DE69117067T2

DE69117067T2 - Verbesserung bei festphasenbindungs-analysenverfahren

Info

Publication number: DE69117067T2
Application number: DE69117067T
Authority: DE
Inventors: Katarina Lagerstroem; Stefan Loefas; Inger Roennberg
Original assignee: Pharmacia Biosensor AB
Current assignee: Biacore AB
Priority date: 1990-10-01
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2011-09-27
Also published as: JPH06501555A; EP0553229B1; SE9003122D0; US5716854A; WO1992006380A1; SE9003122L; DE69117067D1; SE501013C2; EP0553229A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung von Assayverfahren, umfassend die spezifische Bindung einer zweiten Substanz an eine bereits an eine Festphasenoberfläche gebundenen ersten Substanz.
In der WO 90/05303 der Erfinder werden Meßoberflächen mit der Fähigkeit zur selektiven biomolekularen Wechselwirkungen und mit der Ausrichtung als Verwendung in Biosensorsystemen, insbesondere in Systemen, basierend auf der Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR) beschrieben. Bei diesem Typ von optischen Biosensoren werden Veränderungen im Brechungsindex in einer Schicht in der Nähe eines dünnen Metallfilms durch folgende Veränderungen in der Intensität eines vollständig reflektierten Lichtstrahls nachgewiesen. Bezüglich einer ausführlicheren Beschreibung eines solchen Biosensors wird auf die WO 90/05295 der Anmelder, die ein optisches Biosensorsystem betrifft, und die WO 90/05305 der Anmelder, die eine Sensoreinheit und deren Verwendung in Biosensorsystemen betrifft, verwiesen.
Die vorstehend genannten Meßoberflächen umfassen einen Film aus einem Metall mit freien Elektronen, bevorzugt Silber oder Gold, von denen eine der Seiten mit einer dichtgepackten einschichtigen Schicht spezifischer organischer Moleküle beschichtet ist. Auf diese einschichtige Schicht wird eine biokompatible poröse Matrix, z.B. ein Hydrogel, gebunden, wobei die Matrix zur Immobilisierung eines geeigneten Liganden für ein Zielbiomolekül, das durch den speziellen Biosensor bestimmt werden soll, verwendet wird.
Um zu veranlassen, daß die Matrix einen gewünschten Liganden bindet, wird sie durch Einbringen geeigneter funktioneller Gruppen aktiviert, wobei die Matrix dadurch normalerweise eine positive oder negative Nettoladung erhält. Vorausgesetzt, daß der zu bindende Ligand, typischerweise ein Protein, die entgegengesetzte Ladung besitzt, konzentriert die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Liganden und der Matrix den Liganden auf der Oberfläche und gewährleistet dadurch eine effiziente Bindung des Liganden an der Oberfläche. Eine solche Bindung an elektrisch geladene Oberflächen ist auf dem Fachgebiet seit langem gut bekannt, wie beispielsweise bei der Enzymimmobilisation und der Affinitätschromatographie (vergleiche z.B. US-A-4 829 009, WO 83/02954 und J. Immunol. Methods 1988, Bd. 111(2), 5. 157-66).
Obwohl eine solche elektrostatische Wirkung zur Bindung von Liganden vorteilhaft ist, nimmt man bisher an, daß die mögliche Anwesenheit einer Restladung auf der Oberfläche nach der Bindung des Liganden eine mögliche Quelle für Probleme bei den anschließenden analytischen Stufen wegen uner wunschter ionischer Wechselwirkungen mit der Probe ist.
Erfindungsgemäß wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Bereitstellung einer Restladung auf der festen Oberfläche, die nach der Bindung eines Liganden darauf verbleibt, vorteilhafterweise verwendet werden kann, um die Bindung eines analytischen Teilchens in den anschließenden Stufen eines speziellen Assays, der auf der Festphasenoberfläche durchgeführt werden soll, zu erleichtern und zu optimieren. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Ausdruck "analytisches Teilchen" jedes beliebige reaktive Teilchen, das in dem Assay verwendet wird, ausgenommen der anfänglich gebundene Ligand. So kann beispielsweise in einem Assay vom Sandwich-Typ der sogenannte zweite Antikörper (der in einem SPR-Assay als "Verstärkungsmittel" dient) effizient auf der Matrix durch die erzeugte elektrostatische Wechselwirkung konzentriert werden, wodurch eine im wesentlichen vollständige Bindung an den bereits an den Liganden gebundenen ersten Analyt erfolgt, vorausgesetzt, einerseits die Matrix besitzt eine Ursprungsladung, die ausreicht, eine Restladung nach der Immobilisation des Liganden darauf zu hinterlassen und andererseits, daß die Reaktionsbedingungen geeigneterweise hinsichtlich Ionenstärke und pH- Wert ausgewählt sind.
So umfassen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die Reaktionsbedingungen eine niedrige Ionenstärke und einen geeigneten pH-Wert des Reaktionsmediums, um eine negative oder positive Ladung des zweiten Antikörpers, entgegengesetzt zu der Ladung der Festphasenoberfläche, zu gewährleisten, im Gegensatz zu den physiologischen Bedingungen, die im Stand der Technik verwendet wurden, d.h. mittlere Ionenstärke und ungefähr neutraler pH- Wert. Beispielsweise sollte im Falle einer negativen Restladung der Matrix der pH-Wert unter dem isoelektrischen Punkt des Antikörpers gewählt werden, um den zuletztgenannten positiv geladen zu machen und umgekehrt. Unter diesen Bedingungen werden die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen solchen entgegengesetzten Ladungen der Matrix und dem zweiten Antikörper verwendet, ohne daß zuviele Suchionen vorhanden sind. Man nimmt auch an, daß unter solchen Bedingungen die Matrix an sich infolge der internen Abstoßung in der Polymerschicht offener ist, wodurch eine erhöhte Verfügbarkeit des gebundenen Analyten bereitgestellt wird.
Um zu gewährleisten, daß nur die gewünschte spezifisch aktive Substanz auf der Oberfläche gebunden wird, deren Bedeutung natürlich von der speziellen Anwendung abhängt, kann es anschließend an die Bindungsstufe durch die elektrostatisch verursachte Konzentration des zweiten Reagenses erfindungsgemäß gefördert werden, daß es notwendig ist, die Oberfläche Bedingungen mäßiger oder hoher Ionenstärke zu unterwerfen, um die Teilchen, die nur elektrostatisch gebunden wurden, zu entfernen.
Die Verbesserungen, die aus der Durchführung eines Assays, wie vorstehend, im Gegensatz zu normalen Bedingungen hervorgehen, liegen in (i) der höheren Empfindlichkeit und einem größeren dynamischen Bereich des Assays, (ii) beträchtlich reduziertem Verbrauch des zweiten Antikörpers, und (iii) schnelleren Analysen.
Es ist klar, daß die vorstehend beschriebene Konzentrationswirkung, die durch die elektrostatische Wechselwirkung hervorgerufen wird, nicht nur in anderen Typen von SPR-Assays als Sandwich-Assay verwendet werden kann, wie nachstehend weiter erklärt wird, sondern auch allgemein in analytischen Verfahren insgesamt verwendet werden kann, z.B. in an sich herkömmlichen Analysen vom ELISA-Typ, solange sie mit der Verwendung einer modifizierten oder durch eine geladene Matrix eines geeigneten Typs modifizierbaren festen Phase verbunden sind.
In ihrem breitesten Gesichtspunkt betrifft die Erfindung somit ein Assayverfahren, umfassend eine Bindungsstufe einer zweiten Substanz an eine erste Substanz, welche an einer Festphasenoberfläche immobilisiert ist, wobei die erste Substanz entweder ein Ligand oder eine Spezies, direkt oder indirekt daran gebunden, ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Festphasenoberfläche, die die erste Substanz daran immobilisiert enthält, eine elektrische Ladung aufweist, und daß die Bindungsreaktion der zweiten Substanz an die erste Substanz bei einer Ionenstärke unter 100 mM und solchen pH-Bedingungen erfolgt, daß die elektrische Ladung der zweiten Substanz entgegengesetzt zu der der Festphasenoberfläche ist, so daß die zweite Substanz elektrostatisch von der Festphasenoberfläche angezogen wird.
Wie vorstehend erwähnt, kann das Verfahren die Stufe umfassen, daß man die Oberfläche Bedingungen höherer Ionenstärke nach der Bindung der zweiten Substanz unterwirft, um die unspezifische Bindung zu entfernen.
Es wird darauf hingewiesen, daß, obwohl die Erfindung grundlegend auf alle Stufen in einem Assay im Anschluß an die Immobilisation des Liganden anwendbar ist, die zweite Substanz, insbesondere in immunologischen Assays meistens der in dem Assay zu bestimmende Analyt ist, da die zu testende Probe üblicherweise nicht den gewünschten Bedingungen hinsichtlich Ionenstärke und/oder pH-Wert entspricht, und es üblicherweise nicht erwünscht ist, die Probenumgebung, z.B. für eine Serumprobe, zu stören. In bestimmten Fällen kann jedoch die elektrostatische Konzentrationswirkung der Erfindung auch zur Bindung des Analyten in Abhängigkeit von der speziellen Probe verwendet werden.
So ist in einer Ausführungsform der Erfindung die zweite Substanz die zweite Komponente in einem Assay vom Sandwich-Typ, wie bereits vorstehend diskutiert.
In einer weiteren Ausführungsform ist die zweite Substanz ein Mittel, das verwendet wird, um verbleibende Bindungsstellen nach der Immobilisation des Liganden auf der Oberfläche zu blockieren, wobei die Stellen sonst ein spezielles analytisches Verfahren stören würden.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist die zweite Substanz ein Analyt, wobei das erfindungsgemäße Verfahren z.B. verwendet wird, um die Menge an Aktivität (Liganden) zu bestimmen, die auf einer Oberfläche immobilisiert sind.
Grundlegend kann jedoch die zweite Substanz jede beliebige analytische Substanz sein, für die die spezifizierten Reaktionsbedingungen zweckdienlicherweise ohne irgendwelche negativen praktischen Implikationen angewendet werden können.
Die zweite Substanz ist typischerweise ein Protein oder Polypeptid oder aktives Fragment davon, aber kann im allgemeinen jede beliebige Substanz sein, die in einem gewünschten Festphasenassay binden kann. Wie leicht klar ist, ist diese zweite Substanz in erster Linie ein Molekül eines größeren Typs, z.B. ein Makromolekül, wobei die Diffusionsrate für kleinere Moleküle größer ist und die durch die Erfindung erzielte Wirkung dadurch weniger bedeutungsvoll ist.
Wie einem Fachmann leicht klar ist, kann die vorstehend genannte erste Substanz insbesondere als Analyt, beispielsweise ein Protein oder Polypeptid, wie ein Antigen oder Antikörper, Protein A oder G, ein Enzym, ein Lectin, Avidin etc., oder ein Hapten, Hormon, Zucker, Biotion, Toxin, Vitamin etc., sein.
Die vorstehend genannten Proteine und Polypeptide und Fragmente davon umfassen natürlich sowohl natürliche als auch synthetische oder semi-synthetische Substanzen, wie durch chemische Mittel oder auf gentechnischem Weg modifizierte Proteine und Polypeptide. Ein Beispiel sind Chimäre, d.h. bi- oder polyfunktionelle Moleküle, wie bi- oder polyfunktionelle Antikörper. Für die Anwendung solcher Moleküle im Zusammenhang mit Biosensor-Oberflächen kann auf die vorstehend genannte WO 90/05305 der Erfinder Bezug genommen werden. Auch kann z.B. bei einem Sandwich-Typ-Assay das zweite Reagens ein bifunktioneller Antikörper oder ein anderes Molekül sein, das die anschließende Reaktion mit einem dritten Reagens erlaubt.
Die vorstehend genannte Festphasen-Oberflächenschicht hängt von dem Typ des verwendeten analytischen Verfahrens ab. Für Biosensor-Anwendungen, z.B. SPR oder elektrochemische Biosensoren, kann diese Schicht eine Polymerschicht, bevorzugt ein Hydrogel, wie eine Dextranschicht, die an eine Metalloberfläche gebunden ist, sein. Für die Bindung eines Liganden daran wird die Polymerschicht mit geeigneten funktionellen Gruppen versehen, und als Ergebnis davon kann die Oberflächenschicht eine positive oder negative elektrische Restladung erhalten, die für die erfindungsgemäßen Zwecke ausreicht, aber eine solche elektrische Ladung kann auch in einer separaten Behandlung der Oberflächenschicht eingeführt werden. Beispiele für Oberflächen für Biosensor-Anwendungen sind in der vorstehend genannten WO 90/05303 der Erfinder angegeben, worauf hiermit Bezug genommen wird.
Wie aus den vorstehenden Ausführungen hervorgeht, ist "niedrige Ionenstärke" im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung als unter 100 mM definiert, wobei die "normale" Ionenstärke bei den typischen immunologischen Verfahren etwa 150 mM beträgt. Bevorzugt ist jedoch die Ionenstärke niedriger als 50 mM und noch bevorzugter liegt sie unter 20 mM. Obwohl die Ionenstärke in der theoretisch idealen Situation mindestens nahe null liegen sollte, würde dies in den meisten praktischen Fällen infolge beispielsweise Stabilitätsüberlegungen für Proteine etc. nicht möglich sein.
Der notwendige pH-Wert, um eine geeignete Ladung der zweiten Substanz zu gewährleisten, wird natürlich mit der Natur der speziellen Substanz variieren. Beispielsweise hängt im Falle eines Proteins der auszuwählende pH- Wert von dem isoelektrischen Punkt (Ip) des Proteins ab, wobei eine negative Ladung bei pH-Werten über dem und eine positive Ladung bei pH-Werten unter dem Ip erhalten wird. Für ein spezielles Protein mit einem spezifischen Ip sollte der zu wählende pH-Wert sich im allgemeinen von dem Ip um mindestens 0,5 in der gewünschten Richtung unterscheiden. Einige Proteinproben, wie beispielsweise ein Gemisch aus polydonalen Antikörpern, kann einen pH-Bereich anstelle eines einzelnen pH-Werts für seinen Ip zeigen, und in einem solchen Fall sollte sich die vorstehend angegebene pH-Differenz natürlich stattdessen auf den relevanten Grenzbereich des pH-Intervalls beziehen, d.h. bei oder unter 4,5 für ein polyclonales Gemisch mit einem pH-Bereich von 5 bis 8. In diesem Zusammenhang ist auch festzustellen, daß der Ip-Wert eines spezifischen Proteins durch an sich herkömmliche Verfahren modifiziert werden kann, so daß er beispielsweise einer speziellen geladenen Matrix angepaßt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders für Assays vom immunchemischen Typ oder analytische Verfahren, insbesondere Verfahren im Zusammenhang mit Biosensoren. Wie bereits vorstehend diskutiert wurde, läßt sich das erfindungsgemäße Konzept somit vorteilhafterweise auf die Bindung von zweiten Antikörpern in einem immunologischen Sandwich-Assay anwenden, dessen Empfindlichkeit ebenso wie dessen dynamischer Reaktionsbereich beträchtlich erhöht wird.
Eine weitere wertvolle Anwendung der Erfindung, die ebenfalls vorstehend erwähnt wurde, ist die effiziente Blockierung überflüssiger Bindungsstellen. Dies ist beispielsweise bei der sogenannten Epitop-Kartierung durch die Biosensor-Technik nützlich (vergleiche z.B. die WO 90/05306 der Erfinder, die sich auf die Charakterisierung von Makromolekülen mittels der Biosensor- Technik bezieht), wobei ein monoclonaler Antikörper zuerst an eine Meßoberfläche gebunden wird, auf der Antikörper immobilisiert sind, die im allgemeinen Maus-Antikörper binden können (z.B. des Typs Kaninchen-Anti-Maus-G1 oder -Fc). Die Kartierung wird dann so durchgeführt, daß man nacheinander den Analyt (Antigen) und einen zweiten spezifischen monoclonalen Antikörper über die Oberfläche passieren läßt, wobei die Bindung des zuletzt genannten anzeigt, daß die beiden monoclonalen Antikörper an unterschiedliche Stellen auf dem Antigen binden. Wie leicht zu verstehen ist, muß die Menge des allgemein bindenden Antikörpers, der auf der Oberfläche immobilisiert ist, relativ hoch sein, um die Bindung einer ausreichenden Menge des ersten monoclonalen Antikörpers aus der relativ niedrigen Konzentration, die beispielsweise in einem Kulturmedium vorhanden ist, zu erlauben. Da der zweite monoclonale Antikörper nicht an den zuerst immobilisierten allgemein bindenden Antikörper binden darf, was als eine falsch positive Antwort interpretiert werden würde, müssen überflüssige Bindungsstellen des allgemein bindenden Antikörpers, die von dem ersten monoclonalen Antikörper nicht eingenommen werden, durch nichtspezifische Antikörper blockiert werden. Erfindungsgemäß kann dies auf eine effizientere und reagenssparendere Weise durchgeführt werden, wenn die vorstehend beschriebene elektrostatische Konzentrationswirkung durch Bereitstellen des blockierenden Antikörpers in einem Puffer mit niedriger Ionenstärke und bei einem pH-Wert, der dem blockierenden Antikörper eine Ladung verleiht, die der der Meßoberflächenmatrix entgegengesetzt ist, verwendet wird.
Das gleiche Konzept kann verwendet werden, um überflüssige Bindungsstellen auf einer Oberfläche, an die Protein A oder G immobilisiert ist, zu blockieren, um zu bewirken, daß sie allgemein polydonale Antikörper binden kann. In diesem Fall kann die elektrostatische Wirkung in Abhängigkeit von dem pH-Wert verwendet werden, um sowohl die Bindung des Liganden an das Protein A oder G als auch die anschließende Blockierung verbleibender Bindungsstellen zu verbessern.
Anschließend wird die Erfindung anhand einiger spezifischer Beispiele beschrieben, die nur der Erläuterung dienen und die in keiner Hinsicht als Beschränkung aufgefaßt werden sollen. In diesem Zusammenhang wird auf die beigefügten Figuren verwiesen. Darin ist:
Figur 1 ist eine graphische Darstellung, die die Antwort der Oberflächenveränderung bei Bindung des zweiten Antikörpers an eine Biosensor- Oberfläche in einen Sandwich-Assay auf ß&sub2;-Mikroglobulin bei hoher ( ) bzw. niedriger ( ) Ionenstärke zeigt;
Figur 2 eine ähnliche graphische Darstellung wie Figur 1, die die Antwort der Oberflächenveränderung bei Bindung eines zweiten Antikörpers an eine Biosensor-Oberfläche in einem Sandwich-Assay auf luteinisierendes Hormon (LH) bei (i) einer Konzentration an zweitem Antikörper von 1 mg/ml bei hoher ( ) und niedriger ( ) Ionenstärke; (ii) einer Konzentration des zweiten Antikörpers von 250 µg/ml bei niedriger Ionenstärke ( ); und (iii) einer Konzentration des zweiten Antikörpers von 50 µg/ml ( ) bei niedriger Ionenstärke zeigt;
Figuren 3 und 4 Blockdiagramme, die die pH-Abhängigkeit der Antwort der Oberflächenveränderung für die Bindung des zweiten Antikörpers an eine Biosensor-Oberfläche in einem Sandwich-Assay auf LH bei Konzentrationen des zweiten Antikörpers von 1,0 mg/ml (Figur 3) bzw. 50 µg/ml (Figur 4) zeigen;
Figuren 5 bis 7 Blockdiagramme, die die Antwort der Oberflächenveränderung einer Biosensor-Oberfläche für die aufeinanderfolgende Bindung eines monoclonalen Antikörpers (W); blockierenden Antikörpers ( ), LH ( ) und die mögliche anschließende Bindung des ursprünglichen monoclonalen Antikörpers ( ) für drei unterschiedliche monoclonale Antikörper in Kulturmedium bei unterschiedlichen Konzentrationen des blockierenden Antikörpers und bei hoher bzw. niedriger Ionenstärke zeigen;
Figur 8 ein ähnliches Blockdiagramm wie die Figuren 5 bis 7, aber mit einem gereinigten monoclonalen Antikörper und mit einer höheren Konzentration an zugesetztem monoclonalem Antikörper bei der zweiten Zugabe als bei der ersten Zugabe davon;
Figur 9 ein ähnliches Blockdiagramm wie Figur 8 mit gereinigtem monoclonalem Antikörper, aber unter Verwendung der gleichen Konzentration davon, sowohl für die erste als auch die zweite Zugabe des monoclonalen Antikörpers; und
Figur 10 ein ähnliches Blockdiagramm wie die Figuren 5 bis 9 für die Antwort bei niedriger Ionenstärke für vier unterschiedliche Konzentrationen des blockierenden Antikörpers.
Alle Assays in den Beispielen wurden mit einem Oberflächen-Plasmonresonanz-Biosensorsystem eines Typs, der in der WO 90/05295 der Anmelder offenbart ist (auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird) und nun unter der Marke BIAcore von Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden, vertrieben wird, durchgeführt. Dieses Biosensorsystem umfaßt eine austauschbare Sensoreinheit, eine Blockeinheit zur Handhabung einer Flüssigkeit mit einem Fördersystem zum Transport der Reagens- und Probenlösungen über die Meßoberfläche der Sensoreinheit, eine optische Einheit, die einfallende Lichtstrahlen an die Meßoberfläche weiterleitet und die reflektierte Strahlung detektiert, und eine Bewertungseinheit, die nach der Kalibration das Detektorsignal in einen Parameter, der der Substanzmenge auf der Meßoberfläche proportional ist, transformiert. Bei der Durchführung einer Messung wird ein definiertes Probenflüssigkeitsvolumen durch Injektion in einen definierten Leitungsabschnitt eingebracht, wobei das Flüssigkeitsvolumen dann durch die Elutionsflüssigkeit oder den Trägerpuffer durch die Meßoberfläche für die optische Analyse geleitet wird.
Die Sensoreinheit mit der Meßoberfläche war ein Sensorchip CM 5 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden), der ein von einem Glassubstrat getragener Goldfilm ist, auf den eine Matrix gebunden ist, die aus einem Verbundstoff aus einer Metallschutzschicht (eine adsorbierte einzellige Schicht eines langkettigen 1,ω-Hydroxyalkylthiols) und eines covalent gebundenen flexiblen Carboxymethyl-modifizierten Dextran-Hydrogels mit einer negativen Ladung hergestellt ist. Zur Herstellung einer solchen Meßoberfläche wird auf die vorstehend genannte WO 90/05303 der Anmelder Bezug genommen.
Die Messungen wurden im wesentlichen, wie in der vorstehend genannten WO 90/05305 der Erfinder beschrieben, durchgeführt, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Der in den Beispielen verwendete Trägerpuffer war HBS (Hepes-Puffer-Kochsalzlösung), pH 7,4, wie vorstehend angegeben. Die Antwort der Oberflächenveränderung bei den Messungen ist als "Resonanz-Einheiten" (RE) ausgedrückt. Eine Antwort von 1000 RE entspricht einer Verschiebung von 0,10 im Resonanzwinkel (der Winkel des einfallenden Lichtstrahls, bezogen auf die Meßoberfläche, auf der die Oberflächen-Plasmonresonanz eintritt) oder einer Veränderung von 1 ng/mm² in der Oberflächenkonzentration.

BEISPIEL 1

Sandwich-Assay auf β&sub2;-Nikroglobulin

Ein Sandwich-Assay auf β&sub2;-Mikroglobulin wurde so durchgeführt, daß zuerst ein polyclonaler Antikörper, der spezifisch gegen β&sub2;-Mikroglobulin gerichtet ist, auf der Meßoberfläche immobilisiert wurde. Dies wurde durch Aktivieren der Oberfläche mit 0,2 M N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und 0,05 M N-Hydroxysuccinimid (NHS) in destilliertem Wasser, Aufbringen des Antikörpers in einem Kopplungspuffer (10 mM Natriumacetat, pH 5,0) auf die Oberfläche und Entaktivieren jedes Überschusses an EDC und NHS mit 1 M Ethanolamin, pH 8,5, durchgeführt. In einem Testzyklus wurde die Meßoberfläche dann aufeinanderfolgend durch eine Probe, die β&sub2;-Mikroglobulin (Analyt) bzw. ein zweites Reagens in Form einer polyclonalen Ig- Freaktion (2,5 mg/ml; 10% spezifische Aktivität) enthielt, überzogen, und die Antwort auf das zweite Reagens wurde gemessen. Jeder Testzyklus wurde durch Regenerieren der Oberfläche mit 10 mM HCl, pH 2,2, beendet. Der Assay wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen an Analyt und mit niedriger Ionenstärke (10 mM Hepes-Puffer, 0,005% Tween 20, pH 7,5) bzw. hoher Ionenstärke (Hepes- Puffer einschließlich 0,15 M NaCl, pH 7,5) des zweiten Reagenses durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 und in der Figur 1 der Figuren gezeigt. Tabelle 1 β&sub2;µ-Globulin ng/ml Antwort des zweiten Reagenses Niedrige i.s.* Hohe i.s.* * i.s. = Ionenstärke
Aus der Tabelle und der Figur 1 geht eine mehr als 3fach höhere Antwort für die niedrige Ionenstärke für eine Analytkonzentration von 100 ng/ml hervor. Bei einer Analytkonzentration von etwa 800 ng/ml überwiegt die zweite Antwort bei hoher Ionenstärke, wohingegen sie bei 2000 ng/ml bei niedriger Ionenstärke immer noch zunimmt. Da die Läufe bei einem pH-Wert von 7,5 durchgeführt wurden, und der Ip-Wert des zweiten Antikörpers etwa 8,5 beträgt, war der zuletzt Genannte bei diesem pH-Wert positiv geladen.

BEISPIEL 2

Sandwich-Assay auf luteinisierendes Hormon

Ein Sandwich-Assay auf luteinisierendes Hormon wird, wie in Beispiel 1, dadurch durchgeführt, daß zuerst ein spezifisch gegen das luteinisierende Hormon (LH) gerichteter monoclonaler Antikörper auf der Meßoberfläche immobilisiert wird und dann aufeinanderfolgend die LH-haltige Probe (Analyt) bzw. ein monoclonaler Anti-LH-Antikörper als zweites Reagens über die Oberfläche laufengelassen wird. Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen des LH-Analyts wurden dadurch analysiert, daß man die Antwort des zweiten Reagenses bei unterschiedlichen Konzentrationen bzw. hoher und niedriger Ionenstärke (Hepes-Puffer mit und ohne 0,15 M NaCl) analysiert.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 und in der Figur 2 der Figuren dargestellt. TABELLE 2 Antwort des zweiten Reagenses Analytkonzentration mE/ml 1 mg/ml Hohe i.s. µg/ml Niedrige i.s. * Negative Werte werden durch eine leichte Abnahme der Grundlinie im Verlauf des Assays verursacht.
Aus der Tabelle geht hervor, daß die Konzentration des zweiten Reagens 20fach erniedrigt werden kann, wenn ein Puffer mit niedriger Ionenstärke, verglichen mit dem entsprechenden Verfahren bei hoher Ionenstärke, verwendet wird. Jedoch wird sowohl eine höhere Empfindlichkeit als auch eine größere Dynamik erhalten. Die höhere Empfindlichkeit wird beispielsweise bei einer LH-Analytkonzentration von 10 mE/ml beobachtet, wenn die zweite Antwort 50 RE bei niedriger Ionenstärke und die Konzentration des zweiten Reagens 50 µg/ml beträgt, während die gleiche Analytkonzentration keine signifikante Antwort bei hoher Ionenstärke und einer Konzentration an zweitem Reagens von 1 mg/ml ergibt.
Entsprechende Assayläufe wurden durchgeführt, um die pH-Abhängigkeit der zweiten Antwort zu untersuchen, und die Ergebnisse sind in den Figuren 3 und 4 gezeigt; LH wurde bei einer Konzentration von 1000 ng/ml verwendet und zwei unterschiedliche Konzentrationen des zweiten Antikörpers wurden verwendet, d.h. 1,0 mg/ml (Figur 3) und 50 µg/ml (Figur 4). Ähnlich wie in Figur 2 ergibt bei pH-Werten über dem des 1 des zweiten Antikörpers (5,3) die niedrige Ionenstärke niedrigere Antworten als diejenigen mit der hohen Ionenstärke. Dies ist darauf zurückzuführen, daß der Antikörper dann durch die negative Ladung der Matrix abgestoßen wird, was in einem gewissen Ausmaß durch höhere Konzentrationen kompensiert werden kann. Bei pH-Werten unter dem des Antikörpers sind die Ergebnisse jedoch umgekehrt, wobei die niedrige Ionenstärke eine mehr als doppelt so große Antwort bei einer Antikörperkonzentration von 50 µg/ml ergibt.

BEISPIEL 3

Blockierung der überflüssigen Bindungsstellen

Kaninchen-Anti-Maus-G1-Antikörper (RAMG1) (Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala, Schweden), aufgelöst in 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, bis 30 µg/ml wurde auf der Meßoberfläche, wie in den vorstehenden Beispielen 1 und 2, immobilisiert. Ein für das luteinisierende Hormon (LH) spezifischer monoclonaler Antikörper, aufgelöst in HBS (Hepes-Puffer-Kochsalzlösung: 10 mM Hepes, 0,15 M NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,05% Tween ) wurde auf die Oberfläche aufgebracht, worauf ein blockierender monoclonaler Antikörper gegen α-Fetoprotein (AFP), aufgelöst in Hepes-Puffer (10 mM Hepes, 3,4 mM EDTA, 0,05% Tween ) mit bzw. ohne NaCl (0,15 M) über die Oberfläche geleitet wurde, um alle verbleibenden restlichen Bindungsstellen, die von dem monoclonalen LH-Antikörper nicht eingenommen wurden, zu blockieren. Der LH-Analyt (International Enzymes Inc., USA), aufgelöst in Pharmacia Diluent (Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala, Schweden) bis zu 10 µg/ml wurde dann mit der Oberfläche reagieren gelassen. Um auf die Anwesenheit von nicht-spezifischen RAMG1-Reststellen zu testen, wurde der ursprünglich gebundene monoclonale Antikörper erneut über die Oberfläche geleitet, wobei eine Bindung des monoclonalen Antikörpers eine ineffiziente Blockierung anzeigte.
Drei unterschiedliche monoclonale Antikörper mit den Bezeichnungen 2, 5 und 10 wurden verwendet. Wohingegen die monoclonalen Antikörper 2 und 5 in Kulturmedium verwendet wurden, wurde der monoclonale Antikörper 10 sowohl in Kulturmedium als auch in gereinigter Form in zwei unterschiedlichen Konzentrationen, 7 und 70 µg/ml in HBS-Puffer, untersucht.
Der blockierende Antikörper wurde bei hoher Ionenstärke (mit NaCl) bei zwei Konzentrationen, 1000 und 250 µg/ml, und bei niedriger Ionenstärke (ohne NaCl) bei vier Konzentrationen, 0, 50, 10 und 250 µg/ml, getestet.
Die Ergebnisse sind in den Figuren 5 bis 10 gezeigt.
Aus den Figuren geht hervor, daß die Blockierung viel effizienter und reagenssparender durchgeführt werden kann, wenn die elektrostatische Konzentrationswirkung der Erfindung verwendet wird, indem ein blockierender Antikörper in einen Puffer mit niedriger Ionenstärke und bei einem pH-Wert unter dem des Antikörpers verwendet wird (d.h., bei dem er positiv geladen ist). Dies kann beispielsweise aus einem Vergleich der Blöcke 2 und 3 in den Figuren 5 bis 9 hervorgehen, bei denen 250 µg/ml des nicht-spezifischen blockierenden Antikörpers bei hoher bzw. niedriger Ionenstärke verglichen werden.
Die Figur 8 erläutert die Antwort bei Verwendung des gereinigten monoclonalen Antikörpers 10 bei 7 µg/ml als erstem monoclonalem Antikörper und bei 70 µg/ml als zweitem monoclonalem Antikörper, wohingegen die Figur 9 die Antworten zeigt, wenn die Konzentration des gereinigten monoclonalen Antikörpers 10 70 µg/ml in beiden Fällen beträgt.
In Figur 10 wird gezeigt, daß niedrige Konzentrationen des blockierenden Antikörpers von nur 25 µg/ml effizient bei niedriger Ionenstärke wirken; bei 10 µg/ml wurde eine kleine Antwort bei Injektion des zweiten monoclonalen Antikörpers erhalten.
Die vorliegende Erfindung ist natürlich nicht auf die vorstehend speziell beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern viele Variationen und Modifikationen fallen in den Rahmen des allgemeinen erfindungsgemäßen Konzepts, das in den nachstehenden Patentansprüchen angegeben ist.

Claims

1. Assayverfahren, umfassend eine Bindungsstufe einer zweiten Substanz an eine erste Substanz, welche an einer festen Phasenoberfläche immobilisiert ist, wobei die erste Substanz entweder ein Ligand oder ein Spezies, direkt oder indirekt daran gebunden, ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphasenoberfläche, die die erste Substanz daran immobilisiert enthält, eine elektrische Ladung aufweist und daß die Bindungsreaktion der zweiten Substanz an die erste Substanz bei einer Ionenstärke unter 100 mM und solchen pH-Bedingungen erfolgt, daß die elektrische Ladung der zweiten Substanz entgegengesetzt zu der der Festphasenoberfläche ist, so daß die zweite Substanz elektrostatisch von der Festphasenoberfläche angezogen und daran konzentriert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Bindungsstufe der zweiten Substanz eine Stufe folgt, bei der die Oberflache Bedingungen mit mäßiger oder hoher Ionenstärke änterworfen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Substanz ausgewählt wird aus gegebenenfalls modifizierten Proteinen und Polypeptiden und Fragmenten und den Derivaten davon.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Substanz ein Antikörper oder ein Fragment oder ein funktionelles Äquivalent davon ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsreaktion der zweiten Substanz an die erste Substanz eine immunochemische Reaktion ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenstärke unter 20 mM liegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Substanz ein sekundäres Reagens in einem Assay des Sandwichtyps für die Bindung an einen Analyten ist, der zuerst an einen Liganden gebunden worden ist, der an der Oberfläche immobilisiert ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 71 dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Substanz ein Maskierungsreagens für die Maskierung von restlichen Bindungsstellen der festen Phasenoberflächenschicht nach der Immobilisierung eines Liganden daran ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phasenoberfläche eine elektrisch geladene Hydrogel-Oberflächenschicht umfaßt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet daß die feste Phasenoberfläche eine Meßoberfläche für Messungen auf der Grundlage von Oberflächen-Plasmonresonanz ist.