JPH07119764B2 - イオン捕捉試薬およびそれを用いた結合イムノアッセイ法 - Google Patents
イオン捕捉試薬およびそれを用いた結合イムノアッセイ法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に結合アッセイ方法に関する。さらに詳
しくは、本発明は、均一イムノアッセイを行うのに有用
な方法に関する。
しくは、本発明は、均一イムノアッセイを行うのに有用
な方法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 生物学的流体または他の物質中に存在するかもしれない
興味あるもしくは臨床的に重要な物質の存在および／ま
たは濃度を決定するためのアッセイにおいて、種々の分
析手順および装置が一般に用いられている。そのような
物質は、一般に「分析対象物」と呼ばれ、抗体、抗原、
薬物、ホルモン等が含まれる。
興味あるもしくは臨床的に重要な物質の存在および／ま
たは濃度を決定するためのアッセイにおいて、種々の分
析手順および装置が一般に用いられている。そのような
物質は、一般に「分析対象物」と呼ばれ、抗体、抗原、
薬物、ホルモン等が含まれる。
イムアッセイ法は、高等生物における免疫系の機構を利
用するものであって、その機構において、生体にとって
病原性であるかまたは異物である抗原の存在に応答して
抗体が産生される。これらの抗体および抗原、すなわち
免疫反応生成物は相互に結合することができ、それによ
り高度に特異的な反応機構が生成される。この機構は、
生物学的試料中の特定の抗原の存在または濃度を決定す
るためにインビトロで用いることができる。
用するものであって、その機構において、生体にとって
病原性であるかまたは異物である抗原の存在に応答して
抗体が産生される。これらの抗体および抗原、すなわち
免疫反応生成物は相互に結合することができ、それによ
り高度に特異的な反応機構が生成される。この機構は、
生物学的試料中の特定の抗原の存在または濃度を決定す
るためにインビトロで用いることができる。
免疫反応生成物を使用した種々のイムアッセイ法が知ら
れており、その場合、少なくとも１つの免疫反応生成物
を検出可能な成分で標識して分析的に同定できるように
する。たとえば、「サンドイッチ」法または「２部位」
法では、抗原と２つの抗体との間に３成分系の複合体を
生成させることが含まれる。そのような技術において複
合体生成を検出するのに便利な方法は、複合体を容易に
分離できるように、１つの標識抗体と、固相支持体に結
合させた非標識抗体とを用いることである。この例にお
いては、固相に結合した標識抗体の量は、試験試料中の
分析対象物の量に正比例する。
れており、その場合、少なくとも１つの免疫反応生成物
を検出可能な成分で標識して分析的に同定できるように
する。たとえば、「サンドイッチ」法または「２部位」
法では、抗原と２つの抗体との間に３成分系の複合体を
生成させることが含まれる。そのような技術において複
合体生成を検出するのに便利な方法は、複合体を容易に
分離できるように、１つの標識抗体と、固相支持体に結
合させた非標識抗体とを用いることである。この例にお
いては、固相に結合した標識抗体の量は、試験試料中の
分析対象物の量に正比例する。
別の方法は、「競合」アッセイ法と呼ばれるものであ
る。競合アッセイの１つの例においては、捕捉機構にお
いて不溶性の固相に付着した抗体を用いるが、標識分析
対象物（標識抗体ではなく）は固定化抗体への結合につ
いて試験試料中に存在する分析対象物と競合する。同様
に、固定化した分析対象物も標識抗体への結合について
分析対象物と競合することができる。これらの競合アッ
セイにおいては、捕捉された標識試薬の量は試料中に存
在する分析対象物の量に反比例する。
る。競合アッセイの１つの例においては、捕捉機構にお
いて不溶性の固相に付着した抗体を用いるが、標識分析
対象物（標識抗体ではなく）は固定化抗体への結合につ
いて試験試料中に存在する分析対象物と競合する。同様
に、固定化した分析対象物も標識抗体への結合について
分析対象物と競合することができる。これらの競合アッ
セイにおいては、捕捉された標識試薬の量は試料中に存
在する分析対象物の量に反比例する。
そのようなアッセイ法は、有用性が大きいにもかかわら
ず欠点を有する。第一に、可溶性および不溶性の試薬、
および液体試験試料からなる不均一反応混合物は、反応
速度を遅くする。すべての試薬が可溶性である液相反
応、すなわち均一な反応混合物に比べて、不均一な反応
混合物は、反応混合物中において不溶性の固相系、試験
試料中の遊離の分析対象物、可溶性の標識試薬および新
たに生成した不溶性の複合体の間で平衡に達するまで長
いインキュベート期間を要する。第二に、抗体の固相へ
の吸着のような、固相物質へ結合成分を付着させる従来
法では、固相が分析対象物以外の物質を容易に結合させ
てしまう。これは非特異的結合と呼ばれており、陽性結
果の検出を妨害し得る。第三に、従来の固定化法では、
製造した固相試薬の別々のバッチが、変化した量の固定
化結合成分を含有し得る。
ず欠点を有する。第一に、可溶性および不溶性の試薬、
および液体試験試料からなる不均一反応混合物は、反応
速度を遅くする。すべての試薬が可溶性である液相反
応、すなわち均一な反応混合物に比べて、不均一な反応
混合物は、反応混合物中において不溶性の固相系、試験
試料中の遊離の分析対象物、可溶性の標識試薬および新
たに生成した不溶性の複合体の間で平衡に達するまで長
いインキュベート期間を要する。第二に、抗体の固相へ
の吸着のような、固相物質へ結合成分を付着させる従来
法では、固相が分析対象物以外の物質を容易に結合させ
てしまう。これは非特異的結合と呼ばれており、陽性結
果の検出を妨害し得る。第三に、従来の固定化法では、
製造した固相試薬の別々のバッチが、変化した量の固定
化結合成分を含有し得る。
（課題を解決するための手段） 本発明は、 試験試料中の分析対象物の検出方法であって、 （ａ）分析対象物を、 式： （式中、ｎは約10〜約500、ｚは約１〜約６、ＷはH+、N
a+、K+、Li+、アミン塩およびそれらの誘導体よりなる
群から選ばれた基、Ｘはハプテンへの結合を可能にする
反応性基または該反応性基を有する構造である）で示さ
れる活性化ポリマー性アニオン分子に結合したハプテン
からなる負に荷電した捕捉試薬、および 検出可能なシグナルを生成し得る標識に結合した特異的
結合成分からなる指示試薬 と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法； 試験試料中の分析対象物の検出方法であって、 （ａ）分析対象物を、ポリグルタミン酸、アニオン性タ
ンパク質もしくは誘導体化タンパク質、アニオン性多糖
類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸およびポリア
ミノ酸よりなる群からなる群から選ばれる活性化ポリマ
ー性アニオン分子に単独の共有結合により結合したハプ
テンからなる負に荷電した捕捉試薬、および検出可能な
シグナルを生成し得る標識に結合した特異的結合成分か
らなる指示試薬と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法； 試験試料中の分析対象物の検出方法であって、 （ａ）分析対象物を、 式： （式中、ｎは約10〜約500、ｚは約１〜約６、ＷはH+、N
a+、K+、Li+、アミン塩およびそれらの誘導体よりなる
群から選ばれた基、Ｘはハプテンへの結合を可能にする
反応性基または該反応性基を有する構造である）で示さ
れる活性化ポリマー性アニオン分子に結合した特異的結
合成分からなる負に荷電した捕捉試薬、および 検出可能なシグナルを生成し得る標識に結合したハプテ
ンからなる指示試薬 と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法；および 試験試料中の分析対象物の検出方法であって、 （ａ）分析対象物を、ポリグルタミン酸、アニオン性タ
ンパク質もしくは誘導体化タンパク質、アニオン性多糖
類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸およびポリア
ミノ酸よりなる群から選ばれる活性化ポリマー性アニオ
ン分子に単独の共有結合により結合した特異的結合成分
からなる負に荷電した捕捉試薬、および検出可能なシグ
ナルを生成し得る標識に結合したハプテンからなる指示
試薬と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法を提供するものである。
a+、K+、Li+、アミン塩およびそれらの誘導体よりなる
群から選ばれた基、Ｘはハプテンへの結合を可能にする
反応性基または該反応性基を有する構造である）で示さ
れる活性化ポリマー性アニオン分子に結合したハプテン
からなる負に荷電した捕捉試薬、および 検出可能なシグナルを生成し得る標識に結合した特異的
結合成分からなる指示試薬 と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法； 試験試料中の分析対象物の検出方法であって、 （ａ）分析対象物を、ポリグルタミン酸、アニオン性タ
ンパク質もしくは誘導体化タンパク質、アニオン性多糖
類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸およびポリア
ミノ酸よりなる群からなる群から選ばれる活性化ポリマ
ー性アニオン分子に単独の共有結合により結合したハプ
テンからなる負に荷電した捕捉試薬、および検出可能な
シグナルを生成し得る標識に結合した特異的結合成分か
らなる指示試薬と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法； 試験試料中の分析対象物の検出方法であって、 （ａ）分析対象物を、 式： （式中、ｎは約10〜約500、ｚは約１〜約６、ＷはH+、N
a+、K+、Li+、アミン塩およびそれらの誘導体よりなる
群から選ばれた基、Ｘはハプテンへの結合を可能にする
反応性基または該反応性基を有する構造である）で示さ
れる活性化ポリマー性アニオン分子に結合した特異的結
合成分からなる負に荷電した捕捉試薬、および 検出可能なシグナルを生成し得る標識に結合したハプテ
ンからなる指示試薬 と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法；および 試験試料中の分析対象物の検出方法であって、 （ａ）分析対象物を、ポリグルタミン酸、アニオン性タ
ンパク質もしくは誘導体化タンパク質、アニオン性多糖
類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸およびポリア
ミノ酸よりなる群から選ばれる活性化ポリマー性アニオ
ン分子に単独の共有結合により結合した特異的結合成分
からなる負に荷電した捕捉試薬、および検出可能なシグ
ナルを生成し得る標識に結合したハプテンからなる指示
試薬と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法を提供するものである。
本発明では、他のアッセイ試薬または試験試料から分析
対象物および／または指示試薬を分離することにより、
検出可能なシグナルの観察を容易にするための捕捉試薬
を使用する。本発明の捕捉試薬は、特異的結合成分に付
着した１または２以上のアニオン分子からなる。本発明
の検出方法において容易に適合されるアニオン分子は、
式： （式中、ｎは約10〜約500、ｚは約１〜約６、ＷはH+、N
a+、K+、Li+、H+NR3のようなアミン塩およびそれらの誘
導体よりなる群から選ばれた基、Ｘは特異的結合成分が
反応する、アミン反応性残基、チオール反応性残基また
はチオール残基である）で示される活性化ポリマー性ア
ニオン分子である。別の態様においては、Ｘは、ポリマ
ー性アニオン分子と結合すべく活性化された特異的結合
成分であってよい。活性化法はまた、１または２以上の
反応性基が特異的結合成分またはポリマー性アニオン上
に生成されるとして記載される。
対象物および／または指示試薬を分離することにより、
検出可能なシグナルの観察を容易にするための捕捉試薬
を使用する。本発明の捕捉試薬は、特異的結合成分に付
着した１または２以上のアニオン分子からなる。本発明
の検出方法において容易に適合されるアニオン分子は、
式： （式中、ｎは約10〜約500、ｚは約１〜約６、ＷはH+、N
a+、K+、Li+、H+NR3のようなアミン塩およびそれらの誘
導体よりなる群から選ばれた基、Ｘは特異的結合成分が
反応する、アミン反応性残基、チオール反応性残基また
はチオール残基である）で示される活性化ポリマー性ア
ニオン分子である。別の態様においては、Ｘは、ポリマ
ー性アニオン分子と結合すべく活性化された特異的結合
成分であってよい。活性化法はまた、１または２以上の
反応性基が特異的結合成分またはポリマー性アニオン上
に生成されるとして記載される。
捕捉試薬の特異的結合成分は、ハプテンかまたは巨大分
子であってよい。荷電した捕捉試薬により均一アッセイ
および分離反応が可能になり、その場合、反応混合物か
らの反応複合体の除去は、反対に荷電した固相に反応混
合物を接触させることにより行うことができる。本発明
の捕捉試薬は、実質的にあらゆる結合アッセイ（サンド
イッチアッセイ、競合アッセイ、補助特異的結合成分を
用いた間接アッセイ、抑制アッセイなど）に用いること
ができる。
子であってよい。荷電した捕捉試薬により均一アッセイ
および分離反応が可能になり、その場合、反応混合物か
らの反応複合体の除去は、反対に荷電した固相に反応混
合物を接触させることにより行うことができる。本発明
の捕捉試薬は、実質的にあらゆる結合アッセイ（サンド
イッチアッセイ、競合アッセイ、補助特異的結合成分を
用いた間接アッセイ、抑制アッセイなど）に用いること
ができる。
本発明は、結合アッセイに対して２つの利点を提供する
ものである。すなわち、（ａ）結合反応に液相動力学を
用いることにより、分析対象物およびアッセイ試薬の均
一な混合物からの複合体の生成を容易にし、（ｂ）それ
により、固相支持体上に固定化することのできる複合体
の潜在数を増加させる。
ものである。すなわち、（ａ）結合反応に液相動力学を
用いることにより、分析対象物およびアッセイ試薬の均
一な混合物からの複合体の生成を容易にし、（ｂ）それ
により、固相支持体上に固定化することのできる複合体
の潜在数を増加させる。
本発明はまた、捕捉試薬を荷電物質に結合させた分離手
順においても用いることができる。分析対象物を含有し
ていると思われる分離すべき液体試料を、溶液中の捕捉
試薬と混合して荷電複合体を生成させる。結合反応の
後、反対に荷電した固相に溶液を接触させ、新たに生成
した複合体を液体試料から分離させる。
順においても用いることができる。分析対象物を含有し
ていると思われる分離すべき液体試料を、溶液中の捕捉
試薬と混合して荷電複合体を生成させる。結合反応の
後、反対に荷電した固相に溶液を接触させ、新たに生成
した複合体を液体試料から分離させる。
液相動力学を目的としないときには、本発明はまた、吸
収、吸着または共有結合以外の結合法により結合成分を
固相に固定化するための効率のよい方法をも提供する。
収、吸着または共有結合以外の結合法により結合成分を
固相に固定化するための効率のよい方法をも提供する。
本発明のアッセイ法および試薬は、種々のイムノアッセ
イに用いることができる。しかしながら、本発明は、免
疫反応性のアッセイに限られるものではない。分析対象
物とアッセイ試薬との間の特異的結合成分を利用したア
ッセイを行うこともできる。
イに用いることができる。しかしながら、本発明は、免
疫反応性のアッセイに限られるものではない。分析対象
物とアッセイ試薬との間の特異的結合成分を利用したア
ッセイを行うこともできる。
以下に本発明をさらに詳しく説明する。
定義 本発明では以下の定義を定める。
本明細書にいう「特異的結合成分」とは、特異的結合ペ
ア、すなわち２つの異なる分子であって、その一方が第
二の分子に化学的または物理的手段により特異的に結合
するものの一方をいう。抗原および抗体−特異的結合ペ
アに加えて、他の特異的結合ペアには、ビオチンとアビ
ジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列
（標的核酸配列を検出するためにDNAハイブリダイゼー
ションアッセイに用いられるプローブと捕捉核酸配列を
含む）、相補的ペプチド配列（組換え法により生成され
るものを含む）、エフェクター分子とレセプター分子、
ホルモンとホルモン結合タンパク質、酵素補助因子と酵
素、酵素阻害剤と酵素などが含まれる。さらに、特異的
結合ペアには、もともとの特異的結合成分の類似体成分
も含まれる。たとえば、分析対象物の誘導体または断
片、すなわち分析対象物類似体も、それが分析対象物と
共通するエピトープを少なくとも１つ有している限り用
いることができる。免疫特異的結合成分には、抗原、ハ
プテン、抗体、および組換えDNA法またはペプチド合成
により生成されたものを含むそれらの複合体が含まれ
る。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクロー
ナル抗体であってもよく、組換えタンパク質またはその
混合物または断片であってもよく、また他の特異的結合
成分との混合物であってもよい。そのような抗体の調製
法の詳細およびそれが特異的結合成分として使用するの
に適していることについては、当業者にはよく知られて
いる。
ア、すなわち２つの異なる分子であって、その一方が第
二の分子に化学的または物理的手段により特異的に結合
するものの一方をいう。抗原および抗体−特異的結合ペ
アに加えて、他の特異的結合ペアには、ビオチンとアビ
ジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列
（標的核酸配列を検出するためにDNAハイブリダイゼー
ションアッセイに用いられるプローブと捕捉核酸配列を
含む）、相補的ペプチド配列（組換え法により生成され
るものを含む）、エフェクター分子とレセプター分子、
ホルモンとホルモン結合タンパク質、酵素補助因子と酵
素、酵素阻害剤と酵素などが含まれる。さらに、特異的
結合ペアには、もともとの特異的結合成分の類似体成分
も含まれる。たとえば、分析対象物の誘導体または断
片、すなわち分析対象物類似体も、それが分析対象物と
共通するエピトープを少なくとも１つ有している限り用
いることができる。免疫特異的結合成分には、抗原、ハ
プテン、抗体、および組換えDNA法またはペプチド合成
により生成されたものを含むそれらの複合体が含まれ
る。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクロー
ナル抗体であってもよく、組換えタンパク質またはその
混合物または断片であってもよく、また他の特異的結合
成分との混合物であってもよい。そのような抗体の調製
法の詳細およびそれが特異的結合成分として使用するの
に適していることについては、当業者にはよく知られて
いる。
本明細書にいう「ハプテン」とは、抗体に結合すること
はできるが、キャリヤタンパク質に結合しなければ抗体
生成を引き起こすことのできない部分抗原または非タン
パク質結合成分をいう。
はできるが、キャリヤタンパク質に結合しなければ抗体
生成を引き起こすことのできない部分抗原または非タン
パク質結合成分をいう。
本明細書において「試験試料」とは、実質的にあらゆる
液体の試料をいう。試験試料は、生理学的流体、たとえ
ば血液、唾液、眼の水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳、
腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水などの所望の源に由来
するものであってよい。液体の試験試料は、使用前にた
とえば血液から血漿を調製したり粘液流体を希釈したり
などのように前以て処理することができる。処理方法に
はまた、分離、濾過、蒸留、濃縮、妨害成分の不活化、
および試薬の添加などが含まれる。生理学的流体の他
に、水、食品などの他の液体試料を用いることもでき
る。加えて、固体も液体媒質を形成するように修飾する
ことができるなら使用することができる。
液体の試料をいう。試験試料は、生理学的流体、たとえ
ば血液、唾液、眼の水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳、
腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水などの所望の源に由来
するものであってよい。液体の試験試料は、使用前にた
とえば血液から血漿を調製したり粘液流体を希釈したり
などのように前以て処理することができる。処理方法に
はまた、分離、濾過、蒸留、濃縮、妨害成分の不活化、
および試薬の添加などが含まれる。生理学的流体の他
に、水、食品などの他の液体試料を用いることもでき
る。加えて、固体も液体媒質を形成するように修飾する
ことができるなら使用することができる。
本明細書において「分析対象物」とは、本発明により試
験試料中で検出し、または試験試料から分離すべき物質
をいう。分析対象物は、特異的結合成分が天然に存在す
る、または特異的結合成分を調製することのできるいか
なる物質であってもよい。加えて、分析対象物は、１以
上の特異的結合成分に結合していてもよい。「分析対象
物」にはまた、あらゆる抗原性物質、ハプテン、抗体、
およびそれらの結合が含まれる。分析対象物には、タン
パク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、
ビタミン、治療目的で投与されるものおよび不法な目的
で投与されるものを含む薬剤、細菌、ウイルス、および
これら物質のいずれかの代謝産物またはこれら物質のい
ずれかに対する抗体が含まれる。
験試料中で検出し、または試験試料から分離すべき物質
をいう。分析対象物は、特異的結合成分が天然に存在す
る、または特異的結合成分を調製することのできるいか
なる物質であってもよい。加えて、分析対象物は、１以
上の特異的結合成分に結合していてもよい。「分析対象
物」にはまた、あらゆる抗原性物質、ハプテン、抗体、
およびそれらの結合が含まれる。分析対象物には、タン
パク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、
ビタミン、治療目的で投与されるものおよび不法な目的
で投与されるものを含む薬剤、細菌、ウイルス、および
これら物質のいずれかの代謝産物またはこれら物質のい
ずれかに対する抗体が含まれる。
本明細書において「分析対象物類似物」とは、分析対象
物それ自身に比べて多かれ少なかれ、分析対象物特異的
結合成分と交差反応する物質をいう。分析対象物類似物
は、分析対象物と共通するエピトープ部位を少なくとも
１つ有する限り、修飾された分析対象物であっても分析
対象物分子の断片またはその合成部分であってもよい。
物それ自身に比べて多かれ少なかれ、分析対象物特異的
結合成分と交差反応する物質をいう。分析対象物類似物
は、分析対象物と共通するエピトープ部位を少なくとも
１つ有する限り、修飾された分析対象物であっても分析
対象物分子の断片またはその合成部分であってもよい。
本明細書において「標識」とは、特異的結合成分に付着
し、視覚または機器により検出し得るシグナルを生成す
ることのできるあらゆる物質をいう。本発明に使用する
ことのできる種々の適した標識には、色原体；触媒；蛍
光化合物；化学発光化合物；放射性標識；コロイド金属
および非金属粒子、染料粒子、酵素もしくは基質、また
は有機ポリマーラテックス粒子を含む直接視覚標識；シ
グナル生成物質を含有するリポソームまたは他の小胞な
どが含まれる。
し、視覚または機器により検出し得るシグナルを生成す
ることのできるあらゆる物質をいう。本発明に使用する
ことのできる種々の適した標識には、色原体；触媒；蛍
光化合物；化学発光化合物；放射性標識；コロイド金属
および非金属粒子、染料粒子、酵素もしくは基質、また
は有機ポリマーラテックス粒子を含む直接視覚標識；シ
グナル生成物質を含有するリポソームまたは他の小胞な
どが含まれる。
標識として使用するのに適した数多くの酵素が、米国特
許第4,275,149号明細書カラム19〜23に記載されてい
る。本発明に有用な酵素／基質シグナル生成システムの
一例を挙げると、酵素のアルカリホスファターゼと基質
のニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルホスフェートまたはその誘導体もし
くは類似物がある。
許第4,275,149号明細書カラム19〜23に記載されてい
る。本発明に有用な酵素／基質シグナル生成システムの
一例を挙げると、酵素のアルカリホスファターゼと基質
のニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルホスフェートまたはその誘導体もし
くは類似物がある。
別のシグナル生成システムにおいては、標識は蛍光化合
物であってよく、検出可能なシグナルを生じさせるのに
標識の酵素的手順を必要としない。フルオレセイン、フ
ィコビリンタンパク質（phycobiliprotein）、ローダミ
ンおよびそれらの誘導体および類似物が、本発明の反応
に標識として使用するのに適している。
物であってよく、検出可能なシグナルを生じさせるのに
標識の酵素的手順を必要としない。フルオレセイン、フ
ィコビリンタンパク質（phycobiliprotein）、ローダミ
ンおよびそれらの誘導体および類似物が、本発明の反応
に標識として使用するのに適している。
特に好ましい態様においては、指示試薬の標識成分とし
て視覚検出可能な発色粒子を用いることができ、そうす
ることによりシグナル生成試薬をさらに用いることなく
試料中の分析対象物の存在または濃度を直接色で読み取
ることができる。発色粒子として使用する物質は、米国
特許第4,313,734号明細書および同第4,373,932号明細書
に開示されているように、金などのコロイド金属、およ
び染料粒子である。コロイド状セレン粒子などの非金属
コロイドの調製および使用は、1987年７月９日に出願し
た米国特許出願第072,084号明細書に開示されている。
イムノクロマトグラフィーにおけるコロイド粒子の使用
は、1987年７月13日に出願した米国特許出願第072,459
号明細書に開示されている。標識として使用するための
有機ポリマーラテックス粒子は、1988年９月23日に出願
した米国特許出願第248,858号明細書に開示されてい
る。
て視覚検出可能な発色粒子を用いることができ、そうす
ることによりシグナル生成試薬をさらに用いることなく
試料中の分析対象物の存在または濃度を直接色で読み取
ることができる。発色粒子として使用する物質は、米国
特許第4,313,734号明細書および同第4,373,932号明細書
に開示されているように、金などのコロイド金属、およ
び染料粒子である。コロイド状セレン粒子などの非金属
コロイドの調製および使用は、1987年７月９日に出願し
た米国特許出願第072,084号明細書に開示されている。
イムノクロマトグラフィーにおけるコロイド粒子の使用
は、1987年７月13日に出願した米国特許出願第072,459
号明細書に開示されている。標識として使用するための
有機ポリマーラテックス粒子は、1988年９月23日に出願
した米国特許出願第248,858号明細書に開示されてい
る。
本明細書において「シグナル生成成分」とは、他のアッ
セイ試薬または分析対象物と反応して分析対象物の存在
を示し視覚または機器により検出可能な反応生成物また
はシグナルを生じることのできるあらゆる物質をいう。
本明細書において「シグナル生成システム」とは、所望
の反応生成物またはシグナルを生成させるのに必要な一
群のアッセイ試薬をいう。たとえば、標識と反応させて
検出可能なシグナルを生じさせるために１または２以上
のシグナル生成成分を用いることができる。すなわち、
標識が酵素であるときは、酵素を１または２以上の基質
または他の酵素と反応させて検出可能な反応生成物を得
ることにより検出可能なシグナルが増幅される。
セイ試薬または分析対象物と反応して分析対象物の存在
を示し視覚または機器により検出可能な反応生成物また
はシグナルを生じることのできるあらゆる物質をいう。
本明細書において「シグナル生成システム」とは、所望
の反応生成物またはシグナルを生成させるのに必要な一
群のアッセイ試薬をいう。たとえば、標識と反応させて
検出可能なシグナルを生じさせるために１または２以上
のシグナル生成成分を用いることができる。すなわち、
標識が酵素であるときは、酵素を１または２以上の基質
または他の酵素と反応させて検出可能な反応生成物を得
ることにより検出可能なシグナルが増幅される。
本明細書において「指示試薬」とは、特異的結合成分に
付着した標識をいう。指示試薬は、試験試料中の分析対
象物の量と相対的なレベルで検出可能なシグナルを生成
する。一般に、指示試薬は固相物質上に捕捉された後に
検出または測定されるが、未結合指示試薬を測定してア
ッセイの結果を決定することもできる。
付着した標識をいう。指示試薬は、試験試料中の分析対
象物の量と相対的なレベルで検出可能なシグナルを生成
する。一般に、指示試薬は固相物質上に捕捉された後に
検出または測定されるが、未結合指示試薬を測定してア
ッセイの結果を決定することもできる。
指示試薬の特異的結合成分は、サンドイッチアッセイに
おける分析対象物、競合アッセイにおける捕捉試薬、ま
たは間接アッセイにおける補助特異的結合成分に結合す
ることができる。標識は、上述したように、試験試料中
の分析対象物の量と相対する検出可能なシグナルを指示
試薬が生成できるようにする。指示試薬の特異的結合成
分は、分析対象物、補助特異的結合成分、または捕捉試
薬に標識が間接的に結合できるようにする。特定の標識
を選択することは重要ではないが、標識は、発色有機ポ
リマーラテックス粒子により生成される検出可能なシグ
ナルのようにそれ自身で検出可能なシグナルを生成する
か、または酵素／基質シグナル生成システムのように１
もしくは２以上のシグナル生成成分と組み合わせて検出
可能なシグナルを生成する。標識かまたは特異的結合成
分のいずれかを変えることにより種々の異なる指示試薬
を調製することができる。この選択には検出しようとす
る分析対象物および所望の検出手段を考慮することが含
まれることは、当業者には理解されるであろう。
おける分析対象物、競合アッセイにおける捕捉試薬、ま
たは間接アッセイにおける補助特異的結合成分に結合す
ることができる。標識は、上述したように、試験試料中
の分析対象物の量と相対する検出可能なシグナルを指示
試薬が生成できるようにする。指示試薬の特異的結合成
分は、分析対象物、補助特異的結合成分、または捕捉試
薬に標識が間接的に結合できるようにする。特定の標識
を選択することは重要ではないが、標識は、発色有機ポ
リマーラテックス粒子により生成される検出可能なシグ
ナルのようにそれ自身で検出可能なシグナルを生成する
か、または酵素／基質シグナル生成システムのように１
もしくは２以上のシグナル生成成分と組み合わせて検出
可能なシグナルを生成する。標識かまたは特異的結合成
分のいずれかを変えることにより種々の異なる指示試薬
を調製することができる。この選択には検出しようとす
る分析対象物および所望の検出手段を考慮することが含
まれることは、当業者には理解されるであろう。
本明細書において「捕捉試薬」とは、荷電物質に結合し
た非標識の特異的結合成分をいう。成分の付着は本質的
に不可逆的であり、これには共有結合が含まれる。捕捉
試薬は、他のアッセイ試薬および残る試験試料から分析
対象物および／または指示試薬を実質的に分離すること
により、検出可能なシグナルの観察を容易にするために
用いられる。特異的結合成分は、荷電物質への付着が結
合成分の結合部位を妨害しない限り、ハプテンや小さな
ペプチドのような小さな分子であってよい。
た非標識の特異的結合成分をいう。成分の付着は本質的
に不可逆的であり、これには共有結合が含まれる。捕捉
試薬は、他のアッセイ試薬および残る試験試料から分析
対象物および／または指示試薬を実質的に分離すること
により、検出可能なシグナルの観察を容易にするために
用いられる。特異的結合成分は、荷電物質への付着が結
合成分の結合部位を妨害しない限り、ハプテンや小さな
ペプチドのような小さな分子であってよい。
捕捉試薬の特異的結合成分は、サンドイッチアッセイに
おける分析対象物、競合アッセイにおける指示試薬もし
くは分析対象物、または間接アッセイにおける補助特異
的結合成分（それ自身、分析対象物に対し特異的であ
る）に対して特異的である。荷電物質には、アニオン性
およびカチオン性のモノマーおよびポリマーが含まれ
る。たとえば、アニオン性ポリマーには、ポリグルタミ
ン酸（PGA）、アルブミンのようなアニオン性タンパク
質または誘導体化タンパク質、ヘパリンもしくはアルギ
ン酸のような多糖類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリ
ル酸、および適当なpH（たとえば４〜10の範囲のpH）で
正味の負の荷電を有するポリアミノ酸が含まれる。さら
に、特異的結合成分を１よりも多い荷電したモノマーま
たはポリマーと結合させて、捕捉試薬に付随する正味の
荷電を増加させることができる。
おける分析対象物、競合アッセイにおける指示試薬もし
くは分析対象物、または間接アッセイにおける補助特異
的結合成分（それ自身、分析対象物に対し特異的であ
る）に対して特異的である。荷電物質には、アニオン性
およびカチオン性のモノマーおよびポリマーが含まれ
る。たとえば、アニオン性ポリマーには、ポリグルタミ
ン酸（PGA）、アルブミンのようなアニオン性タンパク
質または誘導体化タンパク質、ヘパリンもしくはアルギ
ン酸のような多糖類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリ
ル酸、および適当なpH（たとえば４〜10の範囲のpH）で
正味の負の荷電を有するポリアミノ酸が含まれる。さら
に、特異的結合成分を１よりも多い荷電したモノマーま
たはポリマーと結合させて、捕捉試薬に付随する正味の
荷電を増加させることができる。
本発明の１つの態様において、負に荷電した捕捉試薬
は、一般式： （式中、ｎは約10〜約500、ｚは約１〜約６、ＷはH+、N
a+、K+、Li+、H+NR3のようなアミン塩およびそれらの誘
導体よりなる群から選ばれた基、Ｘは特異的結合成分と
ポリマーとの化学結合を可能とする反応性基を有する実
質的にあらゆる反応性基または残基である）で示される
１または２以上の活性化ポリマー性アニオン分子または
その塩基結合体に特異的結合成分を結合させることによ
り調製することができる。上記式において、Ｘはアミン
反応性基もしくは残基、チオール反応性基もしくは残
基、または式：−Ａ−SH（式中、Ａはスペーサーアーム
である）で示されるチオール基もしくは残基であってよ
い。たとえば、アミノ基を有する特異的結合成分は、ア
ミン反応性残基を有する活性化PGAアニオン分子と結合
させることができる。アミン反応性残基は、活性化ポリ
マーを特異的結合成分上のアミノ基に結合させることが
でき、その例としては、以下の式： （式中、ｍは２または３、Ｒ′は硫黄安定化基、Ｒ″は
脂肪族基またはアリール基である）で示される残基が挙
げられるが、これらに限られるものではない。硫黄安定
化基としては、２−ピリジル基、４−ピリジル基および
５−ニトロ−２−ピリジル基が挙げられるが、これらに
限られるものではない。上記式において「Ａ」は約１〜
約30原子のスペーサーを表し、これにはポリエーテル、
ポリメチレンおよびポリアミドのような炭素、窒素、硫
黄および酸素原子鎖およびその組合わせ、並びにフェニ
ルチオカルバミルのような芳香族スペーサーが含まれる
が、これらに限られるものではない。
は、一般式： （式中、ｎは約10〜約500、ｚは約１〜約６、ＷはH+、N
a+、K+、Li+、H+NR3のようなアミン塩およびそれらの誘
導体よりなる群から選ばれた基、Ｘは特異的結合成分と
ポリマーとの化学結合を可能とする反応性基を有する実
質的にあらゆる反応性基または残基である）で示される
１または２以上の活性化ポリマー性アニオン分子または
その塩基結合体に特異的結合成分を結合させることによ
り調製することができる。上記式において、Ｘはアミン
反応性基もしくは残基、チオール反応性基もしくは残
基、または式：−Ａ−SH（式中、Ａはスペーサーアーム
である）で示されるチオール基もしくは残基であってよ
い。たとえば、アミノ基を有する特異的結合成分は、ア
ミン反応性残基を有する活性化PGAアニオン分子と結合
させることができる。アミン反応性残基は、活性化ポリ
マーを特異的結合成分上のアミノ基に結合させることが
でき、その例としては、以下の式： （式中、ｍは２または３、Ｒ′は硫黄安定化基、Ｒ″は
脂肪族基またはアリール基である）で示される残基が挙
げられるが、これらに限られるものではない。硫黄安定
化基としては、２−ピリジル基、４−ピリジル基および
５−ニトロ−２−ピリジル基が挙げられるが、これらに
限られるものではない。上記式において「Ａ」は約１〜
約30原子のスペーサーを表し、これにはポリエーテル、
ポリメチレンおよびポリアミドのような炭素、窒素、硫
黄および酸素原子鎖およびその組合わせ、並びにフェニ
ルチオカルバミルのような芳香族スペーサーが含まれる
が、これらに限られるものではない。
別の態様において、チオール基を有する特異的結合成分
を、チオール反応性残基を有する活性化ポリマーに結合
させることができる。チオール反応性残基には、式： （式中、Ａは上記約１〜約30原子のスペーサーである）
で示される残基が含まれるが、これらに限られるもので
はない。さらの他の態様において、チオール反応性基を
有する特異的結合成分を、式：−Ａ−SHで示されるよう
なチオール残基を有する活性化ポリマーに結合させるこ
とができる。
を、チオール反応性残基を有する活性化ポリマーに結合
させることができる。チオール反応性残基には、式： （式中、Ａは上記約１〜約30原子のスペーサーである）
で示される残基が含まれるが、これらに限られるもので
はない。さらの他の態様において、チオール反応性基を
有する特異的結合成分を、式：−Ａ−SHで示されるよう
なチオール残基を有する活性化ポリマーに結合させるこ
とができる。
一般に、本発明の負に荷電した捕捉試薬は、以下の実施
例において、所望の特異的結合成分を末端アミノ基が修
飾された活性化PGA分子と反応させることによって生成
させた。簡単に説明すると、修飾方法は、（１）PGAを
溶媒（たとえば、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、
１−メチル−２−ピロリドンおよびジメチルスルホキシ
ドのような水混和性の非プロトン溶媒）中に溶解し、
（２）滴定し得るカルボン酸当たり約１当量の量のプロ
トン吸収試薬（たとえば、４−メチルモルホリン）を加
え、（３）約２〜約100モル過剰のアミン反応性修飾試
薬（たとえば、ジメチルホルムアミド中に溶解した1,4
−フェニレンジイソチオシアネート）を加え、（４）得
られた混合物を反応させ、ついで（５）未反応のアミン
反応性修飾試薬を除く、ことからなる。適当なプロトン
吸収試薬としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
または水酸化リチウムのようなアルカリ金属の水酸化
物、４−メチルモルホリンおよびトリエチルアミンのよ
うな第三級アミンが挙げられる。
例において、所望の特異的結合成分を末端アミノ基が修
飾された活性化PGA分子と反応させることによって生成
させた。簡単に説明すると、修飾方法は、（１）PGAを
溶媒（たとえば、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、
１−メチル−２−ピロリドンおよびジメチルスルホキシ
ドのような水混和性の非プロトン溶媒）中に溶解し、
（２）滴定し得るカルボン酸当たり約１当量の量のプロ
トン吸収試薬（たとえば、４−メチルモルホリン）を加
え、（３）約２〜約100モル過剰のアミン反応性修飾試
薬（たとえば、ジメチルホルムアミド中に溶解した1,4
−フェニレンジイソチオシアネート）を加え、（４）得
られた混合物を反応させ、ついで（５）未反応のアミン
反応性修飾試薬を除く、ことからなる。適当なプロトン
吸収試薬としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
または水酸化リチウムのようなアルカリ金属の水酸化
物、４−メチルモルホリンおよびトリエチルアミンのよ
うな第三級アミンが挙げられる。
ポリマー性アニオン分子または特異的結合成分は、１ま
たは２以上のアミノ基、カルボキシル基またはチオール
基を含んでいるか、またはアミノ基、カルボキシル基ま
たはチオール基を取り込むことにより活性化され、その
結果、特異的結合成分がポリマー性アニオン分子との間
に化学的架橋を形成することが可能になる。「活性化
種」とは、架橋剤または他の活性化剤を取り込むことに
よって反応性基を有する特異的結合成分またはポリマー
性アニオン分子をいう。アミノ反応性修飾試薬は、ポリ
マー性アニオン分子の特異的結合成分を「活性化」す
る、すなわち化学的架橋のために特異的結合成分または
ポリマー性アニオン分子を調製するために用いる試薬の
下位分類である。活性化試薬にはまた、チオラン類（２
−イミノチオランなど）、スクシンイミジルメルカプト
アセテート類（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメ
ルカプトアセテートなど）、およびジスルフィド化合物
（引き続きチオールに還元される）などのようなチオー
ル導入試薬が含まれる。チオール導入試薬は、その後の
チオール反応性基との反応のために、特異的結合成分お
よび固相物質を活性化するために用いることができる。
たは２以上のアミノ基、カルボキシル基またはチオール
基を含んでいるか、またはアミノ基、カルボキシル基ま
たはチオール基を取り込むことにより活性化され、その
結果、特異的結合成分がポリマー性アニオン分子との間
に化学的架橋を形成することが可能になる。「活性化
種」とは、架橋剤または他の活性化剤を取り込むことに
よって反応性基を有する特異的結合成分またはポリマー
性アニオン分子をいう。アミノ反応性修飾試薬は、ポリ
マー性アニオン分子の特異的結合成分を「活性化」す
る、すなわち化学的架橋のために特異的結合成分または
ポリマー性アニオン分子を調製するために用いる試薬の
下位分類である。活性化試薬にはまた、チオラン類（２
−イミノチオランなど）、スクシンイミジルメルカプト
アセテート類（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメ
ルカプトアセテートなど）、およびジスルフィド化合物
（引き続きチオールに還元される）などのようなチオー
ル導入試薬が含まれる。チオール導入試薬は、その後の
チオール反応性基との反応のために、特異的結合成分お
よび固相物質を活性化するために用いることができる。
アミン反応性修飾試薬には、無水コハク酸同族体、イミ
ノチオラン同族体、ホモ２感応性試薬およびヘテロ２感
応性試薬のような２感応性架橋またはカップリング試薬
が含まれるが、これらに限られるものではない。これら
試薬により、特異的結合成分とポリマー性アニオン分子
との間の化学的架橋が可能となる。ホモ２感応性試薬の
例としては、式:X−Ａ−Ｘ（式中、Ｘはアミン反応性基
であり、Ａは約１〜約30原子のスペーサーである）で示
されるものが挙げられる。ヘテロ２感応性試薬の例とし
ては、式:X−Ａ−Ｙ（式中、Ｘはアミン反応性基、Ｙは
チオール反応性残基、チオール残基またはチオール前駆
体、Ａは上記約１〜約30原子のスペーサーである）で示
されるものが挙げられる。タンパク質活性部位にシステ
インを有するタンパク質性特異的結合成分の場合は、カ
ップリング剤を加えると活性が減少するので、当該技術
分野で知られた方法により、カップリング剤と反応させ
る前に活性部位中のシステイン残基を保護しなければな
らない。
ノチオラン同族体、ホモ２感応性試薬およびヘテロ２感
応性試薬のような２感応性架橋またはカップリング試薬
が含まれるが、これらに限られるものではない。これら
試薬により、特異的結合成分とポリマー性アニオン分子
との間の化学的架橋が可能となる。ホモ２感応性試薬の
例としては、式:X−Ａ−Ｘ（式中、Ｘはアミン反応性基
であり、Ａは約１〜約30原子のスペーサーである）で示
されるものが挙げられる。ヘテロ２感応性試薬の例とし
ては、式:X−Ａ−Ｙ（式中、Ｘはアミン反応性基、Ｙは
チオール反応性残基、チオール残基またはチオール前駆
体、Ａは上記約１〜約30原子のスペーサーである）で示
されるものが挙げられる。タンパク質活性部位にシステ
インを有するタンパク質性特異的結合成分の場合は、カ
ップリング剤を加えると活性が減少するので、当該技術
分野で知られた方法により、カップリング剤と反応させ
る前に活性部位中のシステイン残基を保護しなければな
らない。
本明細書において「カップリング剤」には、２感応性架
橋またはカップリング剤、すなわち２個の反応性基また
は「末端」を含有する分子が含まれ、該反応性基または
末端はスペーサーによりつながれていてよい。反応性末
端は、種々の感応性のいずれであってもよく、たとえば
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）活性エステル
類、イミドエステル類、アルデヒド類、エポキシド類、
ハロゲン化スルホニル類、イソシアネート類、イソチオ
シアネート類およびハロゲン化ニトロアリール類のよう
なアミノ反応性末端；およびピリジルジスルフィド類、
マレイミド類、チオフタールイミド類および活性ハロゲ
ンのようなチオール反応性末端などが挙げられるが、こ
れらに限られるものではない。ヘテロ２感応性架橋試薬
は、２つの異なる反応性末端、たとえばアミノ反応性末
端とチオール反応性末端を有しており、一方、ホモ２感
応性架橋試薬は、２つの同じ反応性末端、たとえばビス
マレイミドヘキサン（BMH）（スルフヒドリル含有化合
物の架橋を可能にする）、およびジスクシンイミジルス
ベレート（DSS）、水溶性同族体およびスルホ−NHSエス
テル類のようなNHSホモ２感応性架橋剤を有している
［ピアス（Pierce）の1989ハンドブック・アンド・ジェ
ネラル・カタログ（Handbook and General Catalog）；
ピアス、ロックフォード、IL、61105〜9976参照］。
橋またはカップリング剤、すなわち２個の反応性基また
は「末端」を含有する分子が含まれ、該反応性基または
末端はスペーサーによりつながれていてよい。反応性末
端は、種々の感応性のいずれであってもよく、たとえば
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）活性エステル
類、イミドエステル類、アルデヒド類、エポキシド類、
ハロゲン化スルホニル類、イソシアネート類、イソチオ
シアネート類およびハロゲン化ニトロアリール類のよう
なアミノ反応性末端；およびピリジルジスルフィド類、
マレイミド類、チオフタールイミド類および活性ハロゲ
ンのようなチオール反応性末端などが挙げられるが、こ
れらに限られるものではない。ヘテロ２感応性架橋試薬
は、２つの異なる反応性末端、たとえばアミノ反応性末
端とチオール反応性末端を有しており、一方、ホモ２感
応性架橋試薬は、２つの同じ反応性末端、たとえばビス
マレイミドヘキサン（BMH）（スルフヒドリル含有化合
物の架橋を可能にする）、およびジスクシンイミジルス
ベレート（DSS）、水溶性同族体およびスルホ−NHSエス
テル類のようなNHSホモ２感応性架橋剤を有している
［ピアス（Pierce）の1989ハンドブック・アンド・ジェ
ネラル・カタログ（Handbook and General Catalog）；
ピアス、ロックフォード、IL、61105〜9976参照］。
他の市販のホモ２感応性架橋試薬としては、ジメチルア
ジピミデートジハイドロクロライド（DMA）、ジメチル
ピメリミデーテジハイドロクロライド（DMP）およびジ
メチルスベリミデートジハイドロクロライド（DMS）の
ようなイミドエステル類が挙げられるが、これらに限ら
れるものではない。イミノチオラン同族体は、一般式： （式中、Ａは約１〜約５原子のスペーサーである）で示
されるもの、たとえば２−イミノチオラン（トロート試
薬（Traut's Reagent））が挙げられる。
ジピミデートジハイドロクロライド（DMA）、ジメチル
ピメリミデーテジハイドロクロライド（DMP）およびジ
メチルスベリミデートジハイドロクロライド（DMS）の
ようなイミドエステル類が挙げられるが、これらに限ら
れるものではない。イミノチオラン同族体は、一般式： （式中、Ａは約１〜約５原子のスペーサーである）で示
されるもの、たとえば２−イミノチオラン（トロート試
薬（Traut's Reagent））が挙げられる。
本発明に使用するのに適した市販のヘテロ２感応性試薬
としては、マレイミド−NHS活性エステルカップリング
剤が挙げられるがこれに限られるものではなく、さらに
その具体例としては、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）；スクシン
イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（SMCC）；スクシンイミジル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）およ
びそれらの誘導体、たとえばスルホスクシンイミジル４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート（スルホ−SMCC）;m−マレイミドベンゾイ
ル−スルホスクシンイミドエステル（スルホ−MBS）お
よびスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）ブチレート（スルホ−SMPB）のようなスルホスク
シンイミジル誘導体が挙げられる。
としては、マレイミド−NHS活性エステルカップリング
剤が挙げられるがこれに限られるものではなく、さらに
その具体例としては、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）；スクシン
イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（SMCC）；スクシンイミジル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）およ
びそれらの誘導体、たとえばスルホスクシンイミジル４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート（スルホ−SMCC）;m−マレイミドベンゾイ
ル−スルホスクシンイミドエステル（スルホ−MBS）お
よびスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）ブチレート（スルホ−SMPB）のようなスルホスク
シンイミジル誘導体が挙げられる。
他の適当なヘテロ２感応性試薬としては、Ｎ−スクシン
イミジルブロモアセテートおよびＮ−スクシンイミジル
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（SIAB）の
ような市販の活性ハロゲン−NHS活性エステルカップリ
ング剤、およびスルホスクシンイミジル（４−ヨードア
セチル）アミノベンゾエート（スルホ−SIAB）のような
スルホスクシンイミジル誘導体が挙げられる。他のカッ
プリング剤の例としては、Ｎ−スクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）のよう
なヘテロ２感応性でチオール開裂性試薬が挙げられる。
イミジルブロモアセテートおよびＮ−スクシンイミジル
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（SIAB）の
ような市販の活性ハロゲン−NHS活性エステルカップリ
ング剤、およびスルホスクシンイミジル（４−ヨードア
セチル）アミノベンゾエート（スルホ−SIAB）のような
スルホスクシンイミジル誘導体が挙げられる。他のカッ
プリング剤の例としては、Ｎ−スクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）のよう
なヘテロ２感応性でチオール開裂性試薬が挙げられる。
さらに他のカップリング剤の例としては、米国特許出願
第254,288号（1988年10月11日出願）および同第114,930
号（1987年10月30日出願）各明細書に記載の拡張された
長さのヘテロ２感応性カップリング剤が挙げられる。こ
の拡張された長さのヘテロ２感応性カップリング剤の例
としては、スペーサーが式： （式中、アミノ酸は直鎖中に３〜10個の炭素原子を有す
る置換または非置換アミノ酸、ｎは１〜10、Ｒはアルキ
ル基、シクロアルキル基、アルキル−シクロアルキル基
または芳香族カルボン酸環である）で示されるマレイミ
ド−NHS活性エステル類試薬が挙げられる。アルキル−
シクロアルキルなる語には、シクロアルキル環構造に結
合したアルキル基において該アルキル基がシクロアルキ
ル基をマレイミド基またはカルボニル基に結合させてい
るものが含まれる。アルキルなる語には、直鎖または分
枝鎖アルキル基が含まれ、炭素数１〜６の低級アルキル
基が好ましい。
第254,288号（1988年10月11日出願）および同第114,930
号（1987年10月30日出願）各明細書に記載の拡張された
長さのヘテロ２感応性カップリング剤が挙げられる。こ
の拡張された長さのヘテロ２感応性カップリング剤の例
としては、スペーサーが式： （式中、アミノ酸は直鎖中に３〜10個の炭素原子を有す
る置換または非置換アミノ酸、ｎは１〜10、Ｒはアルキ
ル基、シクロアルキル基、アルキル−シクロアルキル基
または芳香族カルボン酸環である）で示されるマレイミ
ド−NHS活性エステル類試薬が挙げられる。アルキル−
シクロアルキルなる語には、シクロアルキル環構造に結
合したアルキル基において該アルキル基がシクロアルキ
ル基をマレイミド基またはカルボニル基に結合させてい
るものが含まれる。アルキルなる語には、直鎖または分
枝鎖アルキル基が含まれ、炭素数１〜６の低級アルキル
基が好ましい。
スペーサーが存在するときには、該スペーサーは、一緒
に用いた分析対象物または他の特異的結合成分に対して
反応せず、安定で結合しないいかなる分子鎖であっても
よい。スペーサーの長さは種々であってよく、１個の原
子の大きさから米国特許出願第254,288号および同第11
4,930号明細書に記載された大きさまたはそれ以上の大
きさまでにわたることができる。
に用いた分析対象物または他の特異的結合成分に対して
反応せず、安定で結合しないいかなる分子鎖であっても
よい。スペーサーの長さは種々であってよく、１個の原
子の大きさから米国特許出願第254,288号および同第11
4,930号明細書に記載された大きさまたはそれ以上の大
きさまでにわたることができる。
アミン反応性修飾試薬、チオール導入試薬または他の活
性化剤の選択は重要ではなく、当業者であれば診断アッ
セイに用いるべき特定のポリマー性アニオン分子および
特異的結合成分とともに用いるのに適当なまたは好まし
い試薬がわかるであろう。それゆえ、所定のアッセイに
用いるカップリング剤または活性化剤は、一般に経験的
に決定されることが当業者により評価されるであろう。
性化剤の選択は重要ではなく、当業者であれば診断アッ
セイに用いるべき特定のポリマー性アニオン分子および
特異的結合成分とともに用いるのに適当なまたは好まし
い試薬がわかるであろう。それゆえ、所定のアッセイに
用いるカップリング剤または活性化剤は、一般に経験的
に決定されることが当業者により評価されるであろう。
ヘテロ２感応性試薬のチオール反応性残基の例として
は、式： で示されるものが挙げられるが、これらに限られるもの
ではない。
は、式： で示されるものが挙げられるが、これらに限られるもの
ではない。
適当なチオール前駆体残基の例としては、式： で示されるものが挙げられるが、これらに限られるもの
ではない。
ではない。
適当なアミン反応性残基の例としては、式： （式中、ｍは２または３、Ｒ′は上記と同じ硫黄安定化
基、Ｒ″は脂肪族またはアリール基である）で示される
ものが挙げられるが、これらに限られるものではない。
基、Ｒ″は脂肪族またはアリール基である）で示される
ものが挙げられるが、これらに限られるものではない。
本発明のさらに他の態様において、アミン反応性基を有
する特異的結合成分（たとえば、活性化特異的結合成
分）を、ポリマー性アニオン分子の末端アミノ基に結合
させることができる。簡単に説明すると、結合手順は、
（１）PGAを溶媒（たとえば、ジオキサン、ジメチルホ
ルムアミド、１−メチル−２−ピロリドンおよびジメチ
ルスルホキシドのような水混和性の非プロトン溶媒）中
に溶解し、（２）滴定可能なカルボン酸当たり約１当量
の量でプロトン吸収試薬（たとえば、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムのようなアル
カリ金属の水酸化物、４−メチルモルホリンまたはトリ
エチルアミンのような第三級アミンなど）を加え、
（３）約２〜約100モル過剰のアミン反応性特異的結合
成分（たとえば、ホスゲン活性化フェニルサイクリジン
またはフェニルサイクリジン−４−クロロホルメートな
ど）を加え、（４）得られた混合物を反応させ、ついで
（５）未反応のアミン反応性特異的結合成分を除くこと
からなる。特異的結合成分上のアミン反応性基の適当な
例としては、式： （式中、Ａは上記約１〜約30原子のスペーサー、ｍは２
または３、Ｒ′は硫黄安定化基、Ｒ″は脂肪族またはア
リール基である）で示されるものが挙げられるが、これ
らに限られるものではない。
する特異的結合成分（たとえば、活性化特異的結合成
分）を、ポリマー性アニオン分子の末端アミノ基に結合
させることができる。簡単に説明すると、結合手順は、
（１）PGAを溶媒（たとえば、ジオキサン、ジメチルホ
ルムアミド、１−メチル−２−ピロリドンおよびジメチ
ルスルホキシドのような水混和性の非プロトン溶媒）中
に溶解し、（２）滴定可能なカルボン酸当たり約１当量
の量でプロトン吸収試薬（たとえば、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムのようなアル
カリ金属の水酸化物、４−メチルモルホリンまたはトリ
エチルアミンのような第三級アミンなど）を加え、
（３）約２〜約100モル過剰のアミン反応性特異的結合
成分（たとえば、ホスゲン活性化フェニルサイクリジン
またはフェニルサイクリジン−４−クロロホルメートな
ど）を加え、（４）得られた混合物を反応させ、ついで
（５）未反応のアミン反応性特異的結合成分を除くこと
からなる。特異的結合成分上のアミン反応性基の適当な
例としては、式： （式中、Ａは上記約１〜約30原子のスペーサー、ｍは２
または３、Ｒ′は硫黄安定化基、Ｒ″は脂肪族またはア
リール基である）で示されるものが挙げられるが、これ
らに限られるものではない。
負に荷電した捕捉試薬の調製例としては、アミン基を有
する特異的結合成分（SBM）とアミン反応性残基を有す
る活性化PGAとの反応が挙げられる。その反応および反
応生成物は、以下のように図示することができる。
する特異的結合成分（SBM）とアミン反応性残基を有す
る活性化PGAとの反応が挙げられる。その反応および反
応生成物は、以下のように図示することができる。
本明細書において「補助特異的結合成分」とは、捕捉試
薬および指示試薬の特異的結合成分に加えてアッセイ中
で使用する特異的結合ペアのいずれかの成分をいう。た
とえば、間接アッセイにおいて、補助特異的結合成分
は、分析対象物、および分析対象物自身は付着すること
のできない第二の特異的結合成分に結合してよいし、抑
制アッセイにおいては、補助特異的結合成分は、以下に
記載するように参照結合成分であってよい。アッセイに
おいては１または２以上の補助特異的結合成分を用いる
ことができる。
薬および指示試薬の特異的結合成分に加えてアッセイ中
で使用する特異的結合ペアのいずれかの成分をいう。た
とえば、間接アッセイにおいて、補助特異的結合成分
は、分析対象物、および分析対象物自身は付着すること
のできない第二の特異的結合成分に結合してよいし、抑
制アッセイにおいては、補助特異的結合成分は、以下に
記載するように参照結合成分であってよい。アッセイに
おいては１または２以上の補助特異的結合成分を用いる
ことができる。
本明細書において「固相」とは、不溶性であるか、また
はその後の反応により不溶性にすることのできるあらゆ
る物質をいう。固相は、その固有の荷電および捕捉試薬
を誘引する能力により選択することができ、具体的には
メチル化羊毛、ナイロン、および正の荷電を有する特定
のガラスが挙げられる。固相はまた、捕捉試薬の荷電物
質に関して反対に荷電した荷電物質をさらに保持してい
ることができる。たとえば、アニオン性物質を捕捉試薬
に結合させ、カチオン性物質を固相上に保持することが
できるし、またその逆にカチオン性物質を捕捉試薬に結
合させ、アニオン性物質を固相上に保持することもでき
る。天然の物質、合成物質、または合成的に修飾した天
然に存在する物質をカチオン性物質として用いることが
できる。広範囲にわたる専売ポリカチオンが入手可能で
あり、その中には、ヘキサジメスリン（hexadimethrin
e）ブロミド［ポリブレン（Polybrene）；シグマ・ケミ
カル・カンパニー、セントルイス、MO］、ガフコーツ
（GAFQuats）［たとえば、ガフコート（Gaf Quat）；ガ
フ・コーポレーション（GAF Corporation）、ウエイ
ン、NJ、07470］、ジエチルアミノエチルデキストラン
（シグマ）、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド−
ヒドロキシエチルセルロースポリマー［セルコート（Ce
lquat）Ｌ−200およびセルコートＨ−100、ナショナル
・スターチ・アンド・ケミカル・コーポレーション（Na
tional Starch＆Chemical Corporation）、ブリッジウ
ォーター、NJ、08807］などの水溶性セルロース誘導体
が含まれる。
はその後の反応により不溶性にすることのできるあらゆ
る物質をいう。固相は、その固有の荷電および捕捉試薬
を誘引する能力により選択することができ、具体的には
メチル化羊毛、ナイロン、および正の荷電を有する特定
のガラスが挙げられる。固相はまた、捕捉試薬の荷電物
質に関して反対に荷電した荷電物質をさらに保持してい
ることができる。たとえば、アニオン性物質を捕捉試薬
に結合させ、カチオン性物質を固相上に保持することが
できるし、またその逆にカチオン性物質を捕捉試薬に結
合させ、アニオン性物質を固相上に保持することもでき
る。天然の物質、合成物質、または合成的に修飾した天
然に存在する物質をカチオン性物質として用いることが
できる。広範囲にわたる専売ポリカチオンが入手可能で
あり、その中には、ヘキサジメスリン（hexadimethrin
e）ブロミド［ポリブレン（Polybrene）；シグマ・ケミ
カル・カンパニー、セントルイス、MO］、ガフコーツ
（GAFQuats）［たとえば、ガフコート（Gaf Quat）；ガ
フ・コーポレーション（GAF Corporation）、ウエイ
ン、NJ、07470］、ジエチルアミノエチルデキストラン
（シグマ）、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド−
ヒドロキシエチルセルロースポリマー［セルコート（Ce
lquat）Ｌ−200およびセルコートＨ−100、ナショナル
・スターチ・アンド・ケミカル・コーポレーション（Na
tional Starch＆Chemical Corporation）、ブリッジウ
ォーター、NJ、08807］などの水溶性セルロース誘導体
が含まれる。
本発明の検出方法のためのアッセイ装置は多くの態様を
とり得、その幾つかは固相として選んだ物質に依存す
る。たとえば、固相にはあらゆる適当な多孔質物質が含
まれ得る。ここで［多孔質」とは、液体がその中を流れ
ることができ、また容易に通過することのできる物質を
意味する。本発明においては、固相には、ガラス繊維、
セルロース、１または２以上のアッセイ試薬を含有する
１または２以上の層を有するポー・アンド・フロースル
ー（pour and flow−through）アッセイ装置において使
用するナイロンパッド；ディップ・アンド・リード（di
p and read）アッセイのためのディップステイィック；
ウィッキング（wicking）のための試験ストリップ（た
とえば紙）または薄層クロマトグラフィー法のための試
験ストリップ（たとえばニトロセルロース）；または当
業者にはよく知られた他の多孔質物質が含まれる。しか
しながら、固相は多孔質物質に限られるものではない。
固相にはまた、ポリマービーズもしくはガラスビーズ、
微細粒子、管、シート、プレート、スライド、ウエル、
テープ、試験管など、または固有の荷電を有するまたは
荷電物質を保持することのできるあらゆる物質が含まれ
る。
とり得、その幾つかは固相として選んだ物質に依存す
る。たとえば、固相にはあらゆる適当な多孔質物質が含
まれ得る。ここで［多孔質」とは、液体がその中を流れ
ることができ、また容易に通過することのできる物質を
意味する。本発明においては、固相には、ガラス繊維、
セルロース、１または２以上のアッセイ試薬を含有する
１または２以上の層を有するポー・アンド・フロースル
ー（pour and flow−through）アッセイ装置において使
用するナイロンパッド；ディップ・アンド・リード（di
p and read）アッセイのためのディップステイィック；
ウィッキング（wicking）のための試験ストリップ（た
とえば紙）または薄層クロマトグラフィー法のための試
験ストリップ（たとえばニトロセルロース）；または当
業者にはよく知られた他の多孔質物質が含まれる。しか
しながら、固相は多孔質物質に限られるものではない。
固相にはまた、ポリマービーズもしくはガラスビーズ、
微細粒子、管、シート、プレート、スライド、ウエル、
テープ、試験管など、または固有の荷電を有するまたは
荷電物質を保持することのできるあらゆる物質が含まれ
る。
天然の物質、合成物質、または合成的に修飾した天然に
存在する物質を固相として用いることができ、これには
多糖類、たとえば紙のようなセルロース物質および酢酸
セルロースやニトロセルロースのようなセルロース誘導
体；シリカ；不活化アルミナ、ケイソウ土、MgSO4のよ
うな無機物質、または微細に分割し多孔質ポリマーマト
リックス中に均一に分散させた他の無機物質（ポリマー
としては、塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリ
マー、および塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーな
ど）；天然に存在する布（たとえば、綿）および合成の
布（たとえばナイロン）；シリカゲル、アガロース、デ
キストランおよびゼラチンのような多孔質ゲル；ポリア
クリルアミドのような多孔質フィルムなどが含まれる。
固相は、妥当な強度を有しているか、または支持手段に
より強度が与えられていなければならず、また検出可能
なシグナルの生成を妨害してはならない。
存在する物質を固相として用いることができ、これには
多糖類、たとえば紙のようなセルロース物質および酢酸
セルロースやニトロセルロースのようなセルロース誘導
体；シリカ；不活化アルミナ、ケイソウ土、MgSO4のよ
うな無機物質、または微細に分割し多孔質ポリマーマト
リックス中に均一に分散させた他の無機物質（ポリマー
としては、塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリ
マー、および塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーな
ど）；天然に存在する布（たとえば、綿）および合成の
布（たとえばナイロン）；シリカゲル、アガロース、デ
キストランおよびゼラチンのような多孔質ゲル；ポリア
クリルアミドのような多孔質フィルムなどが含まれる。
固相は、妥当な強度を有しているか、または支持手段に
より強度が与えられていなければならず、また検出可能
なシグナルの生成を妨害してはならない。
好ましい固相物質には、多孔質ガラス繊維物質が含ま
れ、その例としては、たとえば「ファットマン（Whatma
n）934−AH」濾紙（名目上の厚さ:0.33mm）、またはア
ポット・ラボラトリーズ（アボットパーク、IL、6006
4）の使捨てIMxウエッジおよびテストパック（TestPac
k）（ファイバーマトリックス）装置が挙げられる。そ
のような物質の厚さは重要ではなく、主として試料やア
ッセイしようとする分析対象物の性質、たとえば試験試
料の流動性などに依存した選択の問題に過ぎないであろ
う。
れ、その例としては、たとえば「ファットマン（Whatma
n）934−AH」濾紙（名目上の厚さ:0.33mm）、またはア
ポット・ラボラトリーズ（アボットパーク、IL、6006
4）の使捨てIMxウエッジおよびテストパック（TestPac
k）（ファイバーマトリックス）装置が挙げられる。そ
のような物質の厚さは重要ではなく、主として試料やア
ッセイしようとする分析対象物の性質、たとえば試験試
料の流動性などに依存した選択の問題に過ぎないであろ
う。
固相の固有の荷電を変化させたり大きくしたりするため
に、荷電物質を直接固相物質にコーティングしたり、ま
たは荷電物質を微細粒子上にコーティングしたのち該微
細粒子を固相支持体物質により保持させることができ
る。別のやり方として、微細粒子のみを荷電固相として
用いることができる。粒子は、これをカラム中に保持
し、または可溶性試薬と試験試料との混合物中に懸濁さ
せることにより固相として用いることができるし、また
は粒子自身を固相支持体物質により保持し固定化するこ
とができる。ここで「保持し固定化する」とは、支持体
物質上または支持体物質中の粒子が支持体物質のどこか
他の場所へ移動することが実質的にできないことを意味
する。粒子は、ポリスチレン、ポリメチルアクリレー
ト、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロ
エチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、
または同様の物質からなる特定の物質の適当なタイプか
ら当業者により選択することができる。粒子の大きさは
重要ではないが、粒子の平均粒径は用いた支持体物質の
平均孔径よりも小さいことが好ましい。
に、荷電物質を直接固相物質にコーティングしたり、ま
たは荷電物質を微細粒子上にコーティングしたのち該微
細粒子を固相支持体物質により保持させることができ
る。別のやり方として、微細粒子のみを荷電固相として
用いることができる。粒子は、これをカラム中に保持
し、または可溶性試薬と試験試料との混合物中に懸濁さ
せることにより固相として用いることができるし、また
は粒子自身を固相支持体物質により保持し固定化するこ
とができる。ここで「保持し固定化する」とは、支持体
物質上または支持体物質中の粒子が支持体物質のどこか
他の場所へ移動することが実質的にできないことを意味
する。粒子は、ポリスチレン、ポリメチルアクリレー
ト、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロ
エチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、
または同様の物質からなる特定の物質の適当なタイプか
ら当業者により選択することができる。粒子の大きさは
重要ではないが、粒子の平均粒径は用いた支持体物質の
平均孔径よりも小さいことが好ましい。
イオン捕捉試薬のための使用 本発明の方法に従ってサンドイッチアッセイを行うこと
ができ、その際、可溶性の捕捉試薬にはアニオン性物質
のような荷電物質に結合した分析対象物特異的結合成分
を含ませることができる。イオン種はモノマーであって
もポリマーであってもよい。捕捉試薬を、分析対象物を
含有していると思われる試験試料、および標識した分析
対象物特異的結合成分を含む指示試薬と接触させる。こ
れらの試薬は同時に混合するか、または単独または組み
合わせて連続して加えることができる。結合反応の結
果、捕捉試薬／分析対象物／指示試薬複合体が生成され
る。アッセイの工程にはまた、捕捉試薬に関して反対に
荷電しているかまたは反対に荷電した物質、たとえばカ
チオン性物質を保持している固相を用いることにより、
生成した均一な複合体を過剰の試薬および試験試料から
分離する工程が含まれる。この場合、反対に荷電した固
相は、アニオン性物質とカチオン性物質との相互作用に
より捕捉試薬／分析対象物／指示試薬複合体を誘引し該
複合体に付着する。固相上に保持された複合体を、つい
で指示試薬について固相を調べることにより検出する。
試料中に分析対象物が存在すると固相物質上に標識が存
在する。固相上の標識の量は、試料中の分析対象物の量
に正比例する。サンドイッチアッセイに内在する唯一の
主だった制限は、少なくとも２個の特異的結合成分が結
合することができるように分析対象物が充分な大きさと
適当に配置されたエピトープを有している必要があるこ
とである。
ができ、その際、可溶性の捕捉試薬にはアニオン性物質
のような荷電物質に結合した分析対象物特異的結合成分
を含ませることができる。イオン種はモノマーであって
もポリマーであってもよい。捕捉試薬を、分析対象物を
含有していると思われる試験試料、および標識した分析
対象物特異的結合成分を含む指示試薬と接触させる。こ
れらの試薬は同時に混合するか、または単独または組み
合わせて連続して加えることができる。結合反応の結
果、捕捉試薬／分析対象物／指示試薬複合体が生成され
る。アッセイの工程にはまた、捕捉試薬に関して反対に
荷電しているかまたは反対に荷電した物質、たとえばカ
チオン性物質を保持している固相を用いることにより、
生成した均一な複合体を過剰の試薬および試験試料から
分離する工程が含まれる。この場合、反対に荷電した固
相は、アニオン性物質とカチオン性物質との相互作用に
より捕捉試薬／分析対象物／指示試薬複合体を誘引し該
複合体に付着する。固相上に保持された複合体を、つい
で指示試薬について固相を調べることにより検出する。
試料中に分析対象物が存在すると固相物質上に標識が存
在する。固相上の標識の量は、試料中の分析対象物の量
に正比例する。サンドイッチアッセイに内在する唯一の
主だった制限は、少なくとも２個の特異的結合成分が結
合することができるように分析対象物が充分な大きさと
適当に配置されたエピトープを有している必要があるこ
とである。
本発明はまた、競合アッセイを行うために用いることも
できる。競合アッセイ態様においてもまた、可溶性の捕
捉試薬は、アニオン性ポリマーのような荷電物質に付着
した特異的結合成分を含んでいる。捕捉試薬を試験試
料、およびシグナル生成化合物で標識した第二の結合成
分を含む指示試薬の両方と接触させる。捕捉試薬と分析
対象物とが指示試薬への結合に対して競合するか（たと
えば、捕捉試薬および分析対象物が標識抗体に対して競
合する抗原である場合）、または指示試薬と分析対象物
とが捕捉試薬への結合に対して競合する（たとえば、指
示試薬が標識抗原であり、抗体である捕捉試薬への結合
に対して抗原である分析対象物と競合する場合）ことが
できる。競合結合反応が起こると、（１）捕捉試薬／分
析対象物または指示試薬／分析対象物および（２）捕捉
試薬／指示試薬の可溶性複合体が生成される。生成した
可溶性複合体は、反対に荷電した固相、たとえば固相上
のカチオン性物質に反応混合物を接触させることにより
過剰の試薬および試験試料から除く。捕捉試薬複合体
は、反対荷電の相互作用により固相上に保持される。固
相上に保持された複合体は、指示試薬の標識により検出
することができる。競合アッセイにおいては、固相に結
合した標識の量は試料中に存在する分析対象物の量に反
比例する。従って、陽性試験試料は陰性のシグナルを生
じる。競合アッセイは、小さいペプチドやハプテンのよ
うな小さい分子の分析対象物の存在を決定するために用
いるのが有利であり、このような小さい分子では単一の
エピトープを有していてこれに特異的に結合する相手方
が結合する。
できる。競合アッセイ態様においてもまた、可溶性の捕
捉試薬は、アニオン性ポリマーのような荷電物質に付着
した特異的結合成分を含んでいる。捕捉試薬を試験試
料、およびシグナル生成化合物で標識した第二の結合成
分を含む指示試薬の両方と接触させる。捕捉試薬と分析
対象物とが指示試薬への結合に対して競合するか（たと
えば、捕捉試薬および分析対象物が標識抗体に対して競
合する抗原である場合）、または指示試薬と分析対象物
とが捕捉試薬への結合に対して競合する（たとえば、指
示試薬が標識抗原であり、抗体である捕捉試薬への結合
に対して抗原である分析対象物と競合する場合）ことが
できる。競合結合反応が起こると、（１）捕捉試薬／分
析対象物または指示試薬／分析対象物および（２）捕捉
試薬／指示試薬の可溶性複合体が生成される。生成した
可溶性複合体は、反対に荷電した固相、たとえば固相上
のカチオン性物質に反応混合物を接触させることにより
過剰の試薬および試験試料から除く。捕捉試薬複合体
は、反対荷電の相互作用により固相上に保持される。固
相上に保持された複合体は、指示試薬の標識により検出
することができる。競合アッセイにおいては、固相に結
合した標識の量は試料中に存在する分析対象物の量に反
比例する。従って、陽性試験試料は陰性のシグナルを生
じる。競合アッセイは、小さいペプチドやハプテンのよ
うな小さい分子の分析対象物の存在を決定するために用
いるのが有利であり、このような小さい分子では単一の
エピトープを有していてこれに特異的に結合する相手方
が結合する。
たとえば、テオフィリンのアッセイにおいては、抗テオ
フィリン抗体（モノクローナルかまたはポリクローナ
ル）をアニオン性物質に結合させて可溶性の捕捉試薬を
生成させ、該抗体への結合に対して可溶性の標識テオフ
ィリン（すなわち指示試薬）と試験試料の非標識テオフ
ィリンとの間で競合を行わせる。インキュベーションし
た後、均一な混合物をカチオンコーティング固相と接触
させる。捕捉試薬および固相の反対に荷電したイオン種
間での引力により、免疫複合体が反応混合物から分離さ
れる。ついで指示試薬からのシグナルを検出する。この
場合、試験試料中でのテオフィリンレベルが増加するこ
とは、固相に関連したシグナル生成を減少させる結果と
なる。
フィリン抗体（モノクローナルかまたはポリクローナ
ル）をアニオン性物質に結合させて可溶性の捕捉試薬を
生成させ、該抗体への結合に対して可溶性の標識テオフ
ィリン（すなわち指示試薬）と試験試料の非標識テオフ
ィリンとの間で競合を行わせる。インキュベーションし
た後、均一な混合物をカチオンコーティング固相と接触
させる。捕捉試薬および固相の反対に荷電したイオン種
間での引力により、免疫複合体が反応混合物から分離さ
れる。ついで指示試薬からのシグナルを検出する。この
場合、試験試料中でのテオフィリンレベルが増加するこ
とは、固相に関連したシグナル生成を減少させる結果と
なる。
本発明はまた、１または２以上の補助特異的結合成分を
用いた間接イムノアッセイに用いたこともできる。たと
えば、捕捉試薬／分析対象物／抗分析対象物抗体／指示
試薬複合体の生成を伴う間接サンドイッチイムノアッセ
イを行うことができ、その際、指示試薬は、分析対象物
に対して特異的な補助特異的結合成分に対して特異的に
結合する相手方である。さらに別の態様においては、捕
捉試薬は、分析対象物に対して特異的な補助特異的結合
成分に対して特異的に結合する相手方である。
用いた間接イムノアッセイに用いたこともできる。たと
えば、捕捉試薬／分析対象物／抗分析対象物抗体／指示
試薬複合体の生成を伴う間接サンドイッチイムノアッセ
イを行うことができ、その際、指示試薬は、分析対象物
に対して特異的な補助特異的結合成分に対して特異的に
結合する相手方である。さらに別の態様においては、捕
捉試薬は、分析対象物に対して特異的な補助特異的結合
成分に対して特異的に結合する相手方である。
加えて、本発明は、参照抗原の検出を抑制することによ
り抗体の測定をするような抑制アッセイに用いることも
できる。たとえば、捕捉試薬は抗体／アニオン結合体を
含み、指示試薬は標識抗体であってよい。分析対象物で
ある抗体を含有していると思われる試験試料を参照抗原
と混合する。該参照抗原と捕捉試薬および指示試薬と
は、固相上に固定化することのできる検出可能なサンド
イッチ複合体を生成し得る。捕捉試薬による抗原取り込
みの抑制の程度は、試験試料中の抗体の量に正比例す
る。従って、分析対象物である抗体の濃度が減少するに
つれて固定化サンドイッチ複合体を完成するに必要な参
照抗原が少なくてすむ。
り抗体の測定をするような抑制アッセイに用いることも
できる。たとえば、捕捉試薬は抗体／アニオン結合体を
含み、指示試薬は標識抗体であってよい。分析対象物で
ある抗体を含有していると思われる試験試料を参照抗原
と混合する。該参照抗原と捕捉試薬および指示試薬と
は、固相上に固定化することのできる検出可能なサンド
イッチ複合体を生成し得る。捕捉試薬による抗原取り込
みの抑制の程度は、試験試料中の抗体の量に正比例す
る。従って、分析対象物である抗体の濃度が減少するに
つれて固定化サンドイッチ複合体を完成するに必要な参
照抗原が少なくてすむ。
一般に分析対象物とアッセイ試薬との間に複合体が生成
されたら、分離のため固相を用いる。均一な反応混合物
を固相と接触させると、新たに生成した結合複合体は、
固相および捕捉試薬の反対荷電間での相互作用により固
相上に保持される。もしも使用者が液相動力学に関心が
ないのであれば、捕捉試薬を固相上に前以て固定化して
「捕捉部位」、すなわち１または２以上の捕捉試薬が非
拡散的に付着した固相の領域を生成することができる。
されたら、分離のため固相を用いる。均一な反応混合物
を固相と接触させると、新たに生成した結合複合体は、
固相および捕捉試薬の反対荷電間での相互作用により固
相上に保持される。もしも使用者が液相動力学に関心が
ないのであれば、捕捉試薬を固相上に前以て固定化して
「捕捉部位」、すなわち１または２以上の捕捉試薬が非
拡散的に付着した固相の領域を生成することができる。
本発明はまた、液体試料から物質を分離するために用い
ることもできる。たとえば、分析対象物を試験試料から
分離することだけを目的として、指示試薬を用いること
なく捕捉試薬および固相を用いることができる。さら
に、捕捉試薬を、該捕捉試薬に関して反対に荷電した可
溶性の第二の荷電物質と接触させることができる。この
第二の荷電物質は、試料を固相物質に接触させる前には
固相上に保持されていないが、捕捉試薬に誘引・付着し
て生成したアッセイ複合体が固相上に保持されるように
する。
ることもできる。たとえば、分析対象物を試験試料から
分離することだけを目的として、指示試薬を用いること
なく捕捉試薬および固相を用いることができる。さら
に、捕捉試薬を、該捕捉試薬に関して反対に荷電した可
溶性の第二の荷電物質と接触させることができる。この
第二の荷電物質は、試料を固相物質に接触させる前には
固相上に保持されていないが、捕捉試薬に誘引・付着し
て生成したアッセイ複合体が固相上に保持されるように
する。
荷電捕捉試薬と分析対象物（および／または指示試薬）
との複合体を反対に荷電した固相と接触させるときに
は、反対に荷電したイオン種間でのイオン引力が、該複
合体を反応混合物から分離する効率を支配する。イオン
引力の選択は、とりわけ複数のポリカチオン性およびポ
リアニオン性化学種が捕捉試薬および固相中に含まれて
いるときには、抗体の抗原に対する免疫学的引力よりも
大きな引力となるようにして行うことができる。さらに
他の利点としては、「イオン捕捉」法は、干渉物質の固
相上への非特異的な吸着を最小限に抑えることができ、
そのことによって一層正確な分析が可能となることであ
る。そのためイオン捕捉法は、特異性の高い分離法、最
小の非特異的結合、および感度の高いアッセイを行うこ
とが可能となる。
との複合体を反対に荷電した固相と接触させるときに
は、反対に荷電したイオン種間でのイオン引力が、該複
合体を反応混合物から分離する効率を支配する。イオン
引力の選択は、とりわけ複数のポリカチオン性およびポ
リアニオン性化学種が捕捉試薬および固相中に含まれて
いるときには、抗体の抗原に対する免疫学的引力よりも
大きな引力となるようにして行うことができる。さらに
他の利点としては、「イオン捕捉」法は、干渉物質の固
相上への非特異的な吸着を最小限に抑えることができ、
そのことによって一層正確な分析が可能となることであ
る。そのためイオン捕捉法は、特異性の高い分離法、最
小の非特異的結合、および感度の高いアッセイを行うこ
とが可能となる。
以下に述べる実施例は、本発明の物質の調製法および該
物質を用いたアッセイ手順について記載するものであ
る。しかしながら、本発明はこれら実施例に限られるこ
とを意図したものではない。
物質を用いたアッセイ手順について記載するものであ
る。しかしながら、本発明はこれら実施例に限られるこ
とを意図したものではない。
実施例１ （癌胎児性抗原（CEA）のサンドイッチアッセイ） （ａ）抗CEA抗体−PGA捕捉試薬の調製： 下記工程手順は、抗体／ポリグルタミン酸（PGA）結合
体、すなわち抗体／アニオン性ポリマー捕捉試薬の調製
のためのものである。
体、すなわち抗体／アニオン性ポリマー捕捉試薬の調製
のためのものである。
［追加可能なアニオン性ポリマーの調製］ PGAのナトリウム塩（1g;7.14×10-5モル；平均分子量
［MW］14,000;シグマ・ケミカル・カンパニー、セント
ルイス、MO）を、ツクダ（Tsukuda）らの方法（JNCI;7
3;721〜729、1984）を用いるが以下の点を変更して３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオニル−PGA（PDP−PG
A）に変えた。PDP−PGAは、チオプロピルセファロース6
B分離をする前には遊離のスルフヒドリルに還元しなか
った。その代わり、PDP−PGAを0.1Mリン酸ナトリウムお
よび1mM EDTA（pH6.5）中に溶解し、チオプロピルセフ
ァロース6B（60ml;30g;ファルマシア・ケミカルズ（Pha
rmacia Chemicals）、ウプサラ、スウェーデン）ととも
に攪拌した。透析および凍結乾燥の後、PDP−PGA結合体
を24％の収率で得た（0.244g;1.72×10-5モル）。
［MW］14,000;シグマ・ケミカル・カンパニー、セント
ルイス、MO）を、ツクダ（Tsukuda）らの方法（JNCI;7
3;721〜729、1984）を用いるが以下の点を変更して３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオニル−PGA（PDP−PG
A）に変えた。PDP−PGAは、チオプロピルセファロース6
B分離をする前には遊離のスルフヒドリルに還元しなか
った。その代わり、PDP−PGAを0.1Mリン酸ナトリウムお
よび1mM EDTA（pH6.5）中に溶解し、チオプロピルセフ
ァロース6B（60ml;30g;ファルマシア・ケミカルズ（Pha
rmacia Chemicals）、ウプサラ、スウェーデン）ととも
に攪拌した。透析および凍結乾燥の後、PDP−PGA結合体
を24％の収率で得た（0.244g;1.72×10-5モル）。
化学処理中にジスルフィドが保持されていることを確実
にするために、チオピリジル基を５−チオ−２−ニトロ
ベンゾエート（TNB）保護基と交換した。100モル過剰の
1,4−ジトオスレイトール（分子量154.2）を、0.1Mリン
酸ナトリウム（4.0ml;pH7）中に溶解したPDP−PGA（20m
g;1.42×10-6モル）の溶液に加え、40℃で１時間反応さ
せた。混合物を5.0mM酢酸ナトリウム、0.14M NaClおよ
び1.0mM EDTA（pH5.5）で10mlまで希釈し、2000分子量
カットオフ（MWCO）管中で希釈緩衝液に対して透析し
た。蒸留水に対して透析を続けた後、凍結乾燥した。チ
オプロピル−PGA（HS−PGA）の収量は13.5mgであった。
このHS−PGA（13.5mg）を0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.
0;9.6×10-7モル）中に溶解し、10モル過剰の5,5′−ジ
チオビス（２−ニトロ安息香酸）（DTNB）と室温で１時
間反応させた。この混合物を0.1Mリン酸ナトリウム（pH
7）で10mlまで希釈し、2000MWCO管中で希釈緩衝液に対
して透析した。蒸留水に対して透析を続けた後、凍結乾
燥して５−（２−ニトロ安息香酸ジチオ）プロピオニル
−PGA（TNB−PGA;8.5mg;6.07×10-7モル）を得た。
にするために、チオピリジル基を５−チオ−２−ニトロ
ベンゾエート（TNB）保護基と交換した。100モル過剰の
1,4−ジトオスレイトール（分子量154.2）を、0.1Mリン
酸ナトリウム（4.0ml;pH7）中に溶解したPDP−PGA（20m
g;1.42×10-6モル）の溶液に加え、40℃で１時間反応さ
せた。混合物を5.0mM酢酸ナトリウム、0.14M NaClおよ
び1.0mM EDTA（pH5.5）で10mlまで希釈し、2000分子量
カットオフ（MWCO）管中で希釈緩衝液に対して透析し
た。蒸留水に対して透析を続けた後、凍結乾燥した。チ
オプロピル−PGA（HS−PGA）の収量は13.5mgであった。
このHS−PGA（13.5mg）を0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.
0;9.6×10-7モル）中に溶解し、10モル過剰の5,5′−ジ
チオビス（２−ニトロ安息香酸）（DTNB）と室温で１時
間反応させた。この混合物を0.1Mリン酸ナトリウム（pH
7）で10mlまで希釈し、2000MWCO管中で希釈緩衝液に対
して透析した。蒸留水に対して透析を続けた後、凍結乾
燥して５−（２−ニトロ安息香酸ジチオ）プロピオニル
−PGA（TNB−PGA;8.5mg;6.07×10-7モル）を得た。
各捕捉試薬抗体に付着したアニオン性ポリマー分子の数
を追跡するために、ついでTNB保護PGAをフルオレセイン
のエチレンジアミン誘導体で標識した。TNB−PGAをエチ
レンジアミン誘導体化フルオレセイン（EDA−Fl）で標
識することは、TNB−PGA（8.5mg）を乾燥N,N−ジメチル
ホルムアミド（2.0ml）中に溶解し、90モル過剰のＮ−
メチルモルホリン（分子量101.15）で処理し、温度を０
℃まで下げ、ついで90モル過剰のイソブチルクロロホル
メート（分子量136.58）を加えることにより行った。こ
の反応は０℃で１時間行った。混合物を室温に温め、30
モル過剰のEDA−Flを加え、室温で攪拌しながら一夜反
応させた。混合物を0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.0）で1
0mlまで希釈し、200MWCO管中で希釈緩衝液に対して透析
した。蒸留水に対して透析を続けた後、凍結乾燥してTN
B−PGA/EDA−Fl結合体（7.8mg;5.6×10-7モル）を得
た。
を追跡するために、ついでTNB保護PGAをフルオレセイン
のエチレンジアミン誘導体で標識した。TNB−PGAをエチ
レンジアミン誘導体化フルオレセイン（EDA−Fl）で標
識することは、TNB−PGA（8.5mg）を乾燥N,N−ジメチル
ホルムアミド（2.0ml）中に溶解し、90モル過剰のＮ−
メチルモルホリン（分子量101.15）で処理し、温度を０
℃まで下げ、ついで90モル過剰のイソブチルクロロホル
メート（分子量136.58）を加えることにより行った。こ
の反応は０℃で１時間行った。混合物を室温に温め、30
モル過剰のEDA−Flを加え、室温で攪拌しながら一夜反
応させた。混合物を0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.0）で1
0mlまで希釈し、200MWCO管中で希釈緩衝液に対して透析
した。蒸留水に対して透析を続けた後、凍結乾燥してTN
B−PGA/EDA−Fl結合体（7.8mg;5.6×10-7モル）を得
た。
TNB基の除去は、TNB−PGA/EDA−Fl（7.8mg）を0.1Mリン
酸ナトリウム（3.0ml;pH7.0）中に溶解し、40℃にて100
モル過剰の1,4−ジチオスレイトールで１時間処理する
ことにより行った。UV/VIS分光光度計上で334nmが412nm
のピークにシフトすることについて反応をモニターし
た。この物質を蒸留水で10mlまで希釈し、2000MWCO管中
で蒸留水に対して透析した。凍結乾燥するとチオプロピ
ルPGA/EDA−Fl（HS−PGA/EDA−Fl;8.4mg）が得られた。
この時点でUV/VISスキャンを取ってPGA分子当たりのフ
ルオレセインの数（すなわち積み込み（loading））を
決定した。この調製物に対しては、PGA当たり0.81フル
オレセインの値が計算された。
酸ナトリウム（3.0ml;pH7.0）中に溶解し、40℃にて100
モル過剰の1,4−ジチオスレイトールで１時間処理する
ことにより行った。UV/VIS分光光度計上で334nmが412nm
のピークにシフトすることについて反応をモニターし
た。この物質を蒸留水で10mlまで希釈し、2000MWCO管中
で蒸留水に対して透析した。凍結乾燥するとチオプロピ
ルPGA/EDA−Fl（HS−PGA/EDA−Fl;8.4mg）が得られた。
この時点でUV/VISスキャンを取ってPGA分子当たりのフ
ルオレセインの数（すなわち積み込み（loading））を
決定した。この調製物に対しては、PGA当たり0.81フル
オレセインの値が計算された。
［抗体の活性化］ モノクローナル抗体である抗CEA抗体を、ツクダらの方
法（JNCI:73;721〜729、1984）に従うが以下の点を変更
してマレイミド活性化した。抗体濃度は1mg/mlであり、
150モル過剰のＮ−スクシンイミジルｍ−（Ｎ−マレイ
ミド）ベンゾエート（SMBE、分子量314.3;シグマ）を用
いた。３〜５個のマレイミド基を抗CEA抗体に導入する
には150モル過剰のSMBEが必要であることが実験的に決
定された。3ml洗浄器カラム中のセファデックスＧ−50/
80（シグマ）を用いたメアレス（Meares）らの遠心分離
法（Analytical Biochemistry:1142;68〜78、1984）を
用いて清澄化（clean−up）を行った。抗体当たりのマ
レイミド数の決定は、リウ（Liu）らの滴定法（Biochem
istry:18、690〜696、1979）を用いて行った。この抗体
活性化の間に抗体当たり4.6個のマレイミドが導入され
たことがわかった。
法（JNCI:73;721〜729、1984）に従うが以下の点を変更
してマレイミド活性化した。抗体濃度は1mg/mlであり、
150モル過剰のＮ−スクシンイミジルｍ−（Ｎ−マレイ
ミド）ベンゾエート（SMBE、分子量314.3;シグマ）を用
いた。３〜５個のマレイミド基を抗CEA抗体に導入する
には150モル過剰のSMBEが必要であることが実験的に決
定された。3ml洗浄器カラム中のセファデックスＧ−50/
80（シグマ）を用いたメアレス（Meares）らの遠心分離
法（Analytical Biochemistry:1142;68〜78、1984）を
用いて清澄化（clean−up）を行った。抗体当たりのマ
レイミド数の決定は、リウ（Liu）らの滴定法（Biochem
istry:18、690〜696、1979）を用いて行った。この抗体
活性化の間に抗体当たり4.6個のマレイミドが導入され
たことがわかった。
ついでチオプロピルフルオレセイン標識PGAをマレイミ
ド誘導抗体と反応させて、癌胎児性抗原イオン捕捉イム
ノアッセイに適した抗体/PGA結合体を得た。0.1Mリン酸
ナトリウム（1.0〜2.0ml;pH7.0）中のマレイミド活性化
抗体（1.0mg;6.25×10-9モル）のpHを、1.0N HClを用い
て6.5に調節した。ついで0.1Mリン酸ナトリウム（100μ
）中の10モル過剰のHS−PGA/EDA−Fl（約1.0mg）を活
性化抗体調製物に加えた。室温で穏やかに攪拌しながら
一夜結合反応を行った。この混合物を0.1Mリン酸ナトリ
ウム（pH7.0）中で10mlまで希釈し、50,000MWCO管中で
0.001Mリン酸ナトリウム（pH7.0）に対して透析した
後、凍結乾燥した。乾燥物質を蒸留水（0.25ml）中に溶
解し、A280での最大ピークに対して高速液体クロマトグ
ラフィー（HPLC）分画した。クロマトグラフィーは、バ
イオ−シル（Bio−Sil）TSK250（バイオ−ラド・ラボラ
トリーズ（Bio−Rad Laboratories）、リッチモンド、
カリフォルニア）の300mm×7.5mmカラムを用い、50mM硫
酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、および0.3M NaC
l（1ml/分）で溶出することにより行った。
ド誘導抗体と反応させて、癌胎児性抗原イオン捕捉イム
ノアッセイに適した抗体/PGA結合体を得た。0.1Mリン酸
ナトリウム（1.0〜2.0ml;pH7.0）中のマレイミド活性化
抗体（1.0mg;6.25×10-9モル）のpHを、1.0N HClを用い
て6.5に調節した。ついで0.1Mリン酸ナトリウム（100μ
）中の10モル過剰のHS−PGA/EDA−Fl（約1.0mg）を活
性化抗体調製物に加えた。室温で穏やかに攪拌しながら
一夜結合反応を行った。この混合物を0.1Mリン酸ナトリ
ウム（pH7.0）中で10mlまで希釈し、50,000MWCO管中で
0.001Mリン酸ナトリウム（pH7.0）に対して透析した
後、凍結乾燥した。乾燥物質を蒸留水（0.25ml）中に溶
解し、A280での最大ピークに対して高速液体クロマトグ
ラフィー（HPLC）分画した。クロマトグラフィーは、バ
イオ−シル（Bio−Sil）TSK250（バイオ−ラド・ラボラ
トリーズ（Bio−Rad Laboratories）、リッチモンド、
カリフォルニア）の300mm×7.5mmカラムを用い、50mM硫
酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、および0.3M NaC
l（1ml/分）で溶出することにより行った。
ウシIgG標準を用いたバイオ−ラドのブラッドフォード
（Bradford）アッセイを用い、最大ピークをタンパク質
含量についてアッセイした。このピークは95.5μg/mlタ
ンパク質を含んでおり、これは5.97×10-7モルタンパク
質（IgGの分子量160,000）と等価であった。UV/VISをス
キャニングし492nmでの吸光度を測定することにより、
このフラクションはまた2.12×10-6モルのフルオレセイ
ンを含有することが決定された。フルオレセインのモル
数をタンパク質のモル数で均等化することにより、抗体
分子当たり3.6個のフルオレセインとなった。このこと
は、PGA分子当たり0.81個のフルオレセインがあること
がわかっているので、各抗体当たり4.4個のPGA分子が結
合しているのと同じことになった。ピークのフラクショ
ンを凍結し、引き続きアッセイに用いた。
（Bradford）アッセイを用い、最大ピークをタンパク質
含量についてアッセイした。このピークは95.5μg/mlタ
ンパク質を含んでおり、これは5.97×10-7モルタンパク
質（IgGの分子量160,000）と等価であった。UV/VISをス
キャニングし492nmでの吸光度を測定することにより、
このフラクションはまた2.12×10-6モルのフルオレセイ
ンを含有することが決定された。フルオレセインのモル
数をタンパク質のモル数で均等化することにより、抗体
分子当たり3.6個のフルオレセインとなった。このこと
は、PGA分子当たり0.81個のフルオレセインがあること
がわかっているので、各抗体当たり4.4個のPGA分子が結
合しているのと同じことになった。ピークのフラクショ
ンを凍結し、引き続きアッセイに用いた。
上記化学において重要なことは、各ポリマー性アニオン
と抗体との間で単一の付着部位しか存在しないことであ
る。これら２分子間での単独の共有結合により、複数の
活性化基を有するポリマー性アニオンを用いた場合には
起こり得る分子間および分子内架橋が回避される。
と抗体との間で単一の付着部位しか存在しないことであ
る。これら２分子間での単独の共有結合により、複数の
活性化基を有するポリマー性アニオンを用いた場合には
起こり得る分子間および分子内架橋が回避される。
上記捕捉試薬の代わりに、カチオン性誘導体化抗体を生
成させてアニオン性固相物質とともに用いることもでき
る。
成させてアニオン性固相物質とともに用いることもでき
る。
（ｂ）固相の調製： 使捨てIMxウエッジの固相ファイバーマトリックスをポ
リマー性第四級化合物でコーティングして固相に正の荷
電を与えた。水溶性セルロース誘導体であるセルコート
Ｌ−200を用いた。セルコートＬ−200の１％水溶液を固
相物質に加え、ついで300mM NaCl、50mMトリスおよび0.
1％NaN3（75μ;pH7.5）を含有する希釈液で洗浄し
た。
リマー性第四級化合物でコーティングして固相に正の荷
電を与えた。水溶性セルロース誘導体であるセルコート
Ｌ−200を用いた。セルコートＬ−200の１％水溶液を固
相物質に加え、ついで300mM NaCl、50mMトリスおよび0.
1％NaN3（75μ;pH7.5）を含有する希釈液で洗浄し
た。
（ｃ）指示試薬の調製： 指示試薬は、アルカリフォスファターゼと抗CEA抗体断
片の結合体からなり、捕捉試薬中の抗体とは異なるエピ
トープに結合する。アルカリフォスファターゼ標識抗CE
A抗体断片は、50mMトリス、50mM NaCl、1.0mM MgCl2、
0.1mM ZnCl2、5.0mM酒石酸ナトリウム、0.5％ウシ皮膚
ゼラチンおよび３％マウス血清を含む緩衝液中に入れて
おいた。
片の結合体からなり、捕捉試薬中の抗体とは異なるエピ
トープに結合する。アルカリフォスファターゼ標識抗CE
A抗体断片は、50mMトリス、50mM NaCl、1.0mM MgCl2、
0.1mM ZnCl2、5.0mM酒石酸ナトリウム、0.5％ウシ皮膚
ゼラチンおよび３％マウス血清を含む緩衝液中に入れて
おいた。
（ｄ）イムノアッセイプロトコール−CEAの決定： 指示試薬（70μ）を反応ウエル中に置いた。ついで、
緩衝液中の捕捉試薬（50mM Na2SO4、20mMリン酸ナトリ
ウムおよび300mM NaClからなる緩衝液（pH6.8）中の抗C
EA/PGA結合体（20μ））をウエルに加えた。CEAを含
有する試料（35μ）をウエルに加え、均一な免疫反応
混合物を34.5℃で20分間インキュベートした。４つの異
なる試料をアッセイにかけたが、各試料はアボット・ラ
ボラトリーズCEA酵素イムノアッセイキットからのCEAカ
リブレーターであった。ついで各反応混合物のアリコー
ト（100μ）をクオート処理固相物質に加え、ついで
希釈液（75μ）で３回洗浄した。最後に酵素基質（70
μ;100mM AMP、1.0mM MgCl2、0.1％NaN3および4.0mM
テトラミソール（tetramisole）の溶液（pH10.3）中の
1.2mM 4−メチルウンベリフェリルホスフェート）を34.
5℃で加えて指示試薬と反応させ、得られた蛍光度（rat
e of fluorescence）を測定した。アッセイの容量−応
答結果を第１表に示す。第１表の結果は、CEA試験試料
の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／分析対象物／
指示試薬複合体の生成も増加し、それゆえ固相に結合し
た検出可能な標識の量も増加することを示している。
緩衝液中の捕捉試薬（50mM Na2SO4、20mMリン酸ナトリ
ウムおよび300mM NaClからなる緩衝液（pH6.8）中の抗C
EA/PGA結合体（20μ））をウエルに加えた。CEAを含
有する試料（35μ）をウエルに加え、均一な免疫反応
混合物を34.5℃で20分間インキュベートした。４つの異
なる試料をアッセイにかけたが、各試料はアボット・ラ
ボラトリーズCEA酵素イムノアッセイキットからのCEAカ
リブレーターであった。ついで各反応混合物のアリコー
ト（100μ）をクオート処理固相物質に加え、ついで
希釈液（75μ）で３回洗浄した。最後に酵素基質（70
μ;100mM AMP、1.0mM MgCl2、0.1％NaN3および4.0mM
テトラミソール（tetramisole）の溶液（pH10.3）中の
1.2mM 4−メチルウンベリフェリルホスフェート）を34.
5℃で加えて指示試薬と反応させ、得られた蛍光度（rat
e of fluorescence）を測定した。アッセイの容量−応
答結果を第１表に示す。第１表の結果は、CEA試験試料
の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／分析対象物／
指示試薬複合体の生成も増加し、それゆえ固相に結合し
た検出可能な標識の量も増加することを示している。
実施例２ （マウス免疫グロブリンの競合抑制アッセイ） （ａ）抗IgG−PGA捕捉試薬の調製： 以下の手順に従い、水溶性カルボジイミド試薬（１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド;EDCl）を用いてプロテインＡアフィニティー精製
マウスモノクローナル免疫グロブリンＧを負に荷電した
PGAに結合させた。
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド;EDCl）を用いてプロテインＡアフィニティー精製
マウスモノクローナル免疫グロブリンＧを負に荷電した
PGAに結合させた。
リン酸緩衝食塩水（PBS;75mM KH2PO4および300mM NaC
l、pH7.2）中の抗体（4.8mg/ml）の氷冷溶液にフルオレ
セイン標識PGA（10mg;Fl−PGA）を加えた。この溶液に
新たに調製したEDCl（100μ;10mg/ml）の氷冷溶液を
加え、得られた反応混合物を絶えず攪拌しながら2.5時
間かけて室温まで温めた。ついで、この反応混合物に急
速に攪拌しながらさらに新たに調製したEDCl（50μ;1
00mg/ml）の氷冷溶液を加えた。反応混合物をさらに1.5
時間攪拌した。ついで、スフェロゲル（Spherogel）TSK
−Ｇガードカラム（2.15cm×7.5cm;ベックマン・インス
ツルメンツ（Beckman Instruments,Inc.,）、フラート
ン、CA、92634）を備えたスフェロゲルTSK−3000SWGカ
ラム（2.15cm×30cm）を用いたゲル濾過カラムクロマト
グラフィーにより、混合物を分画した。カラムをPBSに
より5ml/分の流速で溶出した。抗体のFl−PGA結合体中
の蛍光を定量することにより、これらのプールのPGA/抗
体比を決定した。その結果を第２表に示す。
l、pH7.2）中の抗体（4.8mg/ml）の氷冷溶液にフルオレ
セイン標識PGA（10mg;Fl−PGA）を加えた。この溶液に
新たに調製したEDCl（100μ;10mg/ml）の氷冷溶液を
加え、得られた反応混合物を絶えず攪拌しながら2.5時
間かけて室温まで温めた。ついで、この反応混合物に急
速に攪拌しながらさらに新たに調製したEDCl（50μ;1
00mg/ml）の氷冷溶液を加えた。反応混合物をさらに1.5
時間攪拌した。ついで、スフェロゲル（Spherogel）TSK
−Ｇガードカラム（2.15cm×7.5cm;ベックマン・インス
ツルメンツ（Beckman Instruments,Inc.,）、フラート
ン、CA、92634）を備えたスフェロゲルTSK−3000SWGカ
ラム（2.15cm×30cm）を用いたゲル濾過カラムクロマト
グラフィーにより、混合物を分画した。カラムをPBSに
より5ml/分の流速で溶出した。抗体のFl−PGA結合体中
の蛍光を定量することにより、これらのプールのPGA/抗
体比を決定した。その結果を第２表に示す。
（ｂ）固相の調製： 多孔質の繊維性マトリックス物質をポリマー性第四級ア
ンモニウム化合物（ガフコート755N;GAFコーポレーショ
ン）でコーティングして固相を生成した。0.5％ガフコ
ート水溶液（50μ）をマトリックス物質の表面に適用
し、ついで水（75μ）で洗浄した。
ンモニウム化合物（ガフコート755N;GAFコーポレーショ
ン）でコーティングして固相を生成した。0.5％ガフコ
ート水溶液（50μ）をマトリックス物質の表面に適用
し、ついで水（75μ）で洗浄した。
（ｃ）指示試薬の捕捉試薬への結合： 指示試薬であるヒツジ抗マウス免疫グロブリンのアルカ
リホスファターゼ結合体（ジャクソン・イムノリサーチ
・ラボラトリーズ（Jackson ImmunoResearch Laborator
ies,Inc.）、ウエストグローブ、PA、19390）を、１％
にべを含有するトリス緩衝食塩水［25mMトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンおよび100mM NaCl、pH7.5］
中に希釈した。捕捉試薬であるPGA/マウスモノクローナ
ル抗体結合体（第２表のプールＩ）も同様に処理した。
各試薬（200μ）を一連の試験管に加え、ついで37℃
で30分間インキュベートした。反応混合物のアリコート
（75μ）をクオート処理した固相物質に適用し、直ち
にトリス緩衝食塩水で３回（×150μ）洗浄した。最
後に32.7℃で酵素基質（100mM AMP、1mM MgCl2、0.1％N
aN3および4mMテトラミソールからなる溶液（pH10.3）中
の1.2mM4−メチルウンベリフェリルホスフェート（70μ
））を固相物質に加え、得られた蛍光度を測定した。
この実験の結果は第３表および第４表にまとめてある。
リホスファターゼ結合体（ジャクソン・イムノリサーチ
・ラボラトリーズ（Jackson ImmunoResearch Laborator
ies,Inc.）、ウエストグローブ、PA、19390）を、１％
にべを含有するトリス緩衝食塩水［25mMトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンおよび100mM NaCl、pH7.5］
中に希釈した。捕捉試薬であるPGA/マウスモノクローナ
ル抗体結合体（第２表のプールＩ）も同様に処理した。
各試薬（200μ）を一連の試験管に加え、ついで37℃
で30分間インキュベートした。反応混合物のアリコート
（75μ）をクオート処理した固相物質に適用し、直ち
にトリス緩衝食塩水で３回（×150μ）洗浄した。最
後に32.7℃で酵素基質（100mM AMP、1mM MgCl2、0.1％N
aN3および4mMテトラミソールからなる溶液（pH10.3）中
の1.2mM4−メチルウンベリフェリルホスフェート（70μ
））を固相物質に加え、得られた蛍光度を測定した。
この実験の結果は第３表および第４表にまとめてある。
（ｄ）マウスIgGの競合抑制アッセイ 捕捉試薬および指示試薬を上記のようにして調製した。
いずれの試薬も、１％にべを含有するトリス緩衝食塩水
中に希釈した。指示試薬をストック溶液から1000倍に希
釈し、捕捉試薬を10μg/mlに希釈した。一連の試験管中
で、適当に希釈した指示試薬、捕捉試薬およびマウスモ
ノクローナル抗体各150μを混合した。混合物を37℃
で30分間インキュベートした。混合物のアリコート（75
μ）をクオート処理した固相物質に適用し、直ちにト
リス緩衝食塩水で３回（×150μ）洗浄した。つい
で、32.7℃で酵素基質（100mM AMP、1mM MgCl2、0.1％N
aN3および4.0mMテトラミソールからなる溶液（pH10.3）
中の1.2mM4−メチルウンベリフェリルホスフェート（70
μ））を固相に加え、得られた蛍光度を測定した。マ
ウスIgGの競合抑制アッセイを示すこの実施例の結果
は、第５表に示してある。第５表の結果は、マウスモノ
クローナル抗体の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬
／指示試薬複合体の生成は減少し、それゆえ固相に結合
した検出可能な標識の量も減少することを示している。
いずれの試薬も、１％にべを含有するトリス緩衝食塩水
中に希釈した。指示試薬をストック溶液から1000倍に希
釈し、捕捉試薬を10μg/mlに希釈した。一連の試験管中
で、適当に希釈した指示試薬、捕捉試薬およびマウスモ
ノクローナル抗体各150μを混合した。混合物を37℃
で30分間インキュベートした。混合物のアリコート（75
μ）をクオート処理した固相物質に適用し、直ちにト
リス緩衝食塩水で３回（×150μ）洗浄した。つい
で、32.7℃で酵素基質（100mM AMP、1mM MgCl2、0.1％N
aN3および4.0mMテトラミソールからなる溶液（pH10.3）
中の1.2mM4−メチルウンベリフェリルホスフェート（70
μ））を固相に加え、得られた蛍光度を測定した。マ
ウスIgGの競合抑制アッセイを示すこの実施例の結果
は、第５表に示してある。第５表の結果は、マウスモノ
クローナル抗体の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬
／指示試薬複合体の生成は減少し、それゆえ固相に結合
した検出可能な標識の量も減少することを示している。
実施例３ （ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（hCG）のサンドイッ
チアッセイ） （ａ）捕捉試薬の調製： 以下の手順に従い、高度に負に荷電したアルブミン誘導
体を調製し、抗hCG抗体に結合させて捕捉試薬を生成さ
せた。
チアッセイ） （ａ）捕捉試薬の調製： 以下の手順に従い、高度に負に荷電したアルブミン誘導
体を調製し、抗hCG抗体に結合させて捕捉試薬を生成さ
せた。
［ウサギ血清アルブミンの修飾による負に荷電したタン
パク質誘導体の調製］ ジョウ（Jou）らの手順（Methods in Enzymology:Vol.9
2、Part E;257〜276、アカデミックプレス、1983）によ
り、ウサギ血清アルブミン（RSA）を充分にスクシニル
化し、パラ−アゾベンゼンスルホネートに結合した。リ
ン酸緩衝食塩水（PBS、14ml、pH8.0）中の２％RSAを、
パラ−ジオキサン（2.28ml）中の５％無水コハク酸と混
合した。1.0N NaOHを加えることによりpHを８に維持し
た。反応混合物を室温で30分間攪拌した。ヒドロキシル
アミン塩酸塩（0.6g）を加え、適量の5N NaOHを加える
ことにより溶液のpHを9.5に調節した。ついで混合物を
水に対して透析した。生成したSUC65−RSAを、以下の反
応に従ってパラ−アゾベンゼンスルホネートに結合し
た。
パク質誘導体の調製］ ジョウ（Jou）らの手順（Methods in Enzymology:Vol.9
2、Part E;257〜276、アカデミックプレス、1983）によ
り、ウサギ血清アルブミン（RSA）を充分にスクシニル
化し、パラ−アゾベンゼンスルホネートに結合した。リ
ン酸緩衝食塩水（PBS、14ml、pH8.0）中の２％RSAを、
パラ−ジオキサン（2.28ml）中の５％無水コハク酸と混
合した。1.0N NaOHを加えることによりpHを８に維持し
た。反応混合物を室温で30分間攪拌した。ヒドロキシル
アミン塩酸塩（0.6g）を加え、適量の5N NaOHを加える
ことにより溶液のpHを9.5に調節した。ついで混合物を
水に対して透析した。生成したSUC65−RSAを、以下の反
応に従ってパラ−アゾベンゼンスルホネートに結合し
た。
1N HCl（0.8ml）中のパラ−アゾベンゼンスルホン酸
（0.15ミリモル、26mg）の懸濁液を氷浴中で冷却し、急
速に攪拌しながら1N NaNO2（0.2ml）で30分間処理し
た。得られたジアゾニウム塩溶液を、急速に攪拌しなが
ら氷冷SUC65−RSA溶液に滴下した。反応混合物をpHは、
1.0N NaOHを加えることにより11に維持した。暗赤色の
反応混合物を攪拌し、静置して１時間かけて室温まで温
めた後、水に対して充分に透析した。得られたSp−SUC
65−RSAアニオン性誘導化タンパク質を、使用するとき
まで冷凍しておいた。
（0.15ミリモル、26mg）の懸濁液を氷浴中で冷却し、急
速に攪拌しながら1N NaNO2（0.2ml）で30分間処理し
た。得られたジアゾニウム塩溶液を、急速に攪拌しなが
ら氷冷SUC65−RSA溶液に滴下した。反応混合物をpHは、
1.0N NaOHを加えることにより11に維持した。暗赤色の
反応混合物を攪拌し、静置して１時間かけて室温まで温
めた後、水に対して充分に透析した。得られたSp−SUC
65−RSAアニオン性誘導化タンパク質を、使用するとき
まで冷凍しておいた。
［抗hCG F（ab′）２断片の調製］ ニソノフ（Nisonoff）らの方法（Arch.Biochem.Bioph
y.:89;230〜244、1960）に従い、アフィニティー精製ヤ
ギ抗hCG抗体から抗hCG F（ab′）２断片を調製した。酢
酸を加えることにより、リン酸緩衝食塩水（pH7.2）中
のアフィニティー精製抗体溶液の一部をpH4の酸性にし
た。この時点での抗体の好ましい濃度は1mg/mlであっ
た。ペプシンを最終濃度20μg/mlまで加えた。反応混合
物を37℃で一夜インキュベートした。6.0N NaOHを加え
て反応混合物のpHを7.5までもっていくことにより反応
を停止させた。消化した抗体断片の溶液を20mg/mlまで
濃縮した。Ｆ（ab′）２断片の精製は、スフェロゲルTS
K−Ｇガードカラム（2.15cm×7.5cm）を備えたスフェロ
ゲルTSK−3000SWGカラム（2.15cm×30cm）を用いたゲル
濾過高速液体クロマトグラフィーにより行った。
y.:89;230〜244、1960）に従い、アフィニティー精製ヤ
ギ抗hCG抗体から抗hCG F（ab′）２断片を調製した。酢
酸を加えることにより、リン酸緩衝食塩水（pH7.2）中
のアフィニティー精製抗体溶液の一部をpH4の酸性にし
た。この時点での抗体の好ましい濃度は1mg/mlであっ
た。ペプシンを最終濃度20μg/mlまで加えた。反応混合
物を37℃で一夜インキュベートした。6.0N NaOHを加え
て反応混合物のpHを7.5までもっていくことにより反応
を停止させた。消化した抗体断片の溶液を20mg/mlまで
濃縮した。Ｆ（ab′）２断片の精製は、スフェロゲルTS
K−Ｇガードカラム（2.15cm×7.5cm）を備えたスフェロ
ゲルTSK−3000SWGカラム（2.15cm×30cm）を用いたゲル
濾過高速液体クロマトグラフィーにより行った。
［抗hCG TNB−Fab′断片の調製］ パーハム（Parham）らの方法（J.Immunol.Method.:53:1
33〜173、1982）およびブレナン（Brennan）らの方法
（Science:229:81〜83、1985）の変法により、抗hCG Fa
b′断片をチオール反応性形に調製・誘導体化した。攪
拌しながら、20mM EDTAを含有する0.1M NaAsO2の溶液
（158μ）を、PBS中に痕跡量の125I−Ｆ（ab′）２を
含有するヤギＦ（ab′）２（ヤギ抗ヒト絨毛性生殖腺刺
激ホルモン抗体断片、16mg/ml）（1.28ml）に加えた。
0.1Mシステイン−HCl（158μ）を加えることにより、
還元的開裂反応を開始させた。反応混合物を窒素雰囲気
下に置き、37℃で攪拌しながら１時間インキュベートし
た。ついで、5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香
酸）（19mg）を加えることにより反応を停止させた。室
温で一夜攪拌した後、前以てPBSで平衡化しておいたPD
−10カラム（ファルマシア（Pharmacia Inc.,）ピスカ
タウエイ、NJ）上のクロマトグラフィーに混合物をか
け、ついでサイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ス
フェロゲルTSK−Ｇガードカラム（2.15cm×7.5cm）を備
えたスフェロゲルTSK−2000SWGカラム（2.15cm×30c
m）］にかけた。精製したFab′のチオニトロベンゾエー
ト誘導体（TNB−Fab′）を、CX−10限外濾過ユニット
（ミリポア・コーポレーション（Millipore Corp.,）、
ベッドフォード、MA）を用いて7.9mg/mlまで濃縮した。
33〜173、1982）およびブレナン（Brennan）らの方法
（Science:229:81〜83、1985）の変法により、抗hCG Fa
b′断片をチオール反応性形に調製・誘導体化した。攪
拌しながら、20mM EDTAを含有する0.1M NaAsO2の溶液
（158μ）を、PBS中に痕跡量の125I−Ｆ（ab′）２を
含有するヤギＦ（ab′）２（ヤギ抗ヒト絨毛性生殖腺刺
激ホルモン抗体断片、16mg/ml）（1.28ml）に加えた。
0.1Mシステイン−HCl（158μ）を加えることにより、
還元的開裂反応を開始させた。反応混合物を窒素雰囲気
下に置き、37℃で攪拌しながら１時間インキュベートし
た。ついで、5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香
酸）（19mg）を加えることにより反応を停止させた。室
温で一夜攪拌した後、前以てPBSで平衡化しておいたPD
−10カラム（ファルマシア（Pharmacia Inc.,）ピスカ
タウエイ、NJ）上のクロマトグラフィーに混合物をか
け、ついでサイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ス
フェロゲルTSK−Ｇガードカラム（2.15cm×7.5cm）を備
えたスフェロゲルTSK−2000SWGカラム（2.15cm×30c
m）］にかけた。精製したFab′のチオニトロベンゾエー
ト誘導体（TNB−Fab′）を、CX−10限外濾過ユニット
（ミリポア・コーポレーション（Millipore Corp.,）、
ベッドフォード、MA）を用いて7.9mg/mlまで濃縮した。
［抗hCG TNB−Fab′断片のSp−SUC65−RSAへの結合］ 1Mジチオスレイトール（DTT:86μ）の溶液を、37.5mM
リン酸ナトリウム、150mM NaClおよび2.0mM EDTA（pH6.
8）中にSp−SUC65−RSA（2.2mg/ml）を含有する溶液
（4.2ml）に加えた。混合物を37℃で３時間インキュベ
ートし、ついで室温で一夜インキュベートした。得られ
た反応混合物を、セファデックスＧ−25（ファルマシ
ア）を充填し75mMリン酸ナトリウム、300mM NaClおよび
2.0mM EDTA（pH6.8）で前以て平衡化した2.5cm×20cmカ
ラム上でのクロマトグラフィーにかけた。還元Sp−SUC
65−RSA（0.48mg/ml）のプールしたフラクションの2ml
部分を抗hCG TNB−Fab′（0.15ml;7.9mg/ml）と混合し
た。反応混合物を室温で一夜攪拌した。ついで反応混合
物を100mMヨード酢酸（107μ）で処理し、室温で１時
間攪拌した。Fab′−Sp−SUC65RSA結合体の精製は、ス
フェロゲルTSK−Ｇガードカラム（2.15cm×7.5cm）を備
えたスフェロゲルTSK−3000SWGカラム（2.15cm×30cm）
を用いたサイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより
行った。
リン酸ナトリウム、150mM NaClおよび2.0mM EDTA（pH6.
8）中にSp−SUC65−RSA（2.2mg/ml）を含有する溶液
（4.2ml）に加えた。混合物を37℃で３時間インキュベ
ートし、ついで室温で一夜インキュベートした。得られ
た反応混合物を、セファデックスＧ−25（ファルマシ
ア）を充填し75mMリン酸ナトリウム、300mM NaClおよび
2.0mM EDTA（pH6.8）で前以て平衡化した2.5cm×20cmカ
ラム上でのクロマトグラフィーにかけた。還元Sp−SUC
65−RSA（0.48mg/ml）のプールしたフラクションの2ml
部分を抗hCG TNB−Fab′（0.15ml;7.9mg/ml）と混合し
た。反応混合物を室温で一夜攪拌した。ついで反応混合
物を100mMヨード酢酸（107μ）で処理し、室温で１時
間攪拌した。Fab′−Sp−SUC65RSA結合体の精製は、ス
フェロゲルTSK−Ｇガードカラム（2.15cm×7.5cm）を備
えたスフェロゲルTSK−3000SWGカラム（2.15cm×30cm）
を用いたサイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより
行った。
［抗hCG抗体のSp−SUC65RSAへの結合］ N,N−ジメチルホルムアミド中の30mMスクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−
カルボキシレートの溶液（27μ）を、PBS中のアフィ
ニティー精製ヤギ抗hCG抗体（3mg/ml）（2.25ml）に加
えた。得られた反応混合物を室温で１時間攪拌し、つい
で75mMリン酸ナトリウム、300mM NaClおよび2.0mM EDTA
（pH6.8）で前以て平衡化したPD−10カラム上のクロマ
トグラフィーにかけた。修飾抗体（1.6mg/ml）のプール
したフラクションの1.8ml部分を、DTT還元Sp−SUC65−R
SA（0.48mg/ml）（3ml）と混合した。室温で一夜攪拌し
た後、100mMヨード酢酸（0.25ml）を加え室温で１時間
攪拌することにより反応を停止させた。抗体−Sp−SUC
65−RSA結合体の精製は、上記と同様にしてサイズ排除
高速液体クロマトグラフィーにより行った。
４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−
カルボキシレートの溶液（27μ）を、PBS中のアフィ
ニティー精製ヤギ抗hCG抗体（3mg/ml）（2.25ml）に加
えた。得られた反応混合物を室温で１時間攪拌し、つい
で75mMリン酸ナトリウム、300mM NaClおよび2.0mM EDTA
（pH6.8）で前以て平衡化したPD−10カラム上のクロマ
トグラフィーにかけた。修飾抗体（1.6mg/ml）のプール
したフラクションの1.8ml部分を、DTT還元Sp−SUC65−R
SA（0.48mg/ml）（3ml）と混合した。室温で一夜攪拌し
た後、100mMヨード酢酸（0.25ml）を加え室温で１時間
攪拌することにより反応を停止させた。抗体−Sp−SUC
65−RSA結合体の精製は、上記と同様にしてサイズ排除
高速液体クロマトグラフィーにより行った。
（ｂ）指示試薬の調製： 指示試薬は、25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン、100mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、0.07％Na
N3および１％にべを含有するアッセイ緩衝液（pH7.5）
中のアルカリホスファターゼ−ヤギ抗hCG抗体結合体
（抗hCG抗体を過ヨウ素活性化アルカリホスファターゼ
に結合させることにより調製）からなっていた。
タン、100mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、0.07％Na
N3および１％にべを含有するアッセイ緩衝液（pH7.5）
中のアルカリホスファターゼ−ヤギ抗hCG抗体結合体
（抗hCG抗体を過ヨウ素活性化アルカリホスファターゼ
に結合させることにより調製）からなっていた。
（ｃ）hCGのサンドイッチイムノアッセイプロトコー
ル： イオン捕捉イムノアッセイプロトコールには、実質的に
実施例２に記載した方法に従って調製した固相、指示試
薬（アルカリホスファターゼ−ヤギ抗hCG抗体結合
体）、上記実施例３の工程（ａ）で調製されたような２
つの異なる捕捉試薬（ヤギ抗hCG Fab′−Sp−SUC65−RS
Aおよびヤギ抗hCG IgG−Sp−SUC65−RSA）のうちの一
方、および精製hCG標準溶液を使用することが含まれて
いた。すべての試薬をアッセイ希釈液中で適当に希釈し
た（滴定曲線により決定されるように）。等容量（750
μ）の指示試薬およびhCG試料溶液を一連の試験管中
に入れた。37℃で30分間インキュベートした後、各イン
キュベート混合物の125μアリコートを別の試験管中
で等容量の捕捉試薬と混合した。得られた混合物を30分
間インキュベートした。ついで、アッセイ混合物（75μ
）を各固相に加えた。ついで固相物質を洗浄緩衝液
［25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、100m
M NaCl、1.0mM MgCl2、0.1mM ZnCl2および0.07％NaN3、
pH7.5］（150μ）で３回洗浄した。ついで酵素基質
（100mM AMP、1.0mM MgCl2、0.1％NaN3および4.0mMテト
ラミソールの溶液（pH10.3）中の1.2mM4−メチルウンベ
リフェリルホスフェート（70μ））を固相物質に加え
た。得られた蛍光度を32.7℃で測定した。この実験の結
果は、第６表にまとめてある。第６表の結果は、hCG試
験試料の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／分析対
象物／指示試薬複合体の生成も増加し、それゆえ固相に
結合した検出可能な標識の量も増加することを示してい
る。
ル： イオン捕捉イムノアッセイプロトコールには、実質的に
実施例２に記載した方法に従って調製した固相、指示試
薬（アルカリホスファターゼ−ヤギ抗hCG抗体結合
体）、上記実施例３の工程（ａ）で調製されたような２
つの異なる捕捉試薬（ヤギ抗hCG Fab′−Sp−SUC65−RS
Aおよびヤギ抗hCG IgG−Sp−SUC65−RSA）のうちの一
方、および精製hCG標準溶液を使用することが含まれて
いた。すべての試薬をアッセイ希釈液中で適当に希釈し
た（滴定曲線により決定されるように）。等容量（750
μ）の指示試薬およびhCG試料溶液を一連の試験管中
に入れた。37℃で30分間インキュベートした後、各イン
キュベート混合物の125μアリコートを別の試験管中
で等容量の捕捉試薬と混合した。得られた混合物を30分
間インキュベートした。ついで、アッセイ混合物（75μ
）を各固相に加えた。ついで固相物質を洗浄緩衝液
［25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、100m
M NaCl、1.0mM MgCl2、0.1mM ZnCl2および0.07％NaN3、
pH7.5］（150μ）で３回洗浄した。ついで酵素基質
（100mM AMP、1.0mM MgCl2、0.1％NaN3および4.0mMテト
ラミソールの溶液（pH10.3）中の1.2mM4−メチルウンベ
リフェリルホスフェート（70μ））を固相物質に加え
た。得られた蛍光度を32.7℃で測定した。この実験の結
果は、第６表にまとめてある。第６表の結果は、hCG試
験試料の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／分析対
象物／指示試薬複合体の生成も増加し、それゆえ固相に
結合した検出可能な標識の量も増加することを示してい
る。
実施例４ （hCGの間接サンドイッチイオン捕捉イムノアッセイ） 間接イオン捕捉イムノアッセイには、実質的に実施例２
に記載したようにして調製した固相、指示試薬としてア
ルカリホスファターゼ−ヒツジ抗マウスIgG結合体（ジ
ャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ）、捕捉試
薬として実施例３で調製したようなヤギ抗hCG F（a
b′）２−SP−SUC65−RSA、マウスモノクローナル抗hCG
抗体の補助特異的結合成分［イムノサーチ（Immuno Sea
rch）、トマスリバー、NJ］および精製hCG標準溶液を使
用することが含まれていた。補助特異的結合成分は、分
析対象物および指示試薬と結合させるために用いた。す
べての試薬をアッセイ緩衝液中で適当に希釈した。等量
（150μ）の指示試薬、hCG試料溶液および補助特異的
結合成分を一連の試験管中に入れた。37℃で５分間イン
キュベートした後、捕捉試薬の150μ部分を各試験管
に加えた。得られた混合物を５分間インキュベートし
た。ついで、アッセイ混合物（200μ）を各調製固相
物質に加えた。ついで上記実施例３と同様にして、固相
物質を洗浄緩衝液で洗浄し、酵素基質溶液で処理した。
得られた蛍光度を32.7℃で測定した。このアッセイの結
果を第７表にまとめて示す。アッセイの結果は、hCG試
験試料の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／分析対
象物／補助特異的結合成分／指示試薬複合体の生成も増
加し、それゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も増
加することを示している。
に記載したようにして調製した固相、指示試薬としてア
ルカリホスファターゼ−ヒツジ抗マウスIgG結合体（ジ
ャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ）、捕捉試
薬として実施例３で調製したようなヤギ抗hCG F（a
b′）２−SP−SUC65−RSA、マウスモノクローナル抗hCG
抗体の補助特異的結合成分［イムノサーチ（Immuno Sea
rch）、トマスリバー、NJ］および精製hCG標準溶液を使
用することが含まれていた。補助特異的結合成分は、分
析対象物および指示試薬と結合させるために用いた。す
べての試薬をアッセイ緩衝液中で適当に希釈した。等量
（150μ）の指示試薬、hCG試料溶液および補助特異的
結合成分を一連の試験管中に入れた。37℃で５分間イン
キュベートした後、捕捉試薬の150μ部分を各試験管
に加えた。得られた混合物を５分間インキュベートし
た。ついで、アッセイ混合物（200μ）を各調製固相
物質に加えた。ついで上記実施例３と同様にして、固相
物質を洗浄緩衝液で洗浄し、酵素基質溶液で処理した。
得られた蛍光度を32.7℃で測定した。このアッセイの結
果を第７表にまとめて示す。アッセイの結果は、hCG試
験試料の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／分析対
象物／補助特異的結合成分／指示試薬複合体の生成も増
加し、それゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も増
加することを示している。
実施例５ （２つの補助特異的結合成分を用いたhCGの間接サンド
イッチイオン捕捉イムノアッセイ） 本実施例のイオン捕捉イムノアッセイプロトコールに
は、実質的に実施例２に記載した方法に従って調製した
固相、指示試薬としてアルカリホスファターゼ−ヒツジ
抗マウスIgG結合体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラ
ボラトリーズ）、マウスモノクローナル抗hCG抗体の補
助特異的結合成分［イムノサーチ、トマスリバー、NJ］
および精製hCG標準溶液を使用することが含まれてい
た。このプロトコールにはさらに、アフィニティー精製
ヤギ抗hCG抗体の第二の補助特異的結合成分、および捕
捉試薬としてウサギ抗ヤギIgG−SP−SUC65−RSAを使用
することが含まれていた。捕捉試薬の調製は、上記実施
例３に記載した手順に従い、アフィニティー精製ウサギ
抗ヤギIgG（カッペル（Cappel）；コクランビル、PA、1
9330）をSP−SUC65−RSAに結合させることにより行っ
た。すべての試薬をアッセイ緩衝液中で適当に希釈し
た。等量（100μ）の指示試薬、hCG試料溶液および第
一の補助特異的結合成分を一連の試験管中に入れた。イ
ンキュベート（37℃で10分間）後、第二の補助特異的結
合成分（100μ）を加え、インキュベートをさらに続
けた（37℃でさらに５分間）。最後に捕捉試薬（100μ
）を各試験管に加えた。得られた混合物を５分間イン
キュベートした。ついで、アッセイ混合物（200μ）
を各調製固相物質に加えた。ついで上記実施例３と同様
にして、固相物質を洗浄緩衝液で洗浄し、酵素基質溶液
で処理し、蛍光度を測定した。このアッセイの結果を第
８表にまとめて示す。アッセイの結果は、hCG試験試料
の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／補助特異的結
合成分／分析対象物／補助特異的結合成分／指示試薬複
合体の生成も増加し、それゆえ固相に結合した検出可能
な標識の量も増加することを示している。
イッチイオン捕捉イムノアッセイ） 本実施例のイオン捕捉イムノアッセイプロトコールに
は、実質的に実施例２に記載した方法に従って調製した
固相、指示試薬としてアルカリホスファターゼ−ヒツジ
抗マウスIgG結合体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラ
ボラトリーズ）、マウスモノクローナル抗hCG抗体の補
助特異的結合成分［イムノサーチ、トマスリバー、NJ］
および精製hCG標準溶液を使用することが含まれてい
た。このプロトコールにはさらに、アフィニティー精製
ヤギ抗hCG抗体の第二の補助特異的結合成分、および捕
捉試薬としてウサギ抗ヤギIgG−SP−SUC65−RSAを使用
することが含まれていた。捕捉試薬の調製は、上記実施
例３に記載した手順に従い、アフィニティー精製ウサギ
抗ヤギIgG（カッペル（Cappel）；コクランビル、PA、1
9330）をSP−SUC65−RSAに結合させることにより行っ
た。すべての試薬をアッセイ緩衝液中で適当に希釈し
た。等量（100μ）の指示試薬、hCG試料溶液および第
一の補助特異的結合成分を一連の試験管中に入れた。イ
ンキュベート（37℃で10分間）後、第二の補助特異的結
合成分（100μ）を加え、インキュベートをさらに続
けた（37℃でさらに５分間）。最後に捕捉試薬（100μ
）を各試験管に加えた。得られた混合物を５分間イン
キュベートした。ついで、アッセイ混合物（200μ）
を各調製固相物質に加えた。ついで上記実施例３と同様
にして、固相物質を洗浄緩衝液で洗浄し、酵素基質溶液
で処理し、蛍光度を測定した。このアッセイの結果を第
８表にまとめて示す。アッセイの結果は、hCG試験試料
の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／補助特異的結
合成分／分析対象物／補助特異的結合成分／指示試薬複
合体の生成も増加し、それゆえ固相に結合した検出可能
な標識の量も増加することを示している。
実施例６ （抗プロゲステロン抗体の間接イオン捕捉イムノアッセ
イ） （ａ）PGA標識ヤギ抗マウス捕捉試薬の調製： 下記工程手順は、抗体／ポリグルタミン酸結合体の調製
のためのものである。
イ） （ａ）PGA標識ヤギ抗マウス捕捉試薬の調製： 下記工程手順は、抗体／ポリグルタミン酸結合体の調製
のためのものである。
［PGAナトリウム塩の遊離の酸への変換］ PGAのナトリウム塩（200mg;1.47×10-5モル；平均分子
量13,600;シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイ
ス、MO）を水（60ml）中で陽イオン交換樹脂（AG50W−X
8;13g;バイオ−ラド、リッチモンド、CA）とともに３時
間攪拌した。上清をデカントし、濾過し、蒸発させてPG
Aの遊離の酸を白色粉末として80％の収率で得た（137m
g;平均分子量11,620）。
量13,600;シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイ
ス、MO）を水（60ml）中で陽イオン交換樹脂（AG50W−X
8;13g;バイオ−ラド、リッチモンド、CA）とともに３時
間攪拌した。上清をデカントし、濾過し、蒸発させてPG
Aの遊離の酸を白色粉末として80％の収率で得た（137m
g;平均分子量11,620）。
［イソチオシアネート−PGA（ITC−PGA）の調製］ ジメチルホルムアミド（DMF;2ml）中のPGAの遊離酸（65
mg;5.6×10-6モル）の溶液に、トリエチルアミン（100
μ;7.2×10-4モル）および1,4−フェニレンジイソチ
オシアネート（110mg;5.7×10-4モル；アルドリッチ・
ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company）、
（ミルウォーキー、WI）を加えた。室温で一夜攪拌した
後、酢酸（100μ;1.7×10-3モル）を加えついで反応
混合物を蒸発させた。残渣に塩化メチレン（25ml）を加
え、２時間攪拌した後、混合物を濾過してITC−PGAを白
色粉末（101mg）として得た。
mg;5.6×10-6モル）の溶液に、トリエチルアミン（100
μ;7.2×10-4モル）および1,4−フェニレンジイソチ
オシアネート（110mg;5.7×10-4モル；アルドリッチ・
ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company）、
（ミルウォーキー、WI）を加えた。室温で一夜攪拌した
後、酢酸（100μ;1.7×10-3モル）を加えついで反応
混合物を蒸発させた。残渣に塩化メチレン（25ml）を加
え、２時間攪拌した後、混合物を濾過してITC−PGAを白
色粉末（101mg）として得た。
上記ITC−PGA（295μg;2.5×10-8モル;20％DMF/0.1Mリ
ン酸ナトリウム（pH7.0、40μ）中）を、ヤギ抗マウ
スIgGの緩衝溶液（200μg;1.25×10-9モル；シグマ・ケ
ミカル・カンパニー;0.1Mリン酸ナトリウム（pH7、40μ
）中）に加えてPGA標識ヤギ抗マウス捕捉試薬を調製
した。室温で２日間攪拌した後、0.1Mトリス（20μ;p
H7.4）を加え、得られた混合物を使用するときまで２〜
８℃で貯蔵した。
ン酸ナトリウム（pH7.0、40μ）中）を、ヤギ抗マウ
スIgGの緩衝溶液（200μg;1.25×10-9モル；シグマ・ケ
ミカル・カンパニー;0.1Mリン酸ナトリウム（pH7、40μ
）中）に加えてPGA標識ヤギ抗マウス捕捉試薬を調製
した。室温で２日間攪拌した後、0.1Mトリス（20μ;p
H7.4）を加え、得られた混合物を使用するときまで２〜
８℃で貯蔵した。
（ｂ）抗プロゲステロン抗体の間接イムノアッセイ： 抗プロゲステロン抗体イオン捕捉イムノアッセイには、
実施例１に記載したようなポリマー性の第四級化合物で
コーティングした固相物質を使用することが含まれてい
た。試料（60μ）を反応ウエルに加えた。試料は、リ
ン酸緩衝食塩水（PBS;50mMリン酸ナトリウム、99mM NaC
l、0.1％NaN3、pH7.4）中で０、５、50、100、250およ
び500ng/mlの濃度のモノクローナル抗プロゲステロン抗
体からなっていた。つぎにPBS（20μ）を反応ウエル
に加え、ついで指示試薬緩衝液（20μ）としてアルカ
リホスファターゼ標識プロゲステロン（50mMトリス、pH
7.4、150mM NaCl、１％NaN3、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2
および１％BSAからなるトリス緩衝液中に３μg/ml）を
加えた。混合物を34.5℃で10分間インキュベートした
後、捕捉試薬を加えた（20μ；上記保存溶液であるPB
S中に1/100倍希釈したPGA標識ヤギ抗マウス抗体）。つ
いで混合物を34.5℃でさらに10分間インキュベートし
た。ついで混合物の100μアリコートを固相物質に加
え、希釈液で３回（×75μ）洗浄した。最後に酵素基
質溶液（70μ;100mM AMP、1mM MgCl2、0.1％NaN3およ
び4.0mMテトラミソールからなる溶液（pH10.3）中の1.2
mM 4−メチルウンベリフェリルホスフェート）を固相に
加え、蛍光度を測定した。アッセイの結果を第９表にま
とめて示す。アッセイの結果は、抗プロゲステロン抗体
試験試料の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／分析
対象物／指示試薬複合体の生成も増加し、それゆえ固相
に結合した検出可能な標識の量も増加することを示して
いる。
実施例１に記載したようなポリマー性の第四級化合物で
コーティングした固相物質を使用することが含まれてい
た。試料（60μ）を反応ウエルに加えた。試料は、リ
ン酸緩衝食塩水（PBS;50mMリン酸ナトリウム、99mM NaC
l、0.1％NaN3、pH7.4）中で０、５、50、100、250およ
び500ng/mlの濃度のモノクローナル抗プロゲステロン抗
体からなっていた。つぎにPBS（20μ）を反応ウエル
に加え、ついで指示試薬緩衝液（20μ）としてアルカ
リホスファターゼ標識プロゲステロン（50mMトリス、pH
7.4、150mM NaCl、１％NaN3、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2
および１％BSAからなるトリス緩衝液中に３μg/ml）を
加えた。混合物を34.5℃で10分間インキュベートした
後、捕捉試薬を加えた（20μ；上記保存溶液であるPB
S中に1/100倍希釈したPGA標識ヤギ抗マウス抗体）。つ
いで混合物を34.5℃でさらに10分間インキュベートし
た。ついで混合物の100μアリコートを固相物質に加
え、希釈液で３回（×75μ）洗浄した。最後に酵素基
質溶液（70μ;100mM AMP、1mM MgCl2、0.1％NaN3およ
び4.0mMテトラミソールからなる溶液（pH10.3）中の1.2
mM 4−メチルウンベリフェリルホスフェート）を固相に
加え、蛍光度を測定した。アッセイの結果を第９表にま
とめて示す。アッセイの結果は、抗プロゲステロン抗体
試験試料の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／分析
対象物／指示試薬複合体の生成も増加し、それゆえ固相
に結合した検出可能な標識の量も増加することを示して
いる。
実施例７ （プロゲステロンの間接競合イオン捕捉イムノアッセ
イ） 実質的に実施例１に記載した方法に従って固相を調製し
た。PBS中の種々の濃度のプロゲステロンの試料（60μ
）をプロゲステロン標識アルカリホスファターゼ指示
試薬（実施例４のトリス緩衝液中、0.4μg/ml、20μ
）、および補助特異的結合成分としてのマウス抗プロ
ゲステロン抗体（PBS中に0.3μg/ml、20μ）と混合し
た。混合物を34.5℃で10分間インキュベートした後、PG
A標識ヤギ抗マウス抗体捕捉試薬を上記実施例６に記載
のようにして加えた。得られた混合物を34.5℃でさらに
10分間インキュベートした。ついで混合物の100μア
リコートを固相物質に加え、ついで希釈液で３回洗浄し
た。最後に酵素基質溶液（70μ;100mM AMP、1mM MgCl
2、0.1％NaN3および4.0mMテトラミソールからなる溶液
（pH10.3）中の1.2mM 4−メチルウンベリフェリルホス
フェート）を固相に加え、蛍光度を測定した。このアッ
セイの結果を第10表に示す。アッセイの結果は、プロゲ
ステロン試験試料の濃度が増加するのに対応して捕捉試
薬／補助特異的結合成分／指示試薬複合体の生成は減少
し、それゆえ固相に結合した検出可能の標識の量も減少
することを示している。
イ） 実質的に実施例１に記載した方法に従って固相を調製し
た。PBS中の種々の濃度のプロゲステロンの試料（60μ
）をプロゲステロン標識アルカリホスファターゼ指示
試薬（実施例４のトリス緩衝液中、0.4μg/ml、20μ
）、および補助特異的結合成分としてのマウス抗プロ
ゲステロン抗体（PBS中に0.3μg/ml、20μ）と混合し
た。混合物を34.5℃で10分間インキュベートした後、PG
A標識ヤギ抗マウス抗体捕捉試薬を上記実施例６に記載
のようにして加えた。得られた混合物を34.5℃でさらに
10分間インキュベートした。ついで混合物の100μア
リコートを固相物質に加え、ついで希釈液で３回洗浄し
た。最後に酵素基質溶液（70μ;100mM AMP、1mM MgCl
2、0.1％NaN3および4.0mMテトラミソールからなる溶液
（pH10.3）中の1.2mM 4−メチルウンベリフェリルホス
フェート）を固相に加え、蛍光度を測定した。このアッ
セイの結果を第10表に示す。アッセイの結果は、プロゲ
ステロン試験試料の濃度が増加するのに対応して捕捉試
薬／補助特異的結合成分／指示試薬複合体の生成は減少
し、それゆえ固相に結合した検出可能の標識の量も減少
することを示している。
実施例８ （アニオン性捕捉試薬の生成のためのポリ−Ｌ−グルタ
ミン酸の活性化） 下記工程手順は、負に荷電した捕捉試薬を生成させるた
めのタンパク質−PGA結合体のバルク調製のためのもの
である。
ミン酸の活性化） 下記工程手順は、負に荷電した捕捉試薬を生成させるた
めのタンパク質−PGA結合体のバルク調製のためのもの
である。
（ａ）PGA−ナトリウム塩の遊離酸への変換： PGAのナトリウム塩（100mg;7.35×10-6モル；平均分子
量13,600;シグマ）をＨ型の陽イオン交換樹脂（50当量
／グルタメート残基;AG50W−X8;バイオ−ラド）ととも
に一夜攪拌した。樹脂は前以て膨潤させ、蒸留水中で洗
浄し、最後に蒸留水（20ml/7gビーズ乾燥重量）中に再
懸濁した。上清を除き、凍結乾燥してPGAの遊離酸（PGA
FA）を白色粉末（80mg;平均分子量11,620）として90％
の収率で得た。遊離酸は、有機溶媒中での溶解性を得る
ために用いた。
量13,600;シグマ）をＨ型の陽イオン交換樹脂（50当量
／グルタメート残基;AG50W−X8;バイオ−ラド）ととも
に一夜攪拌した。樹脂は前以て膨潤させ、蒸留水中で洗
浄し、最後に蒸留水（20ml/7gビーズ乾燥重量）中に再
懸濁した。上清を除き、凍結乾燥してPGAの遊離酸（PGA
FA）を白色粉末（80mg;平均分子量11,620）として90％
の収率で得た。遊離酸は、有機溶媒中での溶解性を得る
ために用いた。
（ｂ）ITC−PGAFAの調製： PGAFAを溶媒（10mg/mlのDMF）中に溶解した。プロトン
吸収試薬（４−メチルモルホリン）を、滴定可能な遊離
カルボン酸当たり約１当量の量で上記溶液に加えた。つ
いで、約100モル過剰のアミン反応性修飾試薬（溶解さ
せるに充分な量の1,4−フェニレンジイソチオシアネー
ト［DITC］）を溶液に加えた。反応混合物を室温で一夜
攪拌した。ほとんど乾燥するまで反応混合物を回転蒸発
させ（rotavaporated）、塩化メチレン（25ml）を滴下
してITC−PGAFAを沈澱させた。綿状の沈澱を遠心分離
し、塩化メチレンおよび未反応のDITCを除いた。実質的
にDITCが検出されなくなるまで上記沈澱／遠心分離工程
を繰り返した。DITCの検出は、塩化メチレンで展開した
シリカスライド上の薄層クロマトグラフィーを用いて行
うことができ、その場合、ITC−PGAFAは元の位置に留ど
まるが、DITCは溶媒フロントとともに移動する。残った
固体を真空乾燥してITC−PGAFAを黄色の粉末として得
た。
吸収試薬（４−メチルモルホリン）を、滴定可能な遊離
カルボン酸当たり約１当量の量で上記溶液に加えた。つ
いで、約100モル過剰のアミン反応性修飾試薬（溶解さ
せるに充分な量の1,4−フェニレンジイソチオシアネー
ト［DITC］）を溶液に加えた。反応混合物を室温で一夜
攪拌した。ほとんど乾燥するまで反応混合物を回転蒸発
させ（rotavaporated）、塩化メチレン（25ml）を滴下
してITC−PGAFAを沈澱させた。綿状の沈澱を遠心分離
し、塩化メチレンおよび未反応のDITCを除いた。実質的
にDITCが検出されなくなるまで上記沈澱／遠心分離工程
を繰り返した。DITCの検出は、塩化メチレンで展開した
シリカスライド上の薄層クロマトグラフィーを用いて行
うことができ、その場合、ITC−PGAFAは元の位置に留ど
まるが、DITCは溶媒フロントとともに移動する。残った
固体を真空乾燥してITC−PGAFAを黄色の粉末として得
た。
（ｃ）ITC−PGAFAをタンパク質に結合して捕捉試薬を調
製すること： ITC−PGAFA（タンパク質に対して約１〜約20モル過剰）
を、容量をできるだけ小さく保ちながら0.2Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH8.5）中に溶解した。pHは必要なとき
は8.5に調節した。この溶液に所望のタンパク質を加
え、37℃で一夜インキュベートした。ついで、１〜2mg
のタンパク質調製物に対しては分析TSK400バイオ−ラド
カラム（7.5×300mm、流速1ml/分）上で、２〜10mgのタ
ンパク質調製物に対してはTSK4000ベックマンカラム（3
1.5×300mm、流速5ml/分）上でのHPLCを用い、調製物を
分画した。溶出緩衝液には、0.1Mリン酸ナトリウムおよ
び0.3M NaCl（pH6.8）が含まれていた。フラクションを
試験し、適当に集めた。種々の結合比での種々のタンパ
ク質の結合効率を決定できるように、タンパク質を含有
するフラクションについてアミノ酸含量を決定した。そ
の結果を第11表に示す。
製すること： ITC−PGAFA（タンパク質に対して約１〜約20モル過剰）
を、容量をできるだけ小さく保ちながら0.2Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH8.5）中に溶解した。pHは必要なとき
は8.5に調節した。この溶液に所望のタンパク質を加
え、37℃で一夜インキュベートした。ついで、１〜2mg
のタンパク質調製物に対しては分析TSK400バイオ−ラド
カラム（7.5×300mm、流速1ml/分）上で、２〜10mgのタ
ンパク質調製物に対してはTSK4000ベックマンカラム（3
1.5×300mm、流速5ml/分）上でのHPLCを用い、調製物を
分画した。溶出緩衝液には、0.1Mリン酸ナトリウムおよ
び0.3M NaCl（pH6.8）が含まれていた。フラクションを
試験し、適当に集めた。種々の結合比での種々のタンパ
ク質の結合効率を決定できるように、タンパク質を含有
するフラクションについてアミノ酸含量を決定した。そ
の結果を第11表に示す。
上記第11表中、１番目のカラムには、種々の捕捉試薬を
調製するための反応に用いたタンパク質の量を挙げてあ
る。２番目のカラムには、１番目のカラムのタンパク質
と反応させる活性化ITC−PGAFAのモル過剰量が挙げてあ
る。３番目のカラムには、40,000平均分子量および305
繰り返しグルタメート残基に基づいてアミノ酸分析によ
り計算した、反応により抗体当たりに付着したPGA鎖の
数を挙げてある。４番目のカラムには、反応に用いた活
性化PGAのモル過剰量に基づいて計算したPGA鎖置換の効
率％を挙げてある。
調製するための反応に用いたタンパク質の量を挙げてあ
る。２番目のカラムには、１番目のカラムのタンパク質
と反応させる活性化ITC−PGAFAのモル過剰量が挙げてあ
る。３番目のカラムには、40,000平均分子量および305
繰り返しグルタメート残基に基づいてアミノ酸分析によ
り計算した、反応により抗体当たりに付着したPGA鎖の
数を挙げてある。４番目のカラムには、反応に用いた活
性化PGAのモル過剰量に基づいて計算したPGA鎖置換の効
率％を挙げてある。
実施例９ （テオフィリンのイオン捕捉競合アッセイ−抗原捕捉形
態） （ａ）テオフィリン捕捉試薬の調製： テオフィリンの活性化は、テオフィリンブチレート（10
mg;分子量280.29;3.57×10-5モル）を塩化メチレン（3.
0ml）中に溶解することにより行った。３モル過剰のジ
シクロヘキシルカルボジイミド（22mg;分子量206.3）お
よび３モル過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（12.3
mg;分子量115.09）を加え、反応混合物を室温で一夜攪
拌した。混合物を濾過してジシクロヘキシル尿素を除
き、乾燥するまで回転蒸発させてＮ−スクシンイミドテ
オフィリンブチレート（テオフィリンブチレート−oS
u）（10mg）を得た。
態） （ａ）テオフィリン捕捉試薬の調製： テオフィリンの活性化は、テオフィリンブチレート（10
mg;分子量280.29;3.57×10-5モル）を塩化メチレン（3.
0ml）中に溶解することにより行った。３モル過剰のジ
シクロヘキシルカルボジイミド（22mg;分子量206.3）お
よび３モル過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（12.3
mg;分子量115.09）を加え、反応混合物を室温で一夜攪
拌した。混合物を濾過してジシクロヘキシル尿素を除
き、乾燥するまで回転蒸発させてＮ−スクシンイミドテ
オフィリンブチレート（テオフィリンブチレート−oS
u）（10mg）を得た。
遊離のポリグルタミン酸（NH2−PGAFA;1.4mg;分子量11,
798;1.19×10-7モル）をDMF（0.5ml）およびNMM（1.1m
g;分子量101.15;1.07×10-5モル）中に溶解した。テオ
フィリンブチレート−oSu（10mg;1mg/0.5mlDMF）を加
え、反応混合物を室温で一夜攪拌した。0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.0）に対して透析することにより未
結合テオフィリンを除いた。得られた捕捉試薬のテオフ
ィリン含量を分析した結果、PGA鎖当たり3.9テオフィリ
ン分子が付着したことが示された。ついで、テオフィリ
ン−PGA捕捉試薬（抗テオフィリン抗体と結合すること
ができる）を、25mMトリス、100mM NaCl、1mM MgCl2、
0.1mM ZnCl2、0.1％NaN3および１％にべを含有するアッ
セイ緩衝液（pH7.2）中に３μg/mlに希釈した。
798;1.19×10-7モル）をDMF（0.5ml）およびNMM（1.1m
g;分子量101.15;1.07×10-5モル）中に溶解した。テオ
フィリンブチレート−oSu（10mg;1mg/0.5mlDMF）を加
え、反応混合物を室温で一夜攪拌した。0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.0）に対して透析することにより未
結合テオフィリンを除いた。得られた捕捉試薬のテオフ
ィリン含量を分析した結果、PGA鎖当たり3.9テオフィリ
ン分子が付着したことが示された。ついで、テオフィリ
ン−PGA捕捉試薬（抗テオフィリン抗体と結合すること
ができる）を、25mMトリス、100mM NaCl、1mM MgCl2、
0.1mM ZnCl2、0.1％NaN3および１％にべを含有するアッ
セイ緩衝液（pH7.2）中に３μg/mlに希釈した。
（ｂ）固相の調製： ファイバーマトリックスをポリマー性第四級化合物でコ
ーティングして正の荷電を有する固相を調製した。水溶
性のセルロース誘導体であるセルコートＬ−200を用い
た。10mM NaCl（50μ）を含有するセルコートＬ−200
の0.5％水溶液（50μ）を固相物質に適用した。
ーティングして正の荷電を有する固相を調製した。水溶
性のセルロース誘導体であるセルコートＬ−200を用い
た。10mM NaCl（50μ）を含有するセルコートＬ−200
の0.5％水溶液（50μ）を固相物質に適用した。
（ｃ）指示試薬の調製： 指示試薬は、実質的に実施例３の工程（ｂ）に記載した
プロトコールに従って調製された、アルカリホスファタ
ーゼと抗テオフィリン抗体との結合体からなっていた。
この指示試薬をアッセイ緩衝液中で適当に希釈して（滴
定曲線により決定されるように）0.17μｇ抗体/mlとし
た。
プロトコールに従って調製された、アルカリホスファタ
ーゼと抗テオフィリン抗体との結合体からなっていた。
この指示試薬をアッセイ緩衝液中で適当に希釈して（滴
定曲線により決定されるように）0.17μｇ抗体/mlとし
た。
（ｄ）イムノアッセイプロトコール： 指示試薬（200μ）を一連の反応管内に入れた。つい
で、テオフィリン標準溶液（200μ;50mMトリス、300m
M NaClおよび0.1％NaN3（pH7.2）中に0.6、1.2、2.5、
4.9、9.9、99.2および992μg/mlに希釈したテオフィリ
ンブチレート）を各管に加えた。混合物を37℃で10分間
インキュベートした。捕捉試薬（200μ）を各管に加
え、反応混合物を37℃で10分間インキュベートした。各
反応混合物のアリコート（200μ）をクオート処理し
た固相物質に適用し、ついで希釈液（75μ）で１回洗
浄した。酵素基質（70μ;100mM AMP、1.0mM MgCl2、
0.1％NaN3および4.0mMテトラミソールからなる溶液（pH
10.3）中の1.2mM 4−メチルウンベリフェリルホスフェ
ート）を32℃で加えて指示試薬と反応させ、蛍光度を測
定した。そのアッセイの結果を第12表に示す。アッセイ
の結果は、テオフィリン試験試料濃度が増加するのに対
応して捕捉試薬／指示試薬複合体の生成が減少し、それ
ゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も減少すること
を示している。
で、テオフィリン標準溶液（200μ;50mMトリス、300m
M NaClおよび0.1％NaN3（pH7.2）中に0.6、1.2、2.5、
4.9、9.9、99.2および992μg/mlに希釈したテオフィリ
ンブチレート）を各管に加えた。混合物を37℃で10分間
インキュベートした。捕捉試薬（200μ）を各管に加
え、反応混合物を37℃で10分間インキュベートした。各
反応混合物のアリコート（200μ）をクオート処理し
た固相物質に適用し、ついで希釈液（75μ）で１回洗
浄した。酵素基質（70μ;100mM AMP、1.0mM MgCl2、
0.1％NaN3および4.0mMテトラミソールからなる溶液（pH
10.3）中の1.2mM 4−メチルウンベリフェリルホスフェ
ート）を32℃で加えて指示試薬と反応させ、蛍光度を測
定した。そのアッセイの結果を第12表に示す。アッセイ
の結果は、テオフィリン試験試料濃度が増加するのに対
応して捕捉試薬／指示試薬複合体の生成が減少し、それ
ゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も減少すること
を示している。
実施例10 （フェニルシクリジン（phenylcyclidine）イオン捕捉
競合アッセイ−抗原捕捉形態） （ａ）フェニルシクリジン捕捉試薬の調製： ４−ヒドロキシフェニルシクリジン（1.1mg;分子量259.
37;4.24×10-6モル）をテトラヒドロフラン（THF;0.5m
l）中に溶解した。ベンゼン中の10％ホスゲン（1/2ml）
を加えた（130モル過剰）。室温で2.5時間反応させた。
窒素流下で溶媒を蒸発させてフェニルシクリジン−４−
クロロホルメートの残渣を得た。
競合アッセイ−抗原捕捉形態） （ａ）フェニルシクリジン捕捉試薬の調製： ４−ヒドロキシフェニルシクリジン（1.1mg;分子量259.
37;4.24×10-6モル）をテトラヒドロフラン（THF;0.5m
l）中に溶解した。ベンゼン中の10％ホスゲン（1/2ml）
を加えた（130モル過剰）。室温で2.5時間反応させた。
窒素流下で溶媒を蒸発させてフェニルシクリジン−４−
クロロホルメートの残渣を得た。
上記フェニルシクリジン−４−クロロホルメート（1.1m
g）をTHF（0.5ml）中に溶解した。これに１−メチル−
２−ピロリジノン（0.5ml）中に溶解したNH2−PGAFA
（1.7mg;分子量11,798;1.19×10-7モル）を加えた。反
応を室温にて一夜行い、ついで乾燥するまで回転蒸発さ
せた。生成物を0.1Mリン酸ナトリウム（1.5ml、pH7.0）
中に溶解した。沈澱を濾過し、濁った水性濾液を透明に
なるまで塩化メチレンで抽出した。ついでフェニルシク
リジン−PGA捕捉試薬（抗フェニルシクリジン抗体と結
合することができる）を、上記実施例９に記載したよう
にしてアッセイ緩衝液中で５μg/mlに希釈した。
g）をTHF（0.5ml）中に溶解した。これに１−メチル−
２−ピロリジノン（0.5ml）中に溶解したNH2−PGAFA
（1.7mg;分子量11,798;1.19×10-7モル）を加えた。反
応を室温にて一夜行い、ついで乾燥するまで回転蒸発さ
せた。生成物を0.1Mリン酸ナトリウム（1.5ml、pH7.0）
中に溶解した。沈澱を濾過し、濁った水性濾液を透明に
なるまで塩化メチレンで抽出した。ついでフェニルシク
リジン−PGA捕捉試薬（抗フェニルシクリジン抗体と結
合することができる）を、上記実施例９に記載したよう
にしてアッセイ緩衝液中で５μg/mlに希釈した。
（ｂ）固相の調製： 実質的に実施例９に記載した方法に従って固相を調製し
た。
た。
（ｃ）指示試薬の調製： 指示試薬は、アルカリホスファターゼと抗フェニルシク
リジン抗体との結合体からなっていた。実施例９に記載
のようにして、指示試薬をアッセイ緩衝液中で1/250倍
に希釈した。
リジン抗体との結合体からなっていた。実施例９に記載
のようにして、指示試薬をアッセイ緩衝液中で1/250倍
に希釈した。
（ｄ）イムノアッセイプロトコール： 指示試薬（140μ）を、フェニルシクリジンを知られ
た量（ヒト尿中で調製した0.0、25、60、120、250およ
び500ng/ml）含有する一連の試料（各50μ）と混合
し、混合物を32℃で10分間インキュベートした。フェニ
ルシクリジン−PGA捕捉試薬（100μ）を加え、反応混
合物を10分間インキュベートした。各反応混合物のアリ
コート（200μ）を固相物質に加えた。ついで固相を
２回洗浄した。酵素基質（70μ；実施例９と同じ）を
加え、蛍光度を測定した。そのアッセイの結果を第13表
に示す。アッセイの結果は、フェニルシクリジン試験試
料の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／指示試薬複
合体の生成は減少し、それゆえ固相に結合して検出可能
な標識の量も減少することを示している。
た量（ヒト尿中で調製した0.0、25、60、120、250およ
び500ng/ml）含有する一連の試料（各50μ）と混合
し、混合物を32℃で10分間インキュベートした。フェニ
ルシクリジン−PGA捕捉試薬（100μ）を加え、反応混
合物を10分間インキュベートした。各反応混合物のアリ
コート（200μ）を固相物質に加えた。ついで固相を
２回洗浄した。酵素基質（70μ；実施例９と同じ）を
加え、蛍光度を測定した。そのアッセイの結果を第13表
に示す。アッセイの結果は、フェニルシクリジン試験試
料の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬／指示試薬複
合体の生成は減少し、それゆえ固相に結合して検出可能
な標識の量も減少することを示している。
実施例11 （ジゴキシンイオン捕捉競合アッセイ−抗原捕捉形態） （ａ）ジゴキシン−IgG−PGA捕捉試薬の調製： 以下の手順で修正をした他は実質的に実施例８の工程
（ｃ）に記載した方法に従ってジゴキシン−IgG−PGA捕
捉試薬を調製した。ITC−PGA（5mg;1.25×10-7モル;0.1
Mリン酸ナトリウム（pH8.5、1.0ml）中）をウサギIgG−
ジゴキシンの緩衝溶液（1mg;6.25×10-9モル;0.1Mリン
酸ナトリウムおよび0.3M NaClよりなる溶液（pH8.5、1.
4493ml）中）に加えて捕捉試薬を調製した。溶液を攪拌
し、37℃で一夜インキュベートした。ついで、バイオシ
ル（BioSil）400（バイオ−ラド、300mm×7.5mmゲル濾
過カラム）上のHPLCを用い、0.1Mリン酸ナトリウムおよ
び0.3M NaCl（pH6.8）で1ml/分にて溶出することによ
り、調製物を分画した。ついで、ジゴキシン−IgG−PGA
捕捉試薬（抗ジゴキシン抗体と結合することができる）
を、実施例９に記載したようにしてアッセイ緩衝液中で
３μg/mlに希釈した。
（ｃ）に記載した方法に従ってジゴキシン−IgG−PGA捕
捉試薬を調製した。ITC−PGA（5mg;1.25×10-7モル;0.1
Mリン酸ナトリウム（pH8.5、1.0ml）中）をウサギIgG−
ジゴキシンの緩衝溶液（1mg;6.25×10-9モル;0.1Mリン
酸ナトリウムおよび0.3M NaClよりなる溶液（pH8.5、1.
4493ml）中）に加えて捕捉試薬を調製した。溶液を攪拌
し、37℃で一夜インキュベートした。ついで、バイオシ
ル（BioSil）400（バイオ−ラド、300mm×7.5mmゲル濾
過カラム）上のHPLCを用い、0.1Mリン酸ナトリウムおよ
び0.3M NaCl（pH6.8）で1ml/分にて溶出することによ
り、調製物を分画した。ついで、ジゴキシン−IgG−PGA
捕捉試薬（抗ジゴキシン抗体と結合することができる）
を、実施例９に記載したようにしてアッセイ緩衝液中で
３μg/mlに希釈した。
（ｂ）固相の調製： 実質的に実施例９に記載した方法に従って固相を調製し
た。
た。
（ｃ）指示試薬の調製： 指示試薬は、アルカリホスファターゼとマウス抗ジゴキ
シン抗体（イムノサーチ；エメリービル、カリフォルニ
ア94608）との結合体からなっていた。実施例９に記載
のようにして、指示試薬をアッセイ緩衝液中で33.3ng/m
lに希釈した。
シン抗体（イムノサーチ；エメリービル、カリフォルニ
ア94608）との結合体からなっていた。実施例９に記載
のようにして、指示試薬をアッセイ緩衝液中で33.3ng/m
lに希釈した。
（ｄ）イムノアッセイプロトコール： 指示試薬（200μ）を、知られた量のジゴキシン（正
常ヒト血清中で調製した0.5、1.0、2.5、5.0および50.0
ng/ml）を含有する一連の試料（200μ）を混合した。
混合物を37℃で15分間インキュベートした。ジゴキシン
−IgG−PGA捕捉試薬（200μ）を加え、反応混合物を1
5分間インキュベートした。各反応混合物のアリコート
（200μ）を固相物質に適用し、ついで洗浄した。酵
素基質（70μ；実施例９と同じ）を加え、蛍光度を測
定した。そのアッセイの結果を第14表に示す。アッセイ
の結果は、ジゴキシン試験試料の濃度が増加するのに対
応して捕捉試薬／指示試薬複合体の生成は減少し、それ
ゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も減少すること
を示している。
常ヒト血清中で調製した0.5、1.0、2.5、5.0および50.0
ng/ml）を含有する一連の試料（200μ）を混合した。
混合物を37℃で15分間インキュベートした。ジゴキシン
−IgG−PGA捕捉試薬（200μ）を加え、反応混合物を1
5分間インキュベートした。各反応混合物のアリコート
（200μ）を固相物質に適用し、ついで洗浄した。酵
素基質（70μ；実施例９と同じ）を加え、蛍光度を測
定した。そのアッセイの結果を第14表に示す。アッセイ
の結果は、ジゴキシン試験試料の濃度が増加するのに対
応して捕捉試薬／指示試薬複合体の生成は減少し、それ
ゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も減少すること
を示している。
実施例12 （ジゴキシンイオン捕捉競合アッセイ−抗体捕捉形態） （ａ）指示試薬の調製： 指示試薬は、アルカリホスファターゼとジゴキシン（イ
ムノサーチ）との結合体からなっていた。指示試薬を、
実施例９に記載のようにしてアッセイ緩衝液中で1/100
倍に希釈した。
ムノサーチ）との結合体からなっていた。指示試薬を、
実施例９に記載のようにしてアッセイ緩衝液中で1/100
倍に希釈した。
（ｂ）イムノアッセイプロトコール： 抗ジゴキシン−PGA捕捉試薬（200μ、実質的に実施例
８の工程（ｃ）に記載のプロトコールに従って調製）
を、実施例11に記載のような知られた量のジゴキシンを
含有する一連の試料（各200μ）と混合した。混合物
を37℃で15分間インキュベートした。指示試薬（200μ
）を加え、反応混合物を15分間インキュベートした。
各反応混合物のアリコート（200μ）を固相（実施例
９に記載のようにして調製）に適用し、ついで洗浄し
た。酵素基質（70μ；実施例９と同じ）を加え、蛍光
度を測定した。そのアッセイの結果を第15表に示す。ア
ッセイの結果は、ジゴキシン試験試料の濃度を増加させ
るのに対応して捕捉試薬／指示試薬複合体の生成は減少
し、それゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も減少
することを示している。
８の工程（ｃ）に記載のプロトコールに従って調製）
を、実施例11に記載のような知られた量のジゴキシンを
含有する一連の試料（各200μ）と混合した。混合物
を37℃で15分間インキュベートした。指示試薬（200μ
）を加え、反応混合物を15分間インキュベートした。
各反応混合物のアリコート（200μ）を固相（実施例
９に記載のようにして調製）に適用し、ついで洗浄し
た。酵素基質（70μ；実施例９と同じ）を加え、蛍光
度を測定した。そのアッセイの結果を第15表に示す。ア
ッセイの結果は、ジゴキシン試験試料の濃度を増加させ
るのに対応して捕捉試薬／指示試薬複合体の生成は減少
し、それゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も減少
することを示している。
実施例13 （hCGの別態様のイオン捕捉サンドイッチアッセイ） （ａ）捕捉試薬の調製： 上記実施例８の工程（ｃ）に記載の方法に実質的に従っ
て、抗hCG抗体−PGA捕捉試薬を調製した。
て、抗hCG抗体−PGA捕捉試薬を調製した。
（ｂ）固相の調製： ファイバーマトリックスを緩衝液（80μ;300mM NaC
l、50mMトリスおよび0.1％NaN3を含有、pH7.5）で湿潤
させた。このマトリックスをセルコートＬ−200の0.5％
水溶液（50μ;10mM NaCl含有）でコーティングし、緩
衝液で２回洗浄した。
l、50mMトリスおよび0.1％NaN3を含有、pH7.5）で湿潤
させた。このマトリックスをセルコートＬ−200の0.5％
水溶液（50μ;10mM NaCl含有）でコーティングし、緩
衝液で２回洗浄した。
（ｃ）指示試薬の調製： 指示試薬は、アルカリホスファターゼとヤギ抗hCG抗体
（実質的に実施例３の工程（ｂ）に記載のプロトコール
に従って調製）との結合体からなっていた。指示試薬
を、25mMトリス、100mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnC
l2、0.1％NaN3、５％ヤギ血清および１％にべを含有す
るアッセイ緩衝液（pH7.2）中で適当に希釈した（滴定
曲線により決定されるように）。
（実質的に実施例３の工程（ｂ）に記載のプロトコール
に従って調製）との結合体からなっていた。指示試薬
を、25mMトリス、100mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnC
l2、0.1％NaN3、５％ヤギ血清および１％にべを含有す
るアッセイ緩衝液（pH7.2）中で適当に希釈した（滴定
曲線により決定されるように）。
（ｄ）イムノアッセイプロトコール： 指示試薬（140μ）を、正常ヒト血清中に知られた量
のhCGを含有する一連の試料（50μ）と混合した。混
合物を31〜32℃で10分間インキュベートした。抗hCG抗
体−PGA捕捉試薬（100μ）を加え、反応混合物を10分
間インキュベートした。各反応混合物のアリコート（20
0μ）を固相物質に加え、ついで洗浄した。酵素基質
（70μ；実施例９と同じ）を加え、蛍光度を測定し
た。そのアッセイの結果を第16表に示す。アッセイの結
果は、hCG試験試料濃度が増加するのに対応して捕捉試
薬／分析対象物／指示試薬複合体の生成も増加し、それ
ゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も増加すること
を示している。
のhCGを含有する一連の試料（50μ）と混合した。混
合物を31〜32℃で10分間インキュベートした。抗hCG抗
体−PGA捕捉試薬（100μ）を加え、反応混合物を10分
間インキュベートした。各反応混合物のアリコート（20
0μ）を固相物質に加え、ついで洗浄した。酵素基質
（70μ；実施例９と同じ）を加え、蛍光度を測定し
た。そのアッセイの結果を第16表に示す。アッセイの結
果は、hCG試験試料濃度が増加するのに対応して捕捉試
薬／分析対象物／指示試薬複合体の生成も増加し、それ
ゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も増加すること
を示している。
本発明の概念は、反対に荷電した固相物質および捕捉試
薬を用いることにより、あらゆる分離法および均一結合
アッセイ（結合反応中に標識のシグナル生成能は変わら
ない）に等しく適用し得ることが当業者により認識され
るであろう。従って、上記に詳細に記載した態様は、本
発明を限定するものではなく、単に例示したものに過ぎ
ない。
薬を用いることにより、あらゆる分離法および均一結合
アッセイ（結合反応中に標識のシグナル生成能は変わら
ない）に等しく適用し得ることが当業者により認識され
るであろう。従って、上記に詳細に記載した態様は、本
発明を限定するものではなく、単に例示したものに過ぎ
ない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スチーブン・デンハム・ストループ アメリカ合衆国イリノイ 60048、リバテ ィビル、ルーズベルト 606番 (56)参考文献 特開 昭53−127823（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−110745（ＪＰ，Ａ) 特表 昭56−500901（ＪＰ，Ａ)
Claims (7)
- 【請求項１】試験試料中の分析対象物の検出方法であっ
て、 （ａ）分析対象物を、式： （式中、ｎは約10〜約500、ｚは約１〜約６、ＷはH+、N
a+、K+、Li+、アミン塩およびそれらの誘導体よりなる
群から選ばれた基、Ｘはハプテンへの結合を可能にする
反応性基または該反応性基を有する構造である）で示さ
れる活性化ポリマー性アニオン分子に結合したハプテン
からなる負に荷電した捕捉試薬、および検出可能なシグ
ナルを生成し得る標識に結合した特異的結合成分からな
る指示試薬と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法。 - 【請求項２】試験試料中の分析対象物の検出方法であっ
て、 （ａ）分析対象物を、ポリグルタミン酸、アニオン性タ
ンパク質もしくは誘導体化タンパク質、アニオン性多糖
類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸およびポリア
ミノ酸よりなる群から選ばれる活性化ポリマー性アニオ
ン分子に単独の共有結合により結合したハプテンからな
る負に荷電した捕捉試薬、および検出可能なシグナルを
生成し得る標識に結合した特異的結合成分からなる指示
試薬と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法。 - 【請求項３】試験試料中の分析対象物の検出方法であっ
て、 （ａ）分析対象物を、式： （式中、ｎは約10〜約500、ｚは約１〜約６、ＷはH+、N
a+、K+、Li+、アミン塩およびそれらの誘導体よりなる
群から選ばれた基、Ｘは特異的結合成分への結合を可能
にする反応性基または該反応性基を有する構造である）
で示される活性化ポリマー性アニオン分子に結合した特
異的結合成分からなる負に荷電した捕捉試薬、および検
出可能なシグナルを生成し得る標識に結合したハプテン
からなる指示試薬と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法。 - 【請求項４】試験試料中の分析対象物の検出方法であっ
て、 （ａ）分析対象物を、ポリグルタミン酸、アニオン性タ
ンパク質もしくは誘導体化タンパク質、アニオン性多糖
類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸およびポリア
ミノ酸よりなる群から選ばれる活性化ポリマー性アニオ
ン分子に単独の共有結合により結合した特異的結合成分
からなる負に荷電した捕捉試薬、および検出可能なシグ
ナルを生成し得る標識に結合したハプテンからなる指示
試薬と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 （ｂ）該反応混合物を、正に荷電した固相と接触させる
ことにより該固相を該活性化ポリマー性アニオン分子に
誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合体を該反応混
合物から分離させ、ついで （ｃ）該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法。 - 【請求項５】該正に荷電した固相がポリマー性カチオン
物質により荷電されている請求項（１）、（２）、
（３）または（４）記載の方法。 - 【請求項６】該ポリマー性カチオン物質が、ガフコー
ト、ジエチルアミノエチルデキストラン、ジアリルジメ
チルアンモニウムクロリド−ヒドロキシエチルセルロー
スポリマーおよびヘキサジメスリンブロミドよりなる群
から選ばれたものである請求項（５）記載の方法。 - 【請求項７】誘導体化タンパク質が誘導体化アルブミン
であり、アニオン性多糖類がヘパリンまたはアルギン酸
である請求項（２）または（４）記載の方法。
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|---|---|---|---|
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