SE501013C2 - Förfarande för förbättring av analys med bindning till fast fas - Google Patents

Description

501 013 Även om en sådan elektrostatisk effekt är fördelaktig för bindning av ligander, har emellertid den möjliga närvaron av en resterande ladddning vid den fasta ytan efter ligand- bindningen hittills ansetts utgöra en möjlig källa till problem vid de efterföljande analysstegen pà grund av oönskade joninteraktioner med provet.

Det har nu i enlighet med föreliggande uppfinning över- raskande visat sig att om man ser till att det finns kvar en resterande laddning på den fasta ytan efter bindningen av en ligand till densamma, så kan denna restladdning gynnsamt utnyttjas för att underlätta och optimera bindningen av en analytisk komponent vid de efterföljande stegen i en speciell analys som skall utföras vid fastfasytan. I föreliggande sammanhang avser uttrycket “analytisk komponent" varje reaktiv komponent som används vid analysen med undantag av den initialt bundna liganden. Således kan i exempelvis en analys av sandwichtyp den s k sekundära antikroppen (som vid SPR-analys tjänstgör som “förstärkningsreagens“) effektivt koncentreras till matrisen genom den skapade elektrostatiska växelverkan och resultera i en väsentligen fullständig bindning till den primära analyt som redan bundits till liganden, förutsatt att å ena sidan matrisen har en tillräck- lig ursprunglig laddning för att kvarlämna en resterande laddning efter immobiliseringen av liganden till densamma, och à andra sidan reaktionsbetingelserna är korrekt valda vad gäller jonstyrka och pH.

Således innebär reaktionsbetingelserna för syftena med föreliggande uppfinning låg jonstyrka och lämpligt pH hos reaktionsmediet för att säkerställa en negativ eller positiv laddning hos den sekundära antikroppen som är motsatt laddningen vid fastfasytan, vilket är tvärtemot de fysio- logiska betingelser som konventionellt används pá området, dvs medelhög jonstyrka och ungefär neutralt pH. I exempelvis fallet med en resterande negativ laddning hos matrisen bör pH väljas under antikroppens isoelektriska punkt för att den 501 013 sistnämnda skall göras positivt laddad, och vice versa.

Under dessa betingelser kan de elektrostatiska interaktionerna mellan sådana motsatta laddningar hos matrisen och den sekundära antikroppen användas utan att alltför många skärmande joner finns närvarande. Det antas även att matrisen i sig under sådana betingelser blir mer öppen på grund av inre repulsion i polymerskiktet, varigenom det sörjs för ökad tillgänglighet av den bundna analyten.

För att säkerställa att endast den önskade specifikt aktiva substansen binds till ytan, vars betydelse givetvis beror på den speciella tillämpningen, kan det efter bindningssteget, som främjas av den elektrostatiskt orsakade koncentrationen av sekundärt reagens i enlighet med uppfinningen, vara nödvändigt att utsätta ytan för betingelser med måttlig eller hög jonstyrka för att avlägsna komponenter som endast har bundits elektrostatiskt; De förbättringar som uppnås genom att utföra en analys som ovan i enlighet med föreliggande uppfinning i motsats till vid normala betingelser ligger i (i) högre känslighet och större dynamiskt område för analysen, (ii) avsevärt reducerad förbrukning av sekundär antikropp och (iii) snabbare analyserÅ Man inser att den genom elektrostatisk interaktion erhållna koncentrerande effekt som beskrivits ovan inte endast kan användas i andra typer av SPR-analyser än sandwichanalyser, vilket kommer att förklaras ytterligare nedan, utan även mer generellt vid analytiska metoder över huvud taget, som t ex i och för sig konventionella analyser av ELISA-typ, så länge som de innebär användning av en fast fas som är modifierad eller kapabel att modifieras med en laddad matris av lämplig 'CYP- 501 013 I sin bredaste aspekt avser föreliggande uppfinning således en analysmetod innefattande steget att binda en andra substans till en första substans immobiliserad på en fastfas- yta, varvid den första substansen antingen är en ligand eller en komponent bunden direkt eller indirekt till denna, såsom en analyt eller ett sekundärt reagens bundet till analyten, varvid förfarandet kännetecknas av att den fastfas- yta som har den första substansen immobiliserad till den- samma uppvisar en elektrisk laddning, och att reaktionen för att binda den andra substansen till den första substansen utförs vid en jonstyrka under 100 mM och vid sådana pH- betingelser att den elektriska laddningen för den andra substansen är motsatt den för fastfasytan, så att den andra substansen attraheras elektrostatiskt av fastfasytan.

Som nämnts ovan kan förfarandet innefatta steget att utsätta ytan för betingelser med högre jonstyrka efter bindningen av den andra substansen för avlägsning av ospecifik bindning.

Det bör noteras att även om uppfinningen i princip är avsedd att vara tillämplig på alla steg i en analys efter immobili- seringen av liganden, så är den andra substansen, speciellt när det gäller immunologisk analys, för det mesta inte den analyt som skall bestämmas vid analysen eftersom det prov som skall testas vanligtvis inte uppfyller de nödvändiga betingelserna vad gäller jonstyrka och/eller pH och det vanligtvis inte är lämpligt att störa provmiljön, t ex för ett serumprov. I vissa fall kan emellertid den elektro- statiska koncentrerande effekten enligt uppfinningen även utnyttjas för att binda analyten beroende på provet ifråga.

I en utföringsform av föreliggande uppfinning är således den andra substansen den sekundära komponenten i en analys av sandwichtyp sásom redan diskuterats ovan. 501 013 I en annan utföringsform är den andra substansen ett agens använt för att blockera resterande bindningsställen efter immobiliseringen av liganden till ytan, vilka bindnings- ställen annars skulle störa en speciell analytisk procedur.

I ännu en annan utföringsform är den andra substansen en analyt, varvid förfarandet enligt uppfinningen t ex används för att bestämma den mängd aktivitet (ligander) som är immobiliserad på en yta.

I princip kan emellertid den andra substansen vara en godtycklig analytisk substans för vilken de specificerade reaktionsbetingelserna enkelt kan tillämpas utan några negativa praktiska följder.

Den andra substansen är typiskt ett protein eller en poly- peptid eller ett aktivt fragment därav men kan generellt sett vara varje substans som kan bindas vid en önskad fastfasanalys. Som lätt inses är den andra substansen i första hand en större molekyl, t ex en makromolekyl, efter- som diffussionshastigheten är högre för mindre molekyler och den effekt som uppnås genom föreliggande uppfinning där- igenom blir av mindre betydelse.

Som lätt inses av fackmannen pà området kan den ovannämnda första substansen, speciellt som analyt, exempelvis vara ett protein eller en polypeptid, såsom ett antigen eller en antikropp, protein A eller G, ett enzym, en lektin, avidin, etc; eller en hapten, ett hormon, ett socker, biotin, ett toxin, en vitamin, etc. 501 013 De ovannämnda proteinerna och polypeptiderna och fragment därav innefattar givetvis både naturliga och syntetiska eller halvsyntetiska substanser, såsom proteiner och poly- peptider modifierade med kemiska medel eller med gentekniska metoder. Ett exempel är chimera, dvs bi- eller polyfunktio- nella molekyler, såsom bi- eller polyfunktionella anti- kroppar. För användning av sådana molekyler i biosensoryt- sammanhang kan det hänvisas till vår ovannämnda WO 90/05305.

Vidare kan t ex vid en analys av sandwichtyp det sekundära reagenset vara en bifunktionell antikropp eller annan molekyl för att tillåta efterföljande reaktion med ett tertiärt reagens.

Det fastfasskikt som det hänvisas till ovan beror på typen av analysmetod som skall användas. För biosensorapplika- tioner, t ex SPR- eller elektrokemiska biosensorer, kan detta skikt vara ett polymerskikt, företrädesvis en hydro- gel, såsom ett dextranskikt, bundet till en metallyta. För bindning av en ligand förses polymerskiktet med lämpliga funktionella grupper, och som resultat därav kan ytskiktet erhålla en resterande positiv eller negativ elektrisk laddning som är tillräcklig för syftena med uppfinningen, men en sådan elektrisk laddning kan även införas vid en separat behandling av ytskiktet. Exempel på ytor för bio- sensorapplikationer ges i vår ovannämnda W0 90/05303, vars innehåll införlivas här genom hänvisning¿ Som framgår av det ovanstående definieras "låg jonstyrka" i föreliggande uppfinningssammanhang som liggande under 100 mM, varvid den "normala" jonstyrkan vid typiska immuno- logiska metoder är ca 150 mM. Företrädesvis är emellertid jonstyrkan lägre än 50 mM och mer föredraget under 20 mM. Även om jonstyrkan i den teoretiskt ideala situationen bör vara åtminstone nära noll, torde detta inte vara möjligt i de flesta praktiska fall på grund av t ex stabilitetsöver- väganden för proteiner, etc. -7- 501 013 Det nödvändiga pH-värdet för att säkerställa en lämplig laddning hos den andra substansen kommer givetvis att variera med den speciella substansens natur. I exempelvis fallet med ett protein beror det pH-värde som skall väljas på proteinets isoelektriska punkt (Ip), varvid en negativ laddning erhålls vid pH-värden över Ip och en positiv laddning erhålls vid pH-värden under Ip. För ett speciellt protein med en specifik Ip bör det pH som skall väljas vanligtvis skilja sig från Ip med minst 0,5 i den önskade riktningen. Vissa proteinprov, sàsom en polyklonal antikropps- blandning, kan uppvisa ett pH-område snarare än ett enda pH-värde för sin Ip, och i ett sådant fall skall den ovan angivna pH-differensen givetvis i stället avse den relevanta områdesgränsen för pH-intervallet, dvs vid eller under 4,5 för en polyklonal blandning med ett pH-område från 5 till 8.

I detta sammanhang bör det även noteras att Ip-värdet för ett specifikt protein kan modifieras genom i och för sig kända metoder för att passa exempelvis en speciell laddad matris.

Förfarandet enligt uppfinningen är särskilt lämpligt för assays eller analysmetoder av immunkemisk typ, speciellt biosensor-relaterade metoder. Som redan diskuterats ovan kan således uppfinningstanken med fördel tillämpas på bindning av den sekundära antikroppen i en immunologisk sandwich- analys, varvid sàväl känsligheten som det dynamiska området för reaktionen ökas avsevärt.

En annan värdefull tillämpning av föreliggande uppfinning som också nämnts ovan är för effektiv blockering av över- skott av bindningsställen. Detta är exempelvis användbart vid s k epitopkartläggning ("epitope mapping") med biosensor- teknik (se t ex vår WO 90/05306 som avser karaktärisering av makromolekyler med hjälp av biosensorteknik), där en mono- klonal antikropp först binds till en mätyta med immobili- serade antikroppar kapabla att generellt binda musantikroppar (t ex av typen kanin-antimus Gl eller Fc). Kartläggningen 501 013 utförs sedan genom att man i följd låter analyten (antigenet) och en annan monoklonal passera över ytan, varvid bindning av den senare indikerar att de båda monoklonalerna binder till olika ställen på antigenet. Som lätt inses måste den mängd av den generellt bindande antikroppen som är immobili- serad på ytan vara relativt hög för att tillåta bindning av en tillräcklig mängd av den första monoklonalen från den relativt låga koncentration som föreligger i t ex ett odlingsmedium. Eftersom den andra monoklonalen inte får binda till den initialt immobiliserade generellt bindande antikroppen, vilket skulle tolkas som ett falskt positivt svar, måste överskottet av bindningsställen hos den generellt bindande antikroppen som inte ockuperats av den första monoklonalen blockeras med ospecifika antikroppar. I enlig- het med föreliggande uppfinning kan detta ske på ett mer effektivt och reagensbesparande sätt om den ovan beskrivna elektrostatiska koncentrerande effekten utnyttjas genom att man anordnar den blockerande antikroppen i en buffert med låg jonstyrka och med ett pH som ger den blockerande anti- kroppen en laddning som är motsatt den för mätytmatrisen.

Samma koncept kan användas för att blockera överskott av bindningsställen på en yta med immobiliserat protein A eller G för att göra den kapabel att generellt binda polyklonala antikroppar. I detta fall kan den elektrostatiska effekten, beroende på pH-värdet, användas för att förbättra både bindningen av liganden till protein A eller G och den efterföljande blockeringen av resterande bindningsställen. I det följande kommer uppfinningen att beskrivas med hjälp av några speciella exempel, som endast ges i belysande syfte och som inte skall uppfattas som begränsande i någon som helst mening. I anslutning härtill sker hänvisning till de bifogade ritningarna i vilka: nu 501 013 Figur l är ett diagram som visar ytförändingssvaret vid bindning av sekundär antikropp till en biosensoryta vid en sandwichanalys för BZ-mikroglobulin vid hög (0) respektive låg (El) j onstyrka; Figur 2 är ett liknande diagram som i figur 1 och visar ytförändringssvaret vid bindning av sekundär antikropp till en biosensoryta i en sandwichanalys för luteiniseringshormon (LH) vid (i) en koncentration av sekundär antikropp pá 1 mg/ml vid hög (CD och làg (00 jonstyrka; (ii) en koncentra- tion av sekundär antikropp pà 250 ug/ml vid låg jonstyrka (fl); och (iii) en koncentration av sekundär antikropp på 50 pg/ml Q) vid lag jonstyrka; Figur 3 och 4 är stapeldiagram som visar pH-beroendet hos ytförändingssvaret för bindning av en sekundär antikropp till en biosensoryta vid en sandwichanalys för LH vid koncentrationer av sekundär antikropp av 1,0 mg/ml (figur 3) respektive 50 ug/ml (figur 4); Figur 5 till 7 är stapeldiagram som visar ytförändringssvaret hos en biosensoryta för sekventiell bindning av monoklonal (.); blockerande antikropp (fi), LH () och den eventuella efterföljande bindningen av den ursprungliga monoklonalen GJ) för tre olika monoklonaler i odlingsmedium vid olika koncentra- tioner blockerande antikropp och vid hög respektive låg jonstyrka; Figur 8 är ett liknande stapeldiagram som i figurerna 5 till 7 men med renad monoklonal och med högre koncentration monoklonal tillsatt vid den andra tillsatsen än vid den första tillsatsen: Figur 9 är ett liknande stapeldiagram som i figur 8 med renad monoklonal men med samma koncentration använd för både den första och den andra tillsatsen monoklonal; och 501 013 Figur 10 är ett liknande stapeldiagram som i figur 5 till 9 för svaret vid låg jonstyrka för fyra olika koncentrationer av blockerande antikropp.

Samtliga analyser i exemplen utfördes med ett pà ytplasmon- resonans baserat biosensorsystem av en typ beskriven i vår WO 90/05295 (vars innehåll införlivas häri genom hänvisning) och som nu kommersialiseras av Pharmacia AB, Uppsala. Detta biosensorsystem innefattar en utbytbar biosensorenhet, ett vätskehanteringsblock med ett ledningssystem för transport av reagens och provlösningar över sensorenhetens mätyta, en optikenhet som kopplar infallande ljusstràlar till mätytan och detekterar den reflekterade strålningen samt en ut- värderingsenhet, som efter kalibrering omvandlar detektor- signalen till en parameter proportionell mot mängden sub- stans vid mätytan. Vid utförande av en mätning införs en definierad provvätskevolym genom injektion i en definierad ledningssektion, vilken vätskevolym sedan med hjälp av eluentvätska, eller drivbuffert, tvingas att passera mätytan för optisk analys.

Sensorenheten med mätytan var ett "Sensor Chip CM5" (Pharmacia AB, Uppsala) som är en på ett glassubstrat uppburen guldfilm, till vilken är bunden en matris konst- ruerad av en komposit av ett metallskyddsskikt (ett absor- berat enkelskikt av långkedjiga lßo-hydroxialkyltioler) och en kovalent bunden flexibel karboximetylmodifierad dextran- hydrogel med negativ laddning. För framställning av en sådan mätyta hänvisas till vår ovannämnda WO 90/05303.

Mätningarna utfördes väsentligen som beskrivs i vår ovan- nämnda WO 90/05305, vars innehåll införlivas häri genom hänvisning. Den drivbuffert som genomgående användes i exemplen var HBS (Hepes buffer saline), pH 7,4, enligt specificeringen nedan. Ytförändringssvaret vid mätningarna uttrycks i “resonansenheter" (RE); ett svar på 1000 RE motsvarar en 0,l° förskjutning av resonansvinkeln (den _ 11 _ 501 013 vinkel för den infallande ljusstrálen, relativt sensorytan, vid vilken ytplasmonresonans sker) eller en förändring av 2 . . 1 ng/mm 1 ytkoncentrationen.

EXEMPEL 1 Sandwichanalys för 52-mikroglobulin En sandwichanalys för ßz-mikroglobulin utfördes genom att man först immobiliserade en polyklonal antikropp specifikt riktad mot ßz-mikroglobulin på mätytan. Detta utfördes genom' aktivering av ytan med 0,2 M N-etyl-N'-(3-dimetyl-amino- propyl)karbodiimid (EDC) och 0.05 M N-hydroxisuccinimid (NHS) i destillerat vatten, tillförsel av antikroppen i kopplingsbuffert (10 mM natriumacetat, pH 5,0) till ytan och deaktivering av allt överskott av EDC och NHS med 1 M etanolamin, pH 8,5. I en testcykel fick mätytan sedan i följd passeras av ett prov innehållande ßz-mikroglobulin (analyt) respektive ett sekundärreagens i form av en poly- klonal Ig-fraktion (2,5 mg/ml; 10 % specifik aktivitet), och svaret för sekundärreagenset mättes. Varje testcykel av- slutades genom regenerering av ytan med 10 mM HCl, pH 2,2.

Analysen kördes med olika koncentrationer av analyten och vid låg jonstyrka (10 mM Hepes-buffert, 0,005 % Tween 20, pH 7,5), respektive hög jonstyrka (Hepes-buffert innefattande 0,15 M NaCl, pH 7,5) för sekundärreagenset. Resultatet visas i tabell 1 nedan och i figur 1 i ritningarna. 'få _ 12 _ 501 013 TABELL 1 QQE-globulin Svar pà sekundär- reagens ng/ml Låg j.s.* Hög j.s.* 0 72 173 100 563 173 200 1187 417 400 2190 900 800 3360 1888 1000 3738 1672 1600 g - 1862 2000 4847 1912 * j.s. = jonstyrka Som framgàr av tabellen och figur 1 erhålls ett mer än 3 ggr högre svar för den låga jonstyrkan för en analytkoncentration av 100 ng/ml. Vid en analytkoncentration av cirka 800 ng/ml planar sekundärsvaret ut vid hög jonstyrka, medan det fortfarande ökar vid 2000 ng/ml vid hög jonstyrka. Eftersom körningarna utfördes vid ett pH av 7,5 och Ip-värdet för sekundärantikroppen är cirka 8,5, var den sistnämnda positivt laddad vid detta pH.

EXEMPEL 2 Sandwichanalys för luteiniseringshormon En sandwichanalys för luteiniseringshormon utförs på samma sätt som i exempel 1 genom att man först immobiliserar en monoklonal antikropp specifikt riktad mot luteiniserings- hormon (LH) pà mätytan och därefter i följd låter det LH-innehållande provet (analyt) respektive en mcnoklonal _13- 501 013 anti-LH-antikropp som sekundärreagens passera över ytan.

Prov med olika koncentrationer av LH-analyten analyserades genom observation av svaret pà sekundärreagenset vid olika koncentrationer och hög respektive låg jonstyrka (Hepes- buffert med och utan 0,15 M NaCl). Resultaten visas i den följande tabell 2 och i figur 2 i ritningarna.

TABELL 2 Analzt- Svar på sekundärreagens * konc. l mg/ml 1 mg/ml 250 pg/ml 50 pg/ml mU/ml _ Hög j.s. Låg j.s. Làg j.s. Låg j.s. 0 -24 -17 -6 -7 0,5 -41 -ll -3 -7 2 -36 * -1 3 1 10 -10 ' 49 se sz 25 26 121 91 * 100 213 422 447 411 200 334 570 578 543 * Negativa värden beror pà en obetydlig ökning av baslinje- nivån under analysförloppet.

Som framgår av tabellen kan koncentrationen av sekundär- reagenset minskas 20 gànger när buffert med låg jonstyrka används jämfört med motsvarande förfarande vid hög jonstyrka.

Likväl erhålls både högre känslighet och större dynamik. Den högre känsligheten observeras exempelvis vid LH-analyt- koncentrationen 10 mU/ml då sekundärsvaret är 50 RE för làg jonstyrka och en koncentration sekundärreagens av 50 pg/ml, medan samma analytkoncentration inte ger något signifikant svar vid hög jonstyrka och en koncentration sekundärreagens av 1 mg/ml. _ 14 _ 501 013 Motsvarande analyskörningar utfördes för undersökning av sekundärsvarets pH-beroende, och resultaten visas i figur 3 och 4: LH användes i en koncentration av 1000 ng/ml och två olika koncentrationer av sekundär antikropp användes, nämligen 1,0 mg/ml (figur 3) och 50 pg/ml (figur 4). På liknande sätt som i figur 2 ger den làga jonstyrkan vid pH-värden över den sekundära antikroppens Ip (5,3) lägre svar än vid den höga jonstyrkan. Detta beror på att anti- kroppen dà repelleras av matrisens negativa laddning, vilken effekt i viss utsträckning kan kompenseras av högre koncent- rationer. Vid pH-värden under antikroppens Ip är emellertid resultaten motsatta, varvid den låga jonstyrkan ger ett mer än fördubblat svar vid en antikroppskoncentration av 50 pg/ml.

EXEMPEL 3 Blockering av överskott av bindningsställen Kanin-antimus Gl-antikropp (RAMGl) (Pharmacia AB, Uppsala) löst i 10 mM natriumacetat, pH 5,0, till 30 pg/ml, immobili- serades pà mätytan på samma sätt som i exemplen 1 och 2 ovan. Monoklonal specifik mot luteiniseringshormon (LH) och löst i HBS (Hepes buffer saline: l0 mM Hepes, 0,15 M NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,05 % Tween(:) applicerades därefter pà ytan, varpå en blockerande monoklonal antikropp mot alfafetoprotein (AFP) löst i Hepes-buffert (10 mM Hepes, 3,4 mM EDTA, 0,05 % Tween ) med respektive utan NaCl (0,15 M) fick passera över ytan för att blockera alla resterande bindningsställen som inte ockuperats av LH-monoklonalen. LH-analyt (Inter- national Enzymes Inc., U.S.A.) löst i Pharmacia Diluent (Pharmacia AB, Uppsala) till 10 pg/ml fick sedan reagera med ytan. För att testa med avseende pá närvaro av resterande ospecifika RAMG1-ställen fick den ursprungligen bundna monoklonalen àter passera över ytan, varvid bindning av monoklonalen indikerade ineffektiv blockering. _ 15 _ 501 013 Tre olika monoklonaler, betecknade 2, 5 och 10, användes.

Medan monoklonalerna 2 och 5 användes i odlingsmedium, studerades monoklonal 10 både i odlingsmedium och renad i två olika koncentrationer, 7 och 70 pg/ml i HBS-buffert.

Den blockerande antikroppen användes vid hög jonstyrka (med NaCl) i två koncentrationer, 1000 och 250 pg/ml, och vid låg jonstyrka (utan NaCl) i fyra koncentrationer, 0, 50, 10 och 250 ug/ml.

Resultaten visas i figur 5-10.

Som framgår av figurerna kan blockeringen ske mer effektivt och reagensbesparande om den elektrostatiska koncentrerande effekten enligt uppfinningen utnyttjas genom att anordna den blockerande antikroppen i en buffert med låg jonstyrka och vid ett pH under antikroppens Ip (dvs där den är positivt laddad). Detta framgår exempelvis av en jämförelse av staplarna 2 och 3 i figur 5-9, där 250 pg/ml av den ospeci- fikt blockerande antikroppen jämförs vid hög respektive låg jonstyrka.

Figur 8 illustrerar svaren vid användning av renad monoklonal 10 vid 7 pg/ml som första monoklonal och vid 70 pg/ml som andra monoklonal, medan figur 9 visar svaren när koncentra- tionen av renad monoklonal 10 är 70 pg/ml i bägge fallen.

I figur 10 visas att så låga koncentrationer blockerande antikropp som 25 pg/ml fungerar effektivt vid låg jonstyrka; vid 10 pg/ml erhölls ett litet svar vid injicering av den andra monoklonalen.

Föreliggande uppfinning är givetvis inte begränsad till de ovan specifikt beskrivna utföringsformerna, utan många variationer och modifieringar ligger inom ramen för den allmänna uppfinningstanken sådan den anges i de följande patentkraven.

Claims (1)

1. 501 013 16 PATENTKRAV Analysförfarande som innefattar steget att binda en andra substans till en första substans immobiliserad pá en fastfasyta, varvid den första substansen är antingen en ligand eller en komponent bunden direkt eller indirekt till denna, med nämnda första substans immobiliserad på densamma k ä n n e t e c k n a t av att fastfasytan uppvisar en elektrisk laddning, och att reaktionen för att binda nämnda andra substans till den första substansen utförs vid en jonstyrka under 100 mM, och vid sådana pH-betingelser att den elektriska laddningen hos nämnda andra substans är motsatt fastfasytans, så att den andra substansen attraheras elektrostatiskt av fastfasytan för att koncentreras vid den senare. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a t av att steget att binda nämnda andra substans följs av ett steg där ytan utsätts för betingelser med måttlig eller hög jonstyrka för avlägsning av ospecifik bindning. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a t eventuellt modifierade proteiner och polypeptider och av att nämnda andra substans väljs bland fragment och derivat därav. Förfarande enligt patentkrav 3, k à n n e t e c k n a t av att nämnda andra substans är en antikropp eller ett fragment därav eller en funktionell ekvivalent därtill. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 4, k ä n n e t e c k n a t av att bindningen av nämnda andra substans till nämnda första substans är en immunologisk inbindning. 10. 17 501 013 Förfarande enligt nàgot av patentkraven 1 till 5, k ä n n e t e c k n a t av att jonstyrkan är under 20 mM. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 5, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda andra substans är ett sekundärreagens i en analys av sandwichtyp för bindning till en analyt som först har bundit till en ligand immobiliserad på ytan. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 7, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda andra substans är ett blockeringsreagens för att blockera resterande bindningsställen på ett fastfasytskikt efter immobili- sering av en ligand pá detsamma. Förfarande enligt något av patentkraven l till 8, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda fastfasyta innefattar ett elektriskt laddat hydrogelytskikt. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 9, k ä n n e t e c k n a t av att fastfasytan är en mätyta för mätningar baserade pá ytplasmonresonans.