100m mol/ NaCl/2m mol/ EDTA
（pH6.2）に対して透析する。
アミノデキストラン（分子量20,000）250mgを100m mol/
KPP（pH7.3）10ml中に溶かす。次に、DMSO中に予め
溶かしたSATA2.9mgを加え、25℃で１時間インキユペー
トする。1mol/リシン溶液を全量で10m mol/加えた
後、反応混合物のpHを6.3に調節し、50m mol/ KPP/10
0m mol/ NaCl/2m mol/ EDTA（pH6.2）に対して透析
する。透析液に1mol/ヒドロキシアミン（pH6.2）を、
全量で50m mol/加え、25℃で30分インキユベートす
る。次に反応混合物を、50m mol/ KPP/100m mol/ N
aCl/2m mol/ EDTA（pH6.2）各１に対して２回１時
間透析する。この透析液に、透析緩衝液中のSA（Ｐ）−
MH溶液（ｃ＝1mg/ml）10mlを加え、pHを直ちに6.9に調
節し、25℃で１時間インキユベートする。次にシステイ
ンを全量で1m mol/加え、25℃で30分インキユベート
する。次にヨードアセトアミドを全量で5m mol/加
え、25℃で30分さらにインキユベートする。得られたア
ミノデキストラン−ストレプトアピジン・コポリマーを
濃縮し、ゲル濾過（アクリルアミドアガロース、50m mo
l/ KPP/100m mol/ NaCl/2％サツカロース、pH7.5）
によつて未反応アミノデキストランから分離する。アミ
ノデキストラン−ストレプトアビジン・コポリマーを含
有するフラクシヨンを集め、約1mg/mlの濃度に濃縮す
る。
例 ５ CEAテスト（ｃarcinoembrionales Ａntigen＝癌胚芽形
成抗原でのテスト）において、Fab′＝Fab′−SA（Ｐ）
によつてビオチン妨害作用を除去する。
テスト準備： CEA含有ウマ血清（50ng CEA/ml）をビオチン50、100及
び200ng/mlで凝固する。50m mol/２−（Ｎ−モルホリ
ノ）−エタンスルホン酸緩衝液（pH6.1）中に、ペルオ
キシダーゼ（POD）を有する、CEAに対するモノクロナー
ル抗体（IgG）のFab断片及びCEAに対するビオチニル化
モノクロナール抗体（IgG）から成る複合体を含有する
試薬溶液を、Fab′−Fab′−SA（Ｐ）（例３で記載した
ように製造）５ないし７μg/mlで凝固する。
テストは、市販のテストキツト・エンツイムン（Enzymu
m）ＲテストCEA（Boehringer Mannheim社、Best.Nr.113
2814）の規定により行なう。
テストの実施： CEA含有ウマ血清100μを、ペルオキシダーゼー標識モ
ノクロナール抗CEA−抗体（20mU POD/ml）及びビオチン
−標識モノクロナールCEA−抗体（1.5μg/ml）を含有す
る試薬溶液1mlと一緒に、スロレプトアビジン被覆ルラ
ン試験管中にピペツトで注入し、25℃で２時間インキユ
ベートする。この際ペルオキシダーゼ−標識CEA−抗
体、CEA及びビオチン−標識CEA−抗体から成る複合体が
形成され、固相に結合されたストレプトアビジンに対す
るビチオンの結合によつて固定化される。次に試験管内
容物を吸引し、３回洗浄し、再び入念に吸引する。次に
結合されたペルオキシダーゼの活性の量を、基質溶液1m
lを加えることによつて測定し、1.9m mol/ ATBSR−溶
液（100m mol/リン酸塩−クエン酸塩緩衝液/3.2m mol
/過ホウ酸ナトリウム（pH4.4）中の2,2′−アジノジ
−/3−エチルベンゾチアゾリン−スルホネート（６）を
含有する）を加え、25℃で１時間インキユベートする。
次に、空値としての基質−クロモーゲン−溶液の吸光度
に対して405nmで試料について吸光度を測定する。
結果： 表２に示すように、このテスト系におけるビオチン妨害
作用は、Fab′−Fab′−SA（Ｐ）を加えることによつて
試料中のビオチン100ng/mlまで定量的に除去されうる
が、より高いビオチン濃度の場合には明らかに減少す
る。
例 ６ 抗HBc−抗体（ヘパテイテイスＢコア−抗原に対する抗
体、ヨーロツパ特許第0013828号）の検出のためのテス
トにおいて、RSA−RSA−SA（Ｐ）によつてビオチン妨害
作用を除去する。
テスト基準： 抗HBc−抗体を含まない血清を、ビオチン50、100及び20
0ng/mlで凝固する。40m mol/リン酸塩緩衝液（pH7.
4）中のHBc−抗原（HBcAg）−ビオチン−複合体（HBcAg
とＮ−ヒドロキシスクシンイミド−活性化ビオチンとの
反応によつて製造）を含有する溶液を、例２で記載した
ように製造したRSA−RSA−SA（Ｐ）（全量7.5〜12.5μg
/ml）で凝固した。
テストの実施： 測定は、競合原理による２段階アツセイで行なう。固相
としては、Thermo−RSA−ステレプトアビジン（ヨッロ
ツパ特許出願公開第0269092号）で被覆されたプラスチ
ツク試験管を使用する。標識レセプターとしては抗HBc
−抗体−ペルオシダーゼ・複合体を使用する。
抗HBc−抗体を含まない血清200μを、ビオチン−HBcA
g・複合体（10ng/ml）を含有する溶液1mlと一緒に、The
rmo−RSA−ストレプトアビジンで被覆されたルラン試験
管中にピペツトで注入し、25℃で１時間インキユペート
する。この際試料からの抗HBc−抗体とビオチン−HBcAg
・複合体とが反応し、形成された複合体が、固相に結合
されたストレプトアビジンに前記複合体のビオチンが結
合することによつて固定化される。次に試験管内容物を
吸引し、同試験管を水で３回洗浄する。この際未結合の
ビオチニル化HBcAg及び全血清成分が除去される。次
に、ペルオキシダーゼ標識抗HBcAg−抗体を含有する（2
00mUペルオキシダーゼ/ml）溶液1mlを加え、25℃で１時
間インキユペートとする。この際ペルオキシダーゼ標識
抗HBc−抗体が、試料によつて占られなかつた抗原−結
合位置に結合する。次に試験管内容物を吸引し、再び３
回洗浄すると、未結合ペルオキシダーゼ複合体が除去さ
れる。次に、100m mol/リン酸塩−クエン酸塩緩衝液/
3.2m mol/過ホウ酸ナトリウム（pH4.4）中の1.9m mol
/ ABTS溶液1mlを加え、25℃で１時間インキユベート
する。次に基質−クロモーゲン溶液の吸光度（空値）に
対して405nmで試料に関して吸光度を測定する。
表３で示すように、このテスト系でRSA−RSA−SA（Ｐ）
を加えることによつて、ビオチン妨害使用が200ng/mlま
で殆ど完全に除去されうる。
例 ７ ウシ血清アルブミン−ストレプトアビジン・コポリマー
から成るコア及びFab′断片から成る被覆を有するポリ
マー粒子の製造。
先ず例２と同様にしてRSA−SA（Ｐ）を製造する。この
コポリマーを、例２で記載したようにMHSで活性化す
る。RSA−SA（Ｐ）−MHを、例２で記載した反応条件下
で抗TSH−抗体のFab断片（例３参照）と5:1（mg/mg）の
割合で反応させる。
例 ８ 抗HBc−抗体の検出のためのテストでビオチン妨害作用
をFab′−RSA−SA（Ｐ）によつて除去する。
テストは、例６で記載したように実施したが、HBcAg−
ビオチン・溶液をFab′−RSA−SA（Ｐ）10及び15μg/ml
で凝固した。清血及びHBcAg−ビオチン・溶液を、スト
レプトアビジンの被覆されたルラン試験管中に一緒には
注入しないで、先ず血清200μを試験管中に注入し、
２〜５分の時間後に初めてHBcAg−ビオチン・複合体溶
液を加える。
表４は、この変更されたテストの実施の場合にも、明瞭
な妨害除去作用が観察されうることを示す。
【図面の簡単な説明】
第1a図はサンドイツチ式に行なう本発明方法の模式図、
第1b図は競合式に行なう本発明方法の模式図、第2a図及
び第2b図は、本発明方法の別法を示す模式図である。
フロントページの続き (72)発明者 アルノ・デーガー ドイツ連邦共和国ゼースハウプト・フエー レンシユトラーセ ３ (56)参考文献 特開 昭60−80766（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−28560（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】標識化、固定化又は複合化のためにリガン
    ド複合体を使用するイムノアッセイの原理により、リガ
    ンド複合体のために使用されるリガンドを遊離の形で含
    有する体液中の特異的に結合可能の物質を検出する方法
    において、試料溶液を、コア及び被覆から成り、コアと
    しては多数のリガンド結合位置を有するポリマーを有し
    かつ被覆としてはタンパク質、ペプチド、核酸ポリマ
    ー、炭水化物及び／又は炭水化物とアミノ酸とから成る
    コポリマーを有するポリマー粒子及びリガンド複合体を
    含有する試薬と一緒にインキュベートし、この際被覆の
    層厚を、同被覆が遊離リガンドに対しては透過性である
    が、リガンド複合体に対しては非透過性であるように調
    節することによって、遊離の形で存在するリガンドを免
    疫学的反応から除去することを特徴とする液体中の特異
    的に結合可能の物質の検出方法。
  2. 【請求項２】コア及び被覆を包含する水溶性ポリマーレ
    セプターの分子から成り、この際コアが多数のリガンド
    係合位置を有するポリマーでありかつ被覆がタンパク
    質、ペプチド、核酸ポリマー、炭水化物及び／又は炭水
    化物とアミノ酸とから成るコポリマーから成る少なくと
    も１層から構成されていて、被覆の層厚を、同被覆が遊
    離リガンドに対して透過性であるが、リガンド複合体に
    対しては不透過性であることを特徴とするリガンド受容
    体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014521929A (ja) * 2011-06-30 2014-08-28 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ 低い非特異的結合性を有するアフィニティアッセイのための磁性粒子における分子構造

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3027770B2 (ja) * 1994-03-05 2000-04-04 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー イムノアッセイで使用するための干渉除去剤
AU6720096A (en) 1995-08-09 1997-03-05 Quidel Corporation Test strip and method for one step lateral flow assay
ES2127691B1 (es) * 1996-10-21 2000-04-01 Biolatex S L Procedimiento de union covalente de ligandos para la preparacion de r eactivos inmunoquimicos para utilizacion en inmunoanalisis homogeneos que emplean microparticulas (mps) y su aplicacion a la medida de ferritina y del receptor soluble de la transferrina en suero o plasma sangu
JPH10246725A (ja) * 1997-03-03 1998-09-14 Mikio Nakayama 抗体又は抗原の検出方法
US5958704A (en) 1997-03-12 1999-09-28 Ddx, Inc. Sensing system for specific substance and molecule detection
DE19724787A1 (de) * 1997-06-06 1998-12-10 Biotez Berlin Buch Gmbh Bioche Streptavidin/Avidin beschichtete Oberflächen
US6410692B2 (en) * 1998-02-02 2002-06-25 Novadx, Inc. Removal of abundant interfering proteins from a liquid sample using a collapsible affinity matrix
US6303325B1 (en) 1998-05-29 2001-10-16 Dade Behring Inc. Method for detecting analytes
US6143507A (en) * 1998-10-29 2000-11-07 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. High throughput compatible assay for receptor-TRAF interactions
JP4504608B2 (ja) * 1999-09-13 2010-07-14 日水製薬株式会社 被測定物質の検出又は測定用キット、及び検出又は測定方法
DE10009503A1 (de) * 2000-02-29 2001-08-30 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Immobilisierung von Konjugaten in diagnostischen Tests
EP1184666A3 (en) * 2000-08-21 2002-04-10 Roche Diagnostics GmbH Auxiliary haptens and haptenylated agents in displacement immunoassays
AU2002241602A1 (en) * 2000-11-16 2002-06-11 Burstein Technologies, Inc. Methods and apparatus for detecting and quantifying lymphocytes with optical biodiscs
AU2002259117A1 (en) * 2001-05-03 2002-11-18 Immunetics, Inc. Systems and methods for detection of analytes in biological fluids
JP4839530B2 (ja) * 2001-06-08 2011-12-21 東ソー株式会社 測定妨害を低減する方法及び試薬組成物
WO2003021222A2 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Burstein Technologies, Inc. Capture layer assemblies for cellular assays including related optical analysis discs and methods
WO2003023354A2 (en) * 2001-09-07 2003-03-20 Burstein Technologies, Inc. Optical bio-disc systems for nuclear morphology based identification
AU2002352735A1 (en) * 2001-11-20 2003-06-10 Burstein Technologies, Inc. Optical bio-discs and microfluidic devices for analysis of cells
US7108993B2 (en) * 2002-07-19 2006-09-19 Bayer Healthcare Llc Use of dual conjugated labels in the elimination of serum interference in immunochromatographic assays
US20050112586A1 (en) 2003-11-24 2005-05-26 Roland Janzen Method and composition for stabilizing liquid reagents
US20060046310A1 (en) * 2004-08-25 2006-03-02 Zong-Li Xia Amplification method for solid phase immunoassays
CN117491623A (zh) 2015-08-20 2024-02-02 豪夫迈·罗氏有限公司 使用聚乙二醇化分析物特异性结合剂的基于颗粒的免疫测定法
EP3577460B1 (en) 2017-02-02 2021-01-20 Roche Diagnostics GmbH Immunoassay using at least two pegylated analyte-specific binding agents
US20210172945A1 (en) 2018-05-07 2021-06-10 Immundiagnostik Ag System for analyzing quantitative lateral flow chromatography
EP3857226B1 (en) * 2018-09-25 2023-11-15 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Methods and compositions for removing biotin interference from assays using conjugated molecular traps
CN112703400A (zh) * 2018-09-25 2021-04-23 美国西门子医学诊断股份有限公司 用于从使用环糊精阱的测定除去生物素干扰的方法和组合物
WO2020068541A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Methods and compositions for removing biotin interference from assays using molecular traps
CN112673113A (zh) 2018-09-25 2021-04-16 美国西门子医学诊断股份有限公司 用于校正靶标分析物测量中的生物素干扰的多重测定的组合物、试剂盒和方法
CN111122845A (zh) * 2018-10-31 2020-05-08 博阳生物科技（上海）有限公司 一种抗生物素干扰的化学发光免疫分析试剂盒及其应用
CN111122851A (zh) * 2018-10-31 2020-05-08 博阳生物科技（上海）有限公司 一种抗干扰剂的制备方法及由此方法制备的抗干扰剂的应用
CN111122842A (zh) * 2018-10-31 2020-05-08 博阳生物科技（上海）有限公司 一种抗干扰剂及其应用
US20220163525A1 (en) 2019-02-15 2022-05-26 Immundiagnostik Ag Rapid test for diagnosis of bacterial infections in neonates
CN112129933B (zh) * 2019-06-25 2024-01-05 迈克生物股份有限公司 一种免疫分析系统中抗生物素干扰的试剂、试剂盒及方法
WO2023114993A1 (en) * 2021-12-17 2023-06-22 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Biotin-trap beads and methods of production and use thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3951748A (en) * 1974-11-11 1976-04-20 Medical Products, Inc. Sensitized matrix for detection of disease
US4282287A (en) * 1980-01-24 1981-08-04 Giese Roger W Biochemical avidin-biotin multiple-layer system
US4550075A (en) * 1983-06-22 1985-10-29 Kallestad Laboratories, Inc. Method for ligand determination utilizing an immunoassay monitorable by biotin-containing enzymes, and compositions therefor
US4582810A (en) * 1983-09-30 1986-04-15 Becton, Dickinson And Company Immuno-agglutination particle suspensions
US4752638A (en) * 1983-11-10 1988-06-21 Genetic Systems Corporation Synthesis and use of polymers containing integral binding-pair members
JPS60256057A (ja) * 1984-06-01 1985-12-17 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 免疫学的測定法
DE3640412A1 (de) * 1986-11-26 1988-06-09 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz
DE3720983A1 (de) * 1987-06-25 1989-01-05 Hoechst Ag Immunometrisches bestimmungsverfahren
FR2624613B1 (fr) * 1987-12-15 1994-08-26 Toledano Jacques Support microspherique de detection immuno-enzymatique, fluorescente, cheminumilescente ou radio-active de substances microdosees dans les milieux biologiques
EP0353895A1 (en) * 1988-07-18 1990-02-07 MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. Immunoassay method
DE3829245A1 (de) * 1988-08-29 1990-03-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014521929A (ja) * 2011-06-30 2014-08-28 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ 低い非特異的結合性を有するアフィニティアッセイのための磁性粒子における分子構造

Also Published As

Publication number Publication date
ES2047749T3 (es) 1994-03-01
EP0397113A2 (de) 1990-11-14
JPH02309254A (ja) 1990-12-25
EP0397113A3 (de) 1991-05-29
DE3915135A1 (de) 1990-11-15
ATE97496T1 (de) 1993-12-15
EP0397113B1 (de) 1993-11-18
DK0397113T3 (da) 1994-02-07
DE59003503D1 (de) 1993-12-23
US5212063A (en) 1993-05-18

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