JPH02309254A - 体液中の特異的に結合可能の物質の検出方法及びリガンド受容体 - Google Patents
体液中の特異的に結合可能の物質の検出方法及びリガンド受容体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、標識化、固定化及び複合化のためにリガンド
抱合体を使用するイムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏａａｓ
ａｙンの原理により、リガンド抱合体を形成するために
使用するリガンドを遊離の形で含有する体液中の特異的
に結合可能の物質を検出するための方法に胸する。
抱合体を使用するイムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏａａｓ
ａｙンの原理により、リガンド抱合体を形成するために
使用するリガンドを遊離の形で含有する体液中の特異的
に結合可能の物質を検出するための方法に胸する。
従来の技術
臨床的診断法においては、体液中の特異的に結合可能の
物質を検出するために、多数のテスト全行なう。多数の
測定は、均質又は不均質イムノアッセイの原理を基礎に
しており、この場合一般には少なくとも２ｉａのレセプ
ターを使用し、そのうち一方は標識化されており、他方
のものは固定化されているか又は固定化ｒｉＩ能である
。最近は、標識化されたないしは固定化された又は固定
化可能のレセプターとしてしはしは−抱合体（Ｋｏｎｊ
ｕｇａｔ ）を使用するが、この抱合体の場合には、測
定すべき物質と特異的に結合可能の免疫パートナ−の、
標線又は固相に対する結合が、リガンドと同リガンドに
対して特異的な結合パートナ−との相互作用により行な
われている。リガンドは一般に小さい分子、例えはハプ
テンである。ビオチンとストレプトアビジンないしはア
ビジンとの間の結合力は、生物学的分子の敢為の結合定
数の−゛つを有するので、ビオチンｉ ＩＪガントとし
て頻繁に使用し、それに対する特異的結合パートナ−と
してストレプトアビジンを使用する。この場合、前記結
合対の使用をもたらす利点の他に、ビオチンが体液中に
遍在、する分子であるという欠点がある。従ってビオチ
ンは試料溶液中に遊離の形で存在していて結合位置を有
しているので、テストの狂いをもたらす可能性がある。
物質を検出するために、多数のテスト全行なう。多数の
測定は、均質又は不均質イムノアッセイの原理を基礎に
しており、この場合一般には少なくとも２ｉａのレセプ
ターを使用し、そのうち一方は標識化されており、他方
のものは固定化されているか又は固定化ｒｉＩ能である
。最近は、標識化されたないしは固定化された又は固定
化可能のレセプターとしてしはしは−抱合体（Ｋｏｎｊ
ｕｇａｔ ）を使用するが、この抱合体の場合には、測
定すべき物質と特異的に結合可能の免疫パートナ−の、
標線又は固相に対する結合が、リガンドと同リガンドに
対して特異的な結合パートナ−との相互作用により行な
われている。リガンドは一般に小さい分子、例えはハプ
テンである。ビオチンとストレプトアビジンないしはア
ビジンとの間の結合力は、生物学的分子の敢為の結合定
数の−゛つを有するので、ビオチンｉ ＩＪガントとし
て頻繁に使用し、それに対する特異的結合パートナ−と
してストレプトアビジンを使用する。この場合、前記結
合対の使用をもたらす利点の他に、ビオチンが体液中に
遍在、する分子であるという欠点がある。従ってビオチ
ンは試料溶液中に遊離の形で存在していて結合位置を有
しているので、テストの狂いをもたらす可能性がある。
これは、多音のビオチン量を服用する患者の場合には、
極めて頁大である。ビオチンは３ Ｑ ｎｇ ／ Ｉｕ
（試料）を越える量ではすでに狂った結果をもたらす
、という事実があるからである。ビオチン処置を施した
患者の場合には、１８０ ｎｇ ｉｍｂｘでの血清値及
び約７０ｎｇ／勘の持続値が生じることもある。それ故
に、テスト障害が起らないようにビオチンを除去する方
法が探求されている。
極めて頁大である。ビオチンは３ Ｑ ｎｇ ／ Ｉｕ
（試料）を越える量ではすでに狂った結果をもたらす
、という事実があるからである。ビオチン処置を施した
患者の場合には、１８０ ｎｇ ｉｍｂｘでの血清値及
び約７０ｎｇ／勘の持続値が生じることもある。それ故
に、テスト障害が起らないようにビオチンを除去する方
法が探求されている。
同様な問題は、リガンドとして他のハプテン、例えはジ
ゴキシゲニンを使用する場合にも生じ、このようなハプ
テンは治療において同時に適用され、従って同様に体液
中に存在しておフ、そこでテスト妨害を惹起する。Ｊ能
性がある。
ゴキシゲニンを使用する場合にも生じ、このようなハプ
テンは治療において同時に適用され、従って同様に体液
中に存在しておフ、そこでテスト妨害を惹起する。Ｊ能
性がある。
発明が解決しようとする課題
従って本発明の課題は、妨害的リガンドを含有する体液
中の物質を検出する方法において、該検出方法が妨害さ
れないように前記リガンドを除去するための方法を提供
することである。
中の物質を検出する方法において、該検出方法が妨害さ
れないように前記リガンドを除去するための方法を提供
することである。
課題を解決するための手段
前記課題は、標識化、固定化及び複合化のためにリガン
ド抱合体を使用するイムノアッセイの原理により、リガ
ンド抱合体を形成するために使用されるリガンドを遊離
の形で含有する体准中め特異的に結合可能の物質を検出
するための方法において、試料浴液を、コアとしてリガ
ンドに対する多数の結合位［を有するポリマー及び被覆
としてタンパク質、ペプチド、核酸ポリマー、戻水化物
及び／又は炭水化物とアミノ酸とから成るコポリマーか
ら構成される少なくとも１層ｔ−Ｗするポリマー粒子と
一緒にインキエペートシ、前記被覆の層厚を、同被榎が
遊離リガンドについては透過性であるが、リガンド複合
体については不透過性であるように調節することによっ
て、遊離の形で存在するリガンドを免疫学的反応から除
くことを特徴とする前記方法によって解決される。
ド抱合体を使用するイムノアッセイの原理により、リガ
ンド抱合体を形成するために使用されるリガンドを遊離
の形で含有する体准中め特異的に結合可能の物質を検出
するための方法において、試料浴液を、コアとしてリガ
ンドに対する多数の結合位［を有するポリマー及び被覆
としてタンパク質、ペプチド、核酸ポリマー、戻水化物
及び／又は炭水化物とアミノ酸とから成るコポリマーか
ら構成される少なくとも１層ｔ−Ｗするポリマー粒子と
一緒にインキエペートシ、前記被覆の層厚を、同被榎が
遊離リガンドについては透過性であるが、リガンド複合
体については不透過性であるように調節することによっ
て、遊離の形で存在するリガンドを免疫学的反応から除
くことを特徴とする前記方法によって解決される。
意外にも、本発明により使用されるポリマー粒子によっ
て、妨害的なリガンドを試料浴液から捕捉することに成
功した。該ポリマー粒子は、遊ｇ リガンドのみが結合
され得るが、同リガンドよりも２倍以上大きい分子量を
有するリガンド抱合体は結合され得ないように構成され
ている。このようにしてリガンドを多音に含有する試料
溶液の場合にも、テスト系におけるリガンド抱合体の作
用に不利な影響を与えることなしに、リガンドによる妨
害作用を除去することに成功する。
て、妨害的なリガンドを試料浴液から捕捉することに成
功した。該ポリマー粒子は、遊ｇ リガンドのみが結合
され得るが、同リガンドよりも２倍以上大きい分子量を
有するリガンド抱合体は結合され得ないように構成され
ている。このようにしてリガンドを多音に含有する試料
溶液の場合にも、テスト系におけるリガンド抱合体の作
用に不利な影響を与えることなしに、リガンドによる妨
害作用を除去することに成功する。
本発明により実施される、遊Ｈリガンドの除去は、標識
化、固定化又は複合化のためにリガンド抱合体を使用す
る方式のイムノアッセイの原理による検出方法のすべて
の変法に関して奏効する。ここで、リガンドとは特異的
結合対の一方のパートナ−でるって、比較的小さい分子
蓋全有しかつ＠識、例えは酵素又は螢光性物質との抱合
体の形で又は抗体又はその断片に結合さｎて、抗体を固
相に結合するために使用される。一般にリガンドとはハ
プテン、低分子抗原ならびに抗体及びそれらの断片のこ
とである。
化、固定化又は複合化のためにリガンド抱合体を使用す
る方式のイムノアッセイの原理による検出方法のすべて
の変法に関して奏効する。ここで、リガンドとは特異的
結合対の一方のパートナ−でるって、比較的小さい分子
蓋全有しかつ＠識、例えは酵素又は螢光性物質との抱合
体の形で又は抗体又はその断片に結合さｎて、抗体を固
相に結合するために使用される。一般にリガンドとはハ
プテン、低分子抗原ならびに抗体及びそれらの断片のこ
とである。
例えはビオチン及びジデキシｒニンである。リガンドは
、検出すべき物質ともまたレセプターとも文差反応しな
い。
、検出すべき物質ともまたレセプターとも文差反応しな
い。
本発明による原理が適用されうる検出方法の例は、１段
階法又は２段階法のサンドイッチテスト及び競合テスト
でわる。適当な実施形の例は、１段階法のサンドインチ
テストでるり、この場合には固相に特定の結合系のパー
トナ−が固定されていて、検出すべき物質全１標識レセ
プター及び他の結合パートナ−を有する非標誠レセプタ
ー抱合体と一緒にインキュベートする。
階法又は２段階法のサンドイッチテスト及び競合テスト
でわる。適当な実施形の例は、１段階法のサンドインチ
テストでるり、この場合には固相に特定の結合系のパー
トナ−が固定されていて、検出すべき物質全１標識レセ
プター及び他の結合パートナ−を有する非標誠レセプタ
ー抱合体と一緒にインキュベートする。
次に測定すべき物質、標識レセプター及び結合ハードナ
ーを有するレセプターから形成さｎる複合体が、特異的
結合能力により、前記固相で固定化さ牡ている他のパー
トナ−に結合し、このようにして全複合体が固定化さ扛
る。相を分離した後、両相の一つについて標ｍを測定す
ることができる。
ーを有するレセプターから形成さｎる複合体が、特異的
結合能力により、前記固相で固定化さ牡ている他のパー
トナ−に結合し、このようにして全複合体が固定化さ扛
る。相を分離した後、両相の一つについて標ｍを測定す
ることができる。
遊離の形で存在していて、測定を妨害するリガンドを、
免疫学的反応から除くためには、試料溶液を、リガンド
の遊離の形に特異的に結合しかつコア及び被覆から成る
ポリマー粒子と一緒にインキュベートする。
免疫学的反応から除くためには、試料溶液を、リガンド
の遊離の形に特異的に結合しかつコア及び被覆から成る
ポリマー粒子と一緒にインキュベートする。
コアはリガンドの結合位置を供給し、被覆はリガンドを
リガンド抱合体から選択するだめのバリヤーを形成する
。
リガンド抱合体から選択するだめのバリヤーを形成する
。
有利な実施形の場合には、ポリマー粒子は水溶性でわジ
、試料及び試薬を含有するインキュベーション溶液中に
存在する。
、試料及び試薬を含有するインキュベーション溶液中に
存在する。
コアは多数のリガンド結合位置を有する。コアは、リガ
ンドに結合可能の物質の均質又は不均質なポリマーであ
るか又は不活性のコアと結合可能の物質から成る被〜と
から構成されていてもよい。ここで不活性とは、免疫学
的反応及び検出反応に関して不活性である物質のことで
ある。
ンドに結合可能の物質の均質又は不均質なポリマーであ
るか又は不活性のコアと結合可能の物質から成る被〜と
から構成されていてもよい。ここで不活性とは、免疫学
的反応及び検出反応に関して不活性である物質のことで
ある。
コア中に存在するリガンドの結合位置は、リガンドに特
異的に結合可能の物質によって供給される。ここでこの
特異的に結合可能の物質は、特異的結合対の他のパート
ナ−であってよくかつ固定化された又は標線化された形
で存在する、リガンドの結合のために使用されるパート
ナ−と同じであってよい。適当な結合対は、例えはビオ
チン−アビジン、ビオチンーストレプ′トアビジン、抗
原−抗体、ハゲテン−抗体、タンパク質入−免疫−γ−
グロブリン、タンパク／］（）−免疫−γ−グロブリン
及びハゲテン−結合タンパク質ならびに七の都度結合可
能の肪導体である。リガンドに結合可能の物質から成る
ポリマーは、個々の結合パートナ−相互の又は同パート
ナ−と不活性分子の架橋によって製造することができる
。個々の結合パートナ−はホモ−又はヘテロ二価又は多
価リンカ−を介して相互に結合されつる。有利には架橋
は、二価リンカ−によって行なわれる、それというのも
これによって１合度の制御をより容易にすることができ
る。しかしまた多価リンカ−も適当である。
異的に結合可能の物質によって供給される。ここでこの
特異的に結合可能の物質は、特異的結合対の他のパート
ナ−であってよくかつ固定化された又は標線化された形
で存在する、リガンドの結合のために使用されるパート
ナ−と同じであってよい。適当な結合対は、例えはビオ
チン−アビジン、ビオチンーストレプ′トアビジン、抗
原−抗体、ハゲテン−抗体、タンパク質入−免疫−γ−
グロブリン、タンパク／］（）−免疫−γ−グロブリン
及びハゲテン−結合タンパク質ならびに七の都度結合可
能の肪導体である。リガンドに結合可能の物質から成る
ポリマーは、個々の結合パートナ−相互の又は同パート
ナ−と不活性分子の架橋によって製造することができる
。個々の結合パートナ−はホモ−又はヘテロ二価又は多
価リンカ−を介して相互に結合されつる。有利には架橋
は、二価リンカ−によって行なわれる、それというのも
これによって１合度の制御をより容易にすることができ
る。しかしまた多価リンカ−も適当である。
リンカ−としては、水性溶液中で特異的に結合可能のパ
ートナ−の官能基と反応して共有結合を形成することの
できる反応性基を有するような化合物を使用することが
できる。これに適する多数の二官能性又は多官能性りン
カーは当業者にとって周知でめる。本発明の範囲内にお
いて好適なホモ−又はヘテロニ官能性及び三官能性リン
カ−の代表的例は、次の表１に記載しである。
ートナ−の官能基と反応して共有結合を形成することの
できる反応性基を有するような化合物を使用することが
できる。これに適する多数の二官能性又は多官能性りン
カーは当業者にとって周知でめる。本発明の範囲内にお
いて好適なホモ−又はヘテロニ官能性及び三官能性リン
カ−の代表的例は、次の表１に記載しである。
表 １
８ＰＤＰ Ｎ−スクシンイミジル６−（２−ピリ
ジルジチオ〕−グロビオネート Ｅｆｉ、ＤＢ エチル４−アジドフェニル−１，４
−ジチオプチルイミテエート・ＨＣｌ ＦＮＰＡ ４−フルオロ−５−ニトロフェニルア
ジド Ｈ８ＡＢ Ｎ−ヒドロキシスクシンイばジル−４
−アジドベンゾエート ＭＡＢＩ メチル−４−アジドペンディξデエー
ト・ＨＣｔ Ｍ２Ｓ ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド−エステル ＮＨ８−Ａ８Ａ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−
４−アジドサリチル酸 ＭＨ８マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイばドエステル ＰＮＰ−ＤＴＰ ｐ−二トロフェニル−２−ジアゾ−
５，５；５−トリノルオロプロビオ ネート ８ＡＤＰ Ｎ−スクシンイミジル（４−アジドフ
ェニル）１．３’ −ジチオプロピ オネート ５ＡＮＤ スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−
アジド−０−ニトロベンデアミド） −エチルー１．６′−ジチオプロピ オネート 、８ＡＮＰＡＨＮ−スクシンイミジ＃−６（４’−アジ
ド−２′−二トロフェニルーア ば）〕ヘキサノエート ８ＡＳＤ スルホスクシンイミジル２− （ｐ−ア
ジドサリチルアミド）エチル− １，３′−ジチオプロピオネート ８ＩＡＢ Ｎ−スクシンイミジル（４−イオドア
セチル）アジドベンゾエート ８ＭＣＣスクシンイばジル−４−（Ｎ−マレインイミド
エチル）シクロヘキサン −１−カルボキシレート ８ＭＰＢ スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）ブチレート Ｄ８Ｂ ジスクシンイミジルスペレートＤＭ８
ジメチルスベリミデートトラクト試薬２−イミノ
チオラン ２．４．６−ドリクロルーｓ−トリ アジン ８層ＭＢＡ ８ ’ −７セチルーメルカブトコハ
ク酸無水物 ５ＡＴＡ Ｎ−スクシンイミジル−８−アセチル
チオアセテート 架橋を行なうためには、結合対の溶液に、直接架橋を生
じる条件下でリンカ−分子を加えることができる。この
場合架橋度は加えたリンカ−の賞によって制御する。他
の有利な実施形においては、結合対に、リガンド及び測
定すべき化合物に関して不活性である適当な結合可能な
成分を加える。このために例えば可溶性タンパク質、特
にウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンである。
ジルジチオ〕−グロビオネート Ｅｆｉ、ＤＢ エチル４−アジドフェニル−１，４
−ジチオプチルイミテエート・ＨＣｌ ＦＮＰＡ ４−フルオロ−５−ニトロフェニルア
ジド Ｈ８ＡＢ Ｎ−ヒドロキシスクシンイばジル−４
−アジドベンゾエート ＭＡＢＩ メチル−４−アジドペンディξデエー
ト・ＨＣｔ Ｍ２Ｓ ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド−エステル ＮＨ８−Ａ８Ａ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−
４−アジドサリチル酸 ＭＨ８マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイばドエステル ＰＮＰ−ＤＴＰ ｐ−二トロフェニル−２−ジアゾ−
５，５；５−トリノルオロプロビオ ネート ８ＡＤＰ Ｎ−スクシンイミジル（４−アジドフ
ェニル）１．３’ −ジチオプロピ オネート ５ＡＮＤ スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−
アジド−０−ニトロベンデアミド） −エチルー１．６′−ジチオプロピ オネート 、８ＡＮＰＡＨＮ−スクシンイミジ＃−６（４’−アジ
ド−２′−二トロフェニルーア ば）〕ヘキサノエート ８ＡＳＤ スルホスクシンイミジル２− （ｐ−ア
ジドサリチルアミド）エチル− １，３′−ジチオプロピオネート ８ＩＡＢ Ｎ−スクシンイミジル（４−イオドア
セチル）アジドベンゾエート ８ＭＣＣスクシンイばジル−４−（Ｎ−マレインイミド
エチル）シクロヘキサン −１−カルボキシレート ８ＭＰＢ スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）ブチレート Ｄ８Ｂ ジスクシンイミジルスペレートＤＭ８
ジメチルスベリミデートトラクト試薬２−イミノ
チオラン ２．４．６−ドリクロルーｓ−トリ アジン ８層ＭＢＡ ８ ’ −７セチルーメルカブトコハ
ク酸無水物 ５ＡＴＡ Ｎ−スクシンイミジル−８−アセチル
チオアセテート 架橋を行なうためには、結合対の溶液に、直接架橋を生
じる条件下でリンカ−分子を加えることができる。この
場合架橋度は加えたリンカ−の賞によって制御する。他
の有利な実施形においては、結合対に、リガンド及び測
定すべき化合物に関して不活性である適当な結合可能な
成分を加える。このために例えば可溶性タンパク質、特
にウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンである。
コアは、全部結合パートナ−のポリマーから構成されて
いてもよい。またコアは、例えはポリスチロールまたは
テキスト２ンから成っていてもよい不活性中心部を有し
かつリガンドに結合可能の物質から成るポリマーで被覆
されていてもよい。
いてもよい。またコアは、例えはポリスチロールまたは
テキスト２ンから成っていてもよい不活性中心部を有し
かつリガンドに結合可能の物質から成るポリマーで被覆
されていてもよい。
極めて頻繁に使用されるリガンドであるビオチンの場合
には、コアポリマーとして抗ビオチンー抗体又は特に有
利にはアビジン又はストレプトアビジンから成るポリマ
ーを使用する。リガンドとしてジブΦシデニンを使用す
る吻合には、コアポリマーは有利には抗ジゴキシゲニン
ー抗体又はその断片を含有する。リガンドがストレプト
アビジン又はアビジンでめる場合には、コアポリマーは
ビオチン分子又はストレプトアビジンないしはアビジン
に結合可能の同分子の誘導体、例えはイミノビオチン又
はビオシチンを含有する。
には、コアポリマーとして抗ビオチンー抗体又は特に有
利にはアビジン又はストレプトアビジンから成るポリマ
ーを使用する。リガンドとしてジブΦシデニンを使用す
る吻合には、コアポリマーは有利には抗ジゴキシゲニン
ー抗体又はその断片を含有する。リガンドがストレプト
アビジン又はアビジンでめる場合には、コアポリマーは
ビオチン分子又はストレプトアビジンないしはアビジン
に結合可能の同分子の誘導体、例えはイミノビオチン又
はビオシチンを含有する。
コアは、被覆が遊ｍＩＪガントに対しては透過性である
が、リガンド抱合体に対しては不透過性であるように形
成されている被葎によって包囲される。該被櫟は、タン
パク質、ペプチド、核酸ポリマー、炭水化物及び／又は
炭水化物とアミノ酸とから成るコポリマーから成る少な
くとも１層から構成されている。前記成分はまた誘導体
の形で使用してもよい。
が、リガンド抱合体に対しては不透過性であるように形
成されている被葎によって包囲される。該被櫟は、タン
パク質、ペプチド、核酸ポリマー、炭水化物及び／又は
炭水化物とアミノ酸とから成るコポリマーから成る少な
くとも１層から構成されている。前記成分はまた誘導体
の形で使用してもよい。
コアの大きさは、それ自体］ｋ要ではなく、大体におい
て粒子の溶解度によって分子量に関して限定されている
。遊離の形で存在するリガンドの結合のためには、コア
における十分な数の結合位置が必要である。コア中の僅
かな結合位置がすでに著しい妨害除去作用を起すことが
わかった。良好な妨害除去作用は約１０個の結合位置か
らあり、特に良好な妨害除去作用は約印個以上の結合位
置からめる。
て粒子の溶解度によって分子量に関して限定されている
。遊離の形で存在するリガンドの結合のためには、コア
における十分な数の結合位置が必要である。コア中の僅
かな結合位置がすでに著しい妨害除去作用を起すことが
わかった。良好な妨害除去作用は約１０個の結合位置か
らあり、特に良好な妨害除去作用は約印個以上の結合位
置からめる。
被覆の形成のためには、有利にはポリマーウシ血清アル
ブミン、ポリマーＦａｂ断片又はアミノデキストランポ
リマーを使用する。ポリマーの製造は公知法により個々
の成分の架橋によって行なう。この際層厚は、被覆が遊
崩リガンドに対しては透過性であるが、リガンド抱合体
に対しては不透過性であるように調節する。
ブミン、ポリマーＦａｂ断片又はアミノデキストランポ
リマーを使用する。ポリマーの製造は公知法により個々
の成分の架橋によって行なう。この際層厚は、被覆が遊
崩リガンドに対しては透過性であるが、リガンド抱合体
に対しては不透過性であるように調節する。
コアポリマーは、少なくとも１層によって被覆される。
有利には被覆は、同じか又は異なっていてもよい少なく
とも２層から構成される。
とも２層から構成される。
有利には被覆は、選択的透過性を極めて良好に発揮する
ことのできるスポンジ状又は樹枝状構造を有する。選択
的透過性は、例えはウシ血清アルブミン及び／又は抗体
のＦａｂ’断片を有する多宣被積の場合に生じる。
ことのできるスポンジ状又は樹枝状構造を有する。選択
的透過性は、例えはウシ血清アルブミン及び／又は抗体
のＦａｂ’断片を有する多宣被積の場合に生じる。
被覆は、共有的に、吸着的に又は特異的結合対（例えば
ビオチン／アビジノンによる結合によって官能的結合と
して行なわれる。
ビオチン／アビジノンによる結合によって官能的結合と
して行なわれる。
本発明による方法を用いることによって、試料溶液から
妨害的リガンドを捕捉することに成功する。妨害除去作
用は高い濃度範囲まで奏効する。すなわち、ビオチン２
００ｎｇ／１１１１までを含有する試料溶液から、ビオ
チンをほぼ完全に除去することができる。さらに多重の
ビオチンを含有する試料の場合には、少なくとも十分な
除去を行なうことができる。これによって本発明方法は
、イムノアッセイの原理による測定の精度及び再現性を
改善することができる。
妨害的リガンドを捕捉することに成功する。妨害除去作
用は高い濃度範囲まで奏効する。すなわち、ビオチン２
００ｎｇ／１１１１までを含有する試料溶液から、ビオ
チンをほぼ完全に除去することができる。さらに多重の
ビオチンを含有する試料の場合には、少なくとも十分な
除去を行なうことができる。これによって本発明方法は
、イムノアッセイの原理による測定の精度及び再現性を
改善することができる。
また本発明の対象はリガンド受容体でもあり、その％徴
とするところは、該受容体が、コア及び被ａｔを包含す
る水溶性ポリマーレセプター分子から成り、この際コア
が多数のリガンド結合位ｒＭを有するポリマーであり、
かつ被覆がタンパク質、ペプチド、核酸ポリマー、炭水
化物及び／又は炭水化物とアξ）酸とから成るコポリマ
ーから構成さｎており、該被覆の層厚が、同被覆が遊離
リガンドに対しては透過性である一Ｊｊζすがンド抱合
体に対しては非透過性でおるようになっていることであ
る。
とするところは、該受容体が、コア及び被ａｔを包含す
る水溶性ポリマーレセプター分子から成り、この際コア
が多数のリガンド結合位ｒＭを有するポリマーであり、
かつ被覆がタンパク質、ペプチド、核酸ポリマー、炭水
化物及び／又は炭水化物とアξ）酸とから成るコポリマ
ーから構成さｎており、該被覆の層厚が、同被覆が遊離
リガンドに対しては透過性である一Ｊｊζすがンド抱合
体に対しては非透過性でおるようになっていることであ
る。
次に本発明を図面により詳述する。
第１図は本発明方法の有利な実施形を示す。
この場合には、ストレプトアビジンが固定化されている
固相１、測定すべき物質７に結合することができかつビ
オチンと結合したレセプター３、ならびに測定すべき物
質７に結合することのできる標識レセプター５を、試料
溶液と一緒にインキュベートする。さらに同溶液は本発
明によるリガンド受容体９ｔ−含有する。反応の際、標
識レセプター５が結合された被測定物質７が、レセプタ
ー３を介して固相１に結合する。溶液中に存在するビオ
チン１０は、リガンド受容体９と反応し、免疫反応を起
さない。
固相１、測定すべき物質７に結合することができかつビ
オチンと結合したレセプター３、ならびに測定すべき物
質７に結合することのできる標識レセプター５を、試料
溶液と一緒にインキュベートする。さらに同溶液は本発
明によるリガンド受容体９ｔ−含有する。反応の際、標
識レセプター５が結合された被測定物質７が、レセプタ
ー３を介して固相１に結合する。溶液中に存在するビオ
チン１０は、リガンド受容体９と反応し、免疫反応を起
さない。
第１ｂ図は競合的イムノアッセイの変法を示す。固相１
には、ストレプトアビジンが結合されている。この固相
を、測定すべき抗体２、標識を有する、抗体２に類似の
抗体４及び測定すべき抗体及び標識レセプターに結合で
き、ビオチンと結合さｎた抗ｇ６と一緒にインキュベー
トする。反応の際測定すべき抗体２と標識レセプター４
とが抗原６への結合を競う。抗体と抗原とから形成され
た複合体は、ビオチンを介してストレプトアビジンで被
覆された固相に結合する。
には、ストレプトアビジンが結合されている。この固相
を、測定すべき抗体２、標識を有する、抗体２に類似の
抗体４及び測定すべき抗体及び標識レセプターに結合で
き、ビオチンと結合さｎた抗ｇ６と一緒にインキュベー
トする。反応の際測定すべき抗体２と標識レセプター４
とが抗原６への結合を競う。抗体と抗原とから形成され
た複合体は、ビオチンを介してストレプトアビジンで被
覆された固相に結合する。
第２ａ図及び第２ｂ図は本発明方法の他の変法を示す。
第２ａ図は、固相１１に、測定すべき物質１５に結合で
きる抗体１３が固定化されている実施形を示す。測定す
べき物５Ｍ１５を含有する試料浴液と一緒に、測定すべ
き物質１５と結合できかつビオチンの結合されたレセプ
ター１７をインキュベートする。さらに試料溶液中には
、標識及びストレブトアとジンから成る抱合体１９が存
在する。免疫学的反応の際には、レセブタ−１７が測定
子べき物質１５と反応し、抗体１３を介して固相に固定
化される。標識は、レセプター１９中に含有されたスト
レプトアビジン及びレセプター１７に含有されたビオチ
ンを介して結合される。
きる抗体１３が固定化されている実施形を示す。測定す
べき物５Ｍ１５を含有する試料浴液と一緒に、測定すべ
き物質１５と結合できかつビオチンの結合されたレセプ
ター１７をインキュベートする。さらに試料溶液中には
、標識及びストレブトアとジンから成る抱合体１９が存
在する。免疫学的反応の際には、レセブタ−１７が測定
子べき物質１５と反応し、抗体１３を介して固相に固定
化される。標識は、レセプター１９中に含有されたスト
レプトアビジン及びレセプター１７に含有されたビオチ
ンを介して結合される。
第２ｂ図は競合的方法の他の変法を示す。固相１１には
測定すべき物質に結合できる抗体１３が固定化されてい
る。試料溶液には、測定すべき物質とビオチンとから成
る抱合体１４及び標識とストレプトアビジンとから成る
抱合体１６を加える。免疫学的反応の際には、測定すべ
き物質１８とビ芽チン含有レセプターとが同相に結合さ
れた抗体への結合を競い合う。標識は、標識化されたレ
セプター中に含有されたストレプトアビジンを介してビ
オチン含有抱合体に結合される。
測定すべき物質に結合できる抗体１３が固定化されてい
る。試料溶液には、測定すべき物質とビオチンとから成
る抱合体１４及び標識とストレプトアビジンとから成る
抱合体１６を加える。免疫学的反応の際には、測定すべ
き物質１８とビ芽チン含有レセプターとが同相に結合さ
れた抗体への結合を競い合う。標識は、標識化されたレ
セプター中に含有されたストレプトアビジンを介してビ
オチン含有抱合体に結合される。
実施例
例 １
ポリストレプトアビジン（８Ａ（Ｐ） ）の製造マレイ
ンイミノへキサノイルストレプトアビジン（８Ａ−ＭＨ
）の製造コストレプトアビジン５００■を、５ Ｑ ｍ
ｍｏｂ／ ｌリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＰ ）及び
１Ｑ Ｑ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＮａＣｔ（ｐ）！６．６
）５０Ｌｌ中に溶かし、ＤＭＳＯ中に予め溶かしたマレ
インイばドヘキサノイルーＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＨ８） ２５ηと一緒に４℃で２時間イ
ンキュベートする。次に１０ ｍ ｍｏＡ ／ ｌ Ｋ
ＰＰ ／ ５０ ｍ ｍｏＡ ／ ｌ ＮａＣＬ（ｐｉ
（６，２）に対して透析する。
ンイミノへキサノイルストレプトアビジン（８Ａ−ＭＨ
）の製造コストレプトアビジン５００■を、５ Ｑ ｍ
ｍｏｂ／ ｌリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＰ ）及び
１Ｑ Ｑ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＮａＣｔ（ｐ）！６．６
）５０Ｌｌ中に溶かし、ＤＭＳＯ中に予め溶かしたマレ
インイばドヘキサノイルーＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＨ８） ２５ηと一緒に４℃で２時間イ
ンキュベートする。次に１０ ｍ ｍｏＡ ／ ｌ Ｋ
ＰＰ ／ ５０ ｍ ｍｏＡ ／ ｌ ＮａＣＬ（ｐｉ
（６，２）に対して透析する。
ＳＡＭＢＡで誘導されたストレプトアビジン（ＳＡ−８
ＡＭＢ ）の製造：さらに、５０ ｍ ｍｏｔ／ ｌ
ＫＰＰ／１００ｍｍｏｔ／ＪＮａＣｔ（ｐＨ７−８）に
ストレプトアビジン５００岬ｔ−溶かし、予めＤＭ８０
中に溶かした８ＡＭＢＡ ２９■を加え、２５℃で攪拌
下に３．５時間インキュベートする。次に反応混合物を
５０ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍ
ｏｔ／ ＩＮａＣＡ ／ １ ｒｎ ｍｏｔ／ ｌ ｇ
ＤＴＡ （ｐ）１６．０ ）に対して透析する。
ＡＭＢ ）の製造：さらに、５０ ｍ ｍｏｔ／ ｌ
ＫＰＰ／１００ｍｍｏｔ／ＪＮａＣｔ（ｐＨ７−８）に
ストレプトアビジン５００岬ｔ−溶かし、予めＤＭ８０
中に溶かした８ＡＭＢＡ ２９■を加え、２５℃で攪拌
下に３．５時間インキュベートする。次に反応混合物を
５０ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍ
ｏｔ／ ＩＮａＣＡ ／ １ ｒｎ ｍｏｔ／ ｌ ｇ
ＤＴＡ （ｐ）１６．０ ）に対して透析する。
８Ａ−ＭＷ及び８Ａ−８ＡＭＢの結合：透析さｎた８Ａ
−８ＡＭＢ ＃！液５０勘にｉｍｏｔ／ｊ！ヒドロキシ
ルアミン溶液２７５μノを加え、２５℃で攪拌下に６０
分インキエベートする。次に反応混合物を、５０ ｍ
ｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍｏｌ Ｎａ
Ｃ１／ ２ｍｍｏｔ／ ｌ ＥＤＴＡ （ＰＨ６，５）
各２１に対して２回１時間透析する。この透析液に透析
緩衝液１１ＯｒｔｔＬｔ−加え、透析された８Ａ−ＭＨ
＠液５５紅を加える。この混合物ｔ−２５℃で２〜４時
間攪拌下にインキエベートシ、架橋度をＦＰＬＣ？ル濾
過によって半時間の間隔で検べる。′５Ｉｆ−均の見掛
は分子量が７００〜８００ＫＤＫ達したら、システィン
（全ｔ１ ｍｍｏｔ／ｌ、２５℃、３０分〕及びヨード
アセトアミド（全ｉｉ ５ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ％２５
℃、３０分）を加えて架橋を停止する。得られたストレ
プトアビジンポリマー５Ａ（Ｐ） ’ｉ、５０ ｍ ｍ
ｏｚ ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍｏｚ ／ｉ
Ｎａ０２７１％サッカロース（Ｐ）１６．８ ）中の
スペロース（５ｕｐｅｒｏｓｅ ） ６によるｒ＃＠過
によって精製する。
−８ＡＭＢ ＃！液５０勘にｉｍｏｔ／ｊ！ヒドロキシ
ルアミン溶液２７５μノを加え、２５℃で攪拌下に６０
分インキエベートする。次に反応混合物を、５０ ｍ
ｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍｏｌ Ｎａ
Ｃ１／ ２ｍｍｏｔ／ ｌ ＥＤＴＡ （ＰＨ６，５）
各２１に対して２回１時間透析する。この透析液に透析
緩衝液１１ＯｒｔｔＬｔ−加え、透析された８Ａ−ＭＨ
＠液５５紅を加える。この混合物ｔ−２５℃で２〜４時
間攪拌下にインキエベートシ、架橋度をＦＰＬＣ？ル濾
過によって半時間の間隔で検べる。′５Ｉｆ−均の見掛
は分子量が７００〜８００ＫＤＫ達したら、システィン
（全ｔ１ ｍｍｏｔ／ｌ、２５℃、３０分〕及びヨード
アセトアミド（全ｉｉ ５ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ％２５
℃、３０分）を加えて架橋を停止する。得られたストレ
プトアビジンポリマー５Ａ（Ｐ） ’ｉ、５０ ｍ ｍ
ｏｚ ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍｏｚ ／ｉ
Ｎａ０２７１％サッカロース（Ｐ）１６．８ ）中の
スペロース（５ｕｐｅｒｏｓｅ ） ６によるｒ＃＠過
によって精製する。
８Ａ（Ｐ）を含有す−るフラクションを集め、限外濾過
によってｃ−５Ｉｎ９／継に濃縮し、全１１８０９７都
のサッカロースと共に凝固し、凍結乾燥する。
によってｃ−５Ｉｎ９／継に濃縮し、全１１８０９７都
のサッカロースと共に凝固し、凍結乾燥する。
例 ２
ストレプトアビジン−ポリマーから成るコア及び２層の
クシ血清アルブミン（Ｒ８Ａ ）から成る被覆を有する
ポリマー粒子の製造。
クシ血清アルブミン（Ｒ８Ａ ）から成る被覆を有する
ポリマー粒子の製造。
例１で記載したように製造した８Ａ（Ｐ）−凍結乾燥物
を、全量２５ダ／Ｍの水で浴かし、−を７．０に調節す
る。得られた５Ａ（Ｐ）＃液２Ｉ！ＬｔにＭＨ８（ＤＭ
８０中に予め浴かす）２．６■を加え、２５℃で攪拌下
に６０分インキエベートする。
を、全量２５ダ／Ｍの水で浴かし、−を７．０に調節す
る。得られた５Ａ（Ｐ）＃液２Ｉ！ＬｔにＭＨ８（ＤＭ
８０中に予め浴かす）２．６■を加え、２５℃で攪拌下
に６０分インキエベートする。
１ ｍｏＡ ／ ｌリシン２０ ｔｔｔを加えた後、１
０ｍｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍｏｔ／
ｌ ＮａＣｔ／ ２ ｍｍｏｌ ／ ｌ ＥＤＴＡ
（ｐ）ｆ ６−２ ）に対して透析する。
０ｍｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍｏｔ／
ｌ ＮａＣｔ／ ２ ｍｍｏｌ ／ ｌ ＥＤＴＡ
（ｐ）ｆ ６−２ ）に対して透析する。
透析液に、Ｒ８Ａ溶液（１０ｍ ｍｏｔｉｌ ＫＰＰ／
１００ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＮａＣ１／ ２ ｍ ｍｏ
ｔ／ ｌ ＥＤ’ｌ’ｋ（ｐｉ（６，９）；ＲｓＡ：５
Ａ（ｐ）−１０：１ （〜／卿〕〕５−を加え、反応混
合物のＰ）ｉを６．９に調節し、２５℃で２時間インキ
ユベートスる。０．２ ｍｏｔ／ｌシスティン溶液４４
μｌを加えた後、Ｒ８Ａ−ＳＡ、（Ｐ、）をアクリルア
ミドアガロースによるゲル濾過によって未反応Ｒ８Ａか
ら分離する。このよ’＋ｌｃｔ、テ得ラレ７’ｃうＲ８
Ａ−８Ａ（Ｐ、） ７．５ ｒｎｇを、５０ｍｍｏｔ／
ｌ Ｋ：ＰＰ ／ １００ ｍ ｍａｔ ／ ｌ Ｎ
ａ−ＣＬ ／ ２ ’４サッカロース（−７，０） １
．９５肚に浴かした浴液に、予めＤＭＳＯに爵かしたＭ
Ｂ２７７ ［１層ｇを加え、２５℃で、１時間インキュ
ベートする。次に、１ｍｍｏｔ／Ａ！リシン２０ ｐｌ
を加え、１０ｍｍ０ｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００
ｍ ｍｏｔ／ ｌ Ｎａ−ＣＬ ／ ２ ｍ ｍｏｔ／
ｌ ＥＤＴＡ （Ｐ）１６．２）に対して透析する。
１００ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＮａＣ１／ ２ ｍ ｍｏ
ｔ／ ｌ ＥＤ’ｌ’ｋ（ｐｉ（６，９）；ＲｓＡ：５
Ａ（ｐ）−１０：１ （〜／卿〕〕５−を加え、反応混
合物のＰ）ｉを６．９に調節し、２５℃で２時間インキ
ユベートスる。０．２ ｍｏｔ／ｌシスティン溶液４４
μｌを加えた後、Ｒ８Ａ−ＳＡ、（Ｐ、）をアクリルア
ミドアガロースによるゲル濾過によって未反応Ｒ８Ａか
ら分離する。このよ’＋ｌｃｔ、テ得ラレ７’ｃうＲ８
Ａ−８Ａ（Ｐ、） ７．５ ｒｎｇを、５０ｍｍｏｔ／
ｌ Ｋ：ＰＰ ／ １００ ｍ ｍａｔ ／ ｌ Ｎ
ａ−ＣＬ ／ ２ ’４サッカロース（−７，０） １
．９５肚に浴かした浴液に、予めＤＭＳＯに爵かしたＭ
Ｂ２７７ ［１層ｇを加え、２５℃で、１時間インキュ
ベートする。次に、１ｍｍｏｔ／Ａ！リシン２０ ｐｌ
を加え、１０ｍｍ０ｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００
ｍ ｍｏｔ／ ｌ Ｎａ−ＣＬ ／ ２ ｍ ｍｏｔ／
ｌ ＥＤＴＡ （Ｐ）１６．２）に対して透析する。
透析液（−Ｒ８Ａ−８Ａ（Ｐ万〜、匹で活性化）１．７
６祷に前記のＲ８Ａ 溶液１．１社を加え、Ｆｉｉを６
．９に調節し、２５℃でインキュベートする（ Ｒ８Ａ
：Ｒ８Ａ−８Ａ（Ｐ） −１０： １ ｔｎ９／ｍ？
）。次に０．２ｍｍｏｔ／ ｌシスティン溶液２９μ
ｌを加え、２５℃で６０分インキュベートする。得られ
たＲ８Ａ −Ｒ８Ａ −８Ａ（Ｐ）をゲル濾過（ＡＣＡ
２２．５０ｍｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ
ｍｏｔ／ ｌ ＮａＣｔ２％テツカロース、ｐＨ７，
５）によって未反応Ｒ８Ａから分離する。 Ｒ８Ａ−Ｒ
８Ａ−８Ａ（Ｐ）を含有するフックジョンを集め、ゲル
濾過によって約１１ｎ９７αの濃度に濃縮する。
６祷に前記のＲ８Ａ 溶液１．１社を加え、Ｆｉｉを６
．９に調節し、２５℃でインキュベートする（ Ｒ８Ａ
：Ｒ８Ａ−８Ａ（Ｐ） −１０： １ ｔｎ９／ｍ？
）。次に０．２ｍｍｏｔ／ ｌシスティン溶液２９μ
ｌを加え、２５℃で６０分インキュベートする。得られ
たＲ８Ａ −Ｒ８Ａ −８Ａ（Ｐ）をゲル濾過（ＡＣＡ
２２．５０ｍｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ
ｍｏｔ／ ｌ ＮａＣｔ２％テツカロース、ｐＨ７，
５）によって未反応Ｒ８Ａから分離する。 Ｒ８Ａ−Ｒ
８Ａ−８Ａ（Ｐ）を含有するフックジョンを集め、ゲル
濾過によって約１１ｎ９７αの濃度に濃縮する。
例 ５
ストレプトアビジンポリマーから成るコア及び順次に適
用された２層のＦａｂ’断片から成る抜機を有するポリ
マー粒子の製造。
用された２層のＦａｂ’断片から成る抜機を有するポリ
マー粒子の製造。
例２と同様に処理する、但しＲ８Ａの代りにモノクロナ
ール抗Ｔ８Ｈ−抗体のＦａｂ’断片七使用する。この場
合Ｆａｂ’及び５Ａ（Ｐ）ないしはＦａｂ’及びＦａｂ
’−８Ａ（Ｐ）は５ ： １ （ｒｎｇ／叡）ノ割合テ
使用する。その他の反応条件は同じである。
ール抗Ｔ８Ｈ−抗体のＦａｂ’断片七使用する。この場
合Ｆａｂ’及び５Ａ（Ｐ）ないしはＦａｂ’及びＦａｂ
’−８Ａ（Ｐ）は５ ： １ （ｒｎｇ／叡）ノ割合テ
使用する。その他の反応条件は同じである。
抗Ｔ８Ｈ−抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系統は、
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｆｏｎ ｏｆ Ａｎ
ｉｍａｌ Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓでＥＣＡＣＣ８７
１２２２０２の名称下に寄託されている。
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｆｏｎ ｏｆ Ａｎ
ｉｍａｌ Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓでＥＣＡＣＣ８７
１２２２０２の名称下に寄託されている。
例 ４
ストレプトアビジンポリマーから成るコア及びアミノデ
キストランから成る被惜を有するポリマー粒子の製造。
キストランから成る被惜を有するポリマー粒子の製造。
例２で記載したように、５Ａ（Ｐ）をＭＢ２と反応させ
、次に５０ ｍ ｍｏｔ ／ ｌ ＫＰＰ ／１０ ［
１ｍ ｍａｔ／ ｌ Ｎ！１．ｃｔ ／ ２ ｍ ｍｏ
ｔ／ ｌ ＥＤＴＡ （ｐ）ｔ ６．２ ）に対して透
析する。
、次に５０ ｍ ｍｏｔ ／ ｌ ＫＰＰ ／１０ ［
１ｍ ｍａｔ／ ｌ Ｎ！１．ｃｔ ／ ２ ｍ ｍｏ
ｔ／ ｌ ＥＤＴＡ （ｐ）ｔ ６．２ ）に対して透
析する。
アミノデキストラン（分子ｆｉ ２０．０００ ）２５
０Ｔｎ９ｔ−１００ｍｍｏｔ、／１ＫＰＰ（ｐ）４７．
３ ）１０ム中に溶かす。次に、ＤＭＳＯ中に予め浴か
した５ＡＴＡ ２．９ ｍｙ を加え、２５℃で１時間
インキュベートする。１ｍｏｔ／ｌリシン浴液を全量で
１０ ｍ ｍｏｔ／ ｌ加えた後、反応混合物の−を６
．６に詞節し、５ Ｑ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／
１００ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＮａＣ１／ ２ ｍ ｍｏ
ｔ／ ｌ ＥＤＴＡ （ｐｌ”ｔ ６−２）に対して透
析する。透析液に１１１ｎＯ４／ｌヒドロキシルアミン
（４６，２）を、金倉で５０ ｍ ｍｏｔ／！加え、２
５℃で３０分インキュベートスル。
０Ｔｎ９ｔ−１００ｍｍｏｔ、／１ＫＰＰ（ｐ）４７．
３ ）１０ム中に溶かす。次に、ＤＭＳＯ中に予め浴か
した５ＡＴＡ ２．９ ｍｙ を加え、２５℃で１時間
インキュベートする。１ｍｏｔ／ｌリシン浴液を全量で
１０ ｍ ｍｏｔ／ ｌ加えた後、反応混合物の−を６
．６に詞節し、５ Ｑ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／
１００ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＮａＣ１／ ２ ｍ ｍｏ
ｔ／ ｌ ＥＤＴＡ （ｐｌ”ｔ ６−２）に対して透
析する。透析液に１１１ｎＯ４／ｌヒドロキシルアミン
（４６，２）を、金倉で５０ ｍ ｍｏｔ／！加え、２
５℃で３０分インキュベートスル。
次に反応混合物を、５０ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ
／ １００ｍ ｍｏｔｉ ｌ ＮａＣＬ／ ２ ｍ ｒ
ｎｏｔ ／ １ＥＤＴＡ （ｐＨ６，２）各１１に対し
て２回１時間透析する。この透析液に、透析緩衝液中の
８Ａ（Ｐ）−ＭＨ浴溶液Ｃ−１η／ＩＩ）１０μを加え
、−を直ちに６．９に調節し、２５°Ｃで１時間インキ
ュベートする。次にシスティンを金倉で１ｍｍｏｔ／Ｊ
加え、２５°Ｇで３０分インキュベートする。次にヨー
ドアセトアミドを金倉で５ ｍ ｍａｔ ／ ｌ加え、
２５℃で３０分さらにインキュベートする。得られたア
ミノデキストラン−ストレプトアビジン・コポリマーを
濃縮し、ゲル濾過（アクリルアミドアガロース、５０
ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍａｔ／
ｌ ＮａＣ１／ ２ ｆａサッカロース、ｐＨ７，５
ンによって未反応アミンテキストランから分離する。
／ １００ｍ ｍｏｔｉ ｌ ＮａＣＬ／ ２ ｍ ｒ
ｎｏｔ ／ １ＥＤＴＡ （ｐＨ６，２）各１１に対し
て２回１時間透析する。この透析液に、透析緩衝液中の
８Ａ（Ｐ）−ＭＨ浴溶液Ｃ−１η／ＩＩ）１０μを加え
、−を直ちに６．９に調節し、２５°Ｃで１時間インキ
ュベートする。次にシスティンを金倉で１ｍｍｏｔ／Ｊ
加え、２５°Ｇで３０分インキュベートする。次にヨー
ドアセトアミドを金倉で５ ｍ ｍａｔ ／ ｌ加え、
２５℃で３０分さらにインキュベートする。得られたア
ミノデキストラン−ストレプトアビジン・コポリマーを
濃縮し、ゲル濾過（アクリルアミドアガロース、５０
ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＫＰＰ ／ １００ ｍ ｍａｔ／
ｌ ＮａＣ１／ ２ ｆａサッカロース、ｐＨ７，５
ンによって未反応アミンテキストランから分離する。
アミンテキストラン−ストレプトアビジン・コポリマー
を含有するフラクションを集め、約１■／酩の濃度に濃
縮する。
を含有するフラクションを集め、約１■／酩の濃度に濃
縮する。
例 ５
ＣＥＡテスト（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｉｏｎａｌｅｓ
Ａｎｔｉｇｅｎ−勉胚芽形成抗原でのテスト）におい
て％’ Ｆａｂ’−Ｆａゴー８Ａ（Ｐ）によってビオ
チン妨害作用を除去する。
Ａｎｔｉｇｅｎ−勉胚芽形成抗原でのテスト）におい
て％’ Ｆａｂ’−Ｆａゴー８Ａ（Ｐ）によってビオ
チン妨害作用を除去する。
テスト準備：
ＣＥＡ含有ウマ血清（５０ｎｇ ＣＥＡ／ｄ ）をビオ
チン５０．１００及び２００ｎｇ／ｍｚｌ凝固する。５
０ｍｍｏｔ／１２− （Ｎ−モルホリノ）−エタンスル
ホン酸緩衝液（ｐＨ６，１）中に、ペルオキシダーゼ（
ＰＯＤ ）を有する、ＣＥＡに対するモノクロナール抗
体（Ｉｇ（） ）のＦａｂ断片及びＣ’ＥＡに対スるビ
オチニル化モノクロナール抗体（ＩｇＧ ）から成る抱
合体を含有する試薬溶液を、Ｆａｂ’ −Ｆａｂ’ −
８Ａ（Ｐ） Ｃ例３で記載したように製造〕５ないし７
μｇ／紅で凝固する。
チン５０．１００及び２００ｎｇ／ｍｚｌ凝固する。５
０ｍｍｏｔ／１２− （Ｎ−モルホリノ）−エタンスル
ホン酸緩衝液（ｐＨ６，１）中に、ペルオキシダーゼ（
ＰＯＤ ）を有する、ＣＥＡに対するモノクロナール抗
体（Ｉｇ（） ）のＦａｂ断片及びＣ’ＥＡに対スるビ
オチニル化モノクロナール抗体（ＩｇＧ ）から成る抱
合体を含有する試薬溶液を、Ｆａｂ’ −Ｆａｂ’ −
８Ａ（Ｐ） Ｃ例３で記載したように製造〕５ないし７
μｇ／紅で凝固する。
テストは、市販のテストキット・エンツィムン（Ｅｎｚ
ｙｍｕｎ ） Ｒテストキット （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒＭａｎｎｈｅ １ｍ社、Ｂｅ５ｔ、 Ｎｒ、 １１３
２８１４ ）の規定により行なう− テストの実施： ＣＥＡ含有ウマ血清１００μｌを、ペルオキシダーゼ−
Ｓ識モノクロナール抗ＣＥＡ−抗体（２０ｍＵ ＰＯＤ
／ ｔｕ ）及びビオチン−標赦モノクロナールＣＥ
Ａ−抗体（１，５−μｇ／創）を含有する試薬溶液１μ
と一緒に、ストレプトアビジン被覆ルラン試験管中にピ
ペットで注入し、２５℃で２時間インキュベートする。
ｙｍｕｎ ） Ｒテストキット （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒＭａｎｎｈｅ １ｍ社、Ｂｅ５ｔ、 Ｎｒ、 １１３
２８１４ ）の規定により行なう− テストの実施： ＣＥＡ含有ウマ血清１００μｌを、ペルオキシダーゼ−
Ｓ識モノクロナール抗ＣＥＡ−抗体（２０ｍＵ ＰＯＤ
／ ｔｕ ）及びビオチン−標赦モノクロナールＣＥ
Ａ−抗体（１，５−μｇ／創）を含有する試薬溶液１μ
と一緒に、ストレプトアビジン被覆ルラン試験管中にピ
ペットで注入し、２５℃で２時間インキュベートする。
この際ペルオキシダーゼー標ＲＣＥＡ−抗体、ＣＥＡ及
びビオチン−標ｐ ＣＥＡ−抗体から成る複合体が形成
され、固相に結合さｆしたストレプトアビジンに対する
ビオチンの結合によって固定化される。次に試験管内容
物を吸引し、３回洗゛浄し、再び入念に吸引する。次に
結合さｎたペルオキシダーゼの活性の量を、基質浴ｇ１
継を加えることによって測定し、１．９ ｍ ｍｏｔ／
ｌ ＡＴＢＳＲ−溶ｆｆ（１０，Ｏｍ ｍｏｌ ／
１３リン酸塩−クエン酸塩緩衝液／３．２ ’ｍ ｍ
ｏｔ／ ｌ過ホウ酸ナトリウム（ｐ）１４．４ ）中の
２．２′−アジノジー７６−エチルベンデチアゾリンー
スルホネート（６）を含有する）を加え、２５℃で１時
間インキュベートする。次に、９値としての基質−クロ
モ−ダン−溶液の吸光度に対して４０５ ｎｍで試料に
ついて吸光度を測定する。
びビオチン−標ｐ ＣＥＡ−抗体から成る複合体が形成
され、固相に結合さｆしたストレプトアビジンに対する
ビオチンの結合によって固定化される。次に試験管内容
物を吸引し、３回洗゛浄し、再び入念に吸引する。次に
結合さｎたペルオキシダーゼの活性の量を、基質浴ｇ１
継を加えることによって測定し、１．９ ｍ ｍｏｔ／
ｌ ＡＴＢＳＲ−溶ｆｆ（１０，Ｏｍ ｍｏｌ ／
１３リン酸塩−クエン酸塩緩衝液／３．２ ’ｍ ｍ
ｏｔ／ ｌ過ホウ酸ナトリウム（ｐ）１４．４ ）中の
２．２′−アジノジー７６−エチルベンデチアゾリンー
スルホネート（６）を含有する）を加え、２５℃で１時
間インキュベートする。次に、９値としての基質−クロ
モ−ダン−溶液の吸光度に対して４０５ ｎｍで試料に
ついて吸光度を測定する。
結果：
表２に示すように、このテスト系におけるビオチン妨害
作用は、ｔａｂ’ −Ｆａｂ’−８Ａ（Ｐ）を加えるこ
とによって試料中のビオチン１００ ｎｇ ／ｍｅまで
定量的に除去されつるが、より高いビオチン濃度の場合
には明らかに減少する。
作用は、ｔａｂ’ −Ｆａｂ’−８Ａ（Ｐ）を加えるこ
とによって試料中のビオチン１００ ｎｇ ／ｍｅまで
定量的に除去されつるが、より高いビオチン濃度の場合
には明らかに減少する。
表 ２
１）出発値：ビオチンを含ます、ポリマー粒子を加えな
い試料による吸光度（９値を差引く 〕 例 ６ 抗ＨＢｃ−抗体（ヘバティティスＢコアー４５Ｊｉｔに
対する抗体、ヨーロッパ時計第００１３８２８号）の検
出のためのテストにおいて、ＲＢＡ−ＲＢＡ−８Ａ（Ｐ
）によってビオチン妨害作用を除去する。
い試料による吸光度（９値を差引く 〕 例 ６ 抗ＨＢｃ−抗体（ヘバティティスＢコアー４５Ｊｉｔに
対する抗体、ヨーロッパ時計第００１３８２８号）の検
出のためのテストにおいて、ＲＢＡ−ＲＢＡ−８Ａ（Ｐ
）によってビオチン妨害作用を除去する。
テスト準備：
抗ＨＢｃ−抗体を含まない血清を、ビオチン５０．１０
０及び２００ｎｇ／Ｕで凝固する。
０及び２００ｎｇ／Ｕで凝固する。
４ Ｑ ｍ ｍｏｔ／ ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，４
）中のＨＢｃ−抗原（ＨＢｃＡｇ ）−ビオチン−複合
体（ＨＢｃＡｇ トＮ−ヒドロキシスクシンイミドー活
性化ビオチンとの反応によって製造〕を含有する溶液を
、例２で記載したように製造したＲＢＡ−ＲＢＡ−８Ａ
（Ｐ） （全ｉｔ ７．５〜１２．５μｇ／継）で凝固
した。
）中のＨＢｃ−抗原（ＨＢｃＡｇ ）−ビオチン−複合
体（ＨＢｃＡｇ トＮ−ヒドロキシスクシンイミドー活
性化ビオチンとの反応によって製造〕を含有する溶液を
、例２で記載したように製造したＲＢＡ−ＲＢＡ−８Ａ
（Ｐ） （全ｉｔ ７．５〜１２．５μｇ／継）で凝固
した。
テストの実施：
測定は、競合原理による２段階アッセイで行なう。固相
としては、Ｔｈｅｒｍｏ −ＲＢＡ−ストレプトアビジ
ン（ヨーロッパ％計出願公開第０２６９０９２号）で被
覆されたプラスチック試験管を使用する。標識レセプタ
ーとしては抗ＨＢｃ−抗体−ペルオキシダーゼ・抱合体
を使用する。
としては、Ｔｈｅｒｍｏ −ＲＢＡ−ストレプトアビジ
ン（ヨーロッパ％計出願公開第０２６９０９２号）で被
覆されたプラスチック試験管を使用する。標識レセプタ
ーとしては抗ＨＢｃ−抗体−ペルオキシダーゼ・抱合体
を使用する。
机ＨＢｃ−抗体を含まない血清２００μ２ｆ：、ビオチ
ン−ＨＢｃＡｇ ・抱合体（１Ｑｎｇ／ａｙｔ、）を含
有する溶液１継と一緒に、Ｔｈｅｒｍｏ −ＲＢＡ −
ストレプトアビジンで被覆されたルラン試験管中にピペ
ットで注入し、２５℃で１時間インキュベートする。こ
の際試料からの抗ＨＢｃ−抗体とビオチン−ＨＢＣＡｇ
・抱合体とが反応し、形成された複合体が、同相に結合
されたストレプトアビジンに前記抱合体のビオチンが結
合することによって固１定化される。次に試験管内容物
を吸引し、同試験管を水で６回洗浄する。この際未結合
のビオチニル化ＨＢ ｃ Ａｇ及び全血清成分が除去さ
れる。次に、ペルオキシダーゼ標識抗ＨＢｃＡｇ−抗体
を含有する（ ２００ ｍＵペルオキシダーゼ／ ！！
’Ｕ ） ＃液１肋を加え、２５℃で１時間インキュベ
ートする。この際ベルオキシグーゼ標誠抗ＨＢｃ−抗体
が、試料によって占られなかった抗原−結合位置に結合
する。次に試験管内容物を吸引し、再び６回洗浄すると
、未結合ペルオキシダーゼ抱合体が除去される。次に、
ｊ Ｑ Ｑｍｍｏｔ／ｌ’Ｊン酸塩−クエン酸塩緩衝液
／ ３．２ ｍ ｒｎｏｔ ／ ｌ過ホウ酸ナトリウム
（ｐＨ４，４）中の１．９ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＡＢＴ
８溶欣１溶金１Ｍ、２５℃で１時間インキュベートする
。次に基質−クロモーゲン溶液の吸光度（９値）に対し
て４０５ｎｍで試料に関して吸光度を測定する。
ン−ＨＢｃＡｇ ・抱合体（１Ｑｎｇ／ａｙｔ、）を含
有する溶液１継と一緒に、Ｔｈｅｒｍｏ −ＲＢＡ −
ストレプトアビジンで被覆されたルラン試験管中にピペ
ットで注入し、２５℃で１時間インキュベートする。こ
の際試料からの抗ＨＢｃ−抗体とビオチン−ＨＢＣＡｇ
・抱合体とが反応し、形成された複合体が、同相に結合
されたストレプトアビジンに前記抱合体のビオチンが結
合することによって固１定化される。次に試験管内容物
を吸引し、同試験管を水で６回洗浄する。この際未結合
のビオチニル化ＨＢ ｃ Ａｇ及び全血清成分が除去さ
れる。次に、ペルオキシダーゼ標識抗ＨＢｃＡｇ−抗体
を含有する（ ２００ ｍＵペルオキシダーゼ／ ！！
’Ｕ ） ＃液１肋を加え、２５℃で１時間インキュベ
ートする。この際ベルオキシグーゼ標誠抗ＨＢｃ−抗体
が、試料によって占られなかった抗原−結合位置に結合
する。次に試験管内容物を吸引し、再び６回洗浄すると
、未結合ペルオキシダーゼ抱合体が除去される。次に、
ｊ Ｑ Ｑｍｍｏｔ／ｌ’Ｊン酸塩−クエン酸塩緩衝液
／ ３．２ ｍ ｒｎｏｔ ／ ｌ過ホウ酸ナトリウム
（ｐＨ４，４）中の１．９ ｍ ｍｏｔ／ ｌ ＡＢＴ
８溶欣１溶金１Ｍ、２５℃で１時間インキュベートする
。次に基質−クロモーゲン溶液の吸光度（９値）に対し
て４０５ｎｍで試料に関して吸光度を測定する。
表６で示すように、このテスト系でＲ８Ａ−Ｒ８Ａ−８
Ａ（Ｐ） ｔ−加えることによって、ビオチン妨害作用
が２００ｍｇ／紅まで殆ど完全に除去されつる。
Ａ（Ｐ） ｔ−加えることによって、ビオチン妨害作用
が２００ｍｇ／紅まで殆ど完全に除去されつる。
表 ３
差引く）
例 ７
ウシ血清アルフ゛ミンーストレプトアビジン・コポリマ
ーから成るコア及びｔａｂ’ 断片から成る被覆を有す
るポリマー粒子の製造。
ーから成るコア及びｔａｂ’ 断片から成る被覆を有す
るポリマー粒子の製造。
先づ例２と同様にしてＲ８Ａ−８Ａ（Ｐ）を製造する。
このコボリマニを、例２で記載したようにＭＷ８で活性
化する。Ｒ３ＡＳＡ（Ｐ）−ＭＷを、例２で記載した反
応条件下で抗ＴＳＨ−抗体のＦａｂ ｊｌｊ片（例６参
照）と５ ： １ （！ｎｇ／ｒＩＩＱ）の割合で反応
させ机 例 ８ ＨＡＩＢＣ−抗体の検出のためのテストでビオチン妨害
作用をＦａｂ’−Ｒ８Ａ−ｓＡ（ｐ）によって除去する
。
化する。Ｒ３ＡＳＡ（Ｐ）−ＭＷを、例２で記載した反
応条件下で抗ＴＳＨ−抗体のＦａｂ ｊｌｊ片（例６参
照）と５ ： １ （！ｎｇ／ｒＩＩＱ）の割合で反応
させ机 例 ８ ＨＡＩＢＣ−抗体の検出のためのテストでビオチン妨害
作用をＦａｂ’−Ｒ８Ａ−ｓＡ（ｐ）によって除去する
。
テストは、例６で記載したように実施したが、ＨＢＣＡ
ｇ−ビオチン−Ｓ液をＦａｂ’ −Ｒ８Ａ−８Ａｃｐ）
１０及び１５μ＆／凝で凝固した。清面及びＨＢＣＡ
ｇ−ビオチン・溶液を、ストレプトアビジンの被覆され
たルラン試験管中に一緒には注入しないで、先づ血清２
００μｌを試験管中に注入し、２〜５分の時間後に初め
てＨＢｃＡｇ−ビオチン・抱合体溶液を加える。
ｇ−ビオチン−Ｓ液をＦａｂ’ −Ｒ８Ａ−８Ａｃｐ）
１０及び１５μ＆／凝で凝固した。清面及びＨＢＣＡ
ｇ−ビオチン・溶液を、ストレプトアビジンの被覆され
たルラン試験管中に一緒には注入しないで、先づ血清２
００μｌを試験管中に注入し、２〜５分の時間後に初め
てＨＢｃＡｇ−ビオチン・抱合体溶液を加える。
表４は、この変更されたテストの実施の場合にも、明瞭
な妨害除去作用が観察されうることを示す。
な妨害除去作用が観察されうることを示す。
表 ４
１）出発値：ビオチン金言まず、ポリマー粒子を加えて
ない試料に関する吸光度（９値を差引く）
ない試料に関する吸光度（９値を差引く）
第１ａ図はサンドインチ式に行なう本発明方法の俣式融
、第１ｂ図は競合式に行なう本発明方法の模式図、第２
ａ図及び第２ｂ図は、本発明方法の別法を示す模式図で
るる。 Ｆｉｇ、 ｌａ ９ リガンド受容体 １４．１６．１９・抱合体
、第１ｂ図は競合式に行なう本発明方法の模式図、第２
ａ図及び第２ｂ図は、本発明方法の別法を示す模式図で
るる。 Ｆｉｇ、 ｌａ ９ リガンド受容体 １４．１６．１９・抱合体
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、標識化、固定化又は複合化のためにリガンド抱合体
を使用するイムノアツセイの原理により、リガンド抱合
体のために使用されるリガンドを遊離の形で含有する体
液中の特異的に結合可能の物質を検出する方法において
、試料浴液、コア及び被覆から成り、コアとしては多数
のリガンド結合位置を有するポリマーを有しかつ被覆と
してはタンパク質、ペプチド、核酸ポリマー、炭水化物
及び／又は炭水化物とアミノ酸とから成るコポリマーを
有するポリマー粒子と一緒にインキュベートし、この際
被覆の層厚を、同被覆が遊離リガンドに対しては透過性
であるが、リガンド抱合体に対しては非透過性であるよ
うに調節することによつて、遊離の形で存在するリガン
ドを免疫学的反応から除去することを特徴とする体液中
の特異的に結合可能の物質の検出方法。 ２、コア及び被覆を包含する水溶性ポリマーレセプター
の分子から成り、この際コアが多数のリガンド結合位置
を有するポリマーでありかつ被覆がタンパク質、ペプチ
ド、核酸ポリマー、炭水化物及び／又は炭水化物とアミ
ノ酸とから成るコポリマーから成る少なくとも１層から
構成されていて、被覆の層厚を、同被覆が遊離リガンド
に対して透過性であるが、リガンド抱合体に対しては不
透過性であることを特徴とするリガンド受容体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3915135.2 | 1989-05-09 | ||
| DE3915135A DE3915135A1 (de) | 1989-05-09 | 1989-05-09 | Verfahren zum nachweis spezifisch bindefaehiger substanzen in koerperfluessigkeiten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02309254A true JPH02309254A (ja) | 1990-12-25 |
| JPH07117536B2 JPH07117536B2 (ja) | 1995-12-18 |
Family
ID=6380321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2117808A Expired - Lifetime JPH07117536B2 (ja) | 1989-05-09 | 1990-05-09 | 体液中の特異的に結合可能の物質の検出方法及びリガンド受容体 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5212063A (ja) |
| EP (1) | EP0397113B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07117536B2 (ja) |
| AT (1) | ATE97496T1 (ja) |
| DE (2) | DE3915135A1 (ja) |
| DK (1) | DK0397113T3 (ja) |
| ES (1) | ES2047749T3 (ja) |
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