DE2512730A1 - Verfahren zum nachweis einer immunologischen reaktion und zur bestimmung der konzentration immunologisch reaktiver biologischer teilchen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents
Verfahren zum nachweis einer immunologischen reaktion und zur bestimmung der konzentration immunologisch reaktiver biologischer teilchen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrensInfo
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Description
1 River Road SCHENECTADY, N. Y. /U.S.A.
Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Reaktion und zur Bestimmung der Konzentration immunologisch reaktiver biologischer
Teilchen sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für den hochempfindlichen
Nachweis einer immunologischen Reaktion und zur Bestimmung der Konzentration immunologisch reaktiver biologischer
Teilchen in einer Probe und insbesondere um einen dauerhaften Nachweis der quantitativen Bestimmung einer Antigen/Antikörper-Reaktion
auf der Oberfläche eines festen Substrates zu erhalten, der für das bloße Auge sichtbar ist, ohne daß die Notwendigkeit
besteht, eine Anfärbung vorzunehmen, und die Erfindung betrifft weiter eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Immunologische Reaktionen sind hoch spezifische biologische Reaktionen, in denen ein erstes immunologisch reaktives biochemisches
Teilchen (im allgemeinen ein Protein), das als Antigen bekannt ist, sich mit einem zweiten Protein verbindet, das
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spezifisch für das Antigen ist und als Antikörper bekannt ist, wobei ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet wird.
Immunologische Reaktionen finden innerhalb eines biologischen Systems, wie einem Tier oder einem Menschen, statt und solche
Reaktionen sind lebenswichtig zur Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlaßt der Eintritt eines Fremdproteins,
d.h. eines Antigens, das biologische System zur Bildung spezifischer Antikörperproteine gegenüber dem Antigen in einem
Verfahren, das bisher noch nicht voll verstanden ist. Die Antikörperprotein-Moleküle
weisen verfügbare chemische Bindestellen auf, die komplementär zu denen der Antigen-Moleküle sind, so daß
sich Antigen und Antikörper unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins miteinander verbinden.
Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten Proteine als einen wesentlichen Teil, während alle Antikörper Proteine sind.
Proteine sind große Moleküle von hohem Molekulargewicht, d.h. Polymere, die aus Ketten einer unterschiedlichen Zahl von Aminosäuren
bestehen. In den DT-OS 23 30 702 und 2k 33 246 ist offenbart,
daß ein willkürlich ausgewähltes Protein an einer Substratoberfläche nur in einer monomolekularen Schicht haftet und daß
kein anderes willkürlich ausgewähltes Protein an dieser ersten Proteinschicht haften wird. Ein spezifisch mit dem adsorbierten
ersten Protein reagierendes Protein wird sich jedoch immunologisch mit dieser ersten Proteinschicht verbinden. Diese Peststellung
ist gemäß den oben genannten Druckschriften dazu benutzt worden, medizinisch diagnostische Vorrichtungen zu schaffen, in denen
eine Substratoberfläche, wie ein Objektträger, mit einer monomolekularen
Schicht adsorbierten Proteins dazu benutzt wird, Lösungen zu untersuchen, in denen man die Anwesenheit des spezifisch reagierenden
Proteins dafür vermutet* Ist das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann weist die Substratoberfläche,
nachdem man sie der Lösung ausgesetzt hat, eine bimolekulare Proteinschicht auf. Ist das spezifisch reagierende Protein
in der Lösung nicht vorhanden, dann hat die Substratoberfläche
auch nachdem man sie der Lösung ausgesetzt hat, nur die ursprüngliche monomolekulare Schicht. In den obigen Druckschriften sind
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außerdem optische, elektrische und chemische Mittel angegeben, um zwischen monomolekularen und bimolekularen biologischen Teilchenschichten
zu unterscheiden.
Da in biologischen Systemen Antikörper als Antwort auf das Eindringen
von Premdproteinen produziert werden, ist der Nachweis
von Antikörpern in einem biologischen System von medizinisch diagnostischem Wert für die Bestimmung der Antigene, denen das System
ausgesetzt worden ist. Ein typisches Beispiel für den diagnostischen Nachweis von Antikörpern ist der Nachweis von Antikörpern
zur Syphilis oder Gonorrhoe in menschlichem Serum. Umgekehrt hat aber auch der Nachweis gewisser Antigene in einem biologischen
System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen schließen den Nachweis von HCG-Proteinmolekülen
in Urin als Nachweis für die Schwangerschaft und den Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle
(HAA) im Blut In Aussicht genommener Blutspender ein'.
Um solche diagnostischen Tests auszuführen, muß das geeignete Protein des immunologisch reagierenden Paares erhalten werden.
Die einzige bekannte Quelle eines Antikörperproteins ist ein lebendes biologisches System. Im einzelnen sind derzeit sogar nur
Wirbeltiere bekannt, die die Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen beantworten. So werden z.B. im Blutserum
von Tieren und Menschen, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden sind, viele Antikörper gefunden. Es können jedoch
viele Antigene kontrollierbar in Laboratoriumskulturen hergestellt
werden. Einige Antigene jedoch, wie die mit der Hepatitis verbundenen Antigene, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus
höheren lebenden biologischen Systemen erhältlich.
Es ist in der Immunologie bekannt, daß Antikörpermoleküle als Antigene wirken, wenn sie in das System eines Wirbeltieres eingeführt
werden, für das sie Premdproteine sind. Auf diese Weise
können spezifisch reagierende Antikörper zu einem gegebenen Antikörper leicht in einem solchen Wirbeltier erzeugt werden.
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Derzeit beruht die Sammlung und Reinigung und die diagnostische Nutzung immunologisch reaktiver biologischer Teilchen auf der ausfällenden
oder agglutinierenden Eigenschaft der Proteine, die aus der immunologischen Komplexierungsreaktion erhalten werden. Das
klassische Beispiel dieser diagnostischen Anwendungen ist die
Blutgruppenbestimmung, bei der Blutproben mit Serumantikörpern vermischt werden und bei der die Blutgruppe durch Beobachtung der in den Blutproben auftretenden Agglutinierungen bestimmt wird.
Blutgruppenbestimmung, bei der Blutproben mit Serumantikörpern vermischt werden und bei der die Blutgruppe durch Beobachtung der in den Blutproben auftretenden Agglutinierungen bestimmt wird.
Eine andere diagnostische Anwendung der immunologisch reaktiven biologischen Teilchen ist der Schwangerschaftstest mit HCG-Protein,
der derzeit als Verhinderungstest ausgeführt wird. Dieser
Test wird in der Weise ausgeführt, daß man eine Menge von Anti-HCG-Serum mit einer Urinprobe vermischt. Dann wird eine Vielzahl
von Polystyrolkügelchen, die mit HCG-Protein beschichtet worden
sind, in die'vorher zubereitete Urinprobe eingeführt. Die Polystyrolkügelchen
werden agglutinier en, wenn und nur wenn in der
Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden ist. In diesem Falle komplexiert das HCG-Protein auf den Polystyrolkügelchen mit dem Anti-HCG-Serum, das man vorher zu der Urinprobe hinzugegeben hat und dadurch agglutinieren die Kügelchen. Ist dagegen in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden, dann komplexiert dieses mit dem zuerst hinzugegebenen Anti-HCG-Serum, so daß für das HCG-Protein auf den
Kügelchen kein Antiserum mehr verfügbar ist, um das HCG-Protein auf den Kügelchen zu komplexieren und somit zu agglutinieren. Im Falle anderer diagnostischer Proteintests, wie dem Nachweis des mit der Hepatitis verbundenen Antigens, wäre es sehr erwünscht, einen empfindlicheren Test zu haben, sowie einen, mit dem man die Konzentration der Antikörper oder Antigene messen könnte. Der Nachteil der Agglutinierungstest besteht darin, daß die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen, die nichts mit einer immunologischen Agglut inieru.ng zu tun haben, agglomerieren können und auf diese Weise die Zuverlässigkeit des Tests verringern, üblicherweise werden die Agglutinierungstests mit
großer Sorgfalt durch gut ausgebildetes Personal durchgeführt,
doch gelegentlich treten diagnostische Fehler auf.
Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden ist. In diesem Falle komplexiert das HCG-Protein auf den Polystyrolkügelchen mit dem Anti-HCG-Serum, das man vorher zu der Urinprobe hinzugegeben hat und dadurch agglutinieren die Kügelchen. Ist dagegen in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden, dann komplexiert dieses mit dem zuerst hinzugegebenen Anti-HCG-Serum, so daß für das HCG-Protein auf den
Kügelchen kein Antiserum mehr verfügbar ist, um das HCG-Protein auf den Kügelchen zu komplexieren und somit zu agglutinieren. Im Falle anderer diagnostischer Proteintests, wie dem Nachweis des mit der Hepatitis verbundenen Antigens, wäre es sehr erwünscht, einen empfindlicheren Test zu haben, sowie einen, mit dem man die Konzentration der Antikörper oder Antigene messen könnte. Der Nachteil der Agglutinierungstest besteht darin, daß die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen, die nichts mit einer immunologischen Agglut inieru.ng zu tun haben, agglomerieren können und auf diese Weise die Zuverlässigkeit des Tests verringern, üblicherweise werden die Agglutinierungstests mit
großer Sorgfalt durch gut ausgebildetes Personal durchgeführt,
doch gelegentlich treten diagnostische Fehler auf.
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Immunologische Experimente sind in der Vergangenheit auf Celluloseacetat-Membranen
und in Gelen ausgeführt worden, bei denen Proben, die Antigene und ihre Antikörper enthielten, auf unterschiedliche
Bereiche der feuchten Membran (oder/Schächten in dem
Gel) aufgebracht wurden und aufeinander zu diffundierten und dabei
eine komplexierte Protexnniederschlaglinie bildeten. Bei diesen Experimenten nach dem Stand der Technik war die Empfindlichkeit
jedoch nicht so hoch wie sie oft erwünscht war und die Niederschlagslinie, die von der immunologischen Reaktion herrührte,
war mit dem bloßen Auge nicht sichtbar, solange die Celluloseacetat -Membran oder das Gel nicht in geeigneter Weise mit einem
Proteinmaterial gefärbt war, wie Amido-Schwarz, wie in dem Buch
'Methods in Immunology and Immunochemistry", Band III, herausgegeben
durch C.A. Williams und M.W. Chase, Academic Press, Seiten
I53 und 169 beschrieben. Dieses Anfärben bedeutet eine zusätzliche
Stufe in dem Verfahren zum Nachweisen solcher biologischer
Teilchen. Außerdem hat die Bildung der Niederschlagsiinie in dem Gel den Nachteil, daß sich während der Lagerung des Gels ein unerwünschtes
Bakteriumswachstum ergibt.
Obwohl die Substrate (Objektträger), die in den oben genannten
Druckschriften beschrieben sind, hinsichtlich ihrer Leistungsfähigkeit zum Nachweis einer bimolekularen Schicht aus immunologisch
reaktiven biologischen Teilchen als zufriedenstellend erwiesen haben, sind diese Substrate für die Doppeldiffusionstechnik
nicht geeignet.
Weiter zeigen die in den oben genannten Druckschriften beschriebenen
Substrate nicht die Konzentration der biologischen Teilchen, die die zweite monomolekulare Schicht auf dem Substrat bilden,
in einer Lösung an, wenn nicht ein Einstellverfahren verwendet
wird. Es ist daher festzustellen, daß durch den Gebrauch der metallisierten Objektträger allein kein Mittel zur Bestimmung
der Konzentration der zweiten Teilchen in einer Probe, wie einer Blutprobe gegeben ist. Ähnliche Nachteile ergeben sich
auch mit dem anodisierten Tantalobjektträger, der eine andere
Art metallisierten Objektträgers ist, der in folgenden Artikeln
beschrieben ist:
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"Interactions Among Human Blood Proteins at Interfaces" von L. Vroman et al, Federation Proceedings, Band 3O3 Nr. 5 (September-Oktober
1971)} Seiten 1494 bis 1502 und
"Three Simple Ways to Detect Antibody-Antigen Complex on Flat Surfaces" von A. L. Adams et al, Journal of Immunological Methods
3 (1973, Seiten 227 bis 232,
der weniger empfindlich ist als der in der US-Patentanmeldung
Serial Wo. 445 204 beschriebene Indiumgoldlegierung-Indiumoxyd-Objektträger, insbesondere für den Nachweis der Hepatitis. Ein
anderer Artikel, der sich auf metallisierte Objektträger nach dem Stand der Technik bezieht, ist der von Alexandre Rothen "Immunologie
and Enzymatic Reactions Carried Out at a Solid-Liquid Interface" in Physiological Chemistry and Physicx 5 (1973), Seiten 243
bis 258.
Kurz gesagt und gemäß den Aufgaben der vorliegenden Erfindung wird
ein Verfahren zum Nachweisen zweiter immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer festen Lösung durch direkte visuelle
Betrachtung einer komplexierten Proteinniederschlagslinie, die sich
als Ergebnis einer immunologischen Reaktion auf einer metallisierten festen Oberfläche bildet, geschaffen sowie eine Vorrichtung
zur Durchführung des Verfahrens. Zu diesem Zwecke wird ein Substrat mit einer metallisierten Oberfläche zuerst mit einer Schicht
unbeweglich gemachter Feuchtigkeit, wie einer angefeuchteten Cellulose-Membran
oder einem Gel oder einer Menge Feuchtigkeit bedeckt, die durch ein darüberliegendes Teil, wie einen Glasobjektträger,
begrenzt ist. Dann trägt man eine Probe einer ersten Lösung, die die ersten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen enthält,
auf die Schicht aus unbeweglich gemachter Feuchtigkeit auf, z.B. auf einen ersten ausgewählten Bereich der feuchten Membran oder
einen ersten Schacht im'Falle eines Gels oder einer eingeschlossenen
Feuchtigkeit auf und danach oder gleichzeitig trägt man eine Probe einer Testlösung auf, von der man annimmt, daß sie die zweiten
biologischen Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind, und zwar auf einen zweiten ausgewählten Bereich
oder einen zweiten Schacht, der sich in einem Abstand von dem ersten befindet. Dann läßt man die beiden Proben durch die unbeweglich
gemachte Feuchtigkeitsschicht zu der Oberfläche unterhalb.
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der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht diffundieren» Während
des Diffusionsprozesses durchdringen die biologischen Teilchen
die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht, und es bildet sich eine komplexierte Protein-Niederschlagslinie an dem Schnittpunkt
der diffundierenden ersten und zweiten biologischen Teilchen. Die Niederschlagslinie ist sichtbar und stellt einen guten Kontrast
zum Hintergrund dar, der ohne die Notwendigkeit, ein Färbemittel anzuwenden, mit dem bloßen Auge beobachtbar ist. Darüber
hinaus wird eine dauerhafte Aufzeichnung der nachgewiesenen immunologischen Reaktion gebildet.
Während des Diffusionsprozesses wird die Vorrichtung in einer
Feuchtigkeitskammer belassen. Es ist zu bemerken, daß die zweiten biologischen Teilchen mit einer Empfindlichkeit nachgewiesen werden,
die wesentlich höher ist als die, die mit der üblichen Doppeldiffusionstechnik erhalten werden konnte. Typische Beispiele für
die feste Oberfläche sind Mikroskop-Objektträger, Glasplatten oder
Schalen, Kunststoffplatten oder -schalen usw.
Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Technik ist es möglich, die Konzentration der zweiten immunologisch reaktiven biologischen
Teilchen in einer Testlösung durch direkte visuelle Beobachtung
zu bestimmen. Für diese Bestimmung adsorbiert man erste immunologisch reaktive biologische Teilchen an der Oberfläche des metallisierten
Substrates unter Bildung einer ersten monomolekularen Schicht. Danach wird eine Schicht aus unbeweglich gemachter Feuchtigkeit,
wie oben beschrieben, auf das mit einer monomolekularen Schicht bedeckte Substrat aufgebracht. Im Falle der eingeschlossenen
Feuchtigkeit befeuchtet ein Wassertropfen den Bereich zwischen dem metallisierten Substrat, auf dem die monomolekulare
Schicht gebildet ist, und dem einschließenden Teil durch Kapillarwirkung. Die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht wird dann
einer Probe der Testlösung ausgesetzt, von der man annimmt, daß sie zweiten biologischen Teilchen enthält, die spezifisch zu den
ersten Teilchen sind. Bei Anwesenheit der zweiten Teilchen in der Testlösung bildet sich die zweite monomolekulare Schicht auf der
ersten und sie ist sichtbar für das bloße Auge mit gutem Kontrast gegenüber dem Hintergrund, wobei die Fläche der zweiten Schicht
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in Beziehung steht zur Konzentration der zweiten biologischen Teilchen.
Das Aussetzen der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht
gegenüber der Probe wird bewirkt durch Diffusion eines Tropfens der Probe, der auf einem Bereich angeordnet ist oder in einem Schacht
oder in einem Loch durch ein einschließendes Teil, je nach der Natur
der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht. Darüber hinaus kann die Probe auch an der Kante der Feucht igke it sschbht angeordnet
werden.
Bei einer anderen Ausführungsform wird die zweite Schicht im Falle
der durch ein darüberliegendes Teil eingeschlossenen Feuchtigkeit
rascher gebildet durch eine erzwungene Strömung der Testlösung durch das Loch in dem darüberliegenden Teil, d.h. dem oberen Objektträger,
wobei die Lösung entlang den Kanten der Objektträger oder aus dem Ende eines engen Kanals, der in der unteren Oberfläche
des oberen Objektträgers gebildet ist, aus der Vorrichtung austritt.
Nach einer weiteren Ausführungsform kann die zweite Schicht auch rasch elektrophoretisch gebildet werden, indem man ein Paar
Elektroden mit einer Gleichspannungsquelle verbindet und sie an den gegenüberliegenden Endstücken eines Kanals anordnet, der in
der unteren Oberfläche des oberen Objektträgers gebildet ist, so daß sich die biologischen Teilchen entlang der elektrischen Feldlinien
bewegen. In allen Fällen steht die Konzentration der zweiten Teilchen in Beziehung zur Größe oder zum Bereich der Doppelschichten.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher beschrieben. Im einzelnen zeigen:
Figur la eine Draufsicht auf eine Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, bestehend aus einer metallisierten Schale mit einer Gelschicht, vor dem Aufbringen
der Proben in die durch die Gelschicht hindurch gebildeten Schächte,
Figur Ib einen Querschnitt durch die Vorrichtung nach Figur la
entlang der Linie Ib-Ib,
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Figur 2a eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach Figur la nach der Diffusion der Proben und der Bildung der Niederschlagslinien,
Figur 2b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 2a entlang
der Linie 2b-2b,
Figur 3a eine Draufsicht einer Vorrichtung aus metallisiertem Substrat
mit Gelschicht gemäß einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung vor dem Aufbringen der Proben in die durch die Gelschicht gebildeten Schächte,
Figur 3b einen Querschnitt durch die Vorrichtung nach Figur 3a
entlang der Linie 3ts~3b,
Figur 4a eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach Figur 3a nach
der Diffusion der Proben und der Bildung der Niederschlagslinien,
Figur 4b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 4a entlang der Linie 4b-4b,
Figur 5A eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung
nach der vorliegenden Erfindung zu einem Zeitpunkt, zu dem zwei Tropfen von Lösungen, die biologische
Teilchen enthalten können, auf eine Gelluloseacetat-Membran aufgebracht sind,
Figur 5B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 5A entlang
der Linie 5B-5B,
Figur 6a eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach Figur 5A nach
der Diffusion der beiden Tropfen und der Bildung des Niederschlages ,
Figur 6b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur Sk entlang
der Linie 6B-6B,
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Figur 7Α eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung zum Bestimmen der Konzentration immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer
Pr obe ,
Figur 7B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 7 A entlang
der Linie 7B-7B,
Figur 8a eine Draufsicht des metallisierten Objektträgers der
Figur 7A, nachdem er der Probe ausgesetzt worden ist und der obere Objektträger entfernt worden ist,
Figur 8b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 8A entlang der Linie 8B-8B,
Figur 9A eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung, die hauptsächlich für den Nachweis der Anwesenheit biologischer Teilchen verwendet wird,
die jedoch auch zu einem gewissen Grade die Bestimmung ihrer Konzentration gestattet.
Figur 9B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 9A entlang der Linie 9B-9BS
Figur 1OA eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung, welche die Diffusion der Probe benutzt,
Figur 1OB einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 1OA entlang
der Linie lOB-lOB,
Figur HA eine Draufsicht auf eine weitere Au.sf uhr ungs form der erfindungsgemäßen
Vorrichtung, die eine erzwungene Strömung der Probe benutzt,
Figur HB einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur HA entlang
der Linie HB-HB,
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Figur 12A eine Draufsicht einer veiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung, die eine erz"wungene Strömung
benutzt,
Figur 12B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 12A entlang
der Linie 12B-12B,
Figur I3A eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung, bei der Elektrophorese benutzt wird, und
Figur I3B einen Querschnitt der Vorrichtung gemäß Figur I3A entlang
der Linie 13B-13B.
In den Figuren la und Ib ist eine Ausführungsform der Vorrichtung
der vorliegenden Erfindung gezeigt zum Nachweis einer immunologischen Reaktion. Im einzelnen besteht diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung aus einem geeigneten Behälter 10, wie einer kleinen Schale aus Glas, Metall oder Kunststoff oder einem
Trog oder einer anderen Art Behälter aus geeignetem festem Material, wobei der Behälter einen sich im allgemeinen vertikal erstreckenden
Randteil aufweist, um ein flüssiges Medium innerhalb des Behälters-zu halten. Auf die innere Bodenfläche des Behälters 10
sind Metallteilchen aufgedampft und sie bilden eine nicht-durchgehende
Schicht 11 aus solchen Metallteilchen, um einen metallisierte Oberfläche auf der Innenseite des Behälters 10 zu schaffen.
Ein typisches Beispiel für die Metallisierung des Behälters 10 ist eine nicht-durchgehende Schicht aus Indiumkügelchen mit einer
durchschnittlichen Dicke von 2000 bis 4000 R. Es kann aber auch ein durchgehender Film aus einem einzigen Metall oder einer Legierung
aus zwei Metallen oder ein einzelnes Metall oder eine Legierung aus zwei Metallen mit einem Oxydfilm auf einem der Metalle
als Metallisierung für die Oberfläche des Behälters 10 benutzt werden. Eine geeignete Legierung ist z.B. die aus Indium und Gold.
Ein typisches Beispiel für ein einzelnes Metall mit Oxyd ist Indium mit einem Indiumoxydfilm von einigen hundert 8 Dicke oder
Nickel/Nickeloxyd. Schließlich ist eine typische Metallisierung aus
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einer Legierung aus zwei Metallen mit einem Oxydfilm eines der Metalle
eine Gold/Indiumlegierung mit einem Indiumoxydfilm darauf,
der aus einer kontinuierlichen oder nicht-kontinuierlichen Schicht
von Indiumteilchen besteht, wie in der oben genannten US-Patentanmeldung Serial No. 445,204 beschrieben.
Der metallisierte Behälter 10 wird dann auf einem geeigneten Träger
angeordnet und eine geringe Menge Gel in den Behälter 10 gegossen, um die metallisierte Oberfläche bis zu einer Dicke von weniger als
1 mm zu bedecken und auf diese Weise eine unbeweglich gemachte Peuchtigkeitsschicht aus Gel 12 in einer Dicke von weniger als 1 mm
zu bilden. Die üblichsten Gele, die für die immunologischen Reaktionstests geeignet sind, sind Agar und Agarose» Die in den Behälter
10 gegossene Gellösung kann eine Salzlösung, eine Lösung in destilliertem Wasser und eine gepufferte Lösung sein, je nach den
Lösungen der biologischen Teilchen, die in dem Test benutzt werden sollen, wie dies in dem oben genannten Buch "Methods in Immunology
and Immunochemistry" auf den Seiten 147/148 beschrieben ist. Nachdem
das Gel sich verfestigt hat, wird eine Vielzahl im geringen Abstand
voneinander angeordneter Schächte 13a - e durch die dünne Gelschicht 12 in irgendeiner geeigneten Weise eingebracht, wie auf
Seite 149 des vorgenannten Buches beschrieben.
Die Hauptunterschiede zwischen der vorliegenden Erfindung und dem Stand der Technik hinsichtlich der Diffusion in Gel, wie in dem
vorgenannten Buch beschrieben, sind die folgenden:
(1) Die erfindungsgemäße Vorrichtung erfordert eine metallisierte feste Oberfläche, da die sichtbare Niederschlagslinie, die von
einer immunologischen Reaktion biologischer Teilchen herrührt, auf der metallisierten Oberfläche gebildet wird (obwohl die Niederschlagslinie
auch in dem Gel gebildet wird). Hinsichtlich der bekannten Vorrichtung ist keine metallisierte feste Oberfläche offenbart,
vielmehr ist lediglich ein Mittel zum Tragen der Gelschicht genannt.
(2) Die in der vorliegenden Erfindung benutzte Gelschicht ist
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wesentlich dünner als die bekannte Gelschicht, wobei die bekannte
Gelschicht mindestens 1 mm aufweist, und in dem vorgenannten Buch als in dem Bereich von 1 bis 3 mni liegend beschrieben ist, während
die unbeweglich gemachte Peuchtigkeitsschicht nach der vorliegenden Erfindung eine Dicke von weniger als 1 mm aufweist. Dieser
beträchtliche Unterschied in der Dicke rührt von der Tatsache her, daß in der erfindungsgemäßen Vorrichtung das Gel als eine unbeweglich
gemachte Peuchtigkeitsschicht lediglich für eine Diffusion benutzt wird, d.h. zum Zwecke des Haltens von Feuchtigkeit in einem
unbeweglichen Zustand, so daß Proben der immunologisch reaktiven biologischen Teilchen entlang der metallisierten festen Oberfläche
diffundieren können und darauf die reproduzierbaren Niederschlagslinien bilden. Bei der Vorrichtung nach dem Stand der Technik wird
die Niederschlagslinie in dem Gel gebildet und deshalb ist eine dickere Gelschicht erforderlich, um eine ausreichend dicke Niederschlagslinie
zu bilden, die sichtbar ist.
(3) Als Ergebnis von (2) wird die gemäß der vorliegenden Erfindung
gebildete Niederschlagslinie ein dauerhafter Nachweis der immunologischen Reaktion, der kein Anfärben erfordert, um sichtbar zu
sein. Bei der bekannten Vorrichtung erfordert das Gel häufig ein Anfärben, um die Niederschlagslinie für das bloße Auge sichtbar zu
machen und selbst dann erhält man weniger Kontrast zwischen der Linie und dem Hintergrund als in der vorliegenden Erfindung.
(4) In der vorliegenden Erfindung werden die Schächte vollkommen durch die Gelschicht hindurch gebildet. Bei der Vorrichtung nach
dem Stand der Technik, wie er auf Seite 151 des vorgenannten Buches gegeben ist, müssen die Böden der Schächte von der Oberfläche einer
Platte, auf dem das Gel getragen ist, abgedichtet sein. Obwohl die erfindungsgemäße Vorrichtung auch zufriedenstellend arbeitet, wenn
die Böden der Schächte von der metallisierten Oberfläche des Behälters
10 abgedichtet sind, ist ein solches Abdichten der Böden der Schächte nicht erforderlich, und es ist bevorzugt, die Schächte
vollkommen durch die Gelschicht hindurch zu bilden, wie in allen Figuren dargestellt. Dieser deutliche Unterschied zwischen den
Schächten ergibt sich aus der Tatsache, daß die achtbare Niederschlagslinie in der erfindungsgemäßen Vorrichtung auf einer metallisierten
festen Oberfläche gebildet ist, während sie nach dem
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Stand der Technik im Gel selbst gebildet wird.
Die Schächte 13a - e, die durch die Gelschicht 12 hindurch gebildet
werden, sind im allgemeinen kreisförmig im Querschnitt und im allgemeinen weisen sie einen gleichen Durchmesser von etwa 1 bis zu
mehreren mm auf. Die erfindungsgemäße Vorrichtung unmittelbar vor
dem Einbringen der Proben immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in die Schächte ist in den Figuren la und Ib gezeigt.
In den Figuren 3a und 3b ist eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung gezeigt, in der das Teil mit der metallisierten
festen Oberfläche nun ein metallisiertes Substrat oder ein metallisierter Objektträger ist, wie er in der US-Patentanmeldung
Serial No. 445 204 beschrieben ist. Im einzelnen weist
das Substrat 30 eine im wesentlichen flache obere Oberfläche auf und ist aus einem geeigneten Material hergestellt, das Metall,
Glas, Kunststoff oder ein ähnliches Material sein kann. Das Substrat 30 ist vorzugsweise ein Glasobjektträger, wie ein übliches
Mikroskop-Deckglas. Die obere flache Oberfläche des Substrates wird gemäß der vorgenannten US-Patentanmeldung metallisiert. Diese
Metallisierung kann z.B. bestehen aus (1) einer nicht durchgehenden Schicht, d.h. aus Metallteilchen oder -kügelchen, wobei Indium
ein typisches Beispiel wäre, oder (2) einer ersten Schicht aus Indiumkügelchen, über die ein dünner Goldfilm gelegt ist oder (3)
eine Schicht aus Indiumkügelchen (oder eine durchgehende Schicht
aus Indium konstanter Dicke) , über der ein dünner Goldfilm angeordnet ist, der mit dem Indium legiert ist, und dünner Indiumoxydfilm
oder (4) ein Metall, wie Nickel, und Oxydfilm davon. Die Metallisierung mit Indiumteilchan ist häufig die bevorzugte Ausführungsform
für im allgemeinen gleich große Teilchen, während das mit Indium/Gοld-Legierung und Indiumoxyd beschichtete Substrat
häufig die bevorzugte Ausführungsform ist für sehr verschieden große Teilchen, a.B. wenn man auf Hepbitis untersucht. Die
nicht durchgehende Schicht aus Indiumteilchen als Metallisierung erfordert die Anwendung eines lichtdurchlässigen Substrates, wie
Glas oder Kunststoff, und die Indiumteilchen werden auf die Substratoberfläche
aufgedampft mit Durchmessern in der Größenordnung von 1000 2, obwohl die genaue Größe der Teilchen nicnt kritisch
ist, solange sie Durchmesser gleich einem großen Anteil einer
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Wellenlänge des sichtbaren Lichtes haben. Die Farbe der Indiumteilchen-Metallisierung
ist leicht braun. Im Falle der Indium/Gold-Legierung/Indiumoxyd-Metallisierung
ist die Dicke des Indiums etwa das Doppelte der Dicke des Goldes, wenn sie anfänglich aufgebracht
ist (Indiumdicke etwa 2000 R, Golddicke etwa 1000 S) und die Dicke
des Indiumoxydfilmes beträgt einige hundert R3 um eine Bronzefarbe
eines solchen Filmes zu erhalten. Wie in der vorgenannten US-Patentanmeldung
erwähnt, bestimmt der Grad der Oxydation des Indiummetalles die Farbe des oxydierten Filmes, so daß verschiedene Oxydationsgrade
verschieden gefärbte Objektträger erzeugen, die unterschiedliche
Empfindlichkeiten für verschiedene Dicken der Schichten aus biologischen Teilchen aufweisen.
Im Falle der metallisierten Beschichtung 31 auf der oberen Oberfläche
des Substrates 30, die aus Kügelchen allein oder Kügelchen aus einem ersten Metall wie Indium, einem Film aus einem zweiten
Metall wie Gold und dem Indiumoxydfilm gebildet ist, ist die obere
Oberfläche einer solchen metallisierten Beschichtung leicht irregulär. Wird andererseits eine solche metallisierte Beschichtung
mit einer durchgehenden Indiumschicht konstanter Dicke, einem Film aus Gold und dem Indiumoxyd gebildet, dann ist die obere
Oberfläche im wesentlichen flach. In der vorliegenden Erfindung können beide Arten metallisierten Substrates 30 benutzt werden.
ο Das Substrat 30 braucht nur eine Größe von etwa 3,25 cm (entspre-
2
chend 1/2 Zoll ) zu haben. Weitere Einzelheiten hinsichtlich der Substratmetallisierung und deren Herstellung sind in den oben genannten DT-OS gegeben.
chend 1/2 Zoll ) zu haben. Weitere Einzelheiten hinsichtlich der Substratmetallisierung und deren Herstellung sind in den oben genannten DT-OS gegeben.
Die Vorrichtung mit dem metallisierten Substrat 30 wird in gleicher
Weise wie die erste Ausführungsform hergestellt. Es wird daher eine dünne Schicht (weniger als 1 mm Dicke) aus Gel 12 auf
der metallisierten Oberfläche des Substrates gebildet und zwei oder mehr Schächte 13a und 13b werden vorzugsweise durch die ganze
Gelschicht hindurch gebildet.
In den Figuren 5A und 5B ist eine dritte Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung gezeigt, um eine immunologische Reaktion nachzuweisen. Im einzelnen besteht diese Ausführungsform der
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Vorrichtung aus einem metallisierten Substrat 10 und einer feuchtigkeit
sha It ige η "Cellulose-Membran als einer unbeweglich gemachten
Feuchtigkeitsschicht 11, die mindestens einen Teil der metallisierten Oberfläche des Substrates bedeckt. Das Substrat 10 weist eine
im wesentlichen flache obere Oberfläche auf und ist aus einem geeigneten Material, wie Metall, Glas, Kunststoff oder ähnlichem Material,
hergestellt. Das Substrat 10 ist vorzugsweise ein Glasobjektträger,
wie ein übliches Mikroskop-Deckglas, das leicht im Handel erhältlich ist. Die obere flache Oberfläche des Substrates
wird wie bei der vorbeschriebenen ersten und zweiten Ausführungsform metallisiert. Die Metallisierung kann z.B. folgendermaßen
sein: (1) eine nicht durchgehende Schicht, d.h. Metallteilchen oder -kügelchen, wobei Indium ein typisches Metall ist, oder (2)
eine erste Schicht aus Indiumkügelchen, die mit einem dünnen Goldfilm überlappt sind oder (3) eine Schicht aus Indiumkügelchen (oder
eine durchgehende Indiumschicht konstanter Dicke), die mit einem dünnen Goldfilm überlappt sind, der mit dem Indium legiert ist,
sowie einem dünnen Indiumoxydfilm oder (4) einem Metall, wie Nickel,
und dessen Oxydfilm. Die Indiumteilchen-Metallisierung ist häufig eine bevorzugte Ausführungsform für im allgemeinen gleich große
biologische Teilchen, während das Indium/Gold-Legierung- und Indiumoxyd-beschichtete
Substrat häufig eine bevorzugte Ausführungsform für sehr verschieden große Teilchen ist, z.B. für den Nachweis
der Hepatitis. Die nicht durchgehende Schicht aus Indiumteilchen-Metallisierung erfordert die Anwendung eines lichtdurchlässigen
Substrates, wie Glas oder Kunststoff, und die Indiumteilchen, die auf das Substrat aufgedampft sind, weisen Durchmesser
in der Größenordnung von 1000 S auf, obwohl die genaue Größe der Teilchen nicht kritisch ist, solang^ sie Durchmesser haben, die
gleich einem großen Anteil einer Wellenlänge des sichtbaren Lichtes sind. Die Farbe der Metallisierung aus Indiumteilchen ist
leicht braun. Im Falle der Indium/Gold-Legierung und Indiumoxyd-Metallisierung beträgt die Dicke des Indium's etwa das Doppelte
der Dicke des Goldes, wenn sie am Anfang aufgebracht ist (Indiumdicke , etwa 2000 S, Golddicke etwa 1000 R) und der Indiumoxydfilm
ist einige hundert S dick und man erhält eine Bronzefarbe des Filmes. Der Oxydationsgrad des ersten Metalles bestimmt die Farbe
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des»oxydierten Films, so daß verschiedene Oxydationsgrade zu unterschiedlich
gefärbten Objektträgern führen, die verschiedene Empfindlichkeiten für unterschiedliche Dicken der Schichten aus
biologischen Teilchen aufweisen.
In dem Falle, in dem die metallisierte Beschichtung 10b auf der oberen Oberfläche des Substrates aus Indiumkügelchen oder der Indium/Gold-Legierung
und dem Indiumoxydfilm gebildet ist, ist die obere Oberfläche der metallisierten Schicht leicht irregulär. Ist
andererseits die metallisierte Beschichtung aus einer durchgehenden Indiumschicht konstanter Dicke,dem Goldfilm und dem Indiumoxyd
gebildet, dann ist die obere Oberfläche im wesentlichen flach. In der vorliegenden Erfindung kann jede der beiden Arten metallisierten
Substrates verwendet werden. Dies ist gleichermaßen auf die anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anwendbar.
Die Cellulose-Membran 11 ist eine geeignete sehr dünne Membran aus Cellulose oder einem Cellulosederivat, wie Celluloseacetat,
und sie kann irgendein poröses Papier sein, wie irgendeines der üblichen Filterpapiere oder einfach ein Seidenpapier. Die Dimensionen
der Membran 11 können gleich oder verschieden von denen des Substrats 10 sein. Die Membran 11 ist so dünn, wie s±e bequemerweise
verwendet werden kann und sie weist weniger als 1 mm Dicke auf und sie ist dünner als das Papier, das bei den Doppeldiffusionstechniken
nach dem Stand der Technik benutzt wurde. In einer typischen Anwendung und zur besseren Darstellung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung ist die Membran 11 mit geringerer Breite und Länge als das Substrat 10 dargestellt. Das Substrat 10 braucht
nur eine Fläche von etwa 3,25 cm aufzuweisen. Hinsichtlich weiterer
Einzelheiten der Substratmetallisierung und deren Herstellung wird auf die oben genannten DT-OS verwiesen.
Die Cellulose-Membran 11 wird angefeuchtet, bevor oder nachdem sie
auf dem Substrat 10 angeordnet ist. Die Membran 11 sollte glatt mit ausreichender Sorgfalt auf der metallisierten Oberfläche angeordnet
werden, so daß sie sich entlang ihrer ganzen unteren Oberfläche
in Kontakt mit der metallisierten Oberfläche befindet.
Nach dem Zusammenlegen wird das Substrat mit seiner unbeweglich
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gemachten Feuchtigkeitsschicht in einer Feuchtigkeitskammer angeordnet
und eine erste Lösung, die erste immunologisch reaktive biologische Teilchen enthält, wird in einem ersten Schacht angeordnet,
z.B. dem zentral angeordneten Schacht 13a in dem Falle, in dem die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht ein Gel ist oder
auf einem ersten ausgewählten Bereich, wenn die unbeweglich gemachte Feucht igke its schicht eine feuchte Cellulose-Membran ist. Jede
der Proben kann aus einem oder mehreren Tropfen der entsprechenden Lösung bestehen. Unmittelbar nachdem die erste Probe auf der unbeweglich
gemachten Feuchtigkeitsschicht angeordnet ist (z.B. in dem Schacht 13a der Figur la oder auf der Membran 11 der Figur 5A)
oder zur gleichen Zeit wird eine Probe einer Testlösung oder eine zweite Probe, von der man annimmt, daß sie zweite immunologisch
reaktive biologische Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind, auf der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht angeordnet (z.B. in den Schächten 13c, 13b der Figur la
oder auf der Membran 11 der Figur 5A), die sich im Abstand von
der ersten befinden, und man läßt die beiden Proben in die Schicht diffundieren.
Die erste und die Testlösung enthalten im allgemeinen auch andere (unspezifische) biologische Teilchen, wobei ein typisches Beispiel
eine erste Lösung aus Kaninchen-Antiserum und eine Testlösung aus
menschlichem Serum ist. Während der Diffusion der Proben in der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht diffundieren die ersten
und anderen (unspezifischen) biologischen Teilchen der ersten Probe in die Schicht und werden auf der Oberfläche der metallisierten
festen Oberfläche adsorbiert (z.B. bei 11 der Figur la, 31 der
Figur 4b oder 10b der Figur 5B) und bilden eine monomolekulare
Schicht (z.B. 13a bei Figur 2a oder 12a bei Figur 6A) solcher Teilchen darauf. In gleicher Weise diffundieren irgendwelche zweiten
und anderen (unspezifischen) Teilchen der Testlösung oder der
zweiten Probe in die Membran und werden auf der Oberfläche des metallisieren Objektträgers unter Bildung einer monomolekularen
Schicht solcher Teilchen dort adsorbiert (z.B. 13b' der Figur 2a oder 13a der Figur 6A). Entlang des Schnittbereiches der diffundierenden
Proben wird eine komplexierte Protein-Niederschlagslinie gebildet (z.B. 15 in Figur 2a oder 14 in Figur 4a oder 14
in Figur -6A) , die verschiedene Schichten dick ist und aus einer
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immunologischen Reaktion des ersten und zweiten Teilchen resultiert.
Die Diffusion der Proben in der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht (z.B. Gel 12 oder Membran 11) findet radial
nach außen statt unter Bildung kreisförmiger Muster, so daß die
Niederschlagslinie eine gerade oder gebogene Linie ist, in Abhängigkeit von der Art der Teilchen und deren Konzentrationen» Die
Zeit für die Vervollständigung der Diffusion und der Bildung der Niederschlagslinie ist eine Funktion der Arten der teilnehmenden
ersten und zweiten biologischen Teilchen, der Konzentration jedes Teilchens in seiner Lösung, der Temperatur und des Abstandes der
Proben auf der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht. Ein enger Abstand der Proben führt zu raschen sich schneidenden Diffusionen
und somit zu der rascheren Bildung der Niederschlagslinie, als wenn die Proben in größerem. Abstand voneinander aufgebracht
werden. Die Proben können im Abstand von nur wenigen mm angeordnet werden. Die Zeit für die Diffusion der Proben und der
Bildung der Niederschlagslinie beträgt im allgemeinen 'einige Stunden, obwohl das Verfahren so beschleunigt werden kann, daß nur
einige Minuten erforderlich sind, wie im Falle der Elektrophorese
oder der erzwungenen Strömung der Lösungen. Das Feuchtigkeitsmittel in der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht kann destilliert,es
Wasser, eine Salzlösung oder eine gepufferte Lösung sein, die mit den Proben nicht reagiert und bei der die Feuchtigkeit
unbeweglich gehalten ist, so daß eine kontrollierte Diffusion der Proben in der Schicht stattfindet, um reproduzierbare
Ergebnisse zu erhalten.
Nach Bildung der Niederschlagslinie auf der metallisierten Oberfläche
des Substrates wird die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht, d.h. das Gel 12 oder die Membran 11, von der Substratoberfläche
abgezogen und die Substratoberfläche mit der daran haftenden Niederschlagslinie wird gewaschen, üblicherweise mit destilliertem
Wasser, und getrocknet, vorzugsweise durch Blasen von Luft bei Raumtemperatur über das Substrat. Die metallisierte feste
Oberfläche des Substrates wird dann durch visuelle Betrachtung untersucht» Diese Untersuchung kann eine direkte visuelle Beobachtung
mit dem bloßen Auge sein, um das von der metallisierten Oberfläche reflektierte oder hindurchgehende Licht zu beobachten. So
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wird z.B. die Metallisierung aus -Indiumteilchen im durchgehenden Licht betrachtet, während die Metallisierung aus Indium/Gold-Legierung
und Indiumoxyd im reflektierten Licht betrachtet wird. Die
Farbe des Niederschlages hängt hauptsächlich von der Farbe der metallisierten Oberfläche ab.
Die komplexierte Protein-Niederschlagslinie ist mit dem bloßen Auge
sichtbar und sie zeigt einen guten Kontrast zum Hintergrund und dies ermöglicht den Nachweis der biologischen Teilchen in einer
Empfindlichkeit, die sehr viel größer ist als die, die mit den üblichen
Doppeldiffusionstechniken erhalten wurde. Weiter ist kein Anfärben der Niederschlagslinie erforderlich, und dies im Unterschied
zum Stand der Technik, da der Kontrast zwischen der Niederschlagslinie und dem Hintergrund sehr viel größer ist als nach dem
Stand der Technik,
Die Empfindlichkeit mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist wesentlich
höher als die Empfindlichkeit bei den üblichen Doppeldiffusionstechniken,
insbesondere den Techniken, die in dem oben genannten Buch "Methods in Immunology and Immunochemistry" Band 3
beschrieben sind. Es ist daher nur eine sehr geringe Menge der biologischen Teilchen erforderlich, um mit der vorliegenden Erfindung
nachweisbar zu sein.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, daß die Niederschlagslinie auf der metallisierten Oberfläche eine dauerhafte
Aufzeichnung der nachgewiesenen immunologischen Reaktion
bildet.
Bei dem oben beschriebenen Nachweisverfahren wurde angenommen,
daß die erste Lösung eine bekannte Lösung war, die erste biologische Teilehen enthielt. Andererseits können aber auch die erste
und die zweite Lösung Testlösungen sein, von denen man annimmt, daß sie die ersten und zweiten Teilchen enthalten, in welchem
Falle die Bildung der Niederschlagslinie anzeigen würde, daß solche Teilchen tatsächlich in den entsprechenden Lösungen vorhanden
sind, während die Abwesenheit der Niederschlagslinie nur anzeigen würde, daß eine oder beide Lösungen nicht die entsprechenden Teil-
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chen enthalten haben. Im Falle der bekannten Lösung, die die ersten
Teilchen enthält, können solche ersten Teilchen in Laboratoriumskulturen
hergestellt oder aus höheren lebenden biologischen System erhalten werden, wie oben beschrieben, und sie sind im Handel
in hochreiner Form erhältlich oder sie können, wenn nicht im Handel erhältlich, chemisch gereinigt werden. Die typische Lösung
der ersten biologischen Teilchen kann eine Lösung von Salz in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit sein, die geeignet und nicht
reaktiv ist für die ersten biologischen Teilchen oder eine menschliche Serumprobe..
Die oben als erste und zweite biologische Teilchen bezeichneten biologischen Teilchen können Antigene, Antikörper, Viren, Bakterien,
Hormone, Enzyme oder andere biologische Teilchen sein, die man leicht züchten oder in anderer Weise isolieren und sammeln
kann oder die in menschlichem Serum oder einer anderen untersuchten Lösung vorhanden sind. Ein typisches Beispiel spezieller biologischer
Teilchen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen
werden, ist Hepatitis B- Antigen, nachfolgend HBAg genannt, als erste biologische Teilchen und Antikörper zur Hepatitis (HBAb
genannt) als zweite biologische Teilchen.
In vielen Fällen wird die Probe der ersten Teilchen eine Probe sein, die spezielle Antigene, wie HBAg, enthält. In einem solchen
Falle wäre die Testlösung ein Tropfen menschlichen Serums, das man von einem Patienten entnommen hat, von dem man annimmt, daß er
Hepatitis B habe. In einem direkten Test dafür würde die Anwesenheit der Antikörper HBAb nachgewiesen werden durch direkte visuelle
Beobachtung der Niederschlagslinie 14 oder 140. Andererseits können die Teilchen in der ersten Probe auch Antikörper für eine besondere
Krankheit sein und in einem direkten Test würde die Anwesenheit der Antigene zu solchen Antikörpern in der Serumprobe mit dem erfindungsgemäßen
Nachweistest bestimmt werden.
Ein indirekter oder Inhihitionstest für den Nachweis besonderer
immunologisch reaktiver biologischer Teilchen kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ebenfalls ausgeführt werden. Das Prinzip
des Inhibitionstests ist es, daß die ersten Teilchen, wenn sie in
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ausreichen!!er Menge vorhanden sind, freie sekundäre Teilchen in
Lösung neutralisieren. Bei dem Inhibitionstest neutralisieren also HBAg-Teilchens wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind,
freie Antikörper zur Hepatitis B in Lösung. Diese Reaktion hindert die Antikörper an der Bildung beobachtbarer Komplexe mit HBAg,
wenn die Testprobe auf die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht aufgebracht wird.
Der Inhibitionstest für ein Antigen und spezifisch für HBAg wird folgendermaßen ausgeführt: Eine Probe bekannter Lösung von HBAg
wird auf die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht aufgebracht und das HBAg und andere in der Lösung vorhandene Teilchen werden
als monomolekulare Schicht auf der metallisierten Oberfläche des Substrates adsorbiert, wie bei dem oben beschriebenen direkten
Test. Die Testlösung wird zubereitet, indem man eine Probe zu untersuchenden menschlichen Serums zu einer Lösung von HBAb in einem
Glasfläschchen oder einem anderen geeigneten Behälter'hinzugibt.
Das Glasflaschehen wird dann für eine Zeit gelagert, die ausreicht,
damit das HBAb mit dem HBAg in dem menschlichen Serum komplexiert,
wenn das Antigen darin vorhanden ist. Das Glasf läschchen wird vorzugsweise
bewegt, um die Komplexierungsgeschwxndigkext zu erhöhen. Schließlüi wird die Probe der Testlösung auf der unbeweglich gemachten
Feuchtigkeitsschicht angeordnet und nach einer geeigneten Zeit für die Diffusion der Proben wird die unbeweglich gemachte
Feuchtigkeitsschicht (d.h. das Gel 12 oder die Membran H.) von dem Substrat entfernt und die metallisierte Oberfläche wird visuell
untersucht. Die Ergebnisse des Inhibititionstests sind entgegengesetzt
zu derenjdes direkten Tests, d.h. die Anwesenheit des HBAg in der B?obe menschlichen Serums führt nicht zur Bildung einer
Niederschlagslinie, während, die Anwesenheit einer solche Niederschlagslinie
die Abwesenheit des HBAg in der Pmbe menschlichen Serums anzeigt.
Der Inhibitionstest für den Nachweis von HBAb wird ähnlich ausgeführt
wie der Inhibitionstest für HBAg, wozu in jeder der Stufen Antigen durch Antikörper und Antikörper durch Antigen ersetzt
werden.
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In den obigen Hepatitistests kann das HBAb aus menschlichem Serum eines Patienten erhalten werden, von dem man weiß, daß er Hepatitis
B gehabt hat oder es kann in einer Ziege, einem Kaninchen oder einem anderen geeigneten Tier entwickelt werden durch Injizieren
des HBAg, Warten einer geeigneten Inkubationszeit, wie zwei Wochen, und dann Abnehmen von .Blut aus dem Tier, welches den spezifischen
Antikörper enthält und Abtrennen des Antikörpers von den übrigen Blutteilchen.
Im Falle, daß die erste Lösung bekanntermaßen erste biologische Teilchen enthält, kann die Probe der ersten Lösung zentral auf
der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht angeordnet werden
und man kann Proben der verschiedenen Testlösungen, von denen man annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthalten, auf der unbeweglich
gemachten Feuchtigkeitsschicht um die erste Lösung herum aufbringen. Ist eine ausreichende Konzentration der zweiten Teil.-chen
in den verschiedenen Testlösungen vorhanden, dann bildet sich danach eine gerade oder gebogene Niederschlagslinie an dem Schnitt
der nach außen diffundierenden zentral aufgebrachten und der nachfolgend aufgebrachten verschiedenen Testlösungen. Die Wirkung des
obigen ist es, einen Test für die Anwesenheit der zweiten biologischen Teilchen in den Testlösungen zu schaffen.
Wenn die erste zentrale Lösung bekanntermaßen erste biologische Teilchen enthält und die diese umgebenden Testlösungen eine bekannte
Konzentration der zweiten Teilchen enthalten, dann kann die relative Lage der auf der metallisierten Oberfläche gebildeten
Niederschlagslinie zwischen der ursprünglich zentralen Lösung und der bekannten Lösung, welche die Testlösung umgibt, als Standard
benutzt werden, mit dem die relativen Lagen der anderen Niederschlagslinien, die als Ergebnis der Reaktion der in den Testlösungen
enthaltenen zweiten biologischen Teilchen mit der ersten zentralen Lösung gebildet werden, um die Konzentration der zweiten
Teilchen in solchen Testlösungen zu bestimmen. Ist die Lage der Niederschlagslinie der ersten zentralen Probe und einer unbekannten
Testlösung dichter bei der zentralen Lösung als die "Standard"-Niederschlagslinie,
so zeigt dies, daß die Konzentration der zweiten Teilchen in der Testlösung größer ist als die "Standard"-Kon-
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eo Pil =
zentration. Bei diesem Konzentrationstest bringt man die die erste
zentrale Probe umgebenden Proben der Testlösungen im gleichen Abstand
von der zentralen Pr'"be auf „
Aus der vorgenannten Beschreibung kann entnommen werdens daß die
vorliegende Erfindung ein verbessertes Doppeldiffusionsverfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens schafft zum
Nachweisen immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer Testlösung durch direkte visuelle Beobachtung der metallisierten
Oberfläche eines festen Teiless auf dem ein komplexierter Protein-Niederschlag
gebildet wird als Ergebnis einer immunologischen Reaktion zwischen ersten biologischen Teilchen und den speziellen erforschten
biologischen Teilchens die spezifisch zu den ersten Teilchen
sind ο Die erfindungsgemäßen Verfahren und die Vorrichtungen
zur Durchführung der Verfahren sind sehr einfach,, da lediglich
eine unbeifeglich gemachte Feuertigkeitsschicht auf der Oberfläche
eines festen Teiles angeordnet werden muß,, um die Diffusion der
Proben zu gestatten. Weiter vermeidet die einzigartige und hohe Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen metallisierten Teilchens
die Notwendigkeit des Anfärbens der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht oder des Substrates,, um die Niederschlagslinie
durch direkte visuelle Beobachtung nachzuweisen« Die in der erfindungsgemäßen
Vorrichtung benutzte unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht kann beträchtlich dünner sein als die im Stand der
Technik benutzte s da sie nur für· die Diffusion der Proben benutzt
wirdj, während nach dem Stand der Technik eine beträchtliche Dicke
benötigt wirds um die Niederschlagslinie darin zu bilden. Das erfindungsgemäße
Nachweisverfahren ist sehr viel empfindlicher als die üblichen Doppeldiffusionsverfahren zum Nachweisen immunologisch
reaktiver biologischer Teilchen, und es sind mit dem erfindungsge-
—α
mäßen Verfahren BSA-Anti kör per in einer Menge von 10 J g nachgewiesen
worden, und es kann sogar noch höhere Empfindlichkeit erbringen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die in den oben
genannten DT-OS beschriebenen metallisierten Teile so angepaßt werden,
daß sie für eine Doppeldiffusion von Proben in einer unbeweglich
gemachten Feuchtigkeitsschicht zum Nachweis der biologischen Teilchen brauchbar sind. Da die metallisierten Teile, z.B. Objektträger,
wiederholt mit identischen Eigenschaften hergestellt wer-
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den können, sind die Ergebnisse des Nachweises der biologischen
Teilchen gemäß der vorliegenden Erfindung jehr beständig und sie
können für viele brauchbare Zwecke verlernet werden, besonders auf
dem Gebiet der medizinischen Diagnostik -.si der Analyse menschlichen
Serums, z.B. zum Nachweis der var r-■ ;', .lanön darin enthaltenen
der
Antikörper und. Antigene. Da /visuelle Kontrast zwischen der Nie
der achlagslinie und der monomolekular en Schicht biologischer Teilchen
sehr bestimmt ist, wenn die erfindungsgemäße metallisierte feste Oberfläche benutzt wird, ist der Nachweis durch direkte Beobachtung
mit dem bloßen Auge möglich, und es ist keine komplizierte Testausrüstung erforderlich* Schließlich ist zu bemerken,
daß die Niederschlagslinie, die gemäß der vorliegenden Erfindung
erhalten wird, in dauerhafter Form vorliegt.
In den Figuren 7A und 7B ist in Draufsicht und im Schnitt eine
vierte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt zia* Bestimmung der Konzentration immunologisch reaktiver
biologischer Teilchen in einer Testlösung. Die biologischen Teilchen
der Testlöaung bilden eine zweite monomolekulare Schicht auf einem metallisierten festen Substrat, nachdem eine erste monomolekulare
Schicht immunologisch reaktiver biologischer Teilchen, die spezifisch sind zu den Teilchen in der Test lösung, zuerst an der
metallisierten Oberfläche des Substrates adsorbiert worden ist. Die Vorrichtung besteht grundsätzlich aus einem metallisierten festen
Substrat 10 und einer unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht, die durch eine Menge Feuchtigkeit gebildet wird, üie begrenzt
ist durch das Teil 11, welches auf dem Substrat 10 angeordnet ist, wie in den Figuren 7A und 7B ersichtlich. Der Abstand
zwischen dem Substrat 10 und dem Teil 11 ist in Figur Ib, 3b und 4b übertrieben dargestellt, um die getrennten Bestandteile der erfindungsgemäßen
Vorrichtung deutlicher zu zeigen. Das Substrat weist eine im wesentlichen flache obere Oberfläche 10a auf, und
es ist aus einem geeigneten Material hergestellt, das Metall, Glas, Kunststoff oder ähnliches Material sein kann. Das Substrat
10 ist vorzugsweise ein Glasobjektträger, wie ein übliches Mikroskop-Deckglas,
das leicht im Handel erhältlich ist. Die obere flache Oberfläche 10a des Substrates 10 ist gemäß den oben ge-
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= 26 -
nannten DT-OS metallisiert,, Die Metallisierung kann z.B. bestehen
aus (1) eine? nicht durchgehenden Schicht, d^h» Metallteilchen
oder -küge IeIiSiTi, t;otei Ina ium ein typisches Metall ist, oder (2)
einer ersten Schicht aus IM.iumkugelc.hen, über denen sich ein
dünner Goldfilm befindets oder (3) einer ersten Schicht aus den
Indlumkügelehen (oder- einer durchgehenden Schicht aus Indium konstanter Dicke) s auf der ein dünner Goldfilm angeordnet ist,- der
mit dem Indium legiert Ist und einem dünnen Indluraoxydfilm, oder
(4) einem Metalls wie Micke 1 und einem Orydfilm dai^on. Die Metallisierung
aus Inlluniteliehen Ist häufig eine bevorzugte Ausführung
sform für im allgemeinen gleich große Teilchen liegen der hohen
Empfindlichkeit. Die nicht durchgehend® Schicht aus Indiumteilchen
erfordert die Verwendung eines lichtdurchlässigen Substrates, wie
Glas oder Kunststoff, \xn& die Indiumteilchen, dl® auf die Substrat·=
oberfläche aufgedampft slnds haben Durchmesser In der Größenordnung
von 1000 S.s obwohl die genaue Größe der Teilchen nicht kritisch
ist, solange sie Durchmesser haben3 die gleich einem großen Anteil
einer Wellenlänge des sichtbaren Lichtes sind. Die Farbe der Indium»
tellehen-MetallisIerung Ist leicht braun. Die Metallisierung aus
Indium/Gold-Legierung und Indiumoxyd Ist häufig die bevorzugte
Ausführungsform für zwei In starkem Maße verschieden große biologische
Teilchen, da man damit den besten Kontrast erhält, der für das bloße Auge sichtbar ist, und zwar zwischen einer monomolekularen und einer dlmolekularen Schicht immunologisch reaktiver biologischer
Teilchens wofür ein typisches Beispiel Hepatitis-Antigen
und -Antikörper sind. Die Dicke des Indiums ist etwa die doppelte von der des Goldes, wenn.sie ursprünglich aufgebracht ist (Indiumdicke etwa 2000 S, Gold etwa 1000 R.) und der Indiumoxydfilm hat
eine Dicke von einigen hundert Ä, wobei der Film eine Bronzefarbe
erhält. Der Grad der Oxydation des ersten Metalles bestimmt die Farbe des oxydierten Films, so daß verschiedene Oxydationsgrade
verschieden gefärbte Objektträger hervorbringen, die unterschiedliche Empfindlichkeiten haben3 für verschiedene Dicken der Schichten
aus biologischen Teilchen,
Ist die Metallbeschichtung 10b auf der oberen Oberfläche des Substrates
10 aus Kügelchen eines ersten Metalles wie Indium oder Indium/Gold-Legierung und dem Oxydfilm des Indiums gebildet, dann
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ist die Oberfläche der metallisierten Schicht leicht irregulär.
Ist die Metallschicht andererseits aus einer durchgehenden Schicht von Indium konstanter Dicke aus dem Goldfilm und dem Indiumoxyd gebildet,
dann ist die obere Oberfläche im wesentlichen flach. Beide Arten metallisierten Substrates 10 können in irgendeiner der Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung Anwendung finden. Das Teil 11 kann typischerweise ein sauberer Glasobjektträger sein,
dessen Dimensionen gleich denen oder verschieden von denen des Substrates 10 sind. In einer typischen Anwendung und der besseren
Übersichtlichkeit halber weist das Teil 11 eine geringere Länge und Breite als das Substrat 10 auf. Das Teil 11 weist ein oder
mehrere Löcher lla, lib, lic, lld und lie auf, die durch das Teil
hindurchgehen. Sind mehr als ein Loch vorhanden, dann befinden sich die Löcher im Abstand voneinander3 und sie sind bevorzugt,
wenn auch nicht, notwendigerweise, symmetrisch angeordnet, wie in der besonderen Orientierung der fünf Löcher in. Figur 7A gezeigt.
Diese Löcher gleicher Größe l;aben einen Durchmesser im Bereich
von einem Bruchteil eines Millimeters bis zu einem Zentimeter.
Das Substrat 10 hat Dimensionen in der Größenordnung von etwa
2*2
6,5 cm (entsprechend 1 Zoll ) oder weniger, je nach der Zahl der in dem Teil 11 gebildeten Löcher 11a - e. Hat das Teil 11 nur ein einziges Loch, dann kann das Substrat eine Fläche von nur etwa
6,5 cm (entsprechend 1 Zoll ) oder weniger, je nach der Zahl der in dem Teil 11 gebildeten Löcher 11a - e. Hat das Teil 11 nur ein einziges Loch, dann kann das Substrat eine Fläche von nur etwa
2
3,25 cm haben und das Teil 11 kann ebenfalls eine Fläche von
3,25 cm haben und das Teil 11 kann ebenfalls eine Fläche von
ρ
nur etwa 3,25 cm oder weniger haben.
nur etwa 3,25 cm oder weniger haben.
Nachdem das metallisierte Substrat 10 und das Teil 11 augewählt sind, wird eine monomolekulare Schicht erster immunologich reaktiver
biologischer Teilchen auf der beschichteten Oberfläche 10b des Substrates in allen Ausführungsformen mit Ausnahme der Figuren
9A und 9B adsorbiert. Die Adsorption der ersten biologischen Teilchen
kann durch einfaches Eintauchen des Substrates in einer Lösung der ersten biologischen Teilchen erfolgen, so daß die metallisierte
Oberfläche vollkommen davon bedeckt wird. Es können aber auch einige Tropfen der Lösung auf die metallisierte Oberfläche
aufgebracht und das Substrat in einer Feuchtigkeitskammer aufbewahrt
werden. Das erste biologische Teilchen wird auf der Grundlage seiner Spezifität zu einem besonderen zweiten immunologisch
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reaktiven biologischen Teilchen ausgewählt ΰ das mit dem ersten
Teilchen immunologisch unter Bildung einer kleineren zweiten monomolekularen
Schicht auf dem Substrat reagieren wird«, i-jenn es in
der untersuchten Lösung vorhanden isto Die ersten Teilchen können
in Laboratoriumskulturen hergestellt werden oder man kann sie aus höheren lebenden biologischen Systemen erhaltenfl wie oben beschrieben,
und sie sind im Handel in hochreiner Form erhältlich und falls sie nicht erhältlich sind, können sie chemisch gereinigt werden.
Die Lösung derjersten biologischen Teilchen ist typischerweise eine
Salzlösung in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit, die geeignet ist für und nicht reaktiv mit den ersten biologischen Teilchen
oder einer Probe menschlischen Serums» Nachdem das Substrat in die
Lösung für eine ausreichende Zeit eingetaucht ist, daß die ersten biologischen Teilchen und andere darin vorhandene nicht spezifische
biologische Teilchen an der Oberfläche des Substrates adsorbiert sind und eine im wesentlichen vollständige monomolekulare
Schicht 10c auf der ganzen oberen Oberfläche der metallisierten Beschichtung 10b bilden, wird das Substrat aus der Lösung herausgenommen.
Die für die Bildung der monomolekularen Schicht 10c auf dem Substrat 10 erforderliche Zeit (im allgemeinen bis zu einer ■
Stunde) ist eine umgekehrte Ianktion der Konzentration der ersten
Teilchen in der Lösung. Ein Spülen der beschichteten Oberfläche des Substrates 10 ist häufig empfohlen nach der Bildung der monomolekularen
Schicht 10c darauf s um Verunreinigungen zu entfernen.
Das mit der monomolekularen Schicht bedeckte Substrat 10 wird dann getrocknet s vorzugsweise indem man Luft bei Zimmertemperatur über
das Substrat bläst, um das Trocknen zu beschleunigen. Die monomolekulare
Schicht 10c auf dem Substrat hat eine Dicke im allgemeinen im Bereich von 30 bis 100 S, die natürlich durch die jeweiligen
biologischen Teilchen bestimmt ist, die die erste Schicht bilden und die monomolekulare Schicht ist mit dem bloßen Auge
sichtbar als eine dunklere Schattierung des Brauns auf dem mit Indiumteilchen bedeckten Objektträger und sie ist kaum, wenn überhaupt, auf dem Objektträger mit Indium/GοId-Legierung und Indiumoxyd sichtbar.
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der gesamten oberen Oberfläche des metallisierten Substrates 10 adsorbiert ist, wird das Teil 11 auf der oberen Oberfläche des
mit der monomolekularen Schicht bedeckten Substrates angeordnet. Obwohl diese Anordnung des mit der moncmolekularen Schicht bedeckten
Substrates und des Teiles 11 in einigen Fällen zufriedenstellend sein mag, in denen die metallisierte Beschichtung 10b auf dem
Substrat aus Indiumkügelchen gebildet ist, wurde in vielen solcher
Fälle festgestellt, daß die in die Löcher 10a bis e eingebrachten Testlösungen nicht reproduzierbare und außergewöhnlich große zweite
monomolekulare Schichten durch Kapillarwirkung bilden, die von dem irregulären Abstand zwischen der unteren Oberfläche des Teiles
11 und der irregulären Oberfläche der monomolekularen Schicht 10c
herrühren, da die obere Oberfläche der Substratbeschichtung 10b irregulär ist. Im Falle einer Beschichtung 10b auf dem Substrat
mit einer irregulären Oberfläche ist es daher bevorzugt, eine geringe Klemmkraft anzuwenden, um die untere Oberfläche des Teiles
11 in stärkeren Kontakt mit der monomolekularen Schicht 10c auf
dem Substrat 10 zu halten, um reproduzierbare Ergebnisse zu bekommen, Ist die metallisierte Beschichtung 10b mit Schichten konstanter
Dicke aus Indium und Gold (und Indiumoxyd) hergestellt, dann ist eine solche Klemmkraft im allgemeinen nicht erforderlich«
Das Klemmen wird, wenn es erforderlich ist, mit einem geeigneten Klemmgerät zum Zusammenklemmen der Teile 10 und 11 erhalten. Die
erfindungsgemäßen Vorrichtungen können als ein Gerät vertrieben
werden, das nur aus einem metallisierten Substrat und einem Teil 11 besteht oder es kann auch die monomolekulare Schicht 10c aufweisen.
Mit dem auf dem mit der monomolekularen Schicht bedeckten Substrat
10 angeordneten Teil 11 (das, wenn erforderlieh, festgeklemmt werden
kann) wird der Bereich zwischen den Objektträgern 10 und 11,
der für die Konzentrationsbestimmung benutzt werden soll, angefeuchtet, um die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht fertigzustellen
und eine nachfolgende reproduzierbare Diffusion der Lösung zu erhalten, welche die zweiten biologischen Teilchen einschließen
kann» Das Einrichten der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht wird typischerweise erreicht durch Einbringen eines
Tropfens Wasser in jedes der ein oder mehreren Löcher 11a - e, die
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für die Testlösungen benutzt werden sollen. Der Wassertropfen
wird dann zwischen die untere Oberfläche des Teiles 11 und die freie Oberfläche der monomolekularen Schicht 10b durch Kapillarwirkung
gezogen« Werden die Teile 10 und 11 zusammengeklemrat, dann
vermindert dies die erforderliche Wassermenge»
Die in den Figuren 7A und. TB dargestellte Vorrichtung oder irgend·»
eine der anderen Ausführung sf or men wird dann in einer Feuchtigkeitskammer angeordnet, entweder kurz bevor oder kurz nachdem man
die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht eingerichtet hat= Die Feuchtigkeitskammer wird dazu benutzt, die unbeweglich gemachte
Feuchtigkeitsschicht in dem angefeuehteten Zustand zu erhalten,
da die nachfolgende Diffusion eines Tropfens der Testlösung bis zu einigen Stunden erfordern kann und die angefeuchtete Region
sonst während dieser Zeit austrocknen und die Diffusion der Testlösung entlang der monomolekularen Schicht 10c verhindern würde.
Nachdem die Vorrichtung mit den zwei Objektträgern in der Feuchtigkeitskammer
angeordnet ist und der Wassertropfen durch Kapillarwirkung zwischen die beiden Objektträger gezogen worden ist, wird ein
Tropfen der Lösung, die auf die Anwesenheit und Konzentration eines zweiten immunologisch reaktiven biologischen Teilchens untersucht
werden soll, das spezifisch zu dem ersten Teilchen ist, das die monomolekulare Schicht 10 c bildet, in eines der Löcher 11a - e
eingebracht. Im Falle einiger verschiedener Testlösungen werden einzelne Tropfen davon in den verschiedenen Löchern angeordnet, so
daß jedes Loch einen Tropfen von nur einer der Lösungen enthält. Die Vorrichtung wird dann für eine vorbestimmte Zeit in der Feuchtigkeit
skammer belassen, so daß die zweiten Teilchen, wenn solche in der Testlösung vorhanden'sind, durch Diffusion des Tropfens zwischen
die beiden Objektträger eine monomolekulare Schicht zweiter biologischer Teilchen aufgrund der immunologischen Reaktion zwischen
den ersten und den zweiten Teilchen bilden. Nachdem die vorbestimmte Zeit (die einige Stunden betragen kann) vergangen ist,
wird das Teil 11 entfernt und das Substratteil 10 gespült, typischerweise mit destilliertem Wasser, getrocknet und visuell durch
Betrachten mit dem bloßen Auge im reflektierten oder durchgehenden
Licht untersucht. Wird ein Objektträger mit Indiumteilchen verwendet,
dann wird die Lichtdurchlässigkeit benutzt und bei Objekt -
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trägem mit Indium/Gold-Leglerung uiii Ind.iumoxyd die Lichtreflexion.
Die Abwesenheit der zweiten Teilchen in der Testlosung führt dazu, daß sich keine zweite monomclekulare Schicht au? der
ersten monomolekularen Schicht 10c im Bereich des Loches3 ir das
der Tropfen Testlösung eingebracht war, bildet. Die Anwesenheit
der zweiten Teilchen in der Te st lösung resultiert dagegen in der Eildung einer zweiten monomolekularen Schicht radial nach außen
entlang der freien Oberfläche der monomolekularen Schicht 10c von
dem Bereich, der dem Loch im Teil 11 entspricht. Der Durchmesser oder Bereich dieser zweiten Schicht steht in Beziehung zur Konzentration
der zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung, Durch Messen des Durchmessers der zweiten Schicht kann also die
Konzentration der zweiten Teilchen in der Testlösung bestimmt werden.
Der Durchmesser der zweiten Schicht ist natürlich abhärgig sowohl von der Dauer der Diffusionsstufe als auch der Konzentration
der zweiten Teilchen in der Testlösung. Indem man eine feste Zeit für die Diffusionsstufe für alle Messungen festlegt und indem
man einen Tropfen einer Lösung mit bekannter Konzentrator
an zweiten Teilchen in eines der Löcher als Standard einbringe,
kann die Konzentration der Testlösungen leicht bestimmt werden.
Andererseits kann die Konzentration durch bloßes Betrachten der Fläche oder des Durchmessers und geistiges Vergleichen mit Mheren
Erfahrungen abgeschätzt werden. Wie oben erwähnt, kann irgendeine Zahl verschiedener Testlösungen quantitativ zur gleichen
Zeit auf der gleichen Vorrichtung bewertet werden, indem man die anderen Löcher für die anderen Test lösungen benutzt.
Die Figur 8A ist eine Draufsicht und die Figur 8B ein Schnitt der beschichteten Oberfläche des Substrates 10 nach Beendigung
der quantitativen oben beschriebenen Messung. Es wird angenommen, daß ein Tropfen der Standardlösung (d.h. der bekannten Konzentration)
in das zentrale Loch lic eingebracht worden ist, so daß die zweite monomolekulare'Standard "-Schicht lic1, die sich auf.
der monomolekularen Schicht 10c unter dem Loch lic gebildet hat, das Zentrum des Substrates 10 ist. Ein Tropfen einer ersten Testlösung,
die in das Loch 11a eingebracht wurde, führte nicht zur Bildung einer zweiten Schicht auf der beschichteten Oberfläche
des Substrates 10 unterhalb des Loches lla und daher enthält eine
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solche erste Testlösung keine merkliche Zahl der zweiten Teilchen.
Ein Tropfen einer zweiten Testlösung, der In das Loch lib eingebracht
wurde, führte zum größten Durehmesser (doppelt so groß .wie
der der Schicht lic'} für die zweite Schicht 11b1, so daß die
Dure hmesserbeStimmung anzeigt, daß eine Konzentration vorhanden
sein muß, die sehr viel größer ist als die der Standardlösung. Ein
Tropfen einer dritten Testlösung, die in das Loch lld eingefüllt wurde, führte zu einer zweiten Schicht lld' mit einem Durchmesser,
der etwas kleiner ist als der der Standardschicht lic' und dies zeigt, daß die Konzentration der dritten Testlösung etwas geringer
ist als die Standardkonzentration. Schließlich wurde ein Tropfen .
einer vierten Testlösung in dem Loch lie angeordnet und die gebildete
zweite monomolekulare Schicht lie' hat einen Durchmesser, der
etwa 1,75-mal größer ist als der Standarddurchmesser.
In vielen Fällen besteht die erste monomolekulare Schicht 10c biologischer
Teilchen aus bestimmten Antigenen, wie Hepatitis B-Antigen (BHAg)= In einem solchen Falle würden die Testlösungen menschlichen
Serums von Patienten genommen werden., von denen man annimmt,
daß sie Hepatitis B gehabt hatten und in einem direkten Test würde die Anwesenheit und Konzentration der Antikörper zu Hepatitis B
(HBAb) durch Messen der Durchmesser der zweiten monomolekularen Test- und Standardschichten bestimmt werden» Die Teilchen in der
ersten monomolekularen Schicht 10c können aber auch die Antikörper zu einer bestimmten Krankheit sein und in einem direkten Test würde
die Anwesenheit und die Konzentration der Antigene zu solchen Antikörpern
in der Serumprobe bestimmt werden.
Ein indirekter oder Inhibitionstest für den Nachweis und die Bestimmung
der Konzentration eines bestimmten immunologisch reaktiven biologischen Teilchens kann ebenfalls mit der erfindungsgemäßen
Vorrichtung ausgeführt werden. Das Prinzip des Inhibitionstests
ist es, daß die ersten Teilchen, wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind, freie sekundäre Teilchen in der Lösung neutralisieren.
Wenn daher beim Inhibitionstest HBAg-Teilchen in ausreichender Menge vorhanden sind, dann neutralisieren sie freie HBAb-Teilchen
in Lösung. Diese Reaktion hindert die Antikörper daran, beobachtbare Komplexe zu bilden (d.h. eine bimolekulare Schicht),
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wenn der Objektträger mit der Ant.igenschicht (der ersten monomolekularen
Schicht) der Testlösung ausgesetzt wird.
Der Inhibitionstest für ein Antigen und spezifisch für HBAg wird
folgendermaßen ausgeführt: Eine monomolekulare Schicht 10c aus HBAg wird an der beschichteten Oberfläche 10b des Substrates adsorbiert,
wie bei dem direkten Test oben beschrieben. Die Testlösung wird bereitet, indem man eine Probe zu untersuchenden menschlichen
Serums zu einer Lösung von HBAb in einem Glasfläschchen oder einem anderen geeigneten Behälter hinzugibt. Das Glasfläschchen
wird dann für eine ausreichende Zeit gelagert, damit das HBAb mit dem HBAg in der Probe menschlichen Serums komplexieren kann, wenn
das Antigen darin vorhanden ist. Das Glasfläschchen wird vorzugsweise bewegt, um die Komplexierungsgeschwindigkext zu erhöhen.
Schließlich wird ein Tropfen der Testlösung in eines der Löcher des Teiles 11 eingebracht und nach einer geeigneten Zeit wird das
Teil 11 entfernt und die beschichtete Oberfläche des Substrates gespült, getrocknet und visuell untersucht. Die Ergebnisse dieses
Inhibitionstestes sind entgegengesetzt zu denen des direkten Testes,
d.h. die Anwesenheit des HBAg im menschlichen Serum gibt keine zweite monomolekulare Schicht, während die Anwesenheit einer
solchen Schicht die Abwesenheit des HBAg in der Probe menschlichen Serums anzeigt.
Der Inhibitionstest für den Nachweis von HBAb wird ähnlich ausgeführt
wie der Inhibitionstest für HBAg mit Ersetzung von Antigen durch Antikörper und Antikörper durch Antigen in jeder der Stufen.
In den obigen Hepatitis-Tests kann das HBAb aus menschlichem Serum
eines Patienten erhalten werden, von dem man weiß, daß er Hepatitis B hat oder es kann entwickelt werden in einer Ziege, einem
Kaninchen oder einem anderen Tier, dem man HBAg injiziert, eine geeignete Inkubationszeit, wie etwa 2 Wochen, wartet und dann von
dem Tier Blut abzieht, welches den spezifischen Antikörper enthält und den Antikörper von den verbleibenden Blutteilchen abtrennt,
In allen obigen Test wird die zweite monomolekulare Schicht auf der beschichteten Oberfläche des Substrates 10 durch eine purpur-
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farbige Stelle angezeigt in dem Falle, daß das beschichtete Substrat
10 gemäß dem in der US-Patentanmeldung Serial No. 445 204 beschriebenen Verfahren hergestellt ist, in einer bevorzugten Ausführungsform
des beschichteten Substrates 10, wenn die ersten und zweiten biologischen Teilchen von sehr verschiedener Größe sind.
Anders gefärbte Hintergründe des Oxydfilms und andere Farben des durch die zweite monomolekulare Schicht gebildeten Fleckes sind
auch möglich. Im Falle von Objektträgern mit Indiumteilchen, die bevorzugt sind, wenn die biologischen Teilchen im allgemeinen
von gleicher Größe sind, weist der Fleck mit der zweiten Schicht eine deutlich dunklere Braunschattierung auf.
In den Figuren 9A und 9B ist die fünfte Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung dargestellt. Die Vorrichtung nach den Figuren 9A und 9B ist ähnlich der in den Figuren 7A und 7B abgebildeten
mit der Ausnahme, daß das metallisierte Substrat 10 nicht die monomolekulare Schicht der ersten biologischen Teilchen auf
der freien Oberfläche der metallisierten Oberfläche 10b trägt. Die obere Oberfläche des beschichteten Substrates 10 ist also nur die
freie Oberfläche der Metallisierung, bevor der Test ausgeführt wird. Es werden die beiden gezeigten Löcher 11a und lib durch das
Teil 11, das ein Objektträger sein kann, obwohl dies nicht als Begrenzung der Struktur zu verstehen ist, gebildet und sie verlaufen
vorzugsweise entlang der zentralen Linie des Teiles 11, wobei jedes Loch von der gegenüberliegenden Kante des Objektträgers durch
einen Abstand getrennt ist, der etwa 1/4 der Breite des Teiles ausmachen kann. In der Praxis sind die Löcher 11a und 11b dichter
beieinander angeordnet. Ein Vorteil der Vorrichtung ist es, daß dieser Lochabstand bis zu einem Millimeter zwischen den Kanten
der Löcher 11a und lib verringert werden kann und die Diffusionszeit zum Bilden der monomolekularen Schichten wird dadurch beträchtlich
vermindert. Die Löcher 11a und 11b befinden sich im gleichen Größenbereich wie die Löcher der vierten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Zum Nachweis der zweiten biologischen Teilchen in einer Testlösung
wird ein Tropfen einer ersten Lösung, von der man weiß, daß sie die ersten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen enthält,
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in das Loch 11a gegeben, nachdem die Region zwischen den beiden
Objektträgern in dem Bereich um die Löcher herum angefeuchtet ist, um eine unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht zu schaffen. Unmittelbar danach wird ein Tropfen einer Testlösung, von der man
annimmt, daß sie die zweiten immunologisch reaktiven biologischen
Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind, in
dem Loch 11b angeordnet. Die ersten Teilchen und irgendwelche
nicht spezifischen biologischen Teilchen in dem Tropfen der ersten Lösung bilden eine erste monomolekulare Schicht lla·, die auf der
freien Oberfläche der Substratmetallisierung 10b über einen kreisförmigen Bereich adsorbiert ist, dessen Zentrum im Zentrum des
Loches lla liegt. Der Tropfen der Testlösung, der die zweiten biologischen Teilchen und nicht spezifische biologische Teilchen enthalten kann, bildet eine zweite monomolekulare Schicht 11b1, die
an der freien Oberfläche der Substratmetallisierung lib über einen kreisförmigen Bereich adsorbiert ist, dessen Zentrum im Zentrum
des Loches 11b liegt, wie in den Figuren Sk und 9B gezeigt. Ist
eine ausreichende Konzentration eines oder beider der biologischen Teilchen in der ersten und der Testlösung vorhanden, so daß sich
die diffundierenden ersten und zweiten Teilchen schneiden, dann
wird auf der metallisierten Oberfläche des Substrates eine Niederschlagslxnie 30 gebildet, die für das bloße Auge deutlich sichtbar wird und die Bildung einer komplexierten Protein-Niederschlagslinie anzeigt, die gerade oder gebogen sein kann. Die Niederschlagslinie 30 haftet an dem metallisierten Substrat, so daß beim Wegnehmen des Teiles 11 (zusammen mit der Feuchtigkeit) eine permanente Aufzeichnung der immunologischen Reaktion auf dem Substrat 10 verbleibt, die deutlich sichtbar ist, ohne daß sie ein Anfärben erfordert. Nimmt man gleiche Diffusionsgeschwindigkeiten für die
biologischen Teilchen an, dann zeigt die Lage der Niederschlagslinie 30 zwischen den beiden Löchern lla und 11b die relative Konzentration der biologischen Teilchen in den beiden Lösungen an.
Es wird angenommen, daß die Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in dem Lösungstropfen, der in das Loch 11b eingeführt
wurde, wesentlich größer ist als die ersten Teilchen in der Lösung, die in dem Loch lla angeordnet wurde, da die Niederschlagslinie 30 sich bei etwa 1/3 des Abstandes von dem Loch lla befindet. Wenn
die Diffusionsgeschwindigkeit der beiden biologischen Teilchen
Objektträgern in dem Bereich um die Löcher herum angefeuchtet ist, um eine unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht zu schaffen. Unmittelbar danach wird ein Tropfen einer Testlösung, von der man
annimmt, daß sie die zweiten immunologisch reaktiven biologischen
Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind, in
dem Loch 11b angeordnet. Die ersten Teilchen und irgendwelche
nicht spezifischen biologischen Teilchen in dem Tropfen der ersten Lösung bilden eine erste monomolekulare Schicht lla·, die auf der
freien Oberfläche der Substratmetallisierung 10b über einen kreisförmigen Bereich adsorbiert ist, dessen Zentrum im Zentrum des
Loches lla liegt. Der Tropfen der Testlösung, der die zweiten biologischen Teilchen und nicht spezifische biologische Teilchen enthalten kann, bildet eine zweite monomolekulare Schicht 11b1, die
an der freien Oberfläche der Substratmetallisierung lib über einen kreisförmigen Bereich adsorbiert ist, dessen Zentrum im Zentrum
des Loches 11b liegt, wie in den Figuren Sk und 9B gezeigt. Ist
eine ausreichende Konzentration eines oder beider der biologischen Teilchen in der ersten und der Testlösung vorhanden, so daß sich
die diffundierenden ersten und zweiten Teilchen schneiden, dann
wird auf der metallisierten Oberfläche des Substrates eine Niederschlagslxnie 30 gebildet, die für das bloße Auge deutlich sichtbar wird und die Bildung einer komplexierten Protein-Niederschlagslinie anzeigt, die gerade oder gebogen sein kann. Die Niederschlagslinie 30 haftet an dem metallisierten Substrat, so daß beim Wegnehmen des Teiles 11 (zusammen mit der Feuchtigkeit) eine permanente Aufzeichnung der immunologischen Reaktion auf dem Substrat 10 verbleibt, die deutlich sichtbar ist, ohne daß sie ein Anfärben erfordert. Nimmt man gleiche Diffusionsgeschwindigkeiten für die
biologischen Teilchen an, dann zeigt die Lage der Niederschlagslinie 30 zwischen den beiden Löchern lla und 11b die relative Konzentration der biologischen Teilchen in den beiden Lösungen an.
Es wird angenommen, daß die Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in dem Lösungstropfen, der in das Loch 11b eingeführt
wurde, wesentlich größer ist als die ersten Teilchen in der Lösung, die in dem Loch lla angeordnet wurde, da die Niederschlagslinie 30 sich bei etwa 1/3 des Abstandes von dem Loch lla befindet. Wenn
die Diffusionsgeschwindigkeit der beiden biologischen Teilchen
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verschieden ist, die Konzentration beider aber gleich ist, dann muß dies in die Berechnung zur Bestimmung der Konzentration der
Testlösung von der Lage der Niederschlagslinie 30 aus einbezogen werden. Man läßt die Tropfen der beiden Lösungen wieder für eine
vorbestimmte Zeit durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsbarriere diffundieren, die in dieser Ausführungsform ausreicht, daß
die ersten und zweiten biologischen Teilchen aufeinander stoßen und die Niederschlagslinie auf der metallisierten Substratoberfläche
bilden. Die Abwesenheit der komplexierten Niederschlagslinie 30 zeigt an, daß entweder die Testlösung keines der zweiten
Teilchen enthielt oder daß sie nur eine so geringe Konzentration davon enthielt, daß keine merkliche immunologische Reaktion eintreten
konnte. Wieder ist kein Anfärben erforderlich, um die Nieder schlagslinie zu beobachten. In dem Falle, in dem man weiß, daß
die erste Lösung die ersten biologischen Teilchen enthält, können mehr als zwei Löcher durch das Teil 11 hindurch gebildet werden,
und es kann eine geeignete Anordnung der Löcher erfolgen, wie in Figur la gezeigt, wobei eine Probe der ersten Lösung in das zentral
angeordnete Loch lic eingebracht werden würde und Proben der verschiedenen
Testlösungen, von denen man annimmt, daß sie die zweiten biologischen Teilchen enthalten, würden in den das zentrale
Loch lic umgebenden Löchern 11a, lib, lld und He angeordnet. Ih
jedem Falle ausreichender Konzentration der zweiten Teilchen in der entsprechenden Testlösung bildet sich eine Niederschlagslinie,
wo die diffundierenden ersten und zweiten Teilchen aufeinander stoßen und dies ist ein Nachweis für die Anwesenheit der zweiten
biologischen Teilchen in den Testlösungen. Weiß man, daß die erste Lösung die ersten biologischen Teilchen enthält und enthä-lt eine
der anderen Lösungen eine bekannte Konzentration der zweiten Teilchen, dann wird eine Probe der ersten Lösung in dem zentral angeordneten
Loch lic angeordnet und eine Probe der "Standardlösung" (bekannte Konzentration der zweiten Teilchen) wird in einem der
dieses umgebenden Löcher, z.B. in dem Loch 11a angeordnet. Die relative Lage der Niederschlagslinie, die zwischen den Löchern
lic und 11a. gebildet wird, ist dann der Standard, mit dem die relativen
Lagen der anderen Niederschlagslinien verglichen werden, die als Ergebnis der Diffusion und Reaktion der zweiten biologischen
Teilchen gebildet werden, die in den Proben der Testlösungen vorhanden sind, die in die umgebenden Löcher lib, Hd und He
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eingebracht wurden. Bei diesem Konzentrationstest weisen die umgebenden
Löcher einen gleichen Abstand von dem zentralen Loch lic auf .
In den Figuren 1OA und 1OB ist eine sechste Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt. Im einzelnen ist das Substrat 10 metallisiert und die monomolekulare Schicht 10c der ersten
biologischen Teilchen ist daran adsorbiert, wie in den Figuren 7A und 7B. Der Unterschied zwischen den Strukturen dieser beiden
Ausführungsformen ist die Tatsache, daß das Teil 11 keine Löcher enthält. Bei Abwesenheit der Löcher werden ein oder mehrere
Tropfen Wasser auf die monomolekulare Schicht aufgebracht, welche die Oberfläche 10c des Substrates 10 bedeckt, und zwar entlang
einer oder mehrerer Kanten des Objektträgers 11, so daß der bzw.
die Wassertropfeη durch Kapillarwirkung zwischen die beiden Objektträger
gezogen werden und eine unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht
bilden. In den Figuren 1OA und 1OB wird nur eine der Kanten des Teiles 11, das üblicherweise ein Objektträger ist, zu
diesem Zweck benutzt. Nachdem die einzelnen Bereiche zwischen den beiden Objektträgern angefeuchtet sind, wird ein (oder mehrere
Tropfen im Abstand voneinander entlang der Kante des Teiles 11) der Testlösung auf die monomolekulare Schicht auf dem Substrat 10
an der angefeuchteten Kante des Teiles 11 aufgebracht und man
läßt solche Lösungstropfen für eine vorbestimmte Zeit durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht diffundieren. Wie in den
Figuren 1OA und 1OB gezeigt, bilden die vorhandenen zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung eine zweite monomolekulare
Schicht 11a1 in einer Richtung senkrecht zur Kante des Teiles 11, entlang der der Tropfen aufgebracht wurde. Die Breite der zweiten
monomolekularen Schicht lla1 (gemessen zwischen den beiden gezeigten
langen Seiten) ist ein Maß der Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung. Wie im Falle der Ausführungsformen der Figuren 7A bis 8B kann ein Tropfen einer "Standard"-Lösung
(d.h. einer solchen, die eine bekannte Konzentration der zweiten biologischen Teilchen enthält) entlang einer zweiten Kante
des Teiles 11 aufgebracht werden, um einen Vergleich mit der Testlösung zu haben, wenn ein Standard nicht bereits zu einer früheren
Zeit hergestellt worden ist. Selbstverständlich können auch
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die anderen Kanten des Teiles 11 zum Testen der Konzentration anderer Testlösungen, von denen man annimmt, daß sie die zweiten
biologischen Teilchen enthalten, vorwendet werden.
In den Figuren HA und HB ist eine siebente Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Bestimmen der Konzentration bestimmter immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in einer
Testlösung gezeigt. In den bisher beschriebenen Ausführungsformen
unter Bezugnahme auf die Figuren 7A bis 1OB bilden die zweiten biologischen Teilchen eine zweite monomolekulare Schicht in dem
Maße, in dem der Tropfen der Testlösung durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht diffundiert. Ein solcher Prozeß ist
offensichtlich relativ langsam, und er erfordert bis zu 24 Stunden in Abhängigkeit von der Konzentration der Teilchen in der Testlösung.
Der Prozeß des Entwickeins der zweiten monomolekularen Schicht kann beschleunigt werden, indem man einen wirksamen Mechanismus
benutzt, der die zweiten biologischen Teilchen rascher verteilt. Ein erster wirksamer Mechanismus zur Erhöhung der Teilchenverteilungsgeschwindigkeit
ist in den Figuren HA und HB dargestellt, bei dem ein erzwungenes Fließen der zweiten Lösung
angewandt wird, indem man Druck auf die durch das Loch lla im Teil
11 und somit in den Bereich zwischen den Teilen 10 und 11 fließende Lösung ausübt. Dieses erzwungene Fließen der Testlösung
wird erhalten, indem man ein Rohr 50 verwendet, dessen Eingangsende
in nicht dargestellter Weise mit einer unter Druck stehenden Quelle der Testlösung verbunden ist und bei dem das Auslaßende in
geeigneter Weise mit dem oberen Ende des Loches lla in dem Teil 11 verbunden ist. Wegen dieser Rohrverbindung weist das Teil 11 vorzugsweise
eine größere Dicke auf als bei den bisher beschriebenen Ausführungsformen, in denen das Teil 11 so dünn sein kann wie erwünscht.
In jeder anderen Hinsicht ist die in den Figuren HA und HB dargestellte Struktur gleich der in den Figuren 7A und 7B.
Wegen der Strömung der Testlösung durch das Rohr 50 und das Loch
Ha strömt die Testlösung zwischen den beiden Objektträgern heraus,
wie durch die Pfeile in Figur HB gezeigt. Diese erzwungene Strömung der Testlösung führt dazu, daß die zweiten biologischen
Teilchen, wenn solche vorhanden sind, mit der monomolekularen Schicht 10c der ersten Teilchen in sehr viel kürzerer Zeit rea-
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gieren als wenn man nur die Diffusion anwendet. Die mono molekulare
Schicht lla1 der zweiten biologischen Teilchen aus der Testlösung
wird auf der monomolekularen Schicht 10c der ersten Teilchen in einer kürzeren Zeit und wieder radial nach außen unter dem Loch
lla gebildet» Für einen konstanten Druck der Flüssigkeitsströmung steht der Durchmesser der zweiten monomolekularen Schicht lla wieder
in Beziehung zur Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung. Wie bei den ähnlichen beschriebenen Ausführungsformen
kann die Konzentration durch Vergleich mit dem Durchmesser einer zweiten Schicht bestimmt werden, die aus einer
Standardlösung auf einer zweiten Vorrichtung gebildet ist oder mittels eines zweiten Loches im Teil 11, das einen ausreichenden
Abstand zum Loch lla hat, so daß sich die zweiten monomolekularen Schichten nicht schneiden.
Die Figuren 12A und 12B illustrieren eine achte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die ähnlich der in den Figuren HA und HB gezeigten ist mit der Ausnahme, daß der unter Druck
stehende Flüssigkeitsstrom in einem engen Kanal 60 zwischen den beiden Teilen 10 und 11 enthalten ist und nicht in allen Richtungen
ausströmt. Für diese besondere Ausführungsform ist die metallisierte
Beschichtung 10b auf dem Substrat vorzugsweise aus einer Indiumschicht konstanter Dicke gebildet, um eine im wesentlichen
flache Oberfläche der Indiumoxydschicht zu erhalten. Der Kanal 60 kann in der Größenordnung von 5 Mikron Höhe sein und er wird in
der Bodenoberfläche des Teiles 11 vom Ausgangsende des Loches Ha zu der Kante des Teiles 11 gebildet, die am weitesten entfernt
ist. Der Kanal 60 weist eine Weite gleich oder etwas größer als der Durchmesser des Loches Ha auf, so daß die unter Druck stehende
Flüssigkeit leicht durch den Kanal fließen kann und zwischen den beiden Teilen austreten kann, wie durch den Pfeil in Figur 12B
angedeutet. Die Länge der zweiten monomolekularen Schicht Ha1,
die innerhalb des Kanales auf der ersten monomolekularen Schicht
10c gebildet wird, steht wiederum in Beziehung zur Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Lösung, die durch das
Rohr 50, das Loch Ha und den Kanal 60 fließt.
Ein zweiter wirksamer Mechanismus zur Beschleunigung des Verfah-
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rens der Bildung der zweiten monomolekularen Schicht aus biologischen
Teilchen ist die Anwendung eines elektrischen Feldes auf solche Teilchen, um so das Verfahren elektrophoretisch zu beschleunigen.
Die Figuren I3A und 13B zeigen die entsprechende
erfindungsgemäße Vorrichtung zur Anwendung der Elektrophorese zum
Beschleunigen der Bildung der zweiten monomolekularen Schicht lla'
Die Vorrichtung ist ähnlich der der Fjguren HA und HB mit der Ausnahme,
daß ein enger Kanal 70 in der unteren Oberfläche des Teiles
11 gebildet ist, der sich vom Ausgangsende des Loches lla gegen die entfernte Kante des Teiles 11 erstreckt und es ist kein Rohr
50 erforderlich. Um einen Kanal ausreichender Länge in den Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Vorrichtung der Figuren 12A, 12B und 13A, 13B zu erhalten, wird das Loch Ha durch das Teil 11
vorzugsweise nahe der Kante des Teiles 11 gegenüber der Kante gebildet, welche das Ausgangsende des engen Kanales enthält. Im
Falle der Ausführungsform der Figuren I3A und I3B ist das Ausgangsende
des Kanales 70 durch eine erste Elektrode 71 eingeschlossen,
die geeigneterweise mittels eines elektrischen Leiters an einem ersten Ausgang einer Gleichstromquelle angebracht ist.
In ähnlicher Weise -ist das Ende des Kanales 70 am Ausgangsende des Loches Ha durch eine zweite Elektrode 72 eingeschlossen, die
mittels eines zweiten Leiters mit dem entgegengesetzten Pol der Spannungsquelle verbunden ist. Die Vorrichtung der Figuren 13A
und I3B wird in folgender Weise benutzt: Ein Tropfen der Testlösung,
von der man annimmt, daß sie die zweiten biologischen Teilchen enthält, wird in Loch Ha angeordnet und die Gleichspannung
angestellt, um ein geeignetes elektrisches Gleichspännungsfeld zwischen den Elektroden 71 und 72 zu erzeugen. Die Wahl der richtigen
Polarität und der an die Elektroden angelegten Spannung zwingt die jeweiligen zweiten biologischen Teilchen, sich entlang
der elektrischen Feldlinien mit einer Geschwindigkeit zu bewegen,
die gegeben ist durch das Produkt aus elektrophoretischer Beweglichkeit
und Feldamplitude, Die Geschwindigkeit der zweiten biologischen Teilchen vermindert daher beträchtlich die Zeit, die
zur Bildung der zweiten monomolekularen Schicht auf der ersten Schicht erforderlich ist. Wie im Falle der Figuren 12A und 12B
weist die zweite monomolekulare Schicht lla1 eine Länge in der
axialen Richtung des Kanales 70 auf, die in Beziehung steht zur
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- ill Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der Testlösung.
Aus der vorstehenden Beschreibung ergibt sich, daß durch die vorliegende
Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung
des Verfahrens geschaffen werden, um die Konzentration eines bestimmten immunologisch reaktiven biologischen Teilchens
in einer Testlösung zu bestimmen, durch Messen der Größe einer zweiten monomolekularen Schicht des jeweiligen Teilchens, die auf
einem metallisierten Substrat gebildet wird» Die Größe der zweiten monomolekularen Schicht wird durch direkte visuelle Beobachtung
mit dem bloßen Auge gemessen und die zweite monomolekulare Schicht kann durch Diffusion gebildet werden oder rascher durch
einen wirksamen Mechanismus, wie eine erzwungene Strömung oder die Anwendung eines elektrischen Feldes in einem Elektrophorese-Prozeß.
Die Größe der zweiten monomolekularen Schicht kann mit einem bekannten Standard oder einer Tabelle oder einer graphischen
Darstellung verglichen werden, die angefertigt wurde aufgrund von Testergebnissen mit Standardlösungen bekannter Konzentrationen.
Durch die Erfindung wird daher ein einfaches Verfahren beschrieben, bei dem metallisierte Objektträger so angepaßt werden
können, daß sie für die Bestimmung der Konzentration biologischer Teilchen in Testlösungen brauchbar sind. Da die metallisierten
Objektträger wiederholt mit identischen Eigenschaften hergestellt werden können, sind die Ergebnisse der quantitativen Messungen,
die mit der vorliegenden Erfindung erhalten werden, sehr genau, und sie können vielen brauchbaren Zwecken dienen, insbesondere
auf dem Gebiete der medizinischen Diagnostik in der Analyse des menschlichen Serums, z.B. für den Nachweis und die Bestimmung
der Konzentration der verschiedenen Antikörper und Antigene, die darin enthalten sind. Da der visuelle Kontrast zwischen
einer einzelnen und einer Doppelschicht aus immunologisch reaktiven biologischen Teilchen sehr deutlich ist, wenn man den erfindungsgemäßen
metallisierten Objektträger benutzt, wird die Messung der
Konzentration der zweiten biologischen Teilchen durch direkte Beobachtung mit dem bloßen Auge ausgeführt, und man braucht deshalb
keine komplizierte Testausrüstung.
Neben den beschriebenen acht besonderen Ausführungsformen können
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selbstverständlich noch andere Modifikationen und Variationen vorgenommen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung. So können
die Gestalt und die Größe der verschiedenen Substrate und der damit verbundenen Teile und der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschichten
variiert werden, und es kann irgendein Paar immunologisch reaktiver biologischer Teilchen, die miteinander immunologisch
reagieren, bei den erfindungsgemäßen Vorrichtungen verwendet werden. D.h. die oben als erste und zweite Teilchen bezeichneten
biologischen Teilchen können Antigene, Antikörper, Viren, Bakterien, Hormone, Enzyme und andere Teilchen sein, die leicht
gezüchtet oder in anderer Weise isoliert und gesammelt werden können oder die im menschlichen Serum oder in einer anderen untersuchten
Lösung vorhanden sind. Weiter können verschiedene andere Metallisierungen als die spezifisch hier erwähnten verwendet werden,
und sie können eine hervorragende Empfindlichkeit für besondere
biologische Teilchen haben, wobei ein Beispiel der Metall/Metalloxyd-Metallisierung
die von Nickel sein kann. Zumindest einige der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, nämlich die der
Figuren 7A, 7B, 9A, 9B und I3A, 13B können ohne das Teil 11 hergestellt
werden, indem man die Löcher 11a usw. durch die untere Oberfläche des Substrates 10 bildet (wie in den Figuren 7B, 9B
und I3B orientiert). Der Objektträger würde dann umgedreht werden
und die Wasser- und Testlösung stufenweise in das bzw. die Löcher eingebracht werden, um das Befeuchten und die nachfolgende
Diffusion der zweiten biologischen Teilchen entlang der ersten monomolekularen Schicht zu erhalten.
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Claims (35)
1.!Vorrichtung zum Nachweisen immunologisch reaktiver biologischer
Teilchen, gekennzeichnet durch
(a) ein Substrat mit einer Hauptoberfläche,
(b) eine Metallisierungsschicht, welche die eine Hauptoberfläche
des Substrates bedeckt und
(c) Mittel, um Feuchtigkeit unbeweglich zu machen und eine unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht zu bilden, die
in Berührung steht mit der metallisierten Hauptoberfläche des Substrates.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet
, daß sie weiter eine monomolekulare Schicht erster immunologisch reaktiver biologischer Teilchen zwischen
der metallisierten Oberfläche des Substrates und der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht aufweist.
3. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Subßtrat eine flache
Platte ist.
4. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch
gekennzeichnet , daß das Substrat eine Schale ist.
5. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Substrat aus einem
lichtdurchlässigen Material;wie Kunststoff oder Glas besteht.
6. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Substrat aus Metall
besteht.
7. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Unbeweglichmachen
von Feuchtigkeit ein gelierendes Material ist.
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8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein oder mehrere Schächte in der
Schicht aus Gelmaterial enthält, um ein oder mehrere Proben für die Analyse einführen zu können.
9. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Gel Agar oder Agarose
ist.
10. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Unbeweglichmachen
der Feuchtigkeit aus Cellulosematerial hergestellt ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet
, daß das Cellulosematerial aus Celluloseacetat oder porösem Papier oder Filterpapier oder Seidenpapier
besteht.
12. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Unbeweglichmachen
von Feuchtigkeit ein festes Teil ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß das feste Teil ein oder mehrere durchgehende
Löcher aufweist als Mittel zum Einführen der Probe.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Einführen der Probe
weiter ein Rohr umfaßt, dessen erstes Ende mit einer unter Druck stehenden Quelle der Probe verbunden ist und ein zweites
Ende, das mit einem Loch in dem festen Teil verbunden ist, so daß eine erzwungene Strömung der Probe zu der unbeweglich
gemachten Feuchtigkeitsschicht erzeugt wird,
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß sie weiter einen engen Kanal umfaßt,
der durch die untere Oberfläche des festen Teiles gebildet
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ist und ein erstes Ende aufweist, das mit dem Loch in dem festen
Teil überlappt und ein zweites Ende entlang einer Kante des festen Teiles, die sich in weitem Abstand von dem Loch durch
das Teil befindet.
16. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet
, daß sie weiter einen Kanal umfaßt, der in der unteren Oberfläche des festen Teiles gebildet ist und ein
erstes Ende aufweist, das ein Loch in dem festen Teil überlappt und ein zweites Ende in enger Nachbarschaft zu einer Kante des
festen Teiles, die in weitem Abstand zu dem Loch durch das Teil liegt und eine erste Elektrode an einem ersten Ende mit dem
engen Kanal verbunden ist und eine zweite Elektrode an einem zweiten Ende mit dem Kanal verbunden ist, so daß das Anlegen
einer Gleichspannung über die erste und zweite Elektrode elektrophoretisch rascher eine Schicht von zweiten Teilchen bilden
kann als wenn diese Teilchen lediglich in dem Bereich diffundieren.
17. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch
gekennzeichnet , daß die unbeweglich gemachte Peuchtxgkeitsschicht weniger als 1 mm dick ist.
18. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch
gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche des Substrates ein nicht durchgehender Film aus Metallteilchen
ist.
19. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche
auf dem Substrat aus einer Legierung zweier Metalle gebildet ist.
20. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche
auf dem Substrat aus einer Legierung zweier Metalle gebildet ist und einen äußeren Oxydfilm eines der beiden Metalle
tr ägt.
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21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekenn-
sind zeichnet , daß die beiden Metalle Indium und Gold /und
der Oxydfilm ein Indiumoxydfilm ist.
22. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch
gekennzeichnet , daß die Hauptoberfläche des Substrates flach ist und Indium zuerst auf die flache Haupt oberfläche
des Substrates als nicht durchgehender Film von Indiumkügelchen aufgebracht wird, so daß die metallisierte
Oberfläche leicht irregulär ist,
23· Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17 s dadurch
gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche des Substrates gebildet ist aus einem Metall und einem
Oxydfilm des Metalles.
2k. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß die metallisierte Oberfläche
des Substrates gebildet ist aus einem Metall und einem äußeren Film eines Oxydes des Metalles»
25. Vorrichtung zum Bestimmen der Konzentration immunologisch reaktiver biologischer Teilchen, gekennzeichnet
durch
(a) ein Substrat mit einer Hauptoberfläche,
(b) eine Metallisierungsschicht, die die Hauptoberfläche des
Substrates bedeckt,
(c) eine monomolekulare Schicht erster biologischer Teilchen, die im wesentlichen entlang der ganzen metallisierten
Oberfläche des Substrates adsorbiert ist und
(d) Mittel zum Unbeweglichmachen von Feuchtigkeit zum Schaffen einer unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht in Kontakt
mit der metallisierten Hauptoberfläche des Substrates.
26. Verfahren zum Nachweisen einer immunologischen Reaktion biologischer
Teilchen, gekennz eichnet durch folgende Stufen:
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(a) Aufbringen einer unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht
auf eine metallisierte Oberfläche eines Substrates zur Bildung einer Teststruktur,
(b) Aufbringen einer Menge einer ersten Probe, die ein erstes immunologisch reaktives biologisches Teilchen enthält,
auf einen ersten Bereich der unbeweglich gemachten Peuchtigkeitsschicht,
(c) Aufbringen einer Menge einer Testprobe, von der man annimmt, daß sie ein zweites immunologisch reaktives biologisches
Teilchen enthält, auf einen zweiten Bereich der unbeweglich gemachten Peuchtigkeitsschicht,
(d) Diffundierenlassen der ersten und der Testprobe für eine bestimmte Zeit durch die unbeweglich gemachte Peuchtigkeitsschicht
zur metallisierten Oberfläche und mit der Oberfläche und miteinander in Wechselwirkung zu treten und
(e) Untersuchen der metallisierten Oberfläche mit der erhaltenen immunologischen Reaktion, sofern ein solche stattgefunden
hat, durch Beobachten.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß die Stufe des Aufbringens der Testprobe,
von der man annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthält, auf die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht
im Aufbringen der Testprobe in geringem Abstand zu der Aufbringung der ersten Probe besteht, so daß die ausgewählten
ersten und zweiten Bereiche auf der unbeweglich gemachten Peuchtigkeitsschicht im Abstand von einigen Millimetern zueinander
angeordnet sind.
28. Verfahren nach Anspruch 26,. dadurch gekennzeichnet , daß die Bildung der Test struktur weiter
das Absorbieren einer monomolekularen Schicht der ersten biologischen Teilchen auf der metallisierten Oberfläche vor dem
Aufbringen der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht und das nachfolgende Aufbringen der unbeweglich gemachten Feuchtigkeit
sschicht im Kontakt mit der monomolekularen Schicht einschließt und dann das Aufbringen ein oder mehrerer Proben^
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von denen man annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthalten,
auf ausgewählten Bereichen der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht, um ein oder mehrere monomolekulare Schichten
der zweiten biologischen Teichen auf der ersten monomolekularen Schicht aus ersten biologischen Teilchen zu bilden, dann
die Größe der einen oder mehreren Schichten der zweiten Teilchen zu beobachten, wenn solche vorhanden sind, wobei die Größe
der einen oder mehreren Schichten in Beziehung steht zur Konzentration der zweiten Teilchen in der einen oder den mehreren
Proben.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet
, daß eine weitere Probe aufgebracht wird, die eine bekannte Konzentration an zweiten biologischen Teilchen
enthält, auf einen ausgewählten Bereich der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht im Abstand von dem Bereich, auf
den oder mehrere frühere Proben aufgebracht sind, um eine zusätzliche Schicht aus biologischen Teilchen im Abstand von
der oder den Schichten der zweiten Teilchen zu bilden, dann die metallisierte Oberfläche durch Feststellen der Größe der
zusätzlichen Schicht der zweiten Teilchen zu untersuchen, wobei diese Größe in Beziehung steht zu einer bekannten Konzentration
der zweiten Teilchen in der zusätzlichen Probe und Vergleichen der Größe der früheren einen oder mehreren Schichten
zweiter Teilchen mit der Größe der zusätzlichen Schicht zweiter Teilchen, wodurch die Konzentration der zweiten Teilchen in
der oder den früheren Proben bestimmt werden kann,
30. Verfahren nach Anspruch 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet , daß die erste Probe ein bestimmtes
Antigen enthält, die zweite Probe, von der man annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthält, Antikörper enthält, spezifisch
zu dem bestimmten Antigen und die Untersuchung der metallisierten Oberfläche in dem Nachweis der Antikörper resultiert.
31. Verfahren nach den Ansprüchen 26 bis 29, d a d u r c h gekennzeichnet , daß die erste Probe einen bestimmten
Antikörper enthält, daß die zweite Probe, von der man
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annimmt, daß sie zweite biologische Teilchen enthält, ein Antigen
enthält, zu dem der besondere Antikörper spezifisch ist und die Untersuchung der metallisierten Oberfläche im Beobachten
des von der metallisierten Oberfläche reflektierten Lichtes besteht.
32. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß das Adsorbieren einer monomolekularen
Schicht aus ersten biologischen Teilchen entlang der metallisierten Oberfläche besteht aus dem Adsorbieren einer monomolekularen
Schicht aus einem besonderen Antigen darauf, die Stufe des Aufbringens der Testprobe auf die unbeweglich gemachte
Feuchtigkeitsschicht aus dem Aufbringen einer Testprobe besteht, von der man annimmt, daß sie Antikörper enthält, die
spezifisch zu dem besonderen Antigen sind, das an der metallisierten Oberfläche des Teiles adsorbiert ist und die Stufe des
Diffundierenlassens der Testprobe durch die unbeweglich gemachte
Feuchtigkeitsschicht sowie der Antikörper, wenn solche vorhanden
sind, sowie das Bilden einer monomolekularen Schicht
auf der Antigenschicht als Ergebnis der immunologischen Reaktion zwischen beiden und das Feststellen des Durchmessers der
monomolekularen Schicht aus Antikörpern, aus dem die Konzentration der Antikörper in der Testprobe bestimmt werden kann.
33. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß es weiter die Stufe des Aufbringens
einer zweiten Testprobe umfaßt, die eine bekannte Konzentration der Antikörper enthält, und zwar auf einen nachfolgend
ausgewählten Bereich auf der unbewegüich gemachten Feuchtigkeit
sschicht im Abstand von wenigen Millimetern von dem ersten Bereich, ausreichend langes Diffundierenlassen der zweiten
Testprobe durch die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht
und der Antikörper in der zweiten Testprobe und das Bilden einer zusätzlichen monomolekularen Schicht aus den Antikörpern auf
der Antigenschicht als Ergebnis der immunologischen Reaktion zwischen ihnen und im Abstand von der früheren Schicht aus
Antikörpern sowie die Stufe des Beobachtens der metallisierten
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Oberfläche und des Vergleichens der Durchmesser der Schichten aus Antikörpern, wodurch die Konzentration der Antikörper in
der früheren Probe leicht bestimmt werden kann.
34. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß die Stufe des Einführens der Probe der
zweiten biologischen Teilchen in die Testvorrichtung im Schaffen
einer erzwungenen Strömung aus den zweiten biologischen Teilchen besteht,
35. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß die Stufe des Einführens der Probe aus
den zweiten biologischen Teilchen zu der Testvorrichtung im Aufbringen eines Tropfens der Lösung der zweiten biologischen
Teilchen in die Testvorrichtung besteht und dem Anlegen einer Gleichspannung über eine erste und zweite Elektrode, die in
der Vorrichtung angeordnet sind, so daß die Schicht der zweiten Teilchen elektrophoretisch gebildet wird.
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