JP2626657B2 - 抗体を測定するための方法及び試薬 - Google Patents
抗体を測定するための方法及び試薬Info
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
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- Y10S436/827—Lectins
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、R1及びR3が液体相中に存在し、抗体と結合
可能であり、R2が固体相中に存在し、R1と結合可能であ
り及びR3は標識を有する３種類の異なる受容体（Rezept
or）R1、R2及びR3と抗体を一緒に恒温保持し、固体相を
液体相から分離し、固体相中の標識を測定することによ
つて抗体を測定する方法に関する。
可能であり、R2が固体相中に存在し、R1と結合可能であ
り及びR3は標識を有する３種類の異なる受容体（Rezept
or）R1、R2及びR3と抗体を一緒に恒温保持し、固体相を
液体相から分離し、固体相中の標識を測定することによ
つて抗体を測定する方法に関する。
抗体は、Ｂリンパ球及び血漿細胞の通過する抗原との
接触により産出され、この生成を惹起する抗原に特異的
に対応する蛋白質分子である。従つて特定の抗原に対す
る抗体の検出によつて、病気の段階又は自己免疫病の存
在を解明することができる。
接触により産出され、この生成を惹起する抗原に特異的
に対応する蛋白質分子である。従つて特定の抗原に対す
る抗体の検出によつて、病気の段階又は自己免疫病の存
在を解明することができる。
抗体は免疫学的検出法の原理による方法によつて鋭敏
に検出することができる。この場合に種々の方法が可能
である。すなわち例えば抗原を支持体と共有結合させ、
測定すべき抗体を含有する溶液と接触させ、引続きこの
抗体に対応する公知方法で標識付けしてある抗体一般に
抗−Ig−抗体と反応させることができる。次いで結合し
た標識の程度から抗体含量の量が推論される。この方法
の欠点は、試料中に含有される特異的ではない抗体の非
特異性結合によつて偽の陽性値が得られるこのである。
更にこの測定は連続する２工程でのみ実施できるにすぎ
ない。抗体の検出及び定量測定用のその他の試験は、測
定すべき抗体に対する抗原を固定相に固定することであ
る。引続き患者の血清を前以つて決めた量の測定すべき
抗体（標識を有する）と一緒に添加し、引続き固体相と
結合した標識を測定する。この場合にも感度が特に要求
される競争試験（kompetitiven Test）が問題となる。
その他の方法は固体相に抗−Ig−抗体を結合させ、次い
で試験溶液と反応させることである。引続き測定すべき
抗体に特異的な抗原（これに標識が結合している）を添
加する。この方法の欠点は固体相の結合力に限界がある
ことである。それは測定すべき抗体の他に同じ種類のク
ロブリンのその他の抗体も結合するからである。
に検出することができる。この場合に種々の方法が可能
である。すなわち例えば抗原を支持体と共有結合させ、
測定すべき抗体を含有する溶液と接触させ、引続きこの
抗体に対応する公知方法で標識付けしてある抗体一般に
抗−Ig−抗体と反応させることができる。次いで結合し
た標識の程度から抗体含量の量が推論される。この方法
の欠点は、試料中に含有される特異的ではない抗体の非
特異性結合によつて偽の陽性値が得られるこのである。
更にこの測定は連続する２工程でのみ実施できるにすぎ
ない。抗体の検出及び定量測定用のその他の試験は、測
定すべき抗体に対する抗原を固定相に固定することであ
る。引続き患者の血清を前以つて決めた量の測定すべき
抗体（標識を有する）と一緒に添加し、引続き固体相と
結合した標識を測定する。この場合にも感度が特に要求
される競争試験（kompetitiven Test）が問題となる。
その他の方法は固体相に抗−Ig−抗体を結合させ、次い
で試験溶液と反応させることである。引続き測定すべき
抗体に特異的な抗原（これに標識が結合している）を添
加する。この方法の欠点は固体相の結合力に限界がある
ことである。それは測定すべき抗体の他に同じ種類のク
ロブリンのその他の抗体も結合するからである。
もう１つの変法は、固体相を測定すべき抗体の特異的
な抗原で被覆し、引続きこの固体相を試料溶液と反応さ
せ、その後次の段階で標識を有する特異的な結合可能な
物質を添加することである。このような方法は例えば欧
州特許（EP−Ａ）第168689号明細書及び欧州特許（EP−
Ａ）第160900号明細書から公知である。この方法の欠点
は一つに、固体相がその都度特異的な抗原を有するの
で、各々の測定用にその他の固体相を使用せねばならな
いことである。もう１つの欠点は、抗体と抗原の反応が
多相で行なわれることである。更にこのような方法には
常に２つの工程が必要とされる。しかしこのような方法
は唯一つの洗浄工程が実施可能である分析装置で行うこ
とはできない。
な抗原で被覆し、引続きこの固体相を試料溶液と反応さ
せ、その後次の段階で標識を有する特異的な結合可能な
物質を添加することである。このような方法は例えば欧
州特許（EP−Ａ）第168689号明細書及び欧州特許（EP−
Ａ）第160900号明細書から公知である。この方法の欠点
は一つに、固体相がその都度特異的な抗原を有するの
で、各々の測定用にその他の固体相を使用せねばならな
いことである。もう１つの欠点は、抗体と抗原の反応が
多相で行なわれることである。更にこのような方法には
常に２つの工程が必要とされる。しかしこのような方法
は唯一つの洗浄工程が実施可能である分析装置で行うこ
とはできない。
従つて本発明の課題は、一段階でかつ１回の洗浄工程
で実施することができ、従つて自動化が可能である抗体
測定法を開発することであつた。更に本発明の課題は、
１つの固体相を多数の異なる試験に使用することができ
る方法を開発することであつた。
で実施することができ、従つて自動化が可能である抗体
測定法を開発することであつた。更に本発明の課題は、
１つの固体相を多数の異なる試験に使用することができ
る方法を開発することであつた。
この課題は、R1及びR3が液体相中に存在し、抗体と結
合可能であり、R2が固体相と結合して存在しR1と結合可
能であり、R3が標識を有する３種類の異なる受容体R1、
R2及びR3と一緒に恒温保持し、固体相を液体相から分離
し、固体相の標識を測定することによる抗体の測定法に
よつて解決されるが、これはR1として測定すべき抗体に
よつて特異的に認識される物質及び特異的な結合系の反
応成分から成る結合体（konjugat）を使用し、R3として
測定すべき抗体によつて特異的に認識される物質及び標
識から成る結合体を使用し、R2として特異的な結合系の
その他の結合成分を使用することを特徴とする。
合可能であり、R2が固体相と結合して存在しR1と結合可
能であり、R3が標識を有する３種類の異なる受容体R1、
R2及びR3と一緒に恒温保持し、固体相を液体相から分離
し、固体相の標識を測定することによる抗体の測定法に
よつて解決されるが、これはR1として測定すべき抗体に
よつて特異的に認識される物質及び特異的な結合系の反
応成分から成る結合体（konjugat）を使用し、R3として
測定すべき抗体によつて特異的に認識される物質及び標
識から成る結合体を使用し、R2として特異的な結合系の
その他の結合成分を使用することを特徴とする。
本発明による方法は、２種類の結合成分（このうちの
１つは測定すべき抗体に特異的な少なくとも１つのエピ
トープを有する物質、例えば抗原、抗原フラグメント、
抗−イデイオタイプ−抗体又はハプテンと特異的な結合
系の成分から成る結合体であり、もう一つは測定すべき
抗体に特異的な少なくとも１つのエピトープを有する物
質、例えば抗原、抗原フラグメント、抗−イデイオタイ
プ−抗体又はハプテンと標識から成る結合体である）が
測定すべき抗体の少なくとも２種類の特異的な結合可能
なパラトープに関して競合するという原理に基づく。そ
の際次の反応生成物が生ずる:R1ともR3とも結合してい
る抗体、R1とだけ結合している抗体及びR3とだけ結合し
ている抗体。最初の２つの反応生成物は、特異的な結合
系の反応成分を有するので、固体相と結合することがで
きる。R3とだけ結合している反応生成物は洗浄除去され
る。R1だけが結合している抗体は標識を有さないので、
測定には関与しない。従つて抗体の濃度測定はR1及びR3
が結合している抗体分子に関してのみ行われる。従つて
その際測定すべき抗体によつて特異的に認識される物質
の量（免疫反応性である）がR1中でR3中の免疫反応性物
質の量より多いか又は同じである場合に最高の感度が得
られる。有利にはR1及びR3中の免疫反応性物質は比20〜
1:1で使用される。特に有利には比５〜1:1である。結合
した標識付けされた結合体に関して評価することがで
き、検量線を用いて試料中と抗体の濃度を測定すること
ができる。
１つは測定すべき抗体に特異的な少なくとも１つのエピ
トープを有する物質、例えば抗原、抗原フラグメント、
抗−イデイオタイプ−抗体又はハプテンと特異的な結合
系の成分から成る結合体であり、もう一つは測定すべき
抗体に特異的な少なくとも１つのエピトープを有する物
質、例えば抗原、抗原フラグメント、抗−イデイオタイ
プ−抗体又はハプテンと標識から成る結合体である）が
測定すべき抗体の少なくとも２種類の特異的な結合可能
なパラトープに関して競合するという原理に基づく。そ
の際次の反応生成物が生ずる:R1ともR3とも結合してい
る抗体、R1とだけ結合している抗体及びR3とだけ結合し
ている抗体。最初の２つの反応生成物は、特異的な結合
系の反応成分を有するので、固体相と結合することがで
きる。R3とだけ結合している反応生成物は洗浄除去され
る。R1だけが結合している抗体は標識を有さないので、
測定には関与しない。従つて抗体の濃度測定はR1及びR3
が結合している抗体分子に関してのみ行われる。従つて
その際測定すべき抗体によつて特異的に認識される物質
の量（免疫反応性である）がR1中でR3中の免疫反応性物
質の量より多いか又は同じである場合に最高の感度が得
られる。有利にはR1及びR3中の免疫反応性物質は比20〜
1:1で使用される。特に有利には比５〜1:1である。結合
した標識付けされた結合体に関して評価することがで
き、検量線を用いて試料中と抗体の濃度を測定すること
ができる。
従つて意外にも本発明により、抗体を非常に高い正確
さでかつ簡単な方法で測定することが可能である。本発
明による測定方法は高い濃度の測定すべきではない抗体
によつて阻害されない。本方法の特別な利点は検査経過
の迅速性と簡潔性である。
さでかつ簡単な方法で測定することが可能である。本発
明による測定方法は高い濃度の測定すべきではない抗体
によつて阻害されない。本方法の特別な利点は検査経過
の迅速性と簡潔性である。
本発明により方法は全ての種類の抗体、例えばIgG、I
gM、IgA、IgD及びIgE並びに混合物の測定用に好適であ
る。
gM、IgA、IgD及びIgE並びに混合物の測定用に好適であ
る。
受容体及び測定すべき抗体のいずれもが各々それに特
定の反応成分と特異的にのみ反応しうるので、全ての受
容体及び試料を一緒に恒温保持し、方法を１工程で実施
することができる。この方法は又恒温保持後に１回の洗
浄工程を必要とするにすぎない。勿論本発明による方法
を２段階で実施することもできる。この場合に有利には
試料を先ず受容体R1及びR3と恒温保持し、引き続きR1、
R3及び測定すべき抗体から生じた結合体を固体相と結合
したR2に添加する。本発明による方法のその他の利点
は、方法を１段階で行うことであり、それによつて方法
を容易に自動化することができる。
定の反応成分と特異的にのみ反応しうるので、全ての受
容体及び試料を一緒に恒温保持し、方法を１工程で実施
することができる。この方法は又恒温保持後に１回の洗
浄工程を必要とするにすぎない。勿論本発明による方法
を２段階で実施することもできる。この場合に有利には
試料を先ず受容体R1及びR3と恒温保持し、引き続きR1、
R3及び測定すべき抗体から生じた結合体を固体相と結合
したR2に添加する。本発明による方法のその他の利点
は、方法を１段階で行うことであり、それによつて方法
を容易に自動化することができる。
本発明による方法を実施するために３種類の受容体
R1、R2及びR3を使用する。受容体R1及びR3は各々液体相
中に、有利には同じ濃度で存在する。これらは各々測定
すべき抗体に特異的なエピトープを有する物質から成
る。この物質は各々２つの部分から成る結合体であり、
その際１つの部分はエピトープを有し、例えば抗原、抗
原フラグメント、抗−イデイオタイプ−抗体又はハプテ
ンである。受容体R1及びR3中に含有される抗体特異性物
質は同一であつてもよいし異なるものであつてもよい。
結合体のもう１つの部分はR1では特異的な結合系の反応
成分である。この場合に特異的な結合系とは相互に特異
的に反応しうる２つの成分である。その際結合力は免疫
学的反応に基づくものであつても良いが、その他の特異
的な反応に基づくものであつても良い。
R1、R2及びR3を使用する。受容体R1及びR3は各々液体相
中に、有利には同じ濃度で存在する。これらは各々測定
すべき抗体に特異的なエピトープを有する物質から成
る。この物質は各々２つの部分から成る結合体であり、
その際１つの部分はエピトープを有し、例えば抗原、抗
原フラグメント、抗−イデイオタイプ−抗体又はハプテ
ンである。受容体R1及びR3中に含有される抗体特異性物
質は同一であつてもよいし異なるものであつてもよい。
結合体のもう１つの部分はR1では特異的な結合系の反応
成分である。この場合に特異的な結合系とは相互に特異
的に反応しうる２つの成分である。その際結合力は免疫
学的反応に基づくものであつても良いが、その他の特異
的な反応に基づくものであつても良い。
有利には特異的な結合系としてはビオチンとアビジ
ン；ビオチンとストレプトアビジン；ビオチンとアンチ
ビオチン；ハプテンと抗ハプテン；抗体のFcγ−フラグ
メントとこのFc−γ−フラグメントに対する抗体又は炭
化水素とレクチンの組合せを使用する。その際にこの特
異的に結合可能な組の反応成分の１つは受容体R1を生成
する結合体の部分である。
ン；ビオチンとストレプトアビジン；ビオチンとアンチ
ビオチン；ハプテンと抗ハプテン；抗体のFcγ−フラグ
メントとこのFc−γ−フラグメントに対する抗体又は炭
化水素とレクチンの組合せを使用する。その際にこの特
異的に結合可能な組の反応成分の１つは受容体R1を生成
する結合体の部分である。
その他の反応成分は固体相中に存在する受容体R2であ
る。不溶性の支持体材料に対するR2の結合は結合体成分
（有利には生物学的結合体系の）を固体の支持体物質に
固定するための常用の当業者に公知の方法により行うこ
とができる。共有結合及び吸着性の結合が好適である。
しかし例えばプラスチツクに対しては、その場合に高収
率が達成され、操作方法が簡素化されるために、単に吸
着性結合が有利である。固体層としては内表面をR2で吸
着的に被覆してある試験管又はポリスチレン及び類似の
プラスチツク製の微量滴定プレートが特に好適である。
更に粒状の物質、例えば分子篩材料、ガラス小体、プラ
スチツク管等も好適である。固体相の支持体としては多
孔性の層状支持体、例えば紙が特に好適である。R2とし
て固体層に特異的な結合系の反応成分を固定する。
る。不溶性の支持体材料に対するR2の結合は結合体成分
（有利には生物学的結合体系の）を固体の支持体物質に
固定するための常用の当業者に公知の方法により行うこ
とができる。共有結合及び吸着性の結合が好適である。
しかし例えばプラスチツクに対しては、その場合に高収
率が達成され、操作方法が簡素化されるために、単に吸
着性結合が有利である。固体層としては内表面をR2で吸
着的に被覆してある試験管又はポリスチレン及び類似の
プラスチツク製の微量滴定プレートが特に好適である。
更に粒状の物質、例えば分子篩材料、ガラス小体、プラ
スチツク管等も好適である。固体相の支持体としては多
孔性の層状支持体、例えば紙が特に好適である。R2とし
て固体層に特異的な結合系の反応成分を固定する。
受容体R3は抗原、抗原フラグメント又はハプテンの他
に結合体のその他の部分として標識を有する。標識とし
て酵素、発蛍光性、化学発光性又は放射性物質を使用す
る。抗原、抗原フラグメント又はハプテンを標識付けす
る方法は、例えばクリニカ・ヒミカ・アクタ（clinica
chemica Acta）第81巻（1977年）１〜40から当業者に公
知であり、本明細書で更に詳説する必要はない。標識は
自体公知の方法で測定することができる。
に結合体のその他の部分として標識を有する。標識とし
て酵素、発蛍光性、化学発光性又は放射性物質を使用す
る。抗原、抗原フラグメント又はハプテンを標識付けす
る方法は、例えばクリニカ・ヒミカ・アクタ（clinica
chemica Acta）第81巻（1977年）１〜40から当業者に公
知であり、本明細書で更に詳説する必要はない。標識は
自体公知の方法で測定することができる。
本発明による方法の有利な態様では、受容体R1及びR3
並びに測定すべき抗体を含有する試料を恒温保持する。
その際R1及びR3は統計学的な確率で測定すべき抗体のパ
ラトープと反応する。この反応混合物を引続き受容体R2
を有する固体相と接触させる。
並びに測定すべき抗体を含有する試料を恒温保持する。
その際R1及びR3は統計学的な確率で測定すべき抗体のパ
ラトープと反応する。この反応混合物を引続き受容体R2
を有する固体相と接触させる。
特異的な結合系のR1中に含有される反応成分はR2と反
応する。恒温保持後に固体相の液体相からの相分離を例
えば吸引濾過により行うが次いで固体相を洗浄後標識の
測定を行うことができ、測定すべき抗体の量の程度が判
明する。標識付けを酵素を用いて行う場合には、標識酵
素の活性をこのために一般に公知の方法で測定するだけ
で十分である。標識酵素としては特に有利にはペルオキ
シダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼを使用する。
応する。恒温保持後に固体相の液体相からの相分離を例
えば吸引濾過により行うが次いで固体相を洗浄後標識の
測定を行うことができ、測定すべき抗体の量の程度が判
明する。標識付けを酵素を用いて行う場合には、標識酵
素の活性をこのために一般に公知の方法で測定するだけ
で十分である。標識酵素としては特に有利にはペルオキ
シダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼを使用する。
標識付けを酵素ではなく放射性物質、アイソトープ、
発蛍光性又は化学発光性物質を用いて行う場合にも、当
業者によく知られている方法の１つにより測定を行う。
発蛍光性又は化学発光性物質を用いて行う場合にも、当
業者によく知られている方法の１つにより測定を行う。
方法を遠心分析器で行う場合には、試料を先ず２種類
の受容体R1及びR3が分離して存在する支持体を用いて遠
心分離するのが有利である。この場合に受容体R1及びR3
は溶解される。
の受容体R1及びR3が分離して存在する支持体を用いて遠
心分離するのが有利である。この場合に受容体R1及びR3
は溶解される。
相応する一時的に形成される保持相によつて受容体R1
とR3の分離及び試料中に含有される測定すべき抗体との
それらの錯形成が起る。
とR3の分離及び試料中に含有される測定すべき抗体との
それらの錯形成が起る。
次に段階で生成された反応混合物を固体相に移し、そ
こで最終的な反応が行われる。
こで最終的な反応が行われる。
同様に受容体R1及びR2及び試料を錯形成用の保持相な
しに直接受容体R2を有する固体相に移すことも可能であ
る。受容体R1とR3及び測定すべき抗体との間の反応は均
一であるので、不均質な界面でのR1及びR2の間の反応よ
りも遥かに迅速に進行する。従つてこの反応方法により
保持層を用いる反応方法で得られる結果と大差ない結果
が得られる。
しに直接受容体R2を有する固体相に移すことも可能であ
る。受容体R1とR3及び測定すべき抗体との間の反応は均
一であるので、不均質な界面でのR1及びR2の間の反応よ
りも遥かに迅速に進行する。従つてこの反応方法により
保持層を用いる反応方法で得られる結果と大差ない結果
が得られる。
本発明による方法の特に有利な態様では、３種類の受
容体全て及び測定すべき抗体を含有する試料を恒温保持
する。その際R1及びR3は統計学的な確率で測定すべき抗
体のパラトープと反応する。R1中に含有される特異的な
結合系の反応成分はR2と反応する。この場合にも前記の
ようにR1、R3及び測定すべき抗体間の均一な反応はR1と
R2間の不均一な反応よりも著しく迅速に行われ、従つて
妨害されない。恒温保持後固体相の液体相からの相分離
を例えば吸引濾過によつて行う。固体相を洗浄した後次
いで標識の測定を行うことができ、測定すべき抗体の量
の程度が判る。
容体全て及び測定すべき抗体を含有する試料を恒温保持
する。その際R1及びR3は統計学的な確率で測定すべき抗
体のパラトープと反応する。R1中に含有される特異的な
結合系の反応成分はR2と反応する。この場合にも前記の
ようにR1、R3及び測定すべき抗体間の均一な反応はR1と
R2間の不均一な反応よりも著しく迅速に行われ、従つて
妨害されない。恒温保持後固体相の液体相からの相分離
を例えば吸引濾過によつて行う。固体相を洗浄した後次
いで標識の測定を行うことができ、測定すべき抗体の量
の程度が判る。
その他の態様では、先ず試料を固体相と接触させ、次
いで受容体R1及びR3から成る反応混合物を添加すること
もできる。この方法は、試料及び試薬を同時にな配量添
加することができない自動分析器（Analysenautomate）
用に特に有利である。
いで受容体R1及びR3から成る反応混合物を添加すること
もできる。この方法は、試料及び試薬を同時にな配量添
加することができない自動分析器（Analysenautomate）
用に特に有利である。
本発明のその他の目的は抗体測定用の試薬であり、こ
れは２種類の異なる可溶性の抗体と結合可能な受容体R1
及びR3（このうちR1は特異的な結合系の反応成分を有
し、R3は標識を有する）及び更に受容体R2（これは固体
相中に存在し受容体R1と結合可能である）を含有し、そ
の際不溶性受容体R2及び可溶性受容体R1が物理的に相互
に別々に存在することを特徴とする。
れは２種類の異なる可溶性の抗体と結合可能な受容体R1
及びR3（このうちR1は特異的な結合系の反応成分を有
し、R3は標識を有する）及び更に受容体R2（これは固体
相中に存在し受容体R1と結合可能である）を含有し、そ
の際不溶性受容体R2及び可溶性受容体R1が物理的に相互
に別々に存在することを特徴とする。
受容体R3はR1ともR2とも反応しないのでこれを試薬中
に入れることは問題ない。しかし有利にはR1とR3は一緒
に１つの試薬中に保存する。
に入れることは問題ない。しかし有利にはR1とR3は一緒
に１つの試薬中に保存する。
その際R1及びR3は一般に液状又は凍結乾燥した試薬中
に含有する。R2はこれとは別に不溶性の支持体材料と結
合して存在する。
に含有する。R2はこれとは別に不溶性の支持体材料と結
合して存在する。
もう１つの態様では受容体R1及びR3が可溶性であり、
受容体R2が不溶性であり、R1と別に固体の支持体材料に
含有されていてもよい。支持体材料としては、R2を化学
的又は物理的な結合によつて固定することができる本発
明で現われる条件下で不活性の材料が好適である。この
種の材料は当業者に広く知られている。有利には吸収性
か、膨潤性か又は可溶性のフイルム形成性支持体材料、
例えば試験条片用に公知の支持体材料、例えば紙又は類
似のフリース材料である。
受容体R2が不溶性であり、R1と別に固体の支持体材料に
含有されていてもよい。支持体材料としては、R2を化学
的又は物理的な結合によつて固定することができる本発
明で現われる条件下で不活性の材料が好適である。この
種の材料は当業者に広く知られている。有利には吸収性
か、膨潤性か又は可溶性のフイルム形成性支持体材料、
例えば試験条片用に公知の支持体材料、例えば紙又は類
似のフリース材料である。
次に実施例及び図面につき本発明に詳説する。第１図
はHBs−抗体量を増加させた例４による方法の検量線を
表す。第２図はHBs−抗体量を増加させた例５による方
法の検量線を表す。
はHBs−抗体量を増加させた例４による方法の検量線を
表す。第２図はHBs−抗体量を増加させた例５による方
法の検量線を表す。
例１ 試薬溶液の製造 （１） HBsAg−マウス−IgG−結合体の製造（受容体
１） 1a）HBsAg（肝炎Ｂ−表面−抗原）の限定還元 10ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤（pH4.5）5ml中の
HBsAg〔J.Virol.Meth.11巻、225〜230頁（1985）により
製造〕5mgをジチオフレイト50ミリモルに加え、25℃で3
0分間保つ。
１） 1a）HBsAg（肝炎Ｂ−表面−抗原）の限定還元 10ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤（pH4.5）5ml中の
HBsAg〔J.Virol.Meth.11巻、225〜230頁（1985）により
製造〕5mgをジチオフレイト50ミリモルに加え、25℃で3
0分間保つ。
1b）反応バツチの脱塩 反応バツチをセフアデツクスＧ−25カラム（φ16mm、
充填高さ15cm）を用い10ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝
剤pH4.5中で流速40ml/時でクロマドグラフイーにかけ、
分別する。280nm（E0.3）で吸光を有するフラクシヨン
をプールし、24時間30ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤pH
7.1で透析する（透析液１×３）。
充填高さ15cm）を用い10ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝
剤pH4.5中で流速40ml/時でクロマドグラフイーにかけ、
分別する。280nm（E0.3）で吸光を有するフラクシヨン
をプールし、24時間30ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤pH
7.1で透析する（透析液１×３）。
1c）IgG（マウス−正常−IgG、Ｍ−ｎ−IgG、製造元カ
ルビオヒエム（Calbiochem GmbH、フランクフルト）〕
の変性 30ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（pH.7.1）1ml中の
Ｍ−nIgG10mgの溶液にジメチルスルホキシド中のマレイ
ンアミノヘキサノニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
−エステル（MHS）（ジメチルスルホキシド1ml当りMHS1
4.3mg）の溶液10μを添加し、25℃で１時間反応させ
る。
ルビオヒエム（Calbiochem GmbH、フランクフルト）〕
の変性 30ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（pH.7.1）1ml中の
Ｍ−nIgG10mgの溶液にジメチルスルホキシド中のマレイ
ンアミノヘキサノニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
−エステル（MHS）（ジメチルスルホキシド1ml当りMHS1
4.3mg）の溶液10μを添加し、25℃で１時間反応させ
る。
1d）変性バツチの脱塩 1cからのバツチをセフアデツクスG25 10mlを用い30
ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（pH7.1）中でクロマト
グラフイーにかけ、分別する（流速40ml/時）。最高蛋
白質濃度の蛋白質ピークのフラクシヨンをプールする。
これはマレインアミノヘキサノニル−変性Ｍ−nIgG抗体
を含有する。
ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（pH7.1）中でクロマト
グラフイーにかけ、分別する（流速40ml/時）。最高蛋
白質濃度の蛋白質ピークのフラクシヨンをプールする。
これはマレインアミノヘキサノニル−変性Ｍ−nIgG抗体
を含有する。
1e）結合体バツチ 30ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（pH7.1）4ml中の1b
からの還元されたHBsAg2mgに10ミリモルの燐酸カリウム
緩衝剤（pH7.1）1.6ml中の1dにより変性したＭ−nIgG10
mgを加える。混合後25℃で１時間反応させる。反応を１
ミリモルまでシステインを添加することによつて完了さ
せ、25℃で30分間反応させ、次いでヨードアセトアミド
を５ミリモルまで添加き、25℃で30分間反応させる。引
続き15mg/mlの濃度に濃縮する。
からの還元されたHBsAg2mgに10ミリモルの燐酸カリウム
緩衝剤（pH7.1）1.6ml中の1dにより変性したＭ−nIgG10
mgを加える。混合後25℃で１時間反応させる。反応を１
ミリモルまでシステインを添加することによつて完了さ
せ、25℃で30分間反応させ、次いでヨードアセトアミド
を５ミリモルまで添加き、25℃で30分間反応させる。引
続き15mg/mlの濃度に濃縮する。
1f）結合体バツチのクロマドグラフイーによる分離 バツチを0.8mlに濃縮した後スーペローゼ（Superos
e）6prep（Pharmacia）（約80ml）にのせ、5cm/時の直
線的流速でクロマトグラフイーにかける（10ミリモルの
燐酸カリウム緩衝剤pH7.5;0.2％庶糖;0.1％アジ化
物）。除去したフラクシヨンが好適な生成物である。
e）6prep（Pharmacia）（約80ml）にのせ、5cm/時の直
線的流速でクロマトグラフイーにかける（10ミリモルの
燐酸カリウム緩衝剤pH7.5;0.2％庶糖;0.1％アジ化
物）。除去したフラクシヨンが好適な生成物である。
（２） 羊−抗−マウス−Fcγ（受容体−２） 2a）羊−抗−マウス−Fcγ−抗血清を下記のようにして
精製する： この抗体を含有する血清に硫酸アンモニウムを加えて
1.8モルにする。沈澱を15ミリモルの燐酸ナトリウム緩
衝剤（pH7.0）を含有する50ミリモルの塩化ナトリウム
に入れる。こうして得られる溶液をDEAE−セルロースを
通過させる。
精製する： この抗体を含有する血清に硫酸アンモニウムを加えて
1.8モルにする。沈澱を15ミリモルの燐酸ナトリウム緩
衝剤（pH7.0）を含有する50ミリモルの塩化ナトリウム
に入れる。こうして得られる溶液をDEAE−セルロースを
通過させる。
2b）免疫吸着による精製 2aからの羊−抗−マウス−Fcγ−試薬をPBS緩衝剤
（燐酸塩で緩衝した食塩水）pH7.5中で２時間かけてセ
フエロシル（Sepherosil）−結合マウス−IgGを経て導
入する（試薬蛋白質50mg当りＭ−IgG−セフエロシル約1
ml）。結合されなかつた蛋白質を洗浄除去後特異的に結
合された含分を１モルのプロピオン酸で溶離する。生成
物を透析し、凍結乾燥する。
（燐酸塩で緩衝した食塩水）pH7.5中で２時間かけてセ
フエロシル（Sepherosil）−結合マウス−IgGを経て導
入する（試薬蛋白質50mg当りＭ−IgG−セフエロシル約1
ml）。結合されなかつた蛋白質を洗浄除去後特異的に結
合された含分を１モルのプロピオン酸で溶離する。生成
物を透析し、凍結乾燥する。
（３） HBsAg−βGal−結合体（受容体３） 3a、ｂ）1a、ｂ）と同様にして行うHBsAgの限定還元
及び脱塩 3c）β−ガラクトシダーゼ（β−Gal）の変性 30ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（pH7.1）1mlのβ G
al10mgの溶液に、ビスマレイミド−メチル−エーテル
（BMME）50μ（無水ジメチルスルホキシド1ml当りBMM
E47mg）を添加し、混合し、１時間室温で反応させる。
及び脱塩 3c）β−ガラクトシダーゼ（β−Gal）の変性 30ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（pH7.1）1mlのβ G
al10mgの溶液に、ビスマレイミド−メチル−エーテル
（BMME）50μ（無水ジメチルスルホキシド1ml当りBMM
E47mg）を添加し、混合し、１時間室温で反応させる。
3d）変性されたβ Galの脱塩 3c）からの反応バツチを４℃に冷却し、この温度でセ
フアテツクスＧ−25 10mlを用い30ミリモルの燐酸カリ
ウム緩衝剤（pH7.1）中で流速40ml/時でクロマドグラフ
イーにかけ、分別する。最高蛋白質含量を有するフラク
シヨンをプールする（蛋白質濃度6mg/ml）：β−Gal−B
MME。
フアテツクスＧ−25 10mlを用い30ミリモルの燐酸カリ
ウム緩衝剤（pH7.1）中で流速40ml/時でクロマドグラフ
イーにかけ、分別する。最高蛋白質含量を有するフラク
シヨンをプールする（蛋白質濃度6mg/ml）：β−Gal−B
MME。
3e）結合体バッチ 30ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（pH7.1）4ml中の3
b）からの還元されたHBsAg 2mgに同じ緩衝剤1.6ml中の
β Gal−BMME 10mgを加え、混合後１時間反応させる。
b）からの還元されたHBsAg 2mgに同じ緩衝剤1.6ml中の
β Gal−BMME 10mgを加え、混合後１時間反応させる。
反応をシステイン１ミリモルまでを添加することによ
つて終了させる。25℃で30分後ヨードアセトアミド５ミ
リモルまで添加し、同様に30分間反応させる。引続きバ
ツチを15mg/mlに濃縮する。
つて終了させる。25℃で30分後ヨードアセトアミド５ミ
リモルまで添加し、同様に30分間反応させる。引続きバ
ツチを15mg/mlに濃縮する。
3f）反応のバツチのクロマトグラフイーによる精製 3e）からのバツチをスペローゼ6 prep−カラム80mlに
入れ、流速5cm/時でクロマドグラフイーにかける（緩衝
剤:10ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤pH7.5、0.2％庶
糖、0.1％アジ化物）。
入れ、流速5cm/時でクロマドグラフイーにかける（緩衝
剤:10ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤pH7.5、0.2％庶
糖、0.1％アジ化物）。
最後のフラクシヨンが精製された生成物である。
例２ 抗−HBsの測定 Ａ）基質緩衝剤の製造 HEPES/NaOH pH7.0 70ミリモル／ 塩化ナトリウム 154ミリモル／ 牛血清アルブミン 3g/ クロルフエノールレツド−β−Ｄ−ガラクトシド（西ド
イツ特許第3345748号明細書により製造） ５ミリモル／
トウイーン20（非イオン性清浄剤） 2g/ Ｂ）試薬支持体の製造 １）試薬支持体1: １当り、燐酸ナトリウムpH7.3（37℃） 100ミリモル 塩化マグネシウム ２ミリモル、 塩化ナトリウム 9g、 牛血清アルブミン 5g HBsAg−IgG（受容体１溶液） 10mg、 HBsAg−β−ガラクトシダーゼ−結合体 25gU （受容体３溶液；活性はオルト−ニトロフエニル−β−
ガラクトシドを用い37℃で測定する）を含有する溶液40
μを市販のポリエステル紙から成るフリースに滴加す
る。引続き室温で乾燥する。
イツ特許第3345748号明細書により製造） ５ミリモル／
トウイーン20（非イオン性清浄剤） 2g/ Ｂ）試薬支持体の製造 １）試薬支持体1: １当り、燐酸ナトリウムpH7.3（37℃） 100ミリモル 塩化マグネシウム ２ミリモル、 塩化ナトリウム 9g、 牛血清アルブミン 5g HBsAg−IgG（受容体１溶液） 10mg、 HBsAg−β−ガラクトシダーゼ−結合体 25gU （受容体３溶液；活性はオルト−ニトロフエニル−β−
ガラクトシドを用い37℃で測定する）を含有する溶液40
μを市販のポリエステル紙から成るフリースに滴加す
る。引続き室温で乾燥する。
２）試薬支持体2: セルロース−フリースにブロムシアン活性化法（西ド
イツ特許公開公報第1768512号明細書）によりマウス抗
体のFcγ部に対する羊抗体（受容体２溶液）を固定する
が、その際繊維材料1g当り抗体10μｇを固定する。洗浄
により結合されなかつた抗体を除去し、フリースを室温
で注意深く乾燥する。
イツ特許公開公報第1768512号明細書）によりマウス抗
体のFcγ部に対する羊抗体（受容体２溶液）を固定する
が、その際繊維材料1g当り抗体10μｇを固定する。洗浄
により結合されなかつた抗体を除去し、フリースを室温
で注意深く乾燥する。
この２種類の試薬支持体１及び２を用いる測定は西ド
イツ特許（DE−A1）3425008.5号（特許昭60−14694号）
明細書に記載されている分析測定を行うための装置を用
いて行う（その第１図参照）。
イツ特許（DE−A1）3425008.5号（特許昭60−14694号）
明細書に記載されている分析測定を行うための装置を用
いて行う（その第１図参照）。
これは、成形体から成る自動遠心分析装置用の回転装
入構造物を表し、この成形体は試料塗布室（これは各々
特定の試薬を含浸させた吸収性の支持体材料を含有する
試薬区分（Feld）と接続している）、少なくとも１個の
混合弁室及び１個の測定室を有し（これらは一緒に装入
構造物が回転子上に固定される場合に内径から外径へ通
じる試料液体輸送路を形成する）、更に少なくとも１個
の液体を収容する他の室、及びこの室から測定へと導
く、試料液体輸送路と少なくとも部分的に同じものであ
る輸送路を有する。その際試料収容室Ｐの試料液体輸送
路は、吸収性材料を充填した緩衝剤を含有する室ａ、室
ｃ及び室ａと室ｃの間に配置された第１弁室VK1を経て
第２弁室VK2へ導き、ここから室ｄ及び捕集室AKを経由
して測定室Ｋへ導く。その他の液体を収容するためにポ
ンプ室として作られた基質室PKを具備し、この室は配量
添加室DK及び細管Kapから成る配量添加装置及びオーバ
ーフロー室Ｋを経由して第２弁室VK2と接続してい
る。西ドイツ特許（DE−Ａ）13425008.5明細書の第１図
は使用される回転装入構造物を略示するものである。
入構造物を表し、この成形体は試料塗布室（これは各々
特定の試薬を含浸させた吸収性の支持体材料を含有する
試薬区分（Feld）と接続している）、少なくとも１個の
混合弁室及び１個の測定室を有し（これらは一緒に装入
構造物が回転子上に固定される場合に内径から外径へ通
じる試料液体輸送路を形成する）、更に少なくとも１個
の液体を収容する他の室、及びこの室から測定へと導
く、試料液体輸送路と少なくとも部分的に同じものであ
る輸送路を有する。その際試料収容室Ｐの試料液体輸送
路は、吸収性材料を充填した緩衝剤を含有する室ａ、室
ｃ及び室ａと室ｃの間に配置された第１弁室VK1を経て
第２弁室VK2へ導き、ここから室ｄ及び捕集室AKを経由
して測定室Ｋへ導く。その他の液体を収容するためにポ
ンプ室として作られた基質室PKを具備し、この室は配量
添加室DK及び細管Kapから成る配量添加装置及びオーバ
ーフロー室Ｋを経由して第２弁室VK2と接続してい
る。西ドイツ特許（DE−Ａ）13425008.5明細書の第１図
は使用される回転装入構造物を略示するものである。
試薬支持体１を回転装入構造物の区物ｃに載せ、試薬
支持体２は区分ｄに載せる。その載試料40μを上部開
口部から直接区分にピペツトで入れる。基質溶液270μ
を室PKにピペツトで入れる。次いで高い回転数と静止
状態を交互に変える好適な遠心分離プログラムによつて
試料及び基質溶液を分離マトリツクス及びキユベツトの
方へ搬送する。
支持体２は区分ｄに載せる。その載試料40μを上部開
口部から直接区分にピペツトで入れる。基質溶液270μ
を室PKにピペツトで入れる。次いで高い回転数と静止
状態を交互に変える好適な遠心分離プログラムによつて
試料及び基質溶液を分離マトリツクス及びキユベツトの
方へ搬送する。
その際プログラムが進むにつれて受容体１及び３は区
分ｃの試料液体によつて溶離され、次いで均一な混合物
が反応を起す。区分ｄで生成された錯体（受容体1:分析
物（Analyt）：受容体３）が受容体２に結合する。
分ｃの試料液体によつて溶離され、次いで均一な混合物
が反応を起す。区分ｄで生成された錯体（受容体1:分析
物（Analyt）：受容体３）が受容体２に結合する。
基質溶液は配量添加室DKによつて少量に分けられ、錯
化されなかつた過剰の結合体を洗浄除去するのに役立
つ。
化されなかつた過剰の結合体を洗浄除去するのに役立
つ。
これらの条件下で下記の結果が得られる： 試料を各々５回測定した。測定は700nmに対して576nm
で0.3cmの層厚で実施し、ｄ＝1cmの層厚に換算した。
で0.3cmの層厚で実施し、ｄ＝1cmの層厚に換算した。
例３ 微量滴定プレート（MTPs）を各凹み当り、被覆緩衝剤
（20ミリモルの炭酸塩緩衝剤、pH9.6）中の10μg/mlの
濃度の免疫吸着により精製した受容体２（羊−抗−マウ
ス−Fcγ−抗体）の溶液各250μを用いて室温RTで一
夜被覆する。引続き非特異的な結合部を後被覆緩衝剤
（燐酸カリウム50ミリモル、NaCl150ミリモル、牛血清
アルブミン（RSA）１％、トウイーン20 1g、pH7.5）3
00μと一緒に室温で１時間後恒温保持することによつ
て飽和する。凹み当り洗浄緩衝剤（HEPES 100ミリモ
ル、NaCl 150ミリモル、羊−標準−IgG2.5、Ｌ−アス
パラギン酸マグネシウム0.5ミリモル、トウイーン2g/
、pH7.25）300μで洗浄後、試料150μ及び洗浄緩
衝剤中の例１からの受容体３（HBsAg−βGal−結合体、
0.1U/ml、37℃でｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラク
トシドを用いて活性測定）及び例１からの受容体１（HB
sAg−マウス−IgG−結合体、５μg/ml）を含有する試薬
溶液50μを添加し、揺動し、引続き３時間恒温保持す
る。引続き凹みを吸い出し、洗浄緩衝剤各300μで３
回洗浄する。その後室温で１時間基質溶液（クロルフエ
ノールレツド−β−Ｄ−ガラクトシド５ミリモル、 HEPES70ミリモル、NaCl150ミリモル、RSA3g/、トウイ
ーン20 2g/、pH7.3）250μと共に恒温保持し、引続
き市販のMTP−測定装置を用い570nmで、630nmのビクロ
マト補正（bichromatische Korrektur）を用いて測定す
る。
（20ミリモルの炭酸塩緩衝剤、pH9.6）中の10μg/mlの
濃度の免疫吸着により精製した受容体２（羊−抗−マウ
ス−Fcγ−抗体）の溶液各250μを用いて室温RTで一
夜被覆する。引続き非特異的な結合部を後被覆緩衝剤
（燐酸カリウム50ミリモル、NaCl150ミリモル、牛血清
アルブミン（RSA）１％、トウイーン20 1g、pH7.5）3
00μと一緒に室温で１時間後恒温保持することによつ
て飽和する。凹み当り洗浄緩衝剤（HEPES 100ミリモ
ル、NaCl 150ミリモル、羊−標準−IgG2.5、Ｌ−アス
パラギン酸マグネシウム0.5ミリモル、トウイーン2g/
、pH7.25）300μで洗浄後、試料150μ及び洗浄緩
衝剤中の例１からの受容体３（HBsAg−βGal−結合体、
0.1U/ml、37℃でｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラク
トシドを用いて活性測定）及び例１からの受容体１（HB
sAg−マウス−IgG−結合体、５μg/ml）を含有する試薬
溶液50μを添加し、揺動し、引続き３時間恒温保持す
る。引続き凹みを吸い出し、洗浄緩衝剤各300μで３
回洗浄する。その後室温で１時間基質溶液（クロルフエ
ノールレツド−β−Ｄ−ガラクトシド５ミリモル、 HEPES70ミリモル、NaCl150ミリモル、RSA3g/、トウイ
ーン20 2g/、pH7.3）250μと共に恒温保持し、引続
き市販のMTP−測定装置を用い570nmで、630nmのビクロ
マト補正（bichromatische Korrektur）を用いて測定す
る。
第２表は代表的な実験の結果を表す（各々ｎ＝４を用
いる測定）。
いる測定）。
例４ 管の被覆 ポリスチロール試験管を40ミリモルの燐酸ナトリウム
緩衝剤中のアビジン40μg/mlを用いて18〜24時間被覆す
る。非特異的な結合部を飽和するための後被覆をRSA
（牛血清アルブミン）0.3％、NaCl0.9％、庶糖２％及び
ポリエーテルグリコール（プルオニツクＬ−64）0.05％
を含有する溶液を用いて行う。ペルオキシダーゼと結合
した肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）の製造： この方法は原理的には、HBsAg中で注意深く還元する
ことによつてSH基を遊離させ、次いでこの基にマレイミ
ドヘキサノニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエス
テル（MHS）を用いて誘導しオランダガラシ−ペルオキ
シダーゼ（POD）を結合して、行つた。
緩衝剤中のアビジン40μg/mlを用いて18〜24時間被覆す
る。非特異的な結合部を飽和するための後被覆をRSA
（牛血清アルブミン）0.3％、NaCl0.9％、庶糖２％及び
ポリエーテルグリコール（プルオニツクＬ−64）0.05％
を含有する溶液を用いて行う。ペルオキシダーゼと結合
した肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）の製造： この方法は原理的には、HBsAg中で注意深く還元する
ことによつてSH基を遊離させ、次いでこの基にマレイミ
ドヘキサノニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエス
テル（MHS）を用いて誘導しオランダガラシ−ペルオキ
シダーゼ（POD）を結合して、行つた。
HBsAgを濃度1.4mg/ml及びpH4.5でジチオスレイト（DT
T）10ミリモルの存在で２時間25℃で恒温保持し、引続
きセフアデツクス−G25精製カラム（フアルマシア）を
用い10ミリモルの酢酸塩緩衝剤中で脱塩し、酸化保護の
ためにアルゴンでガス処理する。
T）10ミリモルの存在で２時間25℃で恒温保持し、引続
きセフアデツクス−G25精製カラム（フアルマシア）を
用い10ミリモルの酢酸塩緩衝剤中で脱塩し、酸化保護の
ためにアルゴンでガス処理する。
PODを濃度10mg/mlで30ミリモルの燐酸ナトリウム緩衝
剤、pH7.1中で25倍モルの過剰のMHSと一緒に１時間25℃
で恒温保持する。遊離MHSのセフアデツクス−G25媒体
（medium）カラム（フアルマシア）を用い、燐酸カリウ
ム緩衝剤10ミリモル、pH6.1、NaCl50ミリモル、MgCl210
ミリモル中で分離する。
剤、pH7.1中で25倍モルの過剰のMHSと一緒に１時間25℃
で恒温保持する。遊離MHSのセフアデツクス−G25媒体
（medium）カラム（フアルマシア）を用い、燐酸カリウ
ム緩衝剤10ミリモル、pH6.1、NaCl50ミリモル、MgCl210
ミリモル中で分離する。
還元されたHBsAgのPODへの結合を、HBsAg1mg当りMHS
誘導体化したPOD3mgを使用してpH7及び25℃で行う。２
時間後反応をシステイン１ミリモルまでを添加すること
によつて終了させる。引続きSH基をヨードアセトアミド
５ミリモルによつてpH7.5で１時間25℃で誘導化する。
次いでHBsAg−POD−結合体を燐酸ナトリウム緩衝剤10ミ
リモル、pH7.5、NaCl150ミリモル中でAcA22（IBF、セル
バ、西ドイツ）でゲル濾過を用いて精製する。
誘導体化したPOD3mgを使用してpH7及び25℃で行う。２
時間後反応をシステイン１ミリモルまでを添加すること
によつて終了させる。引続きSH基をヨードアセトアミド
５ミリモルによつてpH7.5で１時間25℃で誘導化する。
次いでHBsAg−POD−結合体を燐酸ナトリウム緩衝剤10ミ
リモル、pH7.5、NaCl150ミリモル中でAcA22（IBF、セル
バ、西ドイツ）でゲル濾過を用いて精製する。
ビオチニル化された肝炎Ｂ表面抗原の製造： ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
〔バイエル、E.A.及びWilchek M.（1980）Meth.Enzymo
l.34巻、265〜267頁〕を用いて蛋白質中のアミノ基に関
してビオチニル化する： 更にHBsAgを30ミリモルの燐酸ナトリウム緩衝剤pH7.1
中で濃度1mg/mlで25℃で１時間、DMSO中のビオチン−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルの6mg/ml溶液50μ
/mlと一緒に恒温保持する。遊離ビオチニル化試薬
を、燐酸ナトリウム緩衝剤（pH7.1）20ミリモル、NaCl1
50ミリモル中でAcA22でゲル濃度を濾過することによつ
て分離する。
〔バイエル、E.A.及びWilchek M.（1980）Meth.Enzymo
l.34巻、265〜267頁〕を用いて蛋白質中のアミノ基に関
してビオチニル化する： 更にHBsAgを30ミリモルの燐酸ナトリウム緩衝剤pH7.1
中で濃度1mg/mlで25℃で１時間、DMSO中のビオチン−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルの6mg/ml溶液50μ
/mlと一緒に恒温保持する。遊離ビオチニル化試薬
を、燐酸ナトリウム緩衝剤（pH7.1）20ミリモル、NaCl1
50ミリモル中でAcA22でゲル濃度を濾過することによつ
て分離する。
試験の実施： 試料（200μ、血清又は血漿）を管中で試薬1000μ
中で室温で４時間恒温保持する。試薬は受容体R3とし
てペルオキシダーゼと結合した肝炎Ｂ表面抗原 60mV/ml及び受容体R1としてビオチニル化された肝炎Ｂ
表面抗原150ng/mlをポリエーテルグリコール（プルロニ
ツクＦ−68）0.5％、牛血清アルブミン0.2％、酒石酸ナ
トリウム0.2モルを有する燐酸ナトルウム緩衝剤（pH7.
0）中に含有する。
中で室温で４時間恒温保持する。試薬は受容体R3とし
てペルオキシダーゼと結合した肝炎Ｂ表面抗原 60mV/ml及び受容体R1としてビオチニル化された肝炎Ｂ
表面抗原150ng/mlをポリエーテルグリコール（プルロニ
ツクＦ−68）0.5％、牛血清アルブミン0.2％、酒石酸ナ
トリウム0.2モルを有する燐酸ナトルウム緩衝剤（pH7.
0）中に含有する。
恒温保持した後管を３回水道水1.5mlで洗浄し、基質
反応させるために2,2′−アジノ−ジβ−エチル−チア
ゾリン−スルホン酸／ジアンモニウム塩1ml（1.9ミリモ
ル）をピペツトで添加する。吸光を405nmで層厚5mmのキ
ユベツト中で測定し、1cmのキユベツトに換算する。
反応させるために2,2′−アジノ−ジβ−エチル−チア
ゾリン−スルホン酸／ジアンモニウム塩1ml（1.9ミリモ
ル）をピペツトで添加する。吸光を405nmで層厚5mmのキ
ユベツト中で測定し、1cmのキユベツトに換算する。
第３表及び第１図は代表的な実験結果である。
例５ 試験管をストレプトアビシン及びテルモ−RSAで被覆
する。
する。
ａ） テルモ−RSA（牛血清アルブミン）の製造： RSA−I1gを50ミリモル／の燐酸カリウム（pH7.0）1
00mlに溶解し、70℃に加熱し、４時間軽く撹拌しながら
この温度で保つ。溶液を冷却し、濾過し、限外濾過室
｛除去限界（Ausschluβgrenze）:30090ダルトン｝中で
濃度50mg/mlに調整する。引続き30倍の容量の２回蒸留
した水で透析し、引続き凍結乾燥する。生成物は分子量
約700000を有する。
00mlに溶解し、70℃に加熱し、４時間軽く撹拌しながら
この温度で保つ。溶液を冷却し、濾過し、限外濾過室
｛除去限界（Ausschluβgrenze）:30090ダルトン｝中で
濃度50mg/mlに調整する。引続き30倍の容量の２回蒸留
した水で透析し、引続き凍結乾燥する。生成物は分子量
約700000を有する。
ストレプトアビシンに結合する前にテルモ−RSAを活
性化する。これに0.1モル／の燐酸カリウム（pH7.8）
2ml中のテルモ−RSA68mgを溶解し、Ｓ−アセチルメルカ
プト琥珀酸アンヒドリド（SAMBA）3.8mgの溶液を徐々に
加える。３時間の反応後、50ミリモル／の燐酸カリウ
ム（pH6.5）２で４℃で透析する。
性化する。これに0.1モル／の燐酸カリウム（pH7.8）
2ml中のテルモ−RSA68mgを溶解し、Ｓ−アセチルメルカ
プト琥珀酸アンヒドリド（SAMBA）3.8mgの溶液を徐々に
加える。３時間の反応後、50ミリモル／の燐酸カリウ
ム（pH6.5）２で４℃で透析する。
ｂ）テルモ−RSAに結合したストレプトアビジンの製造
ストレプトアビジンの活性化： ストレプトアビジン60mgを50ミリモル／の燐酸カリ
ウム/100ミリモルの塩化ナトリウムの溶液（pH7.0）6
mlに溶解し、４℃で冷時に保つ。マレインイミドヘキサ
ノニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MH
S）6.16mgをジオキサン620μに溶解し、ストレプトア
ビジン溶液に混入する。２時間４℃で反応させた後、50
ミリモル／燐酸カリウム/100ミリモル／塩化ナトリ
ウムの溶液（pH5）１で４℃で２回透析する。
ストレプトアビジンの活性化： ストレプトアビジン60mgを50ミリモル／の燐酸カリ
ウム/100ミリモルの塩化ナトリウムの溶液（pH7.0）6
mlに溶解し、４℃で冷時に保つ。マレインイミドヘキサ
ノニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MH
S）6.16mgをジオキサン620μに溶解し、ストレプトア
ビジン溶液に混入する。２時間４℃で反応させた後、50
ミリモル／燐酸カリウム/100ミリモル／塩化ナトリ
ウムの溶液（pH5）１で４℃で２回透析する。
ストレプトアビジン及びテルモ−RSAから成る結合体の
製造： 50ミリモル／の燐酸カリウムpH5.0及び100ミリモル
／の塩化ナトリウム10mlに溶解したMHS誘導体化した
ストレプトアビジン66mg及び50ミリモル／燐酸カリウ
ム/100ミリモル／塩化ナトリウムpH6.5 ml中の活性
化されたテルモ−RSA−SAMBA72mgを一緒にする。混合後
反応を終了させるために１モル／のヒドロキシルアミ
ン（pH7.0）50μｌを添加する。３時間後反応生成物を
ゲルクロマトグラフイー（スペローゼ ６、燐酸カリウ
ム50ミリモル／、塩化ナトリウム100ミリモル／、p
H7.5）で精製する。分子量百万〜５百万を有する結合体
が得られる。
製造： 50ミリモル／の燐酸カリウムpH5.0及び100ミリモル
／の塩化ナトリウム10mlに溶解したMHS誘導体化した
ストレプトアビジン66mg及び50ミリモル／燐酸カリウ
ム/100ミリモル／塩化ナトリウムpH6.5 ml中の活性
化されたテルモ−RSA−SAMBA72mgを一緒にする。混合後
反応を終了させるために１モル／のヒドロキシルアミ
ン（pH7.0）50μｌを添加する。３時間後反応生成物を
ゲルクロマトグラフイー（スペローゼ ６、燐酸カリウ
ム50ミリモル／、塩化ナトリウム100ミリモル／、p
H7.5）で精製する。分子量百万〜５百万を有する結合体
が得られる。
各ポリスチロール小管又はルーラン（Luran） （BAS
F製造）にストレプトアビジン／テルモ−RSA溶液（テル
モ−RSA1ml当りストレプトアビジン10μｇ）1.5mlを充
填し、一夜（約22時間）放置する。その後小管を完全に
空にし、牛血清アルブミンを含有する溶液で後被覆す
る。
F製造）にストレプトアビジン／テルモ−RSA溶液（テル
モ−RSA1ml当りストレプトアビジン10μｇ）1.5mlを充
填し、一夜（約22時間）放置する。その後小管を完全に
空にし、牛血清アルブミンを含有する溶液で後被覆す
る。
次いで例４に記載したように、ペルオキシダーゼと結
合した肝炎Ｂ表面抗原を用いてビオチニル化された抗原
を製造し、例４に記載したように試験を実施する。結果
を下記の第４表及び第２図に記載する。
合した肝炎Ｂ表面抗原を用いてビオチニル化された抗原
を製造し、例４に記載したように試験を実施する。結果
を下記の第４表及び第２図に記載する。
第１図はHBs−抗体量を増加させた例４による方法の検
量線を表し、第２図はHBs−抗体量を増加させた例５に
よる方法の検量線を表す。
量線を表し、第２図はHBs−抗体量を増加させた例５に
よる方法の検量線を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴオルフ・デイーター・エンゲル ドイツ連邦共和国ペール・モースシユト ラーセ ７ (56)参考文献 特開 昭62−30963（ＪＰ，Ａ)
Claims (11)
- 【請求項１】液体相中に存在し、抗体と結合可能である
受容体R1、固体相と結合しており、受容体R1と結合可能
である受容体R2及び、液相中に存在し、抗体と結合可能
であり、標識を有する受容体R3を、測定すべき抗体を含
有する試料と共に恒温保持し、固体相を液体相から分離
して固体相の標識を測定することによって抗体を測定す
る方法において、受容体R1として、測定すべき抗体によ
り特異的に認識される物質と特異的な結合系の反応成分
とからなる複合体を使用し、受容体R3として、測定すべ
き抗体により特異的に認識される物質と標識とからなる
複合体を使用し、受容体R2として受容体R1における特異
的結合系の異なる反応成分を使用し、その際、受容体R1
及び受容体R3は、それぞれ、測定すべき抗体に特異的な
エピトープを有することを特徴とする、抗体を測定する
方法。 - 【請求項２】特異的な結合系としてビオチン／アビジ
ン；ビオチン／ストレプトアビジン；ビオチン／アンチ
ビオチン；ハプテン／抗ハプテン；抗体のFcγ−フラグ
メント／このFcγ−フラグメントに対する抗体；炭化水
素／レクチンを使用することを特徴とする、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】受容体R3は酵素、発蛍光性、化学発光性又
は放射性の物質で標識付けされていることを特徴とす
る、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項４】３種類の受容体R1、R2及びR3の全てを同時
に添加することを特徴とする、請求項１から３までのい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】受容体R1及び受容体R3を試料と共に予め恒
温保持し、引続き受容体R2を加えて恒温保持することを
特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項６】受容体R1中の測定すべき抗体により特異的
に認識される物質の量が受容体R3中の測定すべき抗体に
より特異的に認識される物質の量より多いか又はそれと
同じであることを特徴とする、請求項１から５までのい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】受容体R1中の測定すべき抗体により特異的
に認識される物質の量と受容体R3中の測定すべき抗体に
より特異的に認識される物質の量の比が20〜1:1である
ことを特徴とする、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】比が５〜1:1であることを特徴とする、請
求項７に記載の方法。 - 【請求項９】測定すべき抗体により特異的に認識される
物質と特異的な結合系の反応成分からなる複合体である
受容体R1及び測定すべき抗体と結合可能で標識を有する
受容体R3及び更に固体相に結合して存在し、受容体R1と
結合可能である特異的結合系の異なる反応成分よりなる
受容体R2よりなり、受容体R2及び受容体R1を物理的に相
互に分離して含有し、その際、受容体R1及び受容体R
3は、それぞれ、測定すべき抗体に特異的なエピトープ
を有することを特徴とする、請求項１から８までのいず
れか１項に記載の抗体を測定するための試薬。 - 【請求項１０】受容体R2が結合されている固体相は支持
体材料であることを特徴とする、請求項９に記載の試
薬。 - 【請求項１１】受容体R1は支持体材料に含浸されて存在
することを特徴とする、請求項９に記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3705686A DE3705686C2 (de) | 1987-02-23 | 1987-02-23 | Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern |
| DE3705686.7 | 1987-02-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63229368A JPS63229368A (ja) | 1988-09-26 |
| JP2626657B2 true JP2626657B2 (ja) | 1997-07-02 |
Family
ID=6321540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63038782A Expired - Lifetime JP2626657B2 (ja) | 1987-02-23 | 1988-02-23 | 抗体を測定するための方法及び試薬 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4945042A (ja) |
| EP (1) | EP0280211B1 (ja) |
| JP (1) | JP2626657B2 (ja) |
| AT (1) | ATE113723T1 (ja) |
| DE (2) | DE3705686C2 (ja) |
| ES (1) | ES2062994T3 (ja) |
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