JP2022502681A - 分子トラップを使用して、アッセイからビオチン干渉を取り除く方法および組成物 - Google Patents
分子トラップを使用して、アッセイからビオチン干渉を取り除く方法および組成物 Download PDFInfo
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Abstract
Description
通常、ハプテンのエピトープは分子全体である。
a)粒子または固相剤ではなく、水溶液に可溶な分子構造である。
b)遊離ハプテンにのみ結合するが、ハプテン−Abコンジュゲートなどの大きな分子には結合しないようにする必要がある。
a)およびb)で説明されている機能は、分子ハプテントラップを構成するのに十分である。
あるいは、以下の機能も分子ハプテントラップに十分であるとみなされる:
c)結合のオフ速度が遅いため、結合したハプテンは実際に所定の位置に閉じ込められる。この機能の利点は、捕捉された(または閉じ込められたビオチン)が容易に解離せず、ハプテン結合パートナーを生成するアッセイ信号を求めてコンジュゲートハプテンと競合しないことである。
d)コンジュゲートハプテンがアッセイ信号生成ハプテン結合パートナーに優先的に結合するように、結合のオン速度を遅くする必要がある。
分子ハプテントラップは、機能a)とb)、または機能c)とd)のいずれかを単独で、または組み合わせて十分に機能する。
1)ビオチンを含有するサンプルを、可溶性分子ビオチントラップを含むキャプチャーAbコーティングケミビーズ試薬(例えば、デキサルで修飾されたストレプトアビジンもしくはトラプタビジンまたは非修飾トラプタビジン)とインキュベートする。サンプル中の遊離ビオチンはビオチントラップに結合する。
2)ビオチン化抗体を、続いてストレプトアビジンでコーティングされたセンシビーズを添加する。工程1)でネイティブ(非修飾)トラプタビジンを使用する場合は、ビオチン化抗体の添加直後にストレプトアビジンでコーティングしたセンシビーズを添加する必要がある。これは、ビオチン化抗体が、ビオチン結合に関してストレプトアビジンよりもオン速度が遅いトラプタビジンではなく、センシビーズにコーティングされたストレプトアビジンに優先的に結合することを確実にするためである。コンジュゲートビオチンに結合しない、表面を修飾されたトラプタビジンを使用する場合、結合した、サンプルからの遊離ビオチン分子は、トラプタビジン分子に閉じ込められているため、ストレプトアビジンセンシビーズへの結合についてビオチン化抗体と競合しない。
遊離ハプテンに選択的に結合するためにアッセイ溶液に可溶な分子構造を含み、分子構造は、遊離ハプテンに対する修飾された特異的結合パートナー(sbp)を含む。修飾されたsbpは、デキストランアルデヒド成分、結合した立体障害ポリマー、および他の遊離ハプテン特異的結合パートナー(sbp)アッセイ試薬よりも遅い特異的遊離ハプテン結合オフ速度特性の1つまたはそれ以上を含む。
a)部位特異的変異誘発は、ビオチン結合部位の近くのアミノ酸残基を変化させ、結合部位の近くの別のタンパク質またはポリマーのコンジュゲーションを可能にして、結合部位に入るためにはより小さな遊離ハプテンではなく大きなビオチン化抗体に立体障害をもたらす。
b)他の遺伝子工学技術はa)と同様の変異を生み出す。
c)遺伝子操作されたストレプトアビジンは依然として遊離ビオチンに高い親和性で結合している。
d)タンパク質(BSAなど)またはポリマーを、改変されたストレプトアビジンにコンジュゲートさせて、遊離ビオチントラップの作成を完了する。
e)部位特異的変異誘発によって遺伝子操作され、1つのアミノ酸残基を現在の配列にない固有のアミノ酸に変更する。例えば、{37−{37、{35−{36、または{33−{34(図2を参照)の間の接続部のアミノ酸残基をメチオニン(MetまたはM)に変更する。変異は結合部位の近くにあるため、SMCC(マレイミド化学反応)および/または他のポリマーを使用してタンパク質をコンジュゲートさせると、ビオチン化抗体試薬に立体障害が生じる(図3を参照)。
アッセイ成分、ならびに試験中の分析物および過剰の遊離ハプテンを有する患者のサンプルを組み合わせて、アッセイ溶液を形成する工程であり、アッセイ成分は、ハプテンおよび比較的大きな抗ハプテンを含む特異的結合対、ハプテンおよび抗ハプテンのそれぞれのアッセイコンジュゲート、ならびに遊離ハプテンに選択的な分子トラップを含む、工程と;
分子トラップを用いてアッセイ溶液中の遊離ハプテンを選択的に保持する工程と
を含み、
ここで、分子トラップは、空洞を取り囲むシェルを有する分子ケージ、分子複合体、および修飾された抗ハプテン特異的結合パートナー(sbp)を含む分子構造の1つまたは混合物を含み、修飾された抗ハプテンsbpは、デキストランアルデヒド成分、結合した立体障害ポリマー、および他の抗ハプテン特異的結合パートナー(sbp)アッセイ成分よりも遅い特異的遊離ハプテン結合オフ速度特性のうちの1つまたはそれ以上を含む、
方法を含む。
Claims (10)
- アッセイにおける遊離ハプテン干渉を低減するための分子トラップであって:
遊離ハプテンを選択的に結合するためのアッセイ溶液に可溶な分子構造を含み、該分子構造は、遊離ハプテンに対する修飾された特異的結合パートナー(sbp)を含み、該修飾されたsbpは、デキストランアルデヒド成分、結合した立体障害ポリマー、および他の遊離ハプテン特異的結合パートナー(sbp)アッセイ試薬よりも遅い特異的遊離ハプテン結合オフ速度特性のうちの1つまたはそれ以上を含む、前記分子トラップ。 - 分子構造は、コーティングをさらに含み、該コーティングは、遊離ハプテンのための選択的透過性材料の1つまたはそれ以上、アッセイ溶液中の遊離ハプテンを引き付け他のアッセイ分子をはね返す一方または両方に対するイオン電荷、およびアッセイ溶液中の遊離ハプテンの選択的保持と他のアッセイ分子の立体反発の一方または両方を促進する極性を含む、請求項1に記載の分子トラップ。
- コーティングは、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質またはペプチド、デキストランアルデヒドまたはアミノデキストランのようなポリマー、エチレンジアミン、テトラエチレンペンタアミンのような化合物、イオン的に帯電した部分、疎水性部分のうちの1つまたはそれ以上を含む、請求項2に記載の分子トラップ。
- 修飾されたsbpの特異的遊離ハプテン結合オフ速度特性は、修飾されたsbpの特異的遊離ハプテン結合オン速度特性よりも遅い、請求項1に記載の分子トラップ。
- 遊離ハプテンは遊離ビオチンであり、修飾されたsbpは、アッセイ溶液中の他の遊離ハプテンsbpよりも遅い特異的遊離ハプテン結合オフ速度を有するトラプタビジンを含み、アッセイ溶液中の他の該遊離ハプテンsbpは、ストレプトアビジンおよびアビジンから選択される、請求項1に記載の分子トラップ。
- デキストランアルデヒド成分と立体障害ポリマーの一方または両方を含む修飾されたsbpは、遊離ハプテンよりも比較的大きいアッセイ溶液中のアッセイ成分とアッセイコンジュゲートとの結合を選択的に妨害するためである、請求項1に記載の分子トラップ。
- アッセイ溶液中の遊離ハプテンは、遊離ビオチンおよび遊離フルオレセインからなる群から選択され、遊離ビオチンに対する修飾されたsbpは、修飾されたストレプトアビジン、修飾されたアビジン、およびトラプタビジンのうちの1つであり、遊離フルオレセインに対する修飾されたsbpは、修飾された抗フルオレセインである、請求項1に記載の分子トラップ。
- 修飾されたsbpは、遊離ハプテンの特異的結合部位に隣接する修飾されたsbpのアミノ酸にコンジュゲートした立体障害ポリマーを含む遺伝子操作されたsbpであり、該立体障害ポリマーは、遊離ハプテンに対応するハプテン−アッセイコンジュゲートの特異的結合を妨げる、請求項1に記載の分子トラップ。
- 立体障害ポリマーは、アミノデキストランおよびウシ血清アルブミンからなる群から選択される、請求項8に記載の分子トラップ。
- ハプテン−アッセイコンジュゲートは、ハプテン−抗体コンジュゲート、ハプテン−抗原コンジュゲート、ハプテン−標識酵素コンジュゲート、ハプテン−試験中分析物コンジュゲート、ハプテン−標識コンジュゲート、およびハプテン−受容体コンジュゲートのうちの1つまたはそれ以上からなる群から選択される、請求項8に記載の分子トラップ。
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