DE2512730A1

DE2512730A1 - Verfahren zum nachweis einer immunologischen reaktion und zur bestimmung der konzentration immunologisch reaktiver biologischer teilchen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2512730A1
Application number: DE19752512730
Authority: DE
Inventors: Ivar Giaever
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1974-04-01
Filing date: 1975-03-22
Publication date: 1975-10-16
Also published as: DE2512730C2; CH625625A5; FR2274919A1; US3960489A; US3960490A; US3960491A; GB1514192A; FR2274919B1

Description

1 River Road SCHENECTADY, N. Y. /U.S.A.

Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Reaktion und zur Bestimmung der Konzentration immunologisch reaktiver biologischer Teilchen sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für den hochempfindlichen Nachweis einer immunologischen Reaktion und zur Bestimmung der Konzentration immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer Probe und insbesondere um einen dauerhaften Nachweis der quantitativen Bestimmung einer Antigen/Antikörper-Reaktion auf der Oberfläche eines festen Substrates zu erhalten, der für das bloße Auge sichtbar ist, ohne daß die Notwendigkeit besteht, eine Anfärbung vorzunehmen, und die Erfindung betrifft weiter eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Immunologische Reaktionen sind hoch spezifische biologische Reaktionen, in denen ein erstes immunologisch reaktives biochemisches Teilchen (im allgemeinen ein Protein), das als Antigen bekannt ist, sich mit einem zweiten Protein verbindet, das

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spezifisch für das Antigen ist und als Antikörper bekannt ist, wobei ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen finden innerhalb eines biologischen Systems, wie einem Tier oder einem Menschen, statt und solche Reaktionen sind lebenswichtig zur Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlaßt der Eintritt eines Fremdproteins, d.h. eines Antigens, das biologische System zur Bildung spezifischer Antikörperproteine gegenüber dem Antigen in einem Verfahren, das bisher noch nicht voll verstanden ist. Die Antikörperprotein-Moleküle weisen verfügbare chemische Bindestellen auf, die komplementär zu denen der Antigen-Moleküle sind, so daß sich Antigen und Antikörper unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins miteinander verbinden.

Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten Proteine als einen wesentlichen Teil, während alle Antikörper Proteine sind. Proteine sind große Moleküle von hohem Molekulargewicht, d.h. Polymere, die aus Ketten einer unterschiedlichen Zahl von Aminosäuren bestehen. In den DT-OS 23 30 702 und 2k 33 246 ist offenbart, daß ein willkürlich ausgewähltes Protein an einer Substratoberfläche nur in einer monomolekularen Schicht haftet und daß kein anderes willkürlich ausgewähltes Protein an dieser ersten Proteinschicht haften wird. Ein spezifisch mit dem adsorbierten ersten Protein reagierendes Protein wird sich jedoch immunologisch mit dieser ersten Proteinschicht verbinden. Diese Peststellung ist gemäß den oben genannten Druckschriften dazu benutzt worden, medizinisch diagnostische Vorrichtungen zu schaffen, in denen eine Substratoberfläche, wie ein Objektträger, mit einer monomolekularen Schicht adsorbierten Proteins dazu benutzt wird, Lösungen zu untersuchen, in denen man die Anwesenheit des spezifisch reagierenden Proteins dafür vermutet* Ist das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann weist die Substratoberfläche, nachdem man sie der Lösung ausgesetzt hat, eine bimolekulare Proteinschicht auf. Ist das spezifisch reagierende Protein in der Lösung nicht vorhanden, dann hat die Substratoberfläche auch nachdem man sie der Lösung ausgesetzt hat, nur die ursprüngliche monomolekulare Schicht. In den obigen Druckschriften sind

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außerdem optische, elektrische und chemische Mittel angegeben, um zwischen monomolekularen und bimolekularen biologischen Teilchenschichten zu unterscheiden.

Da in biologischen Systemen Antikörper als Antwort auf das Eindringen von Premdproteinen produziert werden, ist der Nachweis von Antikörpern in einem biologischen System von medizinisch diagnostischem Wert für die Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt worden ist. Ein typisches Beispiel für den diagnostischen Nachweis von Antikörpern ist der Nachweis von Antikörpern zur Syphilis oder Gonorrhoe in menschlichem Serum. Umgekehrt hat aber auch der Nachweis gewisser Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen schließen den Nachweis von HCG-Proteinmolekülen in Urin als Nachweis für die Schwangerschaft und den Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle (HAA) im Blut In Aussicht genommener Blutspender ein'.

Um solche diagnostischen Tests auszuführen, muß das geeignete Protein des immunologisch reagierenden Paares erhalten werden. Die einzige bekannte Quelle eines Antikörperproteins ist ein lebendes biologisches System. Im einzelnen sind derzeit sogar nur Wirbeltiere bekannt, die die Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen beantworten. So werden z.B. im Blutserum von Tieren und Menschen, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden sind, viele Antikörper gefunden. Es können jedoch viele Antigene kontrollierbar in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Einige Antigene jedoch, wie die mit der Hepatitis verbundenen Antigene, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höheren lebenden biologischen Systemen erhältlich.

Es ist in der Immunologie bekannt, daß Antikörpermoleküle als Antigene wirken, wenn sie in das System eines Wirbeltieres eingeführt werden, für das sie Premdproteine sind. Auf diese Weise können spezifisch reagierende Antikörper zu einem gegebenen Antikörper leicht in einem solchen Wirbeltier erzeugt werden.

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Derzeit beruht die Sammlung und Reinigung und die diagnostische Nutzung immunologisch reaktiver biologischer Teilchen auf der ausfällenden oder agglutinierenden Eigenschaft der Proteine, die aus der immunologischen Komplexierungsreaktion erhalten werden. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Anwendungen ist die
Blutgruppenbestimmung, bei der Blutproben mit Serumantikörpern vermischt werden und bei der die Blutgruppe durch Beobachtung der in den Blutproben auftretenden Agglutinierungen bestimmt wird.

Eine andere diagnostische Anwendung der immunologisch reaktiven biologischen Teilchen ist der Schwangerschaftstest mit HCG-Protein, der derzeit als Verhinderungstest ausgeführt wird. Dieser Test wird in der Weise ausgeführt, daß man eine Menge von Anti-HCG-Serum mit einer Urinprobe vermischt. Dann wird eine Vielzahl von Polystyrolkügelchen, die mit HCG-Protein beschichtet worden sind, in die'vorher zubereitete Urinprobe eingeführt. Die Polystyrolkügelchen werden agglutinier en, wenn und nur wenn in der
Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden ist. In diesem Falle komplexiert das HCG-Protein auf den Polystyrolkügelchen mit dem Anti-HCG-Serum, das man vorher zu der Urinprobe hinzugegeben hat und dadurch agglutinieren die Kügelchen. Ist dagegen in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden, dann komplexiert dieses mit dem zuerst hinzugegebenen Anti-HCG-Serum, so daß für das HCG-Protein auf den
Kügelchen kein Antiserum mehr verfügbar ist, um das HCG-Protein auf den Kügelchen zu komplexieren und somit zu agglutinieren. Im Falle anderer diagnostischer Proteintests, wie dem Nachweis des mit der Hepatitis verbundenen Antigens, wäre es sehr erwünscht, einen empfindlicheren Test zu haben, sowie einen, mit dem man die Konzentration der Antikörper oder Antigene messen könnte. Der Nachteil der Agglutinierungstest besteht darin, daß die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen, die nichts mit einer immunologischen Agglut inieru.ng zu tun haben, agglomerieren können und auf diese Weise die Zuverlässigkeit des Tests verringern, üblicherweise werden die Agglutinierungstests mit
großer Sorgfalt durch gut ausgebildetes Personal durchgeführt,
doch gelegentlich treten diagnostische Fehler auf.

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Immunologische Experimente sind in der Vergangenheit auf Celluloseacetat-Membranen und in Gelen ausgeführt worden, bei denen Proben, die Antigene und ihre Antikörper enthielten, auf unterschiedliche Bereiche der feuchten Membran (oder/Schächten in dem Gel) aufgebracht wurden und aufeinander zu diffundierten und dabei eine komplexierte Protexnniederschlaglinie bildeten. Bei diesen Experimenten nach dem Stand der Technik war die Empfindlichkeit jedoch nicht so hoch wie sie oft erwünscht war und die Niederschlagslinie, die von der immunologischen Reaktion herrührte, war mit dem bloßen Auge nicht sichtbar, solange die Celluloseacetat -Membran oder das Gel nicht in geeigneter Weise mit einem Proteinmaterial gefärbt war, wie Amido-Schwarz, wie in dem Buch 'Methods in Immunology and Immunochemistry", Band III, herausgegeben durch C.A. Williams und M.W. Chase, Academic Press, Seiten I53 und 169 beschrieben. Dieses Anfärben bedeutet eine zusätzliche Stufe in dem Verfahren zum Nachweisen solcher biologischer Teilchen. Außerdem hat die Bildung der Niederschlagsiinie in dem Gel den Nachteil, daß sich während der Lagerung des Gels ein unerwünschtes Bakteriumswachstum ergibt.

Obwohl die Substrate (Objektträger), die in den oben genannten Druckschriften beschrieben sind, hinsichtlich ihrer Leistungsfähigkeit zum Nachweis einer bimolekularen Schicht aus immunologisch reaktiven biologischen Teilchen als zufriedenstellend erwiesen haben, sind diese Substrate für die Doppeldiffusionstechnik nicht geeignet.

Weiter zeigen die in den oben genannten Druckschriften beschriebenen Substrate nicht die Konzentration der biologischen Teilchen, die die zweite monomolekulare Schicht auf dem Substrat bilden, in einer Lösung an, wenn nicht ein Einstellverfahren verwendet wird. Es ist daher festzustellen, daß durch den Gebrauch der metallisierten Objektträger allein kein Mittel zur Bestimmung der Konzentration der zweiten Teilchen in einer Probe, wie einer Blutprobe gegeben ist. Ähnliche Nachteile ergeben sich auch mit dem anodisierten Tantalobjektträger, der eine andere Art metallisierten Objektträgers ist, der in folgenden Artikeln beschrieben ist:

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"Interactions Among Human Blood Proteins at Interfaces" von L. Vroman et al, Federation Proceedings, Band 3O₃ Nr. 5 (September-Oktober 1971)_} Seiten 1494 bis 1502 und "Three Simple Ways to Detect Antibody-Antigen Complex on Flat Surfaces" von A. L. Adams et al, Journal of Immunological Methods 3 (1973, Seiten 227 bis 232,

der weniger empfindlich ist als der in der US-Patentanmeldung Serial Wo. 445 204 beschriebene Indiumgoldlegierung-Indiumoxyd-Objektträger, insbesondere für den Nachweis der Hepatitis. Ein anderer Artikel, der sich auf metallisierte Objektträger nach dem Stand der Technik bezieht, ist der von Alexandre Rothen "Immunologie and Enzymatic Reactions Carried Out at a Solid-Liquid Interface" in Physiological Chemistry and Physicx 5 (1973), Seiten 243 bis 258.

Kurz gesagt und gemäß den Aufgaben der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen zweiter immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer festen Lösung durch direkte visuelle Betrachtung einer komplexierten Proteinniederschlagslinie, die sich als Ergebnis einer immunologischen Reaktion auf einer metallisierten festen Oberfläche bildet, geschaffen sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Zu diesem Zwecke wird ein Substrat mit einer metallisierten Oberfläche zuerst mit einer Schicht unbeweglich gemachter Feuchtigkeit, wie einer angefeuchteten Cellulose-Membran oder einem Gel oder einer Menge Feuchtigkeit bedeckt, die durch ein darüberliegendes Teil, wie einen Glasobjektträger, begrenzt ist. Dann trägt man eine Probe einer ersten Lösung, die die ersten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen enthält, auf die Schicht aus unbeweglich gemachter Feuchtigkeit auf, z.B. auf einen ersten ausgewählten Bereich der feuchten Membran oder einen ersten Schacht im'Falle eines Gels oder einer eingeschlossenen Feuchtigkeit auf und danach oder gleichzeitig trägt man eine Probe einer Testlösung auf, von der man annimmt, daß sie die zweiten biologischen Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind, und zwar auf einen zweiten ausgewählten Bereich oder einen zweiten Schacht, der sich in einem Abstand von dem ersten befindet. Dann läßt man die beiden Proben durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht zu der Oberfläche unterhalb.

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der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht diffundieren» Während des Diffusionsprozesses durchdringen die biologischen Teilchen die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht, und es bildet sich eine komplexierte Protein-Niederschlagslinie an dem Schnittpunkt der diffundierenden ersten und zweiten biologischen Teilchen. Die Niederschlagslinie ist sichtbar und stellt einen guten Kontrast zum Hintergrund dar, der ohne die Notwendigkeit, ein Färbemittel anzuwenden, mit dem bloßen Auge beobachtbar ist. Darüber hinaus wird eine dauerhafte Aufzeichnung der nachgewiesenen immunologischen Reaktion gebildet.

Während des Diffusionsprozesses wird die Vorrichtung in einer Feuchtigkeitskammer belassen. Es ist zu bemerken, daß die zweiten biologischen Teilchen mit einer Empfindlichkeit nachgewiesen werden, die wesentlich höher ist als die, die mit der üblichen Doppeldiffusionstechnik erhalten werden konnte. Typische Beispiele für die feste Oberfläche sind Mikroskop-Objektträger, Glasplatten oder Schalen, Kunststoffplatten oder -schalen usw.

Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Technik ist es möglich, die Konzentration der zweiten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen in einer Testlösung durch direkte visuelle Beobachtung zu bestimmen. Für diese Bestimmung adsorbiert man erste immunologisch reaktive biologische Teilchen an der Oberfläche des metallisierten Substrates unter Bildung einer ersten monomolekularen Schicht. Danach wird eine Schicht aus unbeweglich gemachter Feuchtigkeit, wie oben beschrieben, auf das mit einer monomolekularen Schicht bedeckte Substrat aufgebracht. Im Falle der eingeschlossenen Feuchtigkeit befeuchtet ein Wassertropfen den Bereich zwischen dem metallisierten Substrat, auf dem die monomolekulare Schicht gebildet ist, und dem einschließenden Teil durch Kapillarwirkung. Die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht wird dann einer Probe der Testlösung ausgesetzt, von der man annimmt, daß sie zweiten biologischen Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind. Bei Anwesenheit der zweiten Teilchen in der Testlösung bildet sich die zweite monomolekulare Schicht auf der ersten und sie ist sichtbar für das bloße Auge mit gutem Kontrast gegenüber dem Hintergrund, wobei die Fläche der zweiten Schicht

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in Beziehung steht zur Konzentration der zweiten biologischen Teilchen. Das Aussetzen der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht gegenüber der Probe wird bewirkt durch Diffusion eines Tropfens der Probe, der auf einem Bereich angeordnet ist oder in einem Schacht oder in einem Loch durch ein einschließendes Teil, je nach der Natur der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht. Darüber hinaus kann die Probe auch an der Kante der Feucht igke it sschbht angeordnet werden.

Bei einer anderen Ausführungsform wird die zweite Schicht im Falle der durch ein darüberliegendes Teil eingeschlossenen Feuchtigkeit rascher gebildet durch eine erzwungene Strömung der Testlösung durch das Loch in dem darüberliegenden Teil, d.h. dem oberen Objektträger, wobei die Lösung entlang den Kanten der Objektträger oder aus dem Ende eines engen Kanals, der in der unteren Oberfläche des oberen Objektträgers gebildet ist, aus der Vorrichtung austritt. Nach einer weiteren Ausführungsform kann die zweite Schicht auch rasch elektrophoretisch gebildet werden, indem man ein Paar Elektroden mit einer Gleichspannungsquelle verbindet und sie an den gegenüberliegenden Endstücken eines Kanals anordnet, der in der unteren Oberfläche des oberen Objektträgers gebildet ist, so daß sich die biologischen Teilchen entlang der elektrischen Feldlinien bewegen. In allen Fällen steht die Konzentration der zweiten Teilchen in Beziehung zur Größe oder zum Bereich der Doppelschichten.

Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher beschrieben. Im einzelnen zeigen:

Figur la eine Draufsicht auf eine Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bestehend aus einer metallisierten Schale mit einer Gelschicht, vor dem Aufbringen der Proben in die durch die Gelschicht hindurch gebildeten Schächte,

Figur Ib einen Querschnitt durch die Vorrichtung nach Figur la entlang der Linie Ib-Ib,

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Figur 2a eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach Figur la nach der Diffusion der Proben und der Bildung der Niederschlagslinien,

Figur 2b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 2a entlang der Linie 2b-2b,

Figur 3a eine Draufsicht einer Vorrichtung aus metallisiertem Substrat mit Gelschicht gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vor dem Aufbringen der Proben in die durch die Gelschicht gebildeten Schächte,

Figur 3b einen Querschnitt durch die Vorrichtung nach Figur 3a entlang der Linie 3ts~3b,

Figur 4a eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach Figur 3a nach der Diffusion der Proben und der Bildung der Niederschlagslinien,

Figur 4b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 4a entlang der Linie 4b-4b,

Figur 5A eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung zu einem Zeitpunkt, zu dem zwei Tropfen von Lösungen, die biologische Teilchen enthalten können, auf eine Gelluloseacetat-Membran aufgebracht sind,

Figur 5B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 5A entlang der Linie 5B-5B,

Figur 6a eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach Figur 5A nach der Diffusion der beiden Tropfen und der Bildung des Niederschlages ,

Figur 6b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur Sk entlang der Linie 6B-6B,

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Figur 7Α eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Bestimmen der Konzentration immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer Pr obe ,

Figur 7B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 7 A entlang der Linie 7B-7B,

Figur 8a eine Draufsicht des metallisierten Objektträgers der Figur 7A, nachdem er der Probe ausgesetzt worden ist und der obere Objektträger entfernt worden ist,

Figur 8b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 8A entlang der Linie 8B-8B,

Figur 9A eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die hauptsächlich für den Nachweis der Anwesenheit biologischer Teilchen verwendet wird, die jedoch auch zu einem gewissen Grade die Bestimmung ihrer Konzentration gestattet.

Figur 9B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 9A entlang der Linie 9B-9B_S

Figur 1OA eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, welche die Diffusion der Probe benutzt,

Figur 1OB einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 1OA entlang der Linie lOB-lOB,

Figur HA eine Draufsicht auf eine weitere Au.sf uhr ungs form der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die eine erzwungene Strömung der Probe benutzt,

Figur HB einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur HA entlang der Linie HB-HB,

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Figur 12A eine Draufsicht einer veiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die eine erz"wungene Strömung benutzt,

Figur 12B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 12A entlang der Linie 12B-12B,

Figur I3A eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der Elektrophorese benutzt wird, und

Figur I3B einen Querschnitt der Vorrichtung gemäß Figur I3A entlang der Linie 13B-13B.

In den Figuren la und Ib ist eine Ausführungsform der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung gezeigt zum Nachweis einer immunologischen Reaktion. Im einzelnen besteht diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus einem geeigneten Behälter 10, wie einer kleinen Schale aus Glas, Metall oder Kunststoff oder einem Trog oder einer anderen Art Behälter aus geeignetem festem Material, wobei der Behälter einen sich im allgemeinen vertikal erstreckenden Randteil aufweist, um ein flüssiges Medium innerhalb des Behälters-zu halten. Auf die innere Bodenfläche des Behälters 10 sind Metallteilchen aufgedampft und sie bilden eine nicht-durchgehende Schicht 11 aus solchen Metallteilchen, um einen metallisierte Oberfläche auf der Innenseite des Behälters 10 zu schaffen. Ein typisches Beispiel für die Metallisierung des Behälters 10 ist eine nicht-durchgehende Schicht aus Indiumkügelchen mit einer durchschnittlichen Dicke von 2000 bis 4000 R. Es kann aber auch ein durchgehender Film aus einem einzigen Metall oder einer Legierung aus zwei Metallen oder ein einzelnes Metall oder eine Legierung aus zwei Metallen mit einem Oxydfilm auf einem der Metalle als Metallisierung für die Oberfläche des Behälters 10 benutzt werden. Eine geeignete Legierung ist z.B. die aus Indium und Gold. Ein typisches Beispiel für ein einzelnes Metall mit Oxyd ist Indium mit einem Indiumoxydfilm von einigen hundert 8 Dicke oder Nickel/Nickeloxyd. Schließlich ist eine typische Metallisierung aus

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einer Legierung aus zwei Metallen mit einem Oxydfilm eines der Metalle eine Gold/Indiumlegierung mit einem Indiumoxydfilm darauf, der aus einer kontinuierlichen oder nicht-kontinuierlichen Schicht von Indiumteilchen besteht, wie in der oben genannten US-Patentanmeldung Serial No. 445,204 beschrieben.

Der metallisierte Behälter 10 wird dann auf einem geeigneten Träger angeordnet und eine geringe Menge Gel in den Behälter 10 gegossen, um die metallisierte Oberfläche bis zu einer Dicke von weniger als 1 mm zu bedecken und auf diese Weise eine unbeweglich gemachte Peuchtigkeitsschicht aus Gel 12 in einer Dicke von weniger als 1 mm zu bilden. Die üblichsten Gele, die für die immunologischen Reaktionstests geeignet sind, sind Agar und Agarose» Die in den Behälter 10 gegossene Gellösung kann eine Salzlösung, eine Lösung in destilliertem Wasser und eine gepufferte Lösung sein, je nach den Lösungen der biologischen Teilchen, die in dem Test benutzt werden sollen, wie dies in dem oben genannten Buch "Methods in Immunology and Immunochemistry" auf den Seiten 147/148 beschrieben ist. Nachdem das Gel sich verfestigt hat, wird eine Vielzahl im geringen Abstand voneinander angeordneter Schächte 13a - e durch die dünne Gelschicht 12 in irgendeiner geeigneten Weise eingebracht, wie auf Seite 149 des vorgenannten Buches beschrieben.

Die Hauptunterschiede zwischen der vorliegenden Erfindung und dem Stand der Technik hinsichtlich der Diffusion in Gel, wie in dem vorgenannten Buch beschrieben, sind die folgenden:

(1) Die erfindungsgemäße Vorrichtung erfordert eine metallisierte feste Oberfläche, da die sichtbare Niederschlagslinie, die von einer immunologischen Reaktion biologischer Teilchen herrührt, auf der metallisierten Oberfläche gebildet wird (obwohl die Niederschlagslinie auch in dem Gel gebildet wird). Hinsichtlich der bekannten Vorrichtung ist keine metallisierte feste Oberfläche offenbart, vielmehr ist lediglich ein Mittel zum Tragen der Gelschicht genannt.

(2) Die in der vorliegenden Erfindung benutzte Gelschicht ist

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wesentlich dünner als die bekannte Gelschicht, wobei die bekannte Gelschicht mindestens 1 mm aufweist, und in dem vorgenannten Buch als in dem Bereich von 1 bis 3 mni liegend beschrieben ist, während die unbeweglich gemachte Peuchtigkeitsschicht nach der vorliegenden Erfindung eine Dicke von weniger als 1 mm aufweist. Dieser beträchtliche Unterschied in der Dicke rührt von der Tatsache her, daß in der erfindungsgemäßen Vorrichtung das Gel als eine unbeweglich gemachte Peuchtigkeitsschicht lediglich für eine Diffusion benutzt wird, d.h. zum Zwecke des Haltens von Feuchtigkeit in einem unbeweglichen Zustand, so daß Proben der immunologisch reaktiven biologischen Teilchen entlang der metallisierten festen Oberfläche diffundieren können und darauf die reproduzierbaren Niederschlagslinien bilden. Bei der Vorrichtung nach dem Stand der Technik wird die Niederschlagslinie in dem Gel gebildet und deshalb ist eine dickere Gelschicht erforderlich, um eine ausreichend dicke Niederschlagslinie zu bilden, die sichtbar ist.

(3) Als Ergebnis von (2) wird die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildete Niederschlagslinie ein dauerhafter Nachweis der immunologischen Reaktion, der kein Anfärben erfordert, um sichtbar zu sein. Bei der bekannten Vorrichtung erfordert das Gel häufig ein Anfärben, um die Niederschlagslinie für das bloße Auge sichtbar zu machen und selbst dann erhält man weniger Kontrast zwischen der Linie und dem Hintergrund als in der vorliegenden Erfindung.

(4) In der vorliegenden Erfindung werden die Schächte vollkommen durch die Gelschicht hindurch gebildet. Bei der Vorrichtung nach dem Stand der Technik, wie er auf Seite 151 des vorgenannten Buches gegeben ist, müssen die Böden der Schächte von der Oberfläche einer Platte, auf dem das Gel getragen ist, abgedichtet sein. Obwohl die erfindungsgemäße Vorrichtung auch zufriedenstellend arbeitet, wenn die Böden der Schächte von der metallisierten Oberfläche des Behälters 10 abgedichtet sind, ist ein solches Abdichten der Böden der Schächte nicht erforderlich, und es ist bevorzugt, die Schächte vollkommen durch die Gelschicht hindurch zu bilden, wie in allen Figuren dargestellt. Dieser deutliche Unterschied zwischen den Schächten ergibt sich aus der Tatsache, daß die achtbare Niederschlagslinie in der erfindungsgemäßen Vorrichtung auf einer metallisierten festen Oberfläche gebildet ist, während sie nach dem

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Stand der Technik im Gel selbst gebildet wird.

Die Schächte 13a - e, die durch die Gelschicht 12 hindurch gebildet werden, sind im allgemeinen kreisförmig im Querschnitt und im allgemeinen weisen sie einen gleichen Durchmesser von etwa 1 bis zu mehreren mm auf. Die erfindungsgemäße Vorrichtung unmittelbar vor dem Einbringen der Proben immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in die Schächte ist in den Figuren la und Ib gezeigt.

In den Figuren 3a und 3b ist eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt, in der das Teil mit der metallisierten festen Oberfläche nun ein metallisiertes Substrat oder ein metallisierter Objektträger ist, wie er in der US-Patentanmeldung Serial No. 445 204 beschrieben ist. Im einzelnen weist das Substrat 30 eine im wesentlichen flache obere Oberfläche auf und ist aus einem geeigneten Material hergestellt, das Metall, Glas, Kunststoff oder ein ähnliches Material sein kann. Das Substrat 30 ist vorzugsweise ein Glasobjektträger, wie ein übliches Mikroskop-Deckglas. Die obere flache Oberfläche des Substrates wird gemäß der vorgenannten US-Patentanmeldung metallisiert. Diese Metallisierung kann z.B. bestehen aus (1) einer nicht durchgehenden Schicht, d.h. aus Metallteilchen oder -kügelchen, wobei Indium ein typisches Beispiel wäre, oder (2) einer ersten Schicht aus Indiumkügelchen, über die ein dünner Goldfilm gelegt ist oder (3) eine Schicht aus Indiumkügelchen (oder eine durchgehende Schicht aus Indium konstanter Dicke) , über der ein dünner Goldfilm angeordnet ist, der mit dem Indium legiert ist, und dünner Indiumoxydfilm oder (4) ein Metall, wie Nickel, und Oxydfilm davon. Die Metallisierung mit Indiumteilchan ist häufig die bevorzugte Ausführungsform für im allgemeinen gleich große Teilchen, während das mit Indium/Gοld-Legierung und Indiumoxyd beschichtete Substrat häufig die bevorzugte Ausführungsform ist für sehr verschieden große Teilchen, a.B. wenn man auf Hepbitis untersucht. Die nicht durchgehende Schicht aus Indiumteilchen als Metallisierung erfordert die Anwendung eines lichtdurchlässigen Substrates, wie Glas oder Kunststoff, und die Indiumteilchen werden auf die Substratoberfläche aufgedampft mit Durchmessern in der Größenordnung von 1000 2, obwohl die genaue Größe der Teilchen nicnt kritisch ist, solange sie Durchmesser gleich einem großen Anteil einer

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Wellenlänge des sichtbaren Lichtes haben. Die Farbe der Indiumteilchen-Metallisierung ist leicht braun. Im Falle der Indium/Gold-Legierung/Indiumoxyd-Metallisierung ist die Dicke des Indiums etwa das Doppelte der Dicke des Goldes, wenn sie anfänglich aufgebracht ist (Indiumdicke etwa 2000 R, Golddicke etwa 1000 S) und die Dicke des Indiumoxydfilmes beträgt einige hundert R₃ um eine Bronzefarbe eines solchen Filmes zu erhalten. Wie in der vorgenannten US-Patentanmeldung erwähnt, bestimmt der Grad der Oxydation des Indiummetalles die Farbe des oxydierten Filmes, so daß verschiedene Oxydationsgrade verschieden gefärbte Objektträger erzeugen, die unterschiedliche Empfindlichkeiten für verschiedene Dicken der Schichten aus biologischen Teilchen aufweisen.

Im Falle der metallisierten Beschichtung 31 auf der oberen Oberfläche des Substrates 30, die aus Kügelchen allein oder Kügelchen aus einem ersten Metall wie Indium, einem Film aus einem zweiten Metall wie Gold und dem Indiumoxydfilm gebildet ist, ist die obere Oberfläche einer solchen metallisierten Beschichtung leicht irregulär. Wird andererseits eine solche metallisierte Beschichtung mit einer durchgehenden Indiumschicht konstanter Dicke, einem Film aus Gold und dem Indiumoxyd gebildet, dann ist die obere Oberfläche im wesentlichen flach. In der vorliegenden Erfindung können beide Arten metallisierten Substrates 30 benutzt werden.

ο Das Substrat 30 braucht nur eine Größe von etwa 3,25 cm (entspre-

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chend 1/2 Zoll ) zu haben. Weitere Einzelheiten hinsichtlich der Substratmetallisierung und deren Herstellung sind in den oben genannten DT-OS gegeben.

Die Vorrichtung mit dem metallisierten Substrat 30 wird in gleicher Weise wie die erste Ausführungsform hergestellt. Es wird daher eine dünne Schicht (weniger als 1 mm Dicke) aus Gel 12 auf der metallisierten Oberfläche des Substrates gebildet und zwei oder mehr Schächte 13a und 13b werden vorzugsweise durch die ganze Gelschicht hindurch gebildet.

In den Figuren 5A und 5B ist eine dritte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt, um eine immunologische Reaktion nachzuweisen. Im einzelnen besteht diese Ausführungsform der

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Vorrichtung aus einem metallisierten Substrat 10 und einer feuchtigkeit sha It ige η "Cellulose-Membran als einer unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht 11, die mindestens einen Teil der metallisierten Oberfläche des Substrates bedeckt. Das Substrat 10 weist eine im wesentlichen flache obere Oberfläche auf und ist aus einem geeigneten Material, wie Metall, Glas, Kunststoff oder ähnlichem Material, hergestellt. Das Substrat 10 ist vorzugsweise ein Glasobjektträger, wie ein übliches Mikroskop-Deckglas, das leicht im Handel erhältlich ist. Die obere flache Oberfläche des Substrates wird wie bei der vorbeschriebenen ersten und zweiten Ausführungsform metallisiert. Die Metallisierung kann z.B. folgendermaßen sein: (1) eine nicht durchgehende Schicht, d.h. Metallteilchen oder -kügelchen, wobei Indium ein typisches Metall ist, oder (2) eine erste Schicht aus Indiumkügelchen, die mit einem dünnen Goldfilm überlappt sind oder (3) eine Schicht aus Indiumkügelchen (oder eine durchgehende Indiumschicht konstanter Dicke), die mit einem dünnen Goldfilm überlappt sind, der mit dem Indium legiert ist, sowie einem dünnen Indiumoxydfilm oder (4) einem Metall, wie Nickel, und dessen Oxydfilm. Die Indiumteilchen-Metallisierung ist häufig eine bevorzugte Ausführungsform für im allgemeinen gleich große biologische Teilchen, während das Indium/Gold-Legierung- und Indiumoxyd-beschichtete Substrat häufig eine bevorzugte Ausführungsform für sehr verschieden große Teilchen ist, z.B. für den Nachweis der Hepatitis. Die nicht durchgehende Schicht aus Indiumteilchen-Metallisierung erfordert die Anwendung eines lichtdurchlässigen Substrates, wie Glas oder Kunststoff, und die Indiumteilchen, die auf das Substrat aufgedampft sind, weisen Durchmesser in der Größenordnung von 1000 S auf, obwohl die genaue Größe der Teilchen nicht kritisch ist, solang^ sie Durchmesser haben, die gleich einem großen Anteil einer Wellenlänge des sichtbaren Lichtes sind. Die Farbe der Metallisierung aus Indiumteilchen ist leicht braun. Im Falle der Indium/Gold-Legierung und Indiumoxyd-Metallisierung beträgt die Dicke des Indium's etwa das Doppelte der Dicke des Goldes, wenn sie am Anfang aufgebracht ist (Indiumdicke , etwa 2000 S, Golddicke etwa 1000 R) und der Indiumoxydfilm ist einige hundert S dick und man erhält eine Bronzefarbe des Filmes. Der Oxydationsgrad des ersten Metalles bestimmt die Farbe

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des»oxydierten Films, so daß verschiedene Oxydationsgrade zu unterschiedlich gefärbten Objektträgern führen, die verschiedene Empfindlichkeiten für unterschiedliche Dicken der Schichten aus biologischen Teilchen aufweisen.

In dem Falle, in dem die metallisierte Beschichtung 10b auf der oberen Oberfläche des Substrates aus Indiumkügelchen oder der Indium/Gold-Legierung und dem Indiumoxydfilm gebildet ist, ist die obere Oberfläche der metallisierten Schicht leicht irregulär. Ist andererseits die metallisierte Beschichtung aus einer durchgehenden Indiumschicht konstanter Dicke,dem Goldfilm und dem Indiumoxyd gebildet, dann ist die obere Oberfläche im wesentlichen flach. In der vorliegenden Erfindung kann jede der beiden Arten metallisierten Substrates verwendet werden. Dies ist gleichermaßen auf die anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anwendbar. Die Cellulose-Membran 11 ist eine geeignete sehr dünne Membran aus Cellulose oder einem Cellulosederivat, wie Celluloseacetat, und sie kann irgendein poröses Papier sein, wie irgendeines der üblichen Filterpapiere oder einfach ein Seidenpapier. Die Dimensionen der Membran 11 können gleich oder verschieden von denen des Substrats 10 sein. Die Membran 11 ist so dünn, wie _s±_e bequemerweise verwendet werden kann und sie weist weniger als 1 mm Dicke auf und sie ist dünner als das Papier, das bei den Doppeldiffusionstechniken nach dem Stand der Technik benutzt wurde. In einer typischen Anwendung und zur besseren Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Membran 11 mit geringerer Breite und Länge als das Substrat 10 dargestellt. Das Substrat 10 braucht

nur eine Fläche von etwa 3,25 cm aufzuweisen. Hinsichtlich weiterer Einzelheiten der Substratmetallisierung und deren Herstellung wird auf die oben genannten DT-OS verwiesen.

Die Cellulose-Membran 11 wird angefeuchtet, bevor oder nachdem sie auf dem Substrat 10 angeordnet ist. Die Membran 11 sollte glatt mit ausreichender Sorgfalt auf der metallisierten Oberfläche angeordnet werden, so daß sie sich entlang ihrer ganzen unteren Oberfläche in Kontakt mit der metallisierten Oberfläche befindet.

Nach dem Zusammenlegen wird das Substrat mit seiner unbeweglich

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gemachten Feuchtigkeitsschicht in einer Feuchtigkeitskammer angeordnet und eine erste Lösung, die erste immunologisch reaktive biologische Teilchen enthält, wird in einem ersten Schacht angeordnet, z.B. dem zentral angeordneten Schacht 13a in dem Falle, in dem die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht ein Gel ist oder auf einem ersten ausgewählten Bereich, wenn die unbeweglich gemachte Feucht igke its schicht eine feuchte Cellulose-Membran ist. Jede der Proben kann aus einem oder mehreren Tropfen der entsprechenden Lösung bestehen. Unmittelbar nachdem die erste Probe auf der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht angeordnet ist (z.B. in dem Schacht 13a der Figur la oder auf der Membran 11 der Figur 5A) oder zur gleichen Zeit wird eine Probe einer Testlösung oder eine zweite Probe, von der man annimmt, daß sie zweite immunologisch reaktive biologische Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind, auf der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht angeordnet (z.B. in den Schächten 13c, 13b der Figur la oder auf der Membran 11 der Figur 5A), die sich im Abstand von der ersten befinden, und man läßt die beiden Proben in die Schicht diffundieren.

Die erste und die Testlösung enthalten im allgemeinen auch andere (unspezifische) biologische Teilchen, wobei ein typisches Beispiel eine erste Lösung aus Kaninchen-Antiserum und eine Testlösung aus menschlichem Serum ist. Während der Diffusion der Proben in der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht diffundieren die ersten und anderen (unspezifischen) biologischen Teilchen der ersten Probe in die Schicht und werden auf der Oberfläche der metallisierten festen Oberfläche adsorbiert (z.B. bei 11 der Figur la, 31 der Figur 4b oder 10b der Figur 5B) und bilden eine monomolekulare Schicht (z.B. 13a bei Figur 2a oder 12a bei Figur 6A) solcher Teilchen darauf. In gleicher Weise diffundieren irgendwelche zweiten und anderen (unspezifischen) Teilchen der Testlösung oder der zweiten Probe in die Membran und werden auf der Oberfläche des metallisieren Objektträgers unter Bildung einer monomolekularen Schicht solcher Teilchen dort adsorbiert (z.B. 13b' der Figur 2a oder 13a der Figur 6A). Entlang des Schnittbereiches der diffundierenden Proben wird eine komplexierte Protein-Niederschlagslinie gebildet (z.B. 15 in Figur 2a oder 14 in Figur 4a oder 14 in Figur -6A) , die verschiedene Schichten dick ist und aus einer

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immunologischen Reaktion des ersten und zweiten Teilchen resultiert. Die Diffusion der Proben in der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht (z.B. Gel 12 oder Membran 11) findet radial nach außen statt unter Bildung kreisförmiger Muster, so daß die Niederschlagslinie eine gerade oder gebogene Linie ist, in Abhängigkeit von der Art der Teilchen und deren Konzentrationen» Die Zeit für die Vervollständigung der Diffusion und der Bildung der Niederschlagslinie ist eine Funktion der Arten der teilnehmenden ersten und zweiten biologischen Teilchen, der Konzentration jedes Teilchens in seiner Lösung, der Temperatur und des Abstandes der Proben auf der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht. Ein enger Abstand der Proben führt zu raschen sich schneidenden Diffusionen und somit zu der rascheren Bildung der Niederschlagslinie, als wenn die Proben in größerem. Abstand voneinander aufgebracht werden. Die Proben können im Abstand von nur wenigen mm angeordnet werden. Die Zeit für die Diffusion der Proben und der Bildung der Niederschlagslinie beträgt im allgemeinen 'einige Stunden, obwohl das Verfahren so beschleunigt werden kann, daß nur einige Minuten erforderlich sind, wie im Falle der Elektrophorese oder der erzwungenen Strömung der Lösungen. Das Feuchtigkeitsmittel in der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht kann destilliert,es Wasser, eine Salzlösung oder eine gepufferte Lösung sein, die mit den Proben nicht reagiert und bei der die Feuchtigkeit unbeweglich gehalten ist, so daß eine kontrollierte Diffusion der Proben in der Schicht stattfindet, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

Nach Bildung der Niederschlagslinie auf der metallisierten Oberfläche des Substrates wird die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht, d.h. das Gel 12 oder die Membran 11, von der Substratoberfläche abgezogen und die Substratoberfläche mit der daran haftenden Niederschlagslinie wird gewaschen, üblicherweise mit destilliertem Wasser, und getrocknet, vorzugsweise durch Blasen von Luft bei Raumtemperatur über das Substrat. Die metallisierte feste Oberfläche des Substrates wird dann durch visuelle Betrachtung untersucht» Diese Untersuchung kann eine direkte visuelle Beobachtung mit dem bloßen Auge sein, um das von der metallisierten Oberfläche reflektierte oder hindurchgehende Licht zu beobachten. So

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wird z.B. die Metallisierung aus -Indiumteilchen im durchgehenden Licht betrachtet, während die Metallisierung aus Indium/Gold-Legierung und Indiumoxyd im reflektierten Licht betrachtet wird. Die Farbe des Niederschlages hängt hauptsächlich von der Farbe der metallisierten Oberfläche ab.

Die komplexierte Protein-Niederschlagslinie ist mit dem bloßen Auge sichtbar und sie zeigt einen guten Kontrast zum Hintergrund und dies ermöglicht den Nachweis der biologischen Teilchen in einer Empfindlichkeit, die sehr viel größer ist als die, die mit den üblichen Doppeldiffusionstechniken erhalten wurde. Weiter ist kein Anfärben der Niederschlagslinie erforderlich, und dies im Unterschied zum Stand der Technik, da der Kontrast zwischen der Niederschlagslinie und dem Hintergrund sehr viel größer ist als nach dem Stand der Technik,

Die Empfindlichkeit mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist wesentlich höher als die Empfindlichkeit bei den üblichen Doppeldiffusionstechniken, insbesondere den Techniken, die in dem oben genannten Buch "Methods in Immunology and Immunochemistry" Band 3 beschrieben sind. Es ist daher nur eine sehr geringe Menge der biologischen Teilchen erforderlich, um mit der vorliegenden Erfindung nachweisbar zu sein.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, daß die Niederschlagslinie auf der metallisierten Oberfläche eine dauerhafte Aufzeichnung der nachgewiesenen immunologischen Reaktion bildet.

Bei dem oben beschriebenen Nachweisverfahren wurde angenommen, daß die erste Lösung eine bekannte Lösung war, die erste biologische Teilehen enthielt. Andererseits können aber auch die erste und die zweite Lösung Testlösungen sein, von denen man annimmt, daß sie die ersten und zweiten Teilchen enthalten, in welchem Falle die Bildung der Niederschlagslinie anzeigen würde, daß solche Teilchen tatsächlich in den entsprechenden Lösungen vorhanden sind, während die Abwesenheit der Niederschlagslinie nur anzeigen würde, daß eine oder beide Lösungen nicht die entsprechenden Teil-

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chen enthalten haben. Im Falle der bekannten Lösung, die die ersten Teilchen enthält, können solche ersten Teilchen in Laboratoriumskulturen hergestellt oder aus höheren lebenden biologischen System erhalten werden, wie oben beschrieben, und sie sind im Handel in hochreiner Form erhältlich oder sie können, wenn nicht im Handel erhältlich, chemisch gereinigt werden. Die typische Lösung der ersten biologischen Teilchen kann eine Lösung von Salz in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit sein, die geeignet und nicht reaktiv ist für die ersten biologischen Teilchen oder eine menschliche Serumprobe..

Die oben als erste und zweite biologische Teilchen bezeichneten biologischen Teilchen können Antigene, Antikörper, Viren, Bakterien, Hormone, Enzyme oder andere biologische Teilchen sein, die man leicht züchten oder in anderer Weise isolieren und sammeln kann oder die in menschlichem Serum oder einer anderen untersuchten Lösung vorhanden sind. Ein typisches Beispiel spezieller biologischer Teilchen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen werden, ist Hepatitis B- Antigen, nachfolgend HBAg genannt, als erste biologische Teilchen und Antikörper zur Hepatitis (HBAb genannt) als zweite biologische Teilchen.

In vielen Fällen wird die Probe der ersten Teilchen eine Probe sein, die spezielle Antigene, wie HBAg, enthält. In einem solchen Falle wäre die Testlösung ein Tropfen menschlichen Serums, das man von einem Patienten entnommen hat, von dem man annimmt, daß er Hepatitis B habe. In einem direkten Test dafür würde die Anwesenheit der Antikörper HBAb nachgewiesen werden durch direkte visuelle Beobachtung der Niederschlagslinie 14 oder 140. Andererseits können die Teilchen in der ersten Probe auch Antikörper für eine besondere Krankheit sein und in einem direkten Test würde die Anwesenheit der Antigene zu solchen Antikörpern in der Serumprobe mit dem erfindungsgemäßen Nachweistest bestimmt werden.

Ein indirekter oder Inhihitionstest für den Nachweis besonderer immunologisch reaktiver biologischer Teilchen kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ebenfalls ausgeführt werden. Das Prinzip des Inhibitionstests ist es, daß die ersten Teilchen, wenn sie in

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ausreichen!!er Menge vorhanden sind, freie sekundäre Teilchen in Lösung neutralisieren. Bei dem Inhibitionstest neutralisieren also HBAg-Teilchen_s wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind, freie Antikörper zur Hepatitis B in Lösung. Diese Reaktion hindert die Antikörper an der Bildung beobachtbarer Komplexe mit HBAg, wenn die Testprobe auf die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht aufgebracht wird.

Der Inhibitionstest für ein Antigen und spezifisch für HBAg wird folgendermaßen ausgeführt: Eine Probe bekannter Lösung von HBAg wird auf die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht aufgebracht und das HBAg und andere in der Lösung vorhandene Teilchen werden als monomolekulare Schicht auf der metallisierten Oberfläche des Substrates adsorbiert, wie bei dem oben beschriebenen direkten Test. Die Testlösung wird zubereitet, indem man eine Probe zu untersuchenden menschlichen Serums zu einer Lösung von HBAb in einem Glasfläschchen oder einem anderen geeigneten Behälter'hinzugibt. Das Glasflaschehen wird dann für eine Zeit gelagert, die ausreicht, damit das HBAb mit dem HBAg in dem menschlichen Serum komplexiert, wenn das Antigen darin vorhanden ist. Das Glasf läschchen wird vorzugsweise bewegt, um die Komplexierungsgeschwxndigkext zu erhöhen. Schließlüi wird die Probe der Testlösung auf der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht angeordnet und nach einer geeigneten Zeit für die Diffusion der Proben wird die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht (d.h. das Gel 12 oder die Membran H.) von dem Substrat entfernt und die metallisierte Oberfläche wird visuell untersucht. Die Ergebnisse des Inhibititionstests sind entgegengesetzt zu derenjdes direkten Tests, d.h. die Anwesenheit des HBAg in der B?obe menschlichen Serums führt nicht zur Bildung einer Niederschlagslinie, während, die Anwesenheit einer solche Niederschlagslinie die Abwesenheit des HBAg in der Pmbe menschlichen Serums anzeigt.

Der Inhibitionstest für den Nachweis von HBAb wird ähnlich ausgeführt wie der Inhibitionstest für HBAg, wozu in jeder der Stufen Antigen durch Antikörper und Antikörper durch Antigen ersetzt werden.

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In den obigen Hepatitistests kann das HBAb aus menschlichem Serum eines Patienten erhalten werden, von dem man weiß, daß er Hepatitis B gehabt hat oder es kann in einer Ziege, einem Kaninchen oder einem anderen geeigneten Tier entwickelt werden durch Injizieren des HBAg, Warten einer geeigneten Inkubationszeit, wie zwei Wochen, und dann Abnehmen von .Blut aus dem Tier, welches den spezifischen Antikörper enthält und Abtrennen des Antikörpers von den übrigen Blutteilchen.

Im Falle, daß die erste Lösung bekanntermaßen erste biologische Teilchen enthält, kann die Probe der ersten Lösung zentral auf der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht angeordnet werden und man kann Proben der verschiedenen Testlösungen, von denen man annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthalten, auf der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht um die erste Lösung herum aufbringen. Ist eine ausreichende Konzentration der zweiten Teil.-chen in den verschiedenen Testlösungen vorhanden, dann bildet sich danach eine gerade oder gebogene Niederschlagslinie an dem Schnitt der nach außen diffundierenden zentral aufgebrachten und der nachfolgend aufgebrachten verschiedenen Testlösungen. Die Wirkung des obigen ist es, einen Test für die Anwesenheit der zweiten biologischen Teilchen in den Testlösungen zu schaffen.

Wenn die erste zentrale Lösung bekanntermaßen erste biologische Teilchen enthält und die diese umgebenden Testlösungen eine bekannte Konzentration der zweiten Teilchen enthalten, dann kann die relative Lage der auf der metallisierten Oberfläche gebildeten Niederschlagslinie zwischen der ursprünglich zentralen Lösung und der bekannten Lösung, welche die Testlösung umgibt, als Standard benutzt werden, mit dem die relativen Lagen der anderen Niederschlagslinien, die als Ergebnis der Reaktion der in den Testlösungen enthaltenen zweiten biologischen Teilchen mit der ersten zentralen Lösung gebildet werden, um die Konzentration der zweiten Teilchen in solchen Testlösungen zu bestimmen. Ist die Lage der Niederschlagslinie der ersten zentralen Probe und einer unbekannten Testlösung dichter bei der zentralen Lösung als die "Standard"-Niederschlagslinie, so zeigt dies, daß die Konzentration der zweiten Teilchen in der Testlösung größer ist als die "Standard"-Kon-

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eo Pil =

zentration. Bei diesem Konzentrationstest bringt man die die erste zentrale Probe umgebenden Proben der Testlösungen im gleichen Abstand von der zentralen Pr'"be auf „

Aus der vorgenannten Beschreibung kann entnommen werden_s daß die vorliegende Erfindung ein verbessertes Doppeldiffusionsverfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens schafft zum Nachweisen immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer Testlösung durch direkte visuelle Beobachtung der metallisierten Oberfläche eines festen Teiles_s auf dem ein komplexierter Protein-Niederschlag gebildet wird als Ergebnis einer immunologischen Reaktion zwischen ersten biologischen Teilchen und den speziellen erforschten biologischen Teilchen_s die spezifisch zu den ersten Teilchen sind ο Die erfindungsgemäßen Verfahren und die Vorrichtungen zur Durchführung der Verfahren sind sehr einfach,, da lediglich eine unbeifeglich gemachte Feuertigkeitsschicht auf der Oberfläche eines festen Teiles angeordnet werden muß,, um die Diffusion der Proben zu gestatten. Weiter vermeidet die einzigartige und hohe Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen metallisierten Teilchens die Notwendigkeit des Anfärbens der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht oder des Substrates,, um die Niederschlagslinie durch direkte visuelle Beobachtung nachzuweisen« Die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung benutzte unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht kann beträchtlich dünner sein als die im Stand der Technik benutzte _s da sie nur für· die Diffusion der Proben benutzt wirdj, während nach dem Stand der Technik eine beträchtliche Dicke benötigt wird_s um die Niederschlagslinie darin zu bilden. Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist sehr viel empfindlicher als die üblichen Doppeldiffusionsverfahren zum Nachweisen immunologisch reaktiver biologischer Teilchen, und es sind mit dem erfindungsge-

—α

mäßen Verfahren BSA-Anti kör per in einer Menge von 10 ^J g nachgewiesen worden, und es kann sogar noch höhere Empfindlichkeit erbringen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die in den oben genannten DT-OS beschriebenen metallisierten Teile so angepaßt werden, daß sie für eine Doppeldiffusion von Proben in einer unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht zum Nachweis der biologischen Teilchen brauchbar sind. Da die metallisierten Teile, z.B. Objektträger, wiederholt mit identischen Eigenschaften hergestellt wer-

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den können, sind die Ergebnisse des Nachweises der biologischen Teilchen gemäß der vorliegenden Erfindung jehr beständig und sie können für viele brauchbare Zwecke verlernet werden, besonders auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik -.si der Analyse menschlichen Serums, z.B. zum Nachweis der var r-■ ;', .lanön darin enthaltenen

der

Antikörper und. Antigene. Da /visuelle Kontrast zwischen der Nie der achlagslinie und der monomolekular en Schicht biologischer Teilchen sehr bestimmt ist, wenn die erfindungsgemäße metallisierte feste Oberfläche benutzt wird, ist der Nachweis durch direkte Beobachtung mit dem bloßen Auge möglich, und es ist keine komplizierte Testausrüstung erforderlich* Schließlich ist zu bemerken, daß die Niederschlagslinie, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, in dauerhafter Form vorliegt.

In den Figuren 7A und 7B ist in Draufsicht und im Schnitt eine vierte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt zia* Bestimmung der Konzentration immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer Testlösung. Die biologischen Teilchen der Testlöaung bilden eine zweite monomolekulare Schicht auf einem metallisierten festen Substrat, nachdem eine erste monomolekulare Schicht immunologisch reaktiver biologischer Teilchen, die spezifisch sind zu den Teilchen in der Test lösung, zuerst an der metallisierten Oberfläche des Substrates adsorbiert worden ist. Die Vorrichtung besteht grundsätzlich aus einem metallisierten festen Substrat 10 und einer unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht, die durch eine Menge Feuchtigkeit gebildet wird, üie begrenzt ist durch das Teil 11, welches auf dem Substrat 10 angeordnet ist, wie in den Figuren 7A und 7B ersichtlich. Der Abstand zwischen dem Substrat 10 und dem Teil 11 ist in Figur Ib, 3b und 4b übertrieben dargestellt, um die getrennten Bestandteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung deutlicher zu zeigen. Das Substrat weist eine im wesentlichen flache obere Oberfläche 10a auf, und es ist aus einem geeigneten Material hergestellt, das Metall, Glas, Kunststoff oder ähnliches Material sein kann. Das Substrat 10 ist vorzugsweise ein Glasobjektträger, wie ein übliches Mikroskop-Deckglas, das leicht im Handel erhältlich ist. Die obere flache Oberfläche 10a des Substrates 10 ist gemäß den oben ge-

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= 26 -

nannten DT-OS metallisiert,, Die Metallisierung kann z.B. bestehen aus (1) eine? nicht durchgehenden Schicht, d^h» Metallteilchen oder -küge IeIiSiTi, t;otei Ina ium ein typisches Metall ist, oder (2) einer ersten Schicht aus IM.iumkugelc.hen, über denen sich ein dünner Goldfilm befindet_s oder (3) einer ersten Schicht aus den Indlumkügelehen (oder- einer durchgehenden Schicht aus Indium konstanter Dicke) _s auf der ein dünner Goldfilm angeordnet ist,- der mit dem Indium legiert Ist und einem dünnen Indluraoxydfilm, oder (4) einem Metall_s wie Micke 1 und einem Orydfilm dai^on. Die Metallisierung aus Inlluniteliehen Ist häufig eine bevorzugte Ausführung sform für im allgemeinen gleich große Teilchen liegen der hohen Empfindlichkeit. Die nicht durchgehend® Schicht aus Indiumteilchen erfordert die Verwendung eines lichtdurchlässigen Substrates, wie Glas oder Kunststoff, \xn& die Indiumteilchen, dl® auf die Substrat·= oberfläche aufgedampft slnd_s haben Durchmesser In der Größenordnung von 1000 S._s obwohl die genaue Größe der Teilchen nicht kritisch ist, solange sie Durchmesser haben₃ die gleich einem großen Anteil einer Wellenlänge des sichtbaren Lichtes sind. Die Farbe der Indium» tellehen-MetallisIerung Ist leicht braun. Die Metallisierung aus Indium/Gold-Legierung und Indiumoxyd Ist häufig die bevorzugte Ausführungsform für zwei In starkem Maße verschieden große biologische Teilchen, da man damit den besten Kontrast erhält, der für das bloße Auge sichtbar ist, und zwar zwischen einer monomolekularen und einer dlmolekularen Schicht immunologisch reaktiver biologischer Teilchen_s wofür ein typisches Beispiel Hepatitis-Antigen und -Antikörper sind. Die Dicke des Indiums ist etwa die doppelte von der des Goldes, wenn.sie ursprünglich aufgebracht ist (Indiumdicke etwa 2000 S, Gold etwa 1000 R.) und der Indiumoxydfilm hat eine Dicke von einigen hundert Ä, wobei der Film eine Bronzefarbe erhält. Der Grad der Oxydation des ersten Metalles bestimmt die Farbe des oxydierten Films, so daß verschiedene Oxydationsgrade verschieden gefärbte Objektträger hervorbringen, die unterschiedliche Empfindlichkeiten haben₃ für verschiedene Dicken der Schichten aus biologischen Teilchen,

Ist die Metallbeschichtung 10b auf der oberen Oberfläche des Substrates 10 aus Kügelchen eines ersten Metalles wie Indium oder Indium/Gold-Legierung und dem Oxydfilm des Indiums gebildet, dann

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ist die Oberfläche der metallisierten Schicht leicht irregulär. Ist die Metallschicht andererseits aus einer durchgehenden Schicht von Indium konstanter Dicke aus dem Goldfilm und dem Indiumoxyd gebildet, dann ist die obere Oberfläche im wesentlichen flach. Beide Arten metallisierten Substrates 10 können in irgendeiner der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Anwendung finden. Das Teil 11 kann typischerweise ein sauberer Glasobjektträger sein, dessen Dimensionen gleich denen oder verschieden von denen des Substrates 10 sind. In einer typischen Anwendung und der besseren Übersichtlichkeit halber weist das Teil 11 eine geringere Länge und Breite als das Substrat 10 auf. Das Teil 11 weist ein oder mehrere Löcher lla, lib, lic, lld und lie auf, die durch das Teil hindurchgehen. Sind mehr als ein Loch vorhanden, dann befinden sich die Löcher im Abstand voneinander₃ und sie sind bevorzugt, wenn auch nicht, notwendigerweise, symmetrisch angeordnet, wie in der besonderen Orientierung der fünf Löcher in. Figur 7A gezeigt. Diese Löcher gleicher Größe l;aben einen Durchmesser im Bereich von einem Bruchteil eines Millimeters bis zu einem Zentimeter.

Das Substrat 10 hat Dimensionen in der Größenordnung von etwa

2*2
6,5 cm (entsprechend 1 Zoll ) oder weniger, je nach der Zahl der in dem Teil 11 gebildeten Löcher 11a - e. Hat das Teil 11 nur ein einziges Loch, dann kann das Substrat eine Fläche von nur etwa

2
3,25 cm haben und das Teil 11 kann ebenfalls eine Fläche von

ρ
nur etwa 3,25 cm oder weniger haben.

Nachdem das metallisierte Substrat 10 und das Teil 11 augewählt sind, wird eine monomolekulare Schicht erster immunologich reaktiver biologischer Teilchen auf der beschichteten Oberfläche 10b des Substrates in allen Ausführungsformen mit Ausnahme der Figuren 9A und 9B adsorbiert. Die Adsorption der ersten biologischen Teilchen kann durch einfaches Eintauchen des Substrates in einer Lösung der ersten biologischen Teilchen erfolgen, so daß die metallisierte Oberfläche vollkommen davon bedeckt wird. Es können aber auch einige Tropfen der Lösung auf die metallisierte Oberfläche aufgebracht und das Substrat in einer Feuchtigkeitskammer aufbewahrt werden. Das erste biologische Teilchen wird auf der Grundlage seiner Spezifität zu einem besonderen zweiten immunologisch

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reaktiven biologischen Teilchen ausgewählt _ΰ das mit dem ersten Teilchen immunologisch unter Bildung einer kleineren zweiten monomolekularen Schicht auf dem Substrat reagieren wird«, i-jenn es in der untersuchten Lösung vorhanden ist_o Die ersten Teilchen können in Laboratoriumskulturen hergestellt werden oder man kann sie aus höheren lebenden biologischen Systemen erhalten_fl wie oben beschrieben, und sie sind im Handel in hochreiner Form erhältlich und falls sie nicht erhältlich sind, können sie chemisch gereinigt werden. Die Lösung derjersten biologischen Teilchen ist typischerweise eine Salzlösung in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit, die geeignet ist für und nicht reaktiv mit den ersten biologischen Teilchen oder einer Probe menschlischen Serums» Nachdem das Substrat in die Lösung für eine ausreichende Zeit eingetaucht ist, daß die ersten biologischen Teilchen und andere darin vorhandene nicht spezifische biologische Teilchen an der Oberfläche des Substrates adsorbiert sind und eine im wesentlichen vollständige monomolekulare Schicht 10c auf der ganzen oberen Oberfläche der metallisierten Beschichtung 10b bilden, wird das Substrat aus der Lösung herausgenommen. Die für die Bildung der monomolekularen Schicht 10c auf dem Substrat 10 erforderliche Zeit (im allgemeinen bis zu einer ■ Stunde) ist eine umgekehrte Ianktion der Konzentration der ersten Teilchen in der Lösung. Ein Spülen der beschichteten Oberfläche des Substrates 10 ist häufig empfohlen nach der Bildung der monomolekularen Schicht 10c darauf _s um Verunreinigungen zu entfernen. Das mit der monomolekularen Schicht bedeckte Substrat 10 wird dann getrocknet _s vorzugsweise indem man Luft bei Zimmertemperatur über das Substrat bläst, um das Trocknen zu beschleunigen. Die monomolekulare Schicht 10c auf dem Substrat hat eine Dicke im allgemeinen im Bereich von 30 bis 100 S, die natürlich durch die jeweiligen biologischen Teilchen bestimmt ist, die die erste Schicht bilden und die monomolekulare Schicht ist mit dem bloßen Auge sichtbar als eine dunklere Schattierung des Brauns auf dem mit Indiumteilchen bedeckten Objektträger und sie ist kaum, wenn überhaupt, auf dem Objektträger mit Indium/GοId-Legierung und Indiumoxyd sichtbar.

Nachdem die enste monomolekulare Schicht 10c auf im wesentlichen

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der gesamten oberen Oberfläche des metallisierten Substrates 10 adsorbiert ist, wird das Teil 11 auf der oberen Oberfläche des mit der monomolekularen Schicht bedeckten Substrates angeordnet. Obwohl diese Anordnung des mit der moncmolekularen Schicht bedeckten Substrates und des Teiles 11 in einigen Fällen zufriedenstellend sein mag, in denen die metallisierte Beschichtung 10b auf dem Substrat aus Indiumkügelchen gebildet ist, wurde in vielen solcher Fälle festgestellt, daß die in die Löcher 10a bis e eingebrachten Testlösungen nicht reproduzierbare und außergewöhnlich große zweite monomolekulare Schichten durch Kapillarwirkung bilden, die von dem irregulären Abstand zwischen der unteren Oberfläche des Teiles 11 und der irregulären Oberfläche der monomolekularen Schicht 10c herrühren, da die obere Oberfläche der Substratbeschichtung 10b irregulär ist. Im Falle einer Beschichtung 10b auf dem Substrat mit einer irregulären Oberfläche ist es daher bevorzugt, eine geringe Klemmkraft anzuwenden, um die untere Oberfläche des Teiles 11 in stärkeren Kontakt mit der monomolekularen Schicht 10c auf dem Substrat 10 zu halten, um reproduzierbare Ergebnisse zu bekommen, Ist die metallisierte Beschichtung 10b mit Schichten konstanter Dicke aus Indium und Gold (und Indiumoxyd) hergestellt, dann ist eine solche Klemmkraft im allgemeinen nicht erforderlich« Das Klemmen wird, wenn es erforderlich ist, mit einem geeigneten Klemmgerät zum Zusammenklemmen der Teile 10 und 11 erhalten. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können als ein Gerät vertrieben werden, das nur aus einem metallisierten Substrat und einem Teil 11 besteht oder es kann auch die monomolekulare Schicht 10c aufweisen.

Mit dem auf dem mit der monomolekularen Schicht bedeckten Substrat 10 angeordneten Teil 11 (das, wenn erforderlieh, festgeklemmt werden kann) wird der Bereich zwischen den Objektträgern 10 und 11, der für die Konzentrationsbestimmung benutzt werden soll, angefeuchtet, um die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht fertigzustellen und eine nachfolgende reproduzierbare Diffusion der Lösung zu erhalten, welche die zweiten biologischen Teilchen einschließen kann» Das Einrichten der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht wird typischerweise erreicht durch Einbringen eines Tropfens Wasser in jedes der ein oder mehreren Löcher 11a - e, die

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für die Testlösungen benutzt werden sollen. Der Wassertropfen wird dann zwischen die untere Oberfläche des Teiles 11 und die freie Oberfläche der monomolekularen Schicht 10b durch Kapillarwirkung gezogen« Werden die Teile 10 und 11 zusammengeklemrat, dann vermindert dies die erforderliche Wassermenge»

Die in den Figuren 7A und. TB dargestellte Vorrichtung oder irgend·» eine der anderen Ausführung sf or men wird dann in einer Feuchtigkeitskammer angeordnet, entweder kurz bevor oder kurz nachdem man die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht eingerichtet hat= Die Feuchtigkeitskammer wird dazu benutzt, die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht in dem angefeuehteten Zustand zu erhalten, da die nachfolgende Diffusion eines Tropfens der Testlösung bis zu einigen Stunden erfordern kann und die angefeuchtete Region sonst während dieser Zeit austrocknen und die Diffusion der Testlösung entlang der monomolekularen Schicht 10c verhindern würde.

Nachdem die Vorrichtung mit den zwei Objektträgern in der Feuchtigkeitskammer angeordnet ist und der Wassertropfen durch Kapillarwirkung zwischen die beiden Objektträger gezogen worden ist, wird ein Tropfen der Lösung, die auf die Anwesenheit und Konzentration eines zweiten immunologisch reaktiven biologischen Teilchens untersucht werden soll, das spezifisch zu dem ersten Teilchen ist, das die monomolekulare Schicht 10 c bildet, in eines der Löcher 11a - e eingebracht. Im Falle einiger verschiedener Testlösungen werden einzelne Tropfen davon in den verschiedenen Löchern angeordnet, so daß jedes Loch einen Tropfen von nur einer der Lösungen enthält. Die Vorrichtung wird dann für eine vorbestimmte Zeit in der Feuchtigkeit skammer belassen, so daß die zweiten Teilchen, wenn solche in der Testlösung vorhanden'sind, durch Diffusion des Tropfens zwischen die beiden Objektträger eine monomolekulare Schicht zweiter biologischer Teilchen aufgrund der immunologischen Reaktion zwischen den ersten und den zweiten Teilchen bilden. Nachdem die vorbestimmte Zeit (die einige Stunden betragen kann) vergangen ist, wird das Teil 11 entfernt und das Substratteil 10 gespült, typischerweise mit destilliertem Wasser, getrocknet und visuell durch Betrachten mit dem bloßen Auge im reflektierten oder durchgehenden Licht untersucht. Wird ein Objektträger mit Indiumteilchen verwendet, dann wird die Lichtdurchlässigkeit benutzt und bei Objekt -

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trägem mit Indium/Gold-Leglerung uiii Ind.iumoxyd die Lichtreflexion. Die Abwesenheit der zweiten Teilchen in der Testlosung führt dazu, daß sich keine zweite monomclekulare Schicht au? der ersten monomolekularen Schicht 10c im Bereich des Loches₃ ir das der Tropfen Testlösung eingebracht war, bildet. Die Anwesenheit der zweiten Teilchen in der Te st lösung resultiert dagegen in der Eildung einer zweiten monomolekularen Schicht radial nach außen entlang der freien Oberfläche der monomolekularen Schicht 10c von dem Bereich, der dem Loch im Teil 11 entspricht. Der Durchmesser oder Bereich dieser zweiten Schicht steht in Beziehung zur Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung, Durch Messen des Durchmessers der zweiten Schicht kann also die Konzentration der zweiten Teilchen in der Testlösung bestimmt werden. Der Durchmesser der zweiten Schicht ist natürlich abhärgig sowohl von der Dauer der Diffusionsstufe als auch der Konzentration der zweiten Teilchen in der Testlösung. Indem man eine feste Zeit für die Diffusionsstufe für alle Messungen festlegt und indem man einen Tropfen einer Lösung mit bekannter Konzentrator an zweiten Teilchen in eines der Löcher als Standard einbringe, kann die Konzentration der Testlösungen leicht bestimmt werden. Andererseits kann die Konzentration durch bloßes Betrachten der Fläche oder des Durchmessers und geistiges Vergleichen mit Mheren Erfahrungen abgeschätzt werden. Wie oben erwähnt, kann irgendeine Zahl verschiedener Testlösungen quantitativ zur gleichen Zeit auf der gleichen Vorrichtung bewertet werden, indem man die anderen Löcher für die anderen Test lösungen benutzt.

Die Figur 8A ist eine Draufsicht und die Figur 8B ein Schnitt der beschichteten Oberfläche des Substrates 10 nach Beendigung der quantitativen oben beschriebenen Messung. Es wird angenommen, daß ein Tropfen der Standardlösung (d.h. der bekannten Konzentration) in das zentrale Loch lic eingebracht worden ist, so daß die zweite monomolekulare'Standard "-Schicht lic¹, die sich auf. der monomolekularen Schicht 10c unter dem Loch lic gebildet hat, das Zentrum des Substrates 10 ist. Ein Tropfen einer ersten Testlösung, die in das Loch 11a eingebracht wurde, führte nicht zur Bildung einer zweiten Schicht auf der beschichteten Oberfläche des Substrates 10 unterhalb des Loches lla und daher enthält eine

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solche erste Testlösung keine merkliche Zahl der zweiten Teilchen. Ein Tropfen einer zweiten Testlösung, der In das Loch lib eingebracht wurde, führte zum größten Durehmesser (doppelt so groß .wie der der Schicht lic'} für die zweite Schicht 11b¹, so daß die Dure hmesserbeStimmung anzeigt, daß eine Konzentration vorhanden sein muß, die sehr viel größer ist als die der Standardlösung. Ein Tropfen einer dritten Testlösung, die in das Loch lld eingefüllt wurde, führte zu einer zweiten Schicht lld' mit einem Durchmesser, der etwas kleiner ist als der der Standardschicht lic' und dies zeigt, daß die Konzentration der dritten Testlösung etwas geringer ist als die Standardkonzentration. Schließlich wurde ein Tropfen . einer vierten Testlösung in dem Loch lie angeordnet und die gebildete zweite monomolekulare Schicht lie' hat einen Durchmesser, der etwa 1,75-mal größer ist als der Standarddurchmesser.

In vielen Fällen besteht die erste monomolekulare Schicht 10c biologischer Teilchen aus bestimmten Antigenen, wie Hepatitis B-Antigen (BHAg)= In einem solchen Falle würden die Testlösungen menschlichen Serums von Patienten genommen werden., von denen man annimmt, daß sie Hepatitis B gehabt hatten und in einem direkten Test würde die Anwesenheit und Konzentration der Antikörper zu Hepatitis B (HBAb) durch Messen der Durchmesser der zweiten monomolekularen Test- und Standardschichten bestimmt werden» Die Teilchen in der ersten monomolekularen Schicht 10c können aber auch die Antikörper zu einer bestimmten Krankheit sein und in einem direkten Test würde die Anwesenheit und die Konzentration der Antigene zu solchen Antikörpern in der Serumprobe bestimmt werden.

Ein indirekter oder Inhibitionstest für den Nachweis und die Bestimmung der Konzentration eines bestimmten immunologisch reaktiven biologischen Teilchens kann ebenfalls mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ausgeführt werden. Das Prinzip des Inhibitionstests ist es, daß die ersten Teilchen, wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind, freie sekundäre Teilchen in der Lösung neutralisieren. Wenn daher beim Inhibitionstest HBAg-Teilchen in ausreichender Menge vorhanden sind, dann neutralisieren sie freie HBAb-Teilchen in Lösung. Diese Reaktion hindert die Antikörper daran, beobachtbare Komplexe zu bilden (d.h. eine bimolekulare Schicht),

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wenn der Objektträger mit der Ant.igenschicht (der ersten monomolekularen Schicht) der Testlösung ausgesetzt wird.

Der Inhibitionstest für ein Antigen und spezifisch für HBAg wird folgendermaßen ausgeführt: Eine monomolekulare Schicht 10c aus HBAg wird an der beschichteten Oberfläche 10b des Substrates adsorbiert, wie bei dem direkten Test oben beschrieben. Die Testlösung wird bereitet, indem man eine Probe zu untersuchenden menschlichen Serums zu einer Lösung von HBAb in einem Glasfläschchen oder einem anderen geeigneten Behälter hinzugibt. Das Glasfläschchen wird dann für eine ausreichende Zeit gelagert, damit das HBAb mit dem HBAg in der Probe menschlichen Serums komplexieren kann, wenn das Antigen darin vorhanden ist. Das Glasfläschchen wird vorzugsweise bewegt, um die Komplexierungsgeschwindigkext zu erhöhen. Schließlich wird ein Tropfen der Testlösung in eines der Löcher des Teiles 11 eingebracht und nach einer geeigneten Zeit wird das Teil 11 entfernt und die beschichtete Oberfläche des Substrates gespült, getrocknet und visuell untersucht. Die Ergebnisse dieses Inhibitionstestes sind entgegengesetzt zu denen des direkten Testes, d.h. die Anwesenheit des HBAg im menschlichen Serum gibt keine zweite monomolekulare Schicht, während die Anwesenheit einer solchen Schicht die Abwesenheit des HBAg in der Probe menschlichen Serums anzeigt.

Der Inhibitionstest für den Nachweis von HBAb wird ähnlich ausgeführt wie der Inhibitionstest für HBAg mit Ersetzung von Antigen durch Antikörper und Antikörper durch Antigen in jeder der Stufen.

In den obigen Hepatitis-Tests kann das HBAb aus menschlichem Serum eines Patienten erhalten werden, von dem man weiß, daß er Hepatitis B hat oder es kann entwickelt werden in einer Ziege, einem Kaninchen oder einem anderen Tier, dem man HBAg injiziert, eine geeignete Inkubationszeit, wie etwa 2 Wochen, wartet und dann von dem Tier Blut abzieht, welches den spezifischen Antikörper enthält und den Antikörper von den verbleibenden Blutteilchen abtrennt,

In allen obigen Test wird die zweite monomolekulare Schicht auf der beschichteten Oberfläche des Substrates 10 durch eine purpur-

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farbige Stelle angezeigt in dem Falle, daß das beschichtete Substrat 10 gemäß dem in der US-Patentanmeldung Serial No. 445 204 beschriebenen Verfahren hergestellt ist, in einer bevorzugten Ausführungsform des beschichteten Substrates 10, wenn die ersten und zweiten biologischen Teilchen von sehr verschiedener Größe sind. Anders gefärbte Hintergründe des Oxydfilms und andere Farben des durch die zweite monomolekulare Schicht gebildeten Fleckes sind auch möglich. Im Falle von Objektträgern mit Indiumteilchen, die bevorzugt sind, wenn die biologischen Teilchen im allgemeinen von gleicher Größe sind, weist der Fleck mit der zweiten Schicht eine deutlich dunklere Braunschattierung auf.

In den Figuren 9A und 9B ist die fünfte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Die Vorrichtung nach den Figuren 9A und 9B ist ähnlich der in den Figuren 7A und 7B abgebildeten mit der Ausnahme, daß das metallisierte Substrat 10 nicht die monomolekulare Schicht der ersten biologischen Teilchen auf der freien Oberfläche der metallisierten Oberfläche 10b trägt. Die obere Oberfläche des beschichteten Substrates 10 ist also nur die freie Oberfläche der Metallisierung, bevor der Test ausgeführt wird. Es werden die beiden gezeigten Löcher 11a und lib durch das Teil 11, das ein Objektträger sein kann, obwohl dies nicht als Begrenzung der Struktur zu verstehen ist, gebildet und sie verlaufen vorzugsweise entlang der zentralen Linie des Teiles 11, wobei jedes Loch von der gegenüberliegenden Kante des Objektträgers durch einen Abstand getrennt ist, der etwa 1/4 der Breite des Teiles ausmachen kann. In der Praxis sind die Löcher 11a und 11b dichter beieinander angeordnet. Ein Vorteil der Vorrichtung ist es, daß dieser Lochabstand bis zu einem Millimeter zwischen den Kanten der Löcher 11a und lib verringert werden kann und die Diffusionszeit zum Bilden der monomolekularen Schichten wird dadurch beträchtlich vermindert. Die Löcher 11a und 11b befinden sich im gleichen Größenbereich wie die Löcher der vierten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Zum Nachweis der zweiten biologischen Teilchen in einer Testlösung wird ein Tropfen einer ersten Lösung, von der man weiß, daß sie die ersten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen enthält,

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in das Loch 11a gegeben, nachdem die Region zwischen den beiden
Objektträgern in dem Bereich um die Löcher herum angefeuchtet ist, um eine unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht zu schaffen. Unmittelbar danach wird ein Tropfen einer Testlösung, von der man
annimmt, daß sie die zweiten immunologisch reaktiven biologischen
Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind, in
dem Loch 11b angeordnet. Die ersten Teilchen und irgendwelche
nicht spezifischen biologischen Teilchen in dem Tropfen der ersten Lösung bilden eine erste monomolekulare Schicht lla·, die auf der
freien Oberfläche der Substratmetallisierung 10b über einen kreisförmigen Bereich adsorbiert ist, dessen Zentrum im Zentrum des
Loches lla liegt. Der Tropfen der Testlösung, der die zweiten biologischen Teilchen und nicht spezifische biologische Teilchen enthalten kann, bildet eine zweite monomolekulare Schicht 11b¹, die
an der freien Oberfläche der Substratmetallisierung lib über einen kreisförmigen Bereich adsorbiert ist, dessen Zentrum im Zentrum
des Loches 11b liegt, wie in den Figuren Sk und 9B gezeigt. Ist
eine ausreichende Konzentration eines oder beider der biologischen Teilchen in der ersten und der Testlösung vorhanden, so daß sich
die diffundierenden ersten und zweiten Teilchen schneiden, dann
wird auf der metallisierten Oberfläche des Substrates eine Niederschlagslxnie 30 gebildet, die für das bloße Auge deutlich sichtbar wird und die Bildung einer komplexierten Protein-Niederschlagslinie anzeigt, die gerade oder gebogen sein kann. Die Niederschlagslinie 30 haftet an dem metallisierten Substrat, so daß beim Wegnehmen des Teiles 11 (zusammen mit der Feuchtigkeit) eine permanente Aufzeichnung der immunologischen Reaktion auf dem Substrat 10 verbleibt, die deutlich sichtbar ist, ohne daß sie ein Anfärben erfordert. Nimmt man gleiche Diffusionsgeschwindigkeiten für die
biologischen Teilchen an, dann zeigt die Lage der Niederschlagslinie 30 zwischen den beiden Löchern lla und 11b die relative Konzentration der biologischen Teilchen in den beiden Lösungen an.
Es wird angenommen, daß die Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in dem Lösungstropfen, der in das Loch 11b eingeführt
wurde, wesentlich größer ist als die ersten Teilchen in der Lösung, die in dem Loch lla angeordnet wurde, da die Niederschlagslinie 30 sich bei etwa 1/3 des Abstandes von dem Loch lla befindet. Wenn
die Diffusionsgeschwindigkeit der beiden biologischen Teilchen

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verschieden ist, die Konzentration beider aber gleich ist, dann muß dies in die Berechnung zur Bestimmung der Konzentration der Testlösung von der Lage der Niederschlagslinie 30 aus einbezogen werden. Man läßt die Tropfen der beiden Lösungen wieder für eine vorbestimmte Zeit durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsbarriere diffundieren, die in dieser Ausführungsform ausreicht, daß die ersten und zweiten biologischen Teilchen aufeinander stoßen und die Niederschlagslinie auf der metallisierten Substratoberfläche bilden. Die Abwesenheit der komplexierten Niederschlagslinie 30 zeigt an, daß entweder die Testlösung keines der zweiten Teilchen enthielt oder daß sie nur eine so geringe Konzentration davon enthielt, daß keine merkliche immunologische Reaktion eintreten konnte. Wieder ist kein Anfärben erforderlich, um die Nieder schlagslinie zu beobachten. In dem Falle, in dem man weiß, daß die erste Lösung die ersten biologischen Teilchen enthält, können mehr als zwei Löcher durch das Teil 11 hindurch gebildet werden, und es kann eine geeignete Anordnung der Löcher erfolgen, wie in Figur la gezeigt, wobei eine Probe der ersten Lösung in das zentral angeordnete Loch lic eingebracht werden würde und Proben der verschiedenen Testlösungen, von denen man annimmt, daß sie die zweiten biologischen Teilchen enthalten, würden in den das zentrale Loch lic umgebenden Löchern 11a, lib, lld und He angeordnet. Ih jedem Falle ausreichender Konzentration der zweiten Teilchen in der entsprechenden Testlösung bildet sich eine Niederschlagslinie, wo die diffundierenden ersten und zweiten Teilchen aufeinander stoßen und dies ist ein Nachweis für die Anwesenheit der zweiten biologischen Teilchen in den Testlösungen. Weiß man, daß die erste Lösung die ersten biologischen Teilchen enthält und enthä-lt eine der anderen Lösungen eine bekannte Konzentration der zweiten Teilchen, dann wird eine Probe der ersten Lösung in dem zentral angeordneten Loch lic angeordnet und eine Probe der "Standardlösung" (bekannte Konzentration der zweiten Teilchen) wird in einem der dieses umgebenden Löcher, z.B. in dem Loch 11a angeordnet. Die relative Lage der Niederschlagslinie, die zwischen den Löchern lic und 11a. gebildet wird, ist dann der Standard, mit dem die relativen Lagen der anderen Niederschlagslinien verglichen werden, die als Ergebnis der Diffusion und Reaktion der zweiten biologischen Teilchen gebildet werden, die in den Proben der Testlösungen vorhanden sind, die in die umgebenden Löcher lib, Hd und He

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eingebracht wurden. Bei diesem Konzentrationstest weisen die umgebenden Löcher einen gleichen Abstand von dem zentralen Loch lic auf .

In den Figuren 1OA und 1OB ist eine sechste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt. Im einzelnen ist das Substrat 10 metallisiert und die monomolekulare Schicht 10c der ersten biologischen Teilchen ist daran adsorbiert, wie in den Figuren 7A und 7B. Der Unterschied zwischen den Strukturen dieser beiden Ausführungsformen ist die Tatsache, daß das Teil 11 keine Löcher enthält. Bei Abwesenheit der Löcher werden ein oder mehrere Tropfen Wasser auf die monomolekulare Schicht aufgebracht, welche die Oberfläche 10c des Substrates 10 bedeckt, und zwar entlang einer oder mehrerer Kanten des Objektträgers 11, so daß der bzw. die Wassertropfeη durch Kapillarwirkung zwischen die beiden Objektträger gezogen werden und eine unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht bilden. In den Figuren 1OA und 1OB wird nur eine der Kanten des Teiles 11, das üblicherweise ein Objektträger ist, zu diesem Zweck benutzt. Nachdem die einzelnen Bereiche zwischen den beiden Objektträgern angefeuchtet sind, wird ein (oder mehrere Tropfen im Abstand voneinander entlang der Kante des Teiles 11) der Testlösung auf die monomolekulare Schicht auf dem Substrat 10 an der angefeuchteten Kante des Teiles 11 aufgebracht und man läßt solche Lösungstropfen für eine vorbestimmte Zeit durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht diffundieren. Wie in den Figuren 1OA und 1OB gezeigt, bilden die vorhandenen zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung eine zweite monomolekulare Schicht 11a¹ in einer Richtung senkrecht zur Kante des Teiles 11, entlang der der Tropfen aufgebracht wurde. Die Breite der zweiten monomolekularen Schicht lla¹ (gemessen zwischen den beiden gezeigten langen Seiten) ist ein Maß der Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung. Wie im Falle der Ausführungsformen der Figuren 7A bis 8B kann ein Tropfen einer "Standard"-Lösung (d.h. einer solchen, die eine bekannte Konzentration der zweiten biologischen Teilchen enthält) entlang einer zweiten Kante des Teiles 11 aufgebracht werden, um einen Vergleich mit der Testlösung zu haben, wenn ein Standard nicht bereits zu einer früheren Zeit hergestellt worden ist. Selbstverständlich können auch

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die anderen Kanten des Teiles 11 zum Testen der Konzentration anderer Testlösungen, von denen man annimmt, daß sie die zweiten biologischen Teilchen enthalten, vorwendet werden.

In den Figuren HA und HB ist eine siebente Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Bestimmen der Konzentration bestimmter immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer Testlösung gezeigt. In den bisher beschriebenen Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die Figuren 7A bis 1OB bilden die zweiten biologischen Teilchen eine zweite monomolekulare Schicht in dem Maße, in dem der Tropfen der Testlösung durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht diffundiert. Ein solcher Prozeß ist offensichtlich relativ langsam, und er erfordert bis zu 24 Stunden in Abhängigkeit von der Konzentration der Teilchen in der Testlösung. Der Prozeß des Entwickeins der zweiten monomolekularen Schicht kann beschleunigt werden, indem man einen wirksamen Mechanismus benutzt, der die zweiten biologischen Teilchen rascher verteilt. Ein erster wirksamer Mechanismus zur Erhöhung der Teilchenverteilungsgeschwindigkeit ist in den Figuren HA und HB dargestellt, bei dem ein erzwungenes Fließen der zweiten Lösung angewandt wird, indem man Druck auf die durch das Loch lla im Teil 11 und somit in den Bereich zwischen den Teilen 10 und 11 fließende Lösung ausübt. Dieses erzwungene Fließen der Testlösung wird erhalten, indem man ein Rohr 50 verwendet, dessen Eingangsende in nicht dargestellter Weise mit einer unter Druck stehenden Quelle der Testlösung verbunden ist und bei dem das Auslaßende in geeigneter Weise mit dem oberen Ende des Loches lla in dem Teil 11 verbunden ist. Wegen dieser Rohrverbindung weist das Teil 11 vorzugsweise eine größere Dicke auf als bei den bisher beschriebenen Ausführungsformen, in denen das Teil 11 so dünn sein kann wie erwünscht. In jeder anderen Hinsicht ist die in den Figuren HA und HB dargestellte Struktur gleich der in den Figuren 7A und 7B. Wegen der Strömung der Testlösung durch das Rohr 50 und das Loch Ha strömt die Testlösung zwischen den beiden Objektträgern heraus, wie durch die Pfeile in Figur HB gezeigt. Diese erzwungene Strömung der Testlösung führt dazu, daß die zweiten biologischen Teilchen, wenn solche vorhanden sind, mit der monomolekularen Schicht 10c der ersten Teilchen in sehr viel kürzerer Zeit rea-

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gieren als wenn man nur die Diffusion anwendet. Die mono molekulare Schicht lla¹ der zweiten biologischen Teilchen aus der Testlösung wird auf der monomolekularen Schicht 10c der ersten Teilchen in einer kürzeren Zeit und wieder radial nach außen unter dem Loch lla gebildet» Für einen konstanten Druck der Flüssigkeitsströmung steht der Durchmesser der zweiten monomolekularen Schicht lla wieder in Beziehung zur Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung. Wie bei den ähnlichen beschriebenen Ausführungsformen kann die Konzentration durch Vergleich mit dem Durchmesser einer zweiten Schicht bestimmt werden, die aus einer Standardlösung auf einer zweiten Vorrichtung gebildet ist oder mittels eines zweiten Loches im Teil 11, das einen ausreichenden Abstand zum Loch lla hat, so daß sich die zweiten monomolekularen Schichten nicht schneiden.

Die Figuren 12A und 12B illustrieren eine achte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die ähnlich der in den Figuren HA und HB gezeigten ist mit der Ausnahme, daß der unter Druck stehende Flüssigkeitsstrom in einem engen Kanal 60 zwischen den beiden Teilen 10 und 11 enthalten ist und nicht in allen Richtungen ausströmt. Für diese besondere Ausführungsform ist die metallisierte Beschichtung 10b auf dem Substrat vorzugsweise aus einer Indiumschicht konstanter Dicke gebildet, um eine im wesentlichen flache Oberfläche der Indiumoxydschicht zu erhalten. Der Kanal 60 kann in der Größenordnung von 5 Mikron Höhe sein und er wird in der Bodenoberfläche des Teiles 11 vom Ausgangsende des Loches Ha zu der Kante des Teiles 11 gebildet, die am weitesten entfernt ist. Der Kanal 60 weist eine Weite gleich oder etwas größer als der Durchmesser des Loches Ha auf, so daß die unter Druck stehende Flüssigkeit leicht durch den Kanal fließen kann und zwischen den beiden Teilen austreten kann, wie durch den Pfeil in Figur 12B angedeutet. Die Länge der zweiten monomolekularen Schicht Ha¹, die innerhalb des Kanales auf der ersten monomolekularen Schicht 10c gebildet wird, steht wiederum in Beziehung zur Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Lösung, die durch das Rohr 50, das Loch Ha und den Kanal 60 fließt.

Ein zweiter wirksamer Mechanismus zur Beschleunigung des Verfah-

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rens der Bildung der zweiten monomolekularen Schicht aus biologischen Teilchen ist die Anwendung eines elektrischen Feldes auf solche Teilchen, um so das Verfahren elektrophoretisch zu beschleunigen. Die Figuren I3A und 13B zeigen die entsprechende erfindungsgemäße Vorrichtung zur Anwendung der Elektrophorese zum Beschleunigen der Bildung der zweiten monomolekularen Schicht lla' Die Vorrichtung ist ähnlich der der Fjguren HA und HB mit der Ausnahme, daß ein enger Kanal 70 in der unteren Oberfläche des Teiles 11 gebildet ist, der sich vom Ausgangsende des Loches lla gegen die entfernte Kante des Teiles 11 erstreckt und es ist kein Rohr 50 erforderlich. Um einen Kanal ausreichender Länge in den Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung der Figuren 12A, 12B und 13A, 13B zu erhalten, wird das Loch Ha durch das Teil 11 vorzugsweise nahe der Kante des Teiles 11 gegenüber der Kante gebildet, welche das Ausgangsende des engen Kanales enthält. Im Falle der Ausführungsform der Figuren I3A und I3B ist das Ausgangsende des Kanales 70 durch eine erste Elektrode 71 eingeschlossen, die geeigneterweise mittels eines elektrischen Leiters an einem ersten Ausgang einer Gleichstromquelle angebracht ist. In ähnlicher Weise -ist das Ende des Kanales 70 am Ausgangsende des Loches Ha durch eine zweite Elektrode 72 eingeschlossen, die mittels eines zweiten Leiters mit dem entgegengesetzten Pol der Spannungsquelle verbunden ist. Die Vorrichtung der Figuren 13A und I3B wird in folgender Weise benutzt: Ein Tropfen der Testlösung, von der man annimmt, daß sie die zweiten biologischen Teilchen enthält, wird in Loch Ha angeordnet und die Gleichspannung angestellt, um ein geeignetes elektrisches Gleichspännungsfeld zwischen den Elektroden 71 und 72 zu erzeugen. Die Wahl der richtigen Polarität und der an die Elektroden angelegten Spannung zwingt die jeweiligen zweiten biologischen Teilchen, sich entlang der elektrischen Feldlinien mit einer Geschwindigkeit zu bewegen, die gegeben ist durch das Produkt aus elektrophoretischer Beweglichkeit und Feldamplitude, Die Geschwindigkeit der zweiten biologischen Teilchen vermindert daher beträchtlich die Zeit, die zur Bildung der zweiten monomolekularen Schicht auf der ersten Schicht erforderlich ist. Wie im Falle der Figuren 12A und 12B weist die zweite monomolekulare Schicht lla¹ eine Länge in der axialen Richtung des Kanales 70 auf, die in Beziehung steht zur

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- ill Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung.

Aus der vorstehenden Beschreibung ergibt sich, daß durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens geschaffen werden, um die Konzentration eines bestimmten immunologisch reaktiven biologischen Teilchens in einer Testlösung zu bestimmen, durch Messen der Größe einer zweiten monomolekularen Schicht des jeweiligen Teilchens, die auf einem metallisierten Substrat gebildet wird» Die Größe der zweiten monomolekularen Schicht wird durch direkte visuelle Beobachtung mit dem bloßen Auge gemessen und die zweite monomolekulare Schicht kann durch Diffusion gebildet werden oder rascher durch einen wirksamen Mechanismus, wie eine erzwungene Strömung oder die Anwendung eines elektrischen Feldes in einem Elektrophorese-Prozeß. Die Größe der zweiten monomolekularen Schicht kann mit einem bekannten Standard oder einer Tabelle oder einer graphischen Darstellung verglichen werden, die angefertigt wurde aufgrund von Testergebnissen mit Standardlösungen bekannter Konzentrationen. Durch die Erfindung wird daher ein einfaches Verfahren beschrieben, bei dem metallisierte Objektträger so angepaßt werden können, daß sie für die Bestimmung der Konzentration biologischer Teilchen in Testlösungen brauchbar sind. Da die metallisierten Objektträger wiederholt mit identischen Eigenschaften hergestellt werden können, sind die Ergebnisse der quantitativen Messungen, die mit der vorliegenden Erfindung erhalten werden, sehr genau, und sie können vielen brauchbaren Zwecken dienen, insbesondere auf dem Gebiete der medizinischen Diagnostik in der Analyse des menschlichen Serums, z.B. für den Nachweis und die Bestimmung der Konzentration der verschiedenen Antikörper und Antigene, die darin enthalten sind. Da der visuelle Kontrast zwischen einer einzelnen und einer Doppelschicht aus immunologisch reaktiven biologischen Teilchen sehr deutlich ist, wenn man den erfindungsgemäßen metallisierten Objektträger benutzt, wird die Messung der Konzentration der zweiten biologischen Teilchen durch direkte Beobachtung mit dem bloßen Auge ausgeführt, und man braucht deshalb keine komplizierte Testausrüstung.

Neben den beschriebenen acht besonderen Ausführungsformen können

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selbstverständlich noch andere Modifikationen und Variationen vorgenommen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung. So können die Gestalt und die Größe der verschiedenen Substrate und der damit verbundenen Teile und der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschichten variiert werden, und es kann irgendein Paar immunologisch reaktiver biologischer Teilchen, die miteinander immunologisch reagieren, bei den erfindungsgemäßen Vorrichtungen verwendet werden. D.h. die oben als erste und zweite Teilchen bezeichneten biologischen Teilchen können Antigene, Antikörper, Viren, Bakterien, Hormone, Enzyme und andere Teilchen sein, die leicht gezüchtet oder in anderer Weise isoliert und gesammelt werden können oder die im menschlichen Serum oder in einer anderen untersuchten Lösung vorhanden sind. Weiter können verschiedene andere Metallisierungen als die spezifisch hier erwähnten verwendet werden, und sie können eine hervorragende Empfindlichkeit für besondere biologische Teilchen haben, wobei ein Beispiel der Metall/Metalloxyd-Metallisierung die von Nickel sein kann. Zumindest einige der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, nämlich die der Figuren 7A, 7B, 9A, 9B und I3A, 13B können ohne das Teil 11 hergestellt werden, indem man die Löcher 11a usw. durch die untere Oberfläche des Substrates 10 bildet (wie in den Figuren 7B, 9B und I3B orientiert). Der Objektträger würde dann umgedreht werden und die Wasser- und Testlösung stufenweise in das bzw. die Löcher eingebracht werden, um das Befeuchten und die nachfolgende Diffusion der zweiten biologischen Teilchen entlang der ersten monomolekularen Schicht zu erhalten.

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Claims

- 43 Ansprüche

1.!Vorrichtung zum Nachweisen immunologisch reaktiver biologischer Teilchen, gekennzeichnet durch

(a) ein Substrat mit einer Hauptoberfläche,

(b) eine Metallisierungsschicht, welche die eine Hauptoberfläche des Substrates bedeckt und

(c) Mittel, um Feuchtigkeit unbeweglich zu machen und eine unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht zu bilden, die in Berührung steht mit der metallisierten Hauptoberfläche des Substrates.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sie weiter eine monomolekulare Schicht erster immunologisch reaktiver biologischer Teilchen zwischen der metallisierten Oberfläche des Substrates und der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht aufweist.

3. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Subßtrat eine flache Platte ist.

4. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Substrat eine Schale ist.

5. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Substrat aus einem lichtdurchlässigen Material_;wie Kunststoff oder Glas besteht.

6. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Substrat aus Metall besteht.

7. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Unbeweglichmachen von Feuchtigkeit ein gelierendes Material ist.

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8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein oder mehrere Schächte in der Schicht aus Gelmaterial enthält, um ein oder mehrere Proben für die Analyse einführen zu können.

9. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Gel Agar oder Agarose ist.

10. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Unbeweglichmachen der Feuchtigkeit aus Cellulosematerial hergestellt ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß das Cellulosematerial aus Celluloseacetat oder porösem Papier oder Filterpapier oder Seidenpapier besteht.

12. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Unbeweglichmachen von Feuchtigkeit ein festes Teil ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß das feste Teil ein oder mehrere durchgehende Löcher aufweist als Mittel zum Einführen der Probe.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Einführen der Probe weiter ein Rohr umfaßt, dessen erstes Ende mit einer unter Druck stehenden Quelle der Probe verbunden ist und ein zweites Ende, das mit einem Loch in dem festen Teil verbunden ist, so daß eine erzwungene Strömung der Probe zu der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht erzeugt wird,

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß sie weiter einen engen Kanal umfaßt, der durch die untere Oberfläche des festen Teiles gebildet

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ist und ein erstes Ende aufweist, das mit dem Loch in dem festen Teil überlappt und ein zweites Ende entlang einer Kante des festen Teiles, die sich in weitem Abstand von dem Loch durch das Teil befindet.

16. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß sie weiter einen Kanal umfaßt, der in der unteren Oberfläche des festen Teiles gebildet ist und ein erstes Ende aufweist, das ein Loch in dem festen Teil überlappt und ein zweites Ende in enger Nachbarschaft zu einer Kante des festen Teiles, die in weitem Abstand zu dem Loch durch das Teil liegt und eine erste Elektrode an einem ersten Ende mit dem engen Kanal verbunden ist und eine zweite Elektrode an einem zweiten Ende mit dem Kanal verbunden ist, so daß das Anlegen einer Gleichspannung über die erste und zweite Elektrode elektrophoretisch rascher eine Schicht von zweiten Teilchen bilden kann als wenn diese Teilchen lediglich in dem Bereich diffundieren.

17. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß die unbeweglich gemachte Peuchtxgkeitsschicht weniger als 1 mm dick ist.

18. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche des Substrates ein nicht durchgehender Film aus Metallteilchen ist.

19. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche auf dem Substrat aus einer Legierung zweier Metalle gebildet ist.

20. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche auf dem Substrat aus einer Legierung zweier Metalle gebildet ist und einen äußeren Oxydfilm eines der beiden Metalle tr ägt.

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21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekenn-

sind zeichnet , daß die beiden Metalle Indium und Gold /und

der Oxydfilm ein Indiumoxydfilm ist.

22. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß die Hauptoberfläche des Substrates flach ist und Indium zuerst auf die flache Haupt oberfläche des Substrates als nicht durchgehender Film von Indiumkügelchen aufgebracht wird, so daß die metallisierte Oberfläche leicht irregulär ist,

23· Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17 _s dadurch gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche des Substrates gebildet ist aus einem Metall und einem Oxydfilm des Metalles.

2k. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche des Substrates gebildet ist aus einem Metall und einem äußeren Film eines Oxydes des Metalles»

25. Vorrichtung zum Bestimmen der Konzentration immunologisch reaktiver biologischer Teilchen, gekennzeichnet durch

(a) ein Substrat mit einer Hauptoberfläche,

(b) eine Metallisierungsschicht, die die Hauptoberfläche des Substrates bedeckt,

(c) eine monomolekulare Schicht erster biologischer Teilchen, die im wesentlichen entlang der ganzen metallisierten Oberfläche des Substrates adsorbiert ist und

(d) Mittel zum Unbeweglichmachen von Feuchtigkeit zum Schaffen einer unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht in Kontakt mit der metallisierten Hauptoberfläche des Substrates.

26. Verfahren zum Nachweisen einer immunologischen Reaktion biologischer Teilchen, gekennz eichnet durch folgende Stufen:

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(a) Aufbringen einer unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht auf eine metallisierte Oberfläche eines Substrates zur Bildung einer Teststruktur,

(b) Aufbringen einer Menge einer ersten Probe, die ein erstes immunologisch reaktives biologisches Teilchen enthält, auf einen ersten Bereich der unbeweglich gemachten Peuchtigkeitsschicht,

(c) Aufbringen einer Menge einer Testprobe, von der man annimmt, daß sie ein zweites immunologisch reaktives biologisches Teilchen enthält, auf einen zweiten Bereich der unbeweglich gemachten Peuchtigkeitsschicht,

(d) Diffundierenlassen der ersten und der Testprobe für eine bestimmte Zeit durch die unbeweglich gemachte Peuchtigkeitsschicht zur metallisierten Oberfläche und mit der Oberfläche und miteinander in Wechselwirkung zu treten und

(e) Untersuchen der metallisierten Oberfläche mit der erhaltenen immunologischen Reaktion, sofern ein solche stattgefunden hat, durch Beobachten.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß die Stufe des Aufbringens der Testprobe, von der man annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthält, auf die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht im Aufbringen der Testprobe in geringem Abstand zu der Aufbringung der ersten Probe besteht, so daß die ausgewählten ersten und zweiten Bereiche auf der unbeweglich gemachten Peuchtigkeitsschicht im Abstand von einigen Millimetern zueinander angeordnet sind.

28. Verfahren nach Anspruch 26,. dadurch gekennzeichnet , daß die Bildung der Test struktur weiter das Absorbieren einer monomolekularen Schicht der ersten biologischen Teilchen auf der metallisierten Oberfläche vor dem Aufbringen der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht und das nachfolgende Aufbringen der unbeweglich gemachten Feuchtigkeit sschicht im Kontakt mit der monomolekularen Schicht einschließt und dann das Aufbringen ein oder mehrerer Proben^

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von denen man annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthalten, auf ausgewählten Bereichen der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht, um ein oder mehrere monomolekulare Schichten der zweiten biologischen Teichen auf der ersten monomolekularen Schicht aus ersten biologischen Teilchen zu bilden, dann die Größe der einen oder mehreren Schichten der zweiten Teilchen zu beobachten, wenn solche vorhanden sind, wobei die Größe der einen oder mehreren Schichten in Beziehung steht zur Konzentration der zweiten Teilchen in der einen oder den mehreren Proben.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß eine weitere Probe aufgebracht wird, die eine bekannte Konzentration an zweiten biologischen Teilchen enthält, auf einen ausgewählten Bereich der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht im Abstand von dem Bereich, auf den oder mehrere frühere Proben aufgebracht sind, um eine zusätzliche Schicht aus biologischen Teilchen im Abstand von der oder den Schichten der zweiten Teilchen zu bilden, dann die metallisierte Oberfläche durch Feststellen der Größe der zusätzlichen Schicht der zweiten Teilchen zu untersuchen, wobei diese Größe in Beziehung steht zu einer bekannten Konzentration der zweiten Teilchen in der zusätzlichen Probe und Vergleichen der Größe der früheren einen oder mehreren Schichten zweiter Teilchen mit der Größe der zusätzlichen Schicht zweiter Teilchen, wodurch die Konzentration der zweiten Teilchen in der oder den früheren Proben bestimmt werden kann,

30. Verfahren nach Anspruch 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet , daß die erste Probe ein bestimmtes Antigen enthält, die zweite Probe, von der man annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthält, Antikörper enthält, spezifisch zu dem bestimmten Antigen und die Untersuchung der metallisierten Oberfläche in dem Nachweis der Antikörper resultiert.

31. Verfahren nach den Ansprüchen 26 bis 29, d a d u r c h gekennzeichnet , daß die erste Probe einen bestimmten Antikörper enthält, daß die zweite Probe, von der man

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annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthält, ein Antigen enthält, zu dem der besondere Antikörper spezifisch ist und die Untersuchung der metallisierten Oberfläche im Beobachten des von der metallisierten Oberfläche reflektierten Lichtes besteht.

32. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß das Adsorbieren einer monomolekularen Schicht aus ersten biologischen Teilchen entlang der metallisierten Oberfläche besteht aus dem Adsorbieren einer monomolekularen Schicht aus einem besonderen Antigen darauf, die Stufe des Aufbringens der Testprobe auf die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht aus dem Aufbringen einer Testprobe besteht, von der man annimmt, daß sie Antikörper enthält, die spezifisch zu dem besonderen Antigen sind, das an der metallisierten Oberfläche des Teiles adsorbiert ist und die Stufe des Diffundierenlassens der Testprobe durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht sowie der Antikörper, wenn solche vorhanden sind, sowie das Bilden einer monomolekularen Schicht auf der Antigenschicht als Ergebnis der immunologischen Reaktion zwischen beiden und das Feststellen des Durchmessers der monomolekularen Schicht aus Antikörpern, aus dem die Konzentration der Antikörper in der Testprobe bestimmt werden kann.

33. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß es weiter die Stufe des Aufbringens einer zweiten Testprobe umfaßt, die eine bekannte Konzentration der Antikörper enthält, und zwar auf einen nachfolgend ausgewählten Bereich auf der unbewegüich gemachten Feuchtigkeit sschicht im Abstand von wenigen Millimetern von dem ersten Bereich, ausreichend langes Diffundierenlassen der zweiten Testprobe durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht und der Antikörper in der zweiten Testprobe und das Bilden einer zusätzlichen monomolekularen Schicht aus den Antikörpern auf der Antigenschicht als Ergebnis der immunologischen Reaktion zwischen ihnen und im Abstand von der früheren Schicht aus Antikörpern sowie die Stufe des Beobachtens der metallisierten

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Oberfläche und des Vergleichens der Durchmesser der Schichten aus Antikörpern, wodurch die Konzentration der Antikörper in der früheren Probe leicht bestimmt werden kann.

34. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß die Stufe des Einführens der Probe der zweiten biologischen Teilchen in die Testvorrichtung im Schaffen einer erzwungenen Strömung aus den zweiten biologischen Teilchen besteht,

35. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß die Stufe des Einführens der Probe aus den zweiten biologischen Teilchen zu der Testvorrichtung im Aufbringen eines Tropfens der Lösung der zweiten biologischen Teilchen in die Testvorrichtung besteht und dem Anlegen einer Gleichspannung über eine erste und zweite Elektrode, die in der Vorrichtung angeordnet sind, so daß die Schicht der zweiten Teilchen elektrophoretisch gebildet wird.

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